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Neuroscience

재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도 분석 하기 위한 마이크로-agar 소금 다리 전극

doi: 10.3791/58552 Published: January 7, 2019

Summary

Electrophysiological 측정, 유포 잠재력의 존재 전극 전위를 변경 하 여 역 잠재력의 정확한 측정을 방해. 마이크로-한 천 염 다리를 사용 하 여 잠재적인 확산의 영향 최소화 됩니다, 재구성 된 재조합 막 단백질의 기판 회전율 숫자의 더 정확한 측정을 허용 하.

Abstract

날짜 하려면, 모든 약물 약물의 50% 이상이 막 단백질의 전송 속도 대상. 막 캐리어 단백질 지질 bilayer 막 재구성 electrophysiological 특성은 그들의 물리 화학적 및 약리 속성의 평가 대 한 강력 하지만 섬세 한 방법입니다. 기판 매출 수 다른 막 단백질의 활동의 비교를 허용 하는 고유 매개 변수입니다. Electrogenic 전송에서 translocated 기판의 그라데이션 막 잠재적인 단백질의 기판 회전 속도에 직접 연결을 만듭니다. 전극 잠재력을 상당히 정확한 막 잠재력 측정을 방해 사용 하 여 염화는 전극, 유포 잠재력, 가능성, 액체 접합 라고도 유발 됩니다. 전극 잠재력 균형 소금 다리 확산 가능성을 최소화할 수 있습니다. 이 문서에서는, 마이크로-한 천 염 다리는 electrophysiological 설정, 막 형성에 대 한 micropipettes를 사용 하 여 하도록 설계 되었습니다. 소금 솔루션 microcapillary 피 펫 팁, agarose의 추가 의해 안정으로 채워집니다 그리고 표준 전극에 쉽게 장착할 수 있습니다. 마이크로-소금 다리 전극의 전극 전위는 표준 전극에 비해 더 안정적입니다. 이 시스템의 구현 전극 전위를 안정화 하 고 막 잠재적인 pH 기온 변화도 의해 생성 된의 더 정확한 측정을 허용 한다. 이 시스템을 사용 하 여, 미토 콘 드 리아 사업자 UCP1 및 UCP3의 양성자 이직 률 reinvestigated 이며 이전 측정에 비해.

Introduction

막 단백질은 모든 알려진된 의약품1의 최대 60%까지 타겟팅 됩니다. 막 단백질의 electrophysiological 측정 분석 기판 막 캐리어 단백질에 의해 중재의 electrogenic 전송 하 강력 하지만 섬세 한 도구입니다. 일정 전압 또는 전압 램프의 적용으로 막 횡단 전류의 변조 수 예를 들어, 활성화 및 저해 기질 또는 전송 사업자의 약리학 및 물리적 특성 평가 속도 론입니다. 특별 한 관심의 기판 매출 번호, 시간 단위 당 막 단백질에 의해 translocated 기판의 표시 이다. 다양 한 막 단백질의 활동을 비교 하는 경우 주요 매개 변수입니다. 막에 걸쳐 청구 기판의 농도 기온 변화도 설치는 기판의 매출 수 연 역 한 기전력 생성 합니다.

AgCl 전극에 사용 하 여, 염화 무료 버퍼의 존재 확산 잠재력을 전극 전위를 전류-전압 측정2의 변화에 이르게 만듭니다. 이러한 매개 변수 중 하나는 이후 그것은 표준 전도도 및 용량 측정에 대 한 무시할 수 있지만 항상 존재는 전류-전압 기록 (전도성) 또는 단일 기록 (용량)의 차이의 기울기에 따라 어떤 잠재력을 취소합니다. 그러나, 기판의 전송에 의해 생성 되는 역방향 잠재력의 녹음 잠재적인 확산에 의해 크게 방해 될 수 있습니다. 따라서, 역방향 잠재력의 정확한 측정을 위해 전극 전위를 일정 하 게 유지 될 필요가.

두 가지 방법으로 잠재적인 확산을 최소화할 수 있습니다: (i) bilayer 막의 존재 기질 농도 막3,4의 1 개의 측에 증가 또는 (ii) 소금 다리 균형 전극 전위 5. 첫 번째 방법은 높은 측정의 안정성에 따라 달라 집니다. 막 기판 솔루션에서 거의 동일 하 게 배포 때까지 교 반 아래 기판의 추가에서 몇 분 동안 살아남을 수 있다. 막 사이 파열, 기판 그라데이션 된 분자의 자유 교환에 의해 변경 하 고 측정 설정 부정확. 두 번째 방법은 잠재적인 확산을 균형 하지만 설정의 크기에 의해 제한 됩니다. 작은 구현 하지만 electrophysiological 설정에 마이크로 범위에 소금 다리를 작동6을도전 이다. 후자의 방법을 소금 솔루션은 microcapillary 팁으로 가득 및 버퍼 솔루션에 소금 솔루션의 확산을 방지 하기 위해 agarose의 추가 의해 안정.

이 프로토콜에서 마이크로-한 천 염 다리 및 피 펫 설정7 에 따라 electrophysiological 설정으로 구현 간단한 생산 설명 되어 있습니다. Microcapillary 팁 1 mol % (w/v) agarose 3m KCl 솔루션을 포함 하 고 다리는 AgCl 전극 및 버퍼 솔루션 조정 됩니다. 마이크로-소금 다리의 장점은 전극 잠재적인 변화의 시간 녹음 및 다양 한 pH 기온 변화도에 잠재적인 막의 더 정확한 측정으로 표시 됩니다. 리로 재구성 하는 재조합 형 단백질의 모델 시스템에서 미토 콘 드 리아 사업자 UCP1와 비슷한 조건 하에서 생산 하는 UCP3의 이직 률은 reinvestigated 이며 이전 결과3,8에 비해.

Protocol

1. 재조합 연결을 푸는 단백질 (UCPs)의 생산 및 평면 Bilayer 막의 형성

  1. Rupprecht 에 설명 된 대로 재조합 UCP1와 UCP3를 생산 9 및 Hilse 외. 10
  2. 에 설명 된 대로 기존의 불가결 플라스틱 펫의 팁에 평면 bilayer 막 형성 7

2. 마이크로 agar 소금 다리 전극의 준비

  1. 조정 microcapillary 피 펫 팁 적절 한 길이를 ( 재료의 표참조).
    1. 포함 하는 버퍼 팁에 부착 될 것입니다 및 슬라이딩 캘리퍼스를 사용 하 여 마이크로-agar 소금 다리 전극의 길이 측정 하는 빈 끝에 위치를 표시 합니다.
      주의: microcapillary 팁 해야 합니다 충분히 측정에 대 한 버퍼 솔루션을 입력.
    2. 날카로운 칼 또는 블레이드 microcapillary 끝을 잘라 고 에탄올과 물 커트 표면 청소.
  2. AgCl 코팅 전극을 준비 합니다.
    1. 길이 약 8cm의 Ag 와이어에서 잘라내어 에탄올과 물으로 청소.
    2. 샌드 페이퍼의 한 조각을 그리고 소금 솔루션 접촉 해야 와이어의 끝에 1 cm 길이의 표면 아래로 부드럽게.
    3. 3m KCl 솔루션으로 마무리 끝을 찍어와 10 1.5 V DC 공급 장치를 사용 하 여 염화와 그것을 화학적 코트 s.
    4. 물으로 전극 청소 하 고, 건조 한 microcapillary 팁 가능한 깊은 침투 코팅된 측에서 AgCl 전극의 길이 조정.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  3. 3m KCl 소금 솔루션 1% (v/v) agarose 준비 합니다.
    1. 그리고 KCl의 4.47 g 밖으로 무게는 플라스 크에 감동 하 여 그것을 물 20 mL에 녹.
    2. 활동가 제거 하 고의 agarose, 0.2 g으로 무게는 플라스 크에 추가.
    3. agarose를 용 해 하 고 응고 하지 않도록를 100 ° C에 솔루션을 열.
      주의: 플라스 크 매우 뜨거운 될 것 이다입니다. 맨 손으로 그것을 만지지 마십시오. 글러브를 사용 하 여 처리.
  4. Agarose 소금 솔루션 microcapillary 팁을 작성.
    주의:이 솔루션은 뜨거운. 손을 보호 하 고 작업을 피하기 위해 신중 하 게 많아요.
    1. agarose 시작 되 면 응고, 열을 완전히 다시는 agarose를 녹 소금 솔루션을.
    2. Microcapillary 팁으로 agar 소금 솔루션의 10 µ L를 담근 다. 천천히 그것을 흡수 하 고 신중 하 게 거품을 공기를 피하기 위해 팁.
    3. 피펫으로에서 끝을 제거 하 고 AgCl 전극 팁의 광범위 한 측면에서 밀어. 전극 소금 솔루션 침투 확인 합니다.
    4. 실내 온도에 전극 아래로 냉각 하 고 앰프에 연결.
  5. 측정에 대 한 버퍼를 준비 합니다.
    1. 4, MES의 0.195 g 나2의 0.710 g 밖으로 무게, 0.121 g 트라이앵글, EGTA, 0.023 g 비 커에 증류수 100 mL를 추가 하 고 솔루션을 저 어.
    2. PH 전극 사용 하 여 버퍼의 pH 값에 대 한 확인 하 고 pH 값 7.32 조정.
    3. 기준 전극과 한 천 염 다리 전극 전기 접촉에 있는 확인 하십시오.
      1. 플라스틱 용기를 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
      2. 기준 전극과 한 천 염 다리 전극에와 신호 응답 확인. 신호 응답이 정확한 경우 2.7 단계로 진행 합니다.
  6. 있다면 거짓 신호 응답 또는 전기 접촉에, 다음 문제 해결을 수행 합니다.
    1. 소금 솔루션 접촉 전극 인지 확인 하 고 솔루션으로 전극을 밀어.
      참고: 경우이 솔루션은 이미 너무 끈 적, 마이크로-agar 소금 다리를 제거 하 고 새로운 microcapillary 팁을 준비.
    2. 소금 솔루션 내에서 공기 방울 인지 확인 하십시오. 그렇다면, 새로운 microcapillary 팁을 준비 합니다.
    3. 버퍼 솔루션 문의 소금 솔루션 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다음 다른 1 mm의 팁의 튜브 끝을 잘라.
      주의: 팁은 아직도 충분히 포함 하는 버퍼 끝을 관통 하는 것을 해야 합니다. 여전히 접촉은, 새로운 microcapillary 팁을 준비.
    4. 이러한 단계 중 도움이 새로운 microcapillary 팁을 준비.
  7. 저장용, 천 염 다리 전극 3 M KCl 해결책에 찍어.
    참고: 프로토콜 여기 중지 될 수 있습니다. 일시 중지에 대 한 하룻밤, 4 ° c.에 3 M KCl 소금물에 전극을 저장
  8. 플라스틱 팁 포함 하는 버퍼를 준비 합니다.
    참고: 전극 하룻밤 저장 된 경우 밖으로 그것을가 고 그것을 하자 30 분 동안 실내 온도까지 열.
    1. Microcapillary 팁 고 벤드 튜브, 좁은 부분의 가장자리에서 2cm 난방 철사를 사용 하 여 약 90도.
    2. 매우 날카로운 칼 또는 칼 날을 사용 하 고 굽이에서 약 5 m m 튜브를 잘라.
    3. 끝에 에탄올과 물 표면을 청소 고 끝의 구멍의 지름을 측정 한다. 이것에서 표면 영역을 계산 합니다.
    4. 코트 85:15 (v:) 헥 산: hexadecane와 팁의 표면.
      1. 용 매의 3 µ L 플라스틱 고 끝에서 제거 합니다.
      2. 모든 팁에 잔류 용 매 증발 되도록 1 분을 기다립니다.
    5. 버퍼의 3 µ L를 측정 팁와 소금 다리 전극에 연결.
      참고: 경우 소금 다리 전극과 참조 전극 전기 접촉에서 단계 2.5.3 수행 하 여 다시 확인 하십시오.
    6. 전기 접촉 나 있는 경우에, 다음에 대 한 확인:
      1. 소금 다리 전극 접촉 버퍼 솔루션 인지 확인 합니다. 그렇지 않다면, 다음에 있는 버퍼의 볼륨을 증가 하거나 더 긴 microcapillary 팁을 준비 합니다.
      2. 공기 방울이 있는 경우에, 마이크로-소금 다리 전극에서 끝을 제거, 팁에 버퍼를 리필 그리고 그것 전극에 다시 꽂습니다.

3. 재조합 단백질으로 재구성 하는 막의 전기 매개 변수 측정

  1. 삼각 교류 전압 신호를 적용 최대 전압 U최대 50 mV와 δ T램프 = = 50ms 사각형 교류 전류 응답을 만듭니다. 포지티브 및 네거티브 전류 (+ 어 나-)의 평균 값에서 다음 수식에 따라 막의 용량을 계산:
    Equation 1
  2. -50에서 배열 하는 전압 램프 적용 + 50 mV를 기록 현재 mV. -기울기는 전도도-데이터를 선형 함수에 맞게 그리고 적합의 x 축 교차점을 계산.
  3. 플라스틱에 있는 솔루션을 방전 하 고 새로운 한 증가 기질 농도 포함 하는 버퍼를 채울.
    1. 아니 막 처음으로 20-30 s 내에서 형성 되 면 볼륨 방전 고 그것을 리필. 이 막에 걸쳐 농도 기온 변화도 막 형성 동안 크게 변경 되지 않습니다 보장 합니다.
    2. 막의 형성, 3.1과 3.2 다시 적절 한 막 형성을 확인 하 고 x 축 교차점을 단계를 수행 합니다.

4입니다. 기판 회전 속도의 계산

주: 자세한 내용은3,7에 대 한 이전 작업을 참조 하십시오.

  1. 지질 및 단백질 (M지질 및 M단백질), 막의 한 지질 머리 그룹 ( 지질), 지역 및 당 단백질의 대량 비율의 분자 질량에서 막에 있는 단백질의 양을 추정합니다 지질 (r)입니다.
    Equation 2
  2. 네른스트 수송된 기판에 대 한 잠재적인 계산 합니다. R은 기체 상수, T는 온도, z 수송된 기판, F는 패러데이 상수, 및 c의 충전1 과 c2 막의 양측의 기판의 농도.
    Equation 3
  3. 전류-전압 녹음에서 걸릴 반전 잠재적인 존재와 부재의 기판 그라데이션 선형 맞는에서 x 축 교차점의 차이와 계산.
  4. 네른스트 잠재적인11역 잠재력의 비율에 의해 기판 전도도, G기판, G, 총 막 전도도의 비율을 계산 합니다.
    Equation 4
  5. 계산 기판 매출 번호 ΔN기판 기판 전도도 (G기판), 적용된 전압 U, 그리고 기판 z: 충전 시간 단위 δ T 당
    Equation 5
  6. 단백질의 수는 시간 당 수송된 기판의 비율에서 이직 률 κ를 계산 합니다.
    Equation 6

Representative Results

잠재적인 확산의 최소화, 확인 하는 그대로 막의 전류-전압 측정의 안정성 측정 했다. 그림 2A, 대표 전류 전압 녹음 존재 (흰색 점) 및 pH 기온 변화도의 부재 (검은 점)에 묘사 된다. Nernst 방정식에 따라 pH 기온 변화도 전압의 변화를 유도 한다. 데이터에 선형 적합의 x 축 교차 지점에서 잠재적인 변화 계산 됩니다. 두 전극을 테스트 하려면 x 축 교차점에 변화 (그림 2B; 백색 점) 표준 AgCl 전극과 마이크로-한 천 염 다리 (그림 2B, 검은 점 들)에 대 한 분석 했다. 전압 램프 연속에서 10 번을 기록 했다 하 고 x 축에 평균 근무 시간에 대 한 묘사. MV 측정, 표준 전극의 300 초 후에 최대 30 다양 한 소금 다리 전극 미만 5의 최대 변화를 했다 반면, 무작위, 예측할 수 없는 행동에 mV.

다음, 두 전극 다른 pH 기울기(그림 3)에서 테스트 되었습니다. 표준 전극 0.35와 1.0 (흰색 점)의 pH 기온 변화도 생성 했다; 대 한 한 천 염 다리 전극, 0.35, 0.7, 1.0 (검은 점)의 pH 기울기. 잠재력에 3 개의 독립적인 측정에서 분석 했다. 0.35, 어디 측정된 변화만 달라 약간의 그라데이션 달리 전압 변화는 크게 마이크로-한 천 염 다리의 부재에서 1.0의 pH 기온 변화도에서 변경 합니다. 데이터에 선형 적합에서 함수의 기울기 이며 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH 표준 전극 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH 마이크로-agar 소금 다리 전극에 대 한. Nernst 방정식에 따라 계산 된 잠재적인 변화는 60.7 mV/ΔpH t = 32 ° c.

마이크로-agar 소금 다리, 양성자 회전율 숫자를 사용 하 여 미토 콘 드 리아 UCP1 및 UCP3의 κ 측정 되었고 이전 측정 (그림 3B)에 비해. 그림 3A, ΔpH과 마찬가지로 = 1.0 생성 하 고 역방향 잠재력 측정 되었다. 막에 있는 단백질 양의 지질 비율 4 µ g의 단백질 프로토콜의 섹션 4에서에서 제공 하는 공식에 따라 추정 되었다 / (mg의 지질), 단백질 및 지질, 3.53 x 10 의 막 면적 33000, 및 750 Da의 분자 질량 -4 cm2, 그리고 10-15 cm2x 7.8의 지질 당 지역. 각각 UCP1 및 UCP3, κwas 5.56 ± 0.38의-1 과 4.10 ± 0.71의-1 를 획득 (그림 3B).

Figure 1
그림 1 : 마이크로 agar 소금 다리로 electrophysiological 설정. (A)이이 패널 설정의 스케치를 표시 합니다. (오렌지에 묘사 된) 한 소금물을 포함 하는 microcapillary 팁 (블루) (까만) 전극과 포함 하는 버퍼 끝 사이 배치 됩니다. 막 (화살표로 표시) 포함 하는 버퍼 팁의 끝에 표면에 형성 된다. (B)이이 패널 마이크로-한 천 염 다리의 구현 electrophysiological 설정의 이미지를 보여 줍니다. 화살표는 전극, 마이크로-한 천 염 다리, 참조 전극 및 버퍼 솔루션 컨테이너를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 마이크로 agar 소금 다리와 표준 AgCl 전극의 비교. 존재 (회색 점)에 1의 pH 기온 변화도의 부재 (흰색 점) (A)이이 패널 쇼 대표 전류 전압 측정. 라인은 교차점 값은 전도성 및 x 축에서 가져온 데이터에 선형 적합을 나타냅니다. 전압 변화는 두 기록의 교차 값의 차이 의해 평가 됩니다. (B)이이 패널 시간에 마이크로-agar 소금 다리 전극 (검은 점)을 표준 AgCl 전극 (흰색 점)의 잠재적인 막의 변화를 보여 줍니다. 10 전류-전압 측정 한 행에 기록 된 고 잠재적인 확산에 의해 평균 전압 변화 시간에 대해 그려집니다. 모든 실험에서 막 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 1.5 mg/mL의 농도에 15 몰 % 아라키 돈 산으로 재구성 되었다. 버퍼 포함 50 m m 나24, 10 mM MES, 10 mM TRIS, 그리고 pH에 0.6 m m EGTA = 7.34와 T = 32 ° c. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : PH 기온 변화도의 역방향 잠재력에서 UCP1 및 UCP3의 양성자 회전율 수 계산. (A)이이 패널 표준 AgCl 전극 (흰색 점)과 마이크로-agar 소금 다리 전극 (검은 점)의 다양 한 pH 기온 변화도의 UCP1 포함 된 막의 잠재력에 변화를 보여줍니다. 라인은 데이터에 선형 적합을 나타냅니다. (B)이이 패널 표시 UCP1 양성자 회전율 수 (첫 번째 데이터 집합) 및 UCP3 (2 차 데이터 세트) 프로토콜의 섹션 4에 있는 수식 따라 Nernst 잠재력을 전압 변화의 비율에서 계산. 각 집합의 첫 번째 막대 마이크로 agar 소금 다리와 함께 측정 하는 이직 률을 나타냅니다. 각 데이터 세트의 두 번째 바 이전 측정을 표준 AgCl 전극을 사용 하 여 나타냅니다. UCP1 및 UCP3 값을 Urbankova그 외 여러분 에서 찍은 3 그리고 Macher 외. 8. 모든 측정에서 막의 45:45:10 mol % DOPC:DOPE:CL 15 몰 %AA UCP1/UCP3 재구성 되었다. 지질과 단백질의 농도가 1.5 mg/mL 및 µ g/4mg의 지질, 각각 이었다. 버퍼 포함 50 m m 나24, 10 mM MES, 10 mM TRIS, 그리고 pH에 0.6 m m EGTA = 7.34와 T = 32 ° c. 그라데이션 측정에 대 한 버퍼의 pH 7.66, 8.00, 또는 8.33 트리를 추가 하 여 증가 하 고 솔루션에 포함 된 피 펫에서 변경 되었습니다. 값은 3 개의 독립적인 측정의 평균 ± 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

전극 마이크로-agar 소금 다리 구현 그것의 유포 가능성을 최소화 하 고 막 잠재적인 pH 기온 변화도 의해 생성 된의 더 정확한 측정을 허용 한다. 두 전극의 잠재적인 변화 다양 한 막 횡단 pH 기온 변화도, 존재 ΔpH에서 허용 했다 잠재적인 네른스트 평형의 이론적인 값을 비교할 때 0.35 = (Φ네른스트 23.8 = ΔpH에 대 한 mV = 0.4). 그러나, 더 많은 생리 적 pH 기온 변화도에서 인스턴스는 매트릭스와 intermembrane 공간, 표준 AgCl 전극 사이의 미토 콘 드리 아에서 ΔpH에 잠재적인 변화를 정확 하 게 측정 하지 못했습니다 = 1 (그림 3A) 합니다. 전극 마이크로-agar 소금 브리지 전달 값 훨씬 더 이론에 비교 했다.

버퍼 솔루션 실험 기간 동안 변경 되 면 잠재적인 확산 AgCl 기준 전극에 발생할 수 있습니다. 염화-무료 버퍼 솔루션 연결을 푸는 단백질 염화 이온 수송을 제안 했다 때문에 Tris 또는 MES를 사용 하 여 pH 조정 실험에서 사용 되었다. 전극 잠재력, 염화 물의 상당한 농도의 부재는 주로 염화 불순물 버퍼 솔루션에서에 따라 달라 집니다. 그것의 구성 실험 기간 동안 변경 되지 않습니다, 그것은 단순히 일정 오프셋된 가능성이 발생 합니다. 그러나, 두 개의 전극 사이의 절대적인 전위차 측정에 대 한 간단한 한 천 소금 브리지 시스템 (Ag/AgCl 3 M KCl) 또한 기준 전극에 대 한 사용 될 수 있습니다.

마이크로-agar 소금 다리 전극 전위의 평형에 의해 잠재적인 확산을 균형. 소금 솔루션 안정화를 위해 1% (w/v) agarose 버퍼 솔루션 소금물의 혼합을 방지 하기 위해 추가 되었습니다. + K 및 Cl- 소금 이온 액체에서 비슷한 mobilities 있고 전극 전위를 균형. 소금 다리를 제대로 설치 하려면 agar 소금 솔루션 충분히가 열 될 어떤 기포 없이 microcapillary 팁 작성 AgCl 전극 커버 하 고 있다. 더 사용 하기 전에 소금 다리 전극과 기준 전극 사이의 전기 접촉 확인할 수 있다. 염 다리를 사용 하는 시간에 따라 소금 솔루션은 수 충분히 gelled 어떤 버퍼와 소금 솔루션의 혼합을 방지 하기 위해. 이것은 K+ 또는 Cl- 전송기 조사 하는 경우에 특히 중요입니다. 그리고 염 다리 아주 짧은 시간 동안 사용 agarose의 차입은이 시간 범위에 무시할 수 있습니다. Agarose 최대 5%, 또는 천 (3%-5%)의 높은 농도 소금 다리를 사용 하 여 시간6,12의 더 긴 기간에 대 한 수 있습니다.

이 메서드는 전송 속도 론 (i)와 낮은 이직 률 막 운송업 자 그리고 (ii) 표준 패치 클램프 업13조사 거의 수 있는 내부 막의 미토 콘 드리 아 단백질의 결정을 수 있습니다. 그것의 정밀도 주로 낮은 총 막 전도도 및 막 잠재적인 아래 녹음의 소음을 유발 하는 작은 농도 기온 변화도에 있는 정확도 감소 역방향 잠재적인 측정에 의존 합니다.

이 설정 사용 하 여, UCP1와 UCP3는 동일한 조건 하에서 생산으로의 이직 률을 측정 했다. 높은 산도 그라데이션 때문 획득된 속도 더 정확 하 고 작은 전극 잠재적인 변화에서 발생 하는 인공 물에 의해 교란 될 것 같습니다. 그것은 더 분석 하 고 유사한 조건 하에서 생산 하는 미토 콘 드 리아 멤브레인 전송기를 비교 하 여 사용할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 오스트리아 연구 기금 (E.E.P.에 P31559-B20)에 의해 지원 되었다. 저자는 생산에서 우수한 기술 지원에 대 한 사라 Bardakji 감사 하 고 재구성의 마우스 UCP1 및 UCP3 proteoliposomes에.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microloader tips Eppendorf 5242956.003 Microcapillary pipette tip
Ethanol 99% AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H AAAH-5020-07025-230317
Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. Kg 6781.3
DC supply Voltcraft V10/CPG 1940 -01
Agarose Standard Carl Roth GmbH + Co. Kg 3810.2
Patch Clamp Amplifier Heka
Sample tube Carl Roth GmbH + Co. Kg 5863.1
Na2SO4 Carl Roth GmbH + Co. Kg 8560.3
MES Carl Roth GmbH + Co. Kg 4256.2
TRIS Carl Roth GmbH + Co. Kg AE15.2
EGTA Carl Roth GmbH + Co. Kg 3054.1
Hexane Sigma-Aldrich 296090-100ML
Hexadecane Sigma-Aldrich 296317-100ML
Heating wire Voltcraft USPS-2250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19, (3), 249-255 (1987).
  3. Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278, (35), 32497-32500 (2003).
  4. Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21, (4), 1137-1144 (2007).
  5. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159, (1), 108-115 (2007).
  6. Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46, (1), 11-16 (1993).
  7. Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (5-6), 474-479 (2006).
  8. Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860, (3), 664-672 (2018).
  9. Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98, (8), 1503-1511 (2010).
  10. Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857, (1), 72-78 (2016).
  11. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, (5), 1404-1414 (1994).
  12. Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42, (8), 631-646 (2013).
  13. Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47, (4), 269-272 (2011).
재조합 막 단백질의 양성자 회전 속도 분석 하기 위한 마이크로-agar 소금 다리 전극
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Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).More

Kreiter, J., Pohl, E. E. A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (143), e58552, doi:10.3791/58552 (2019).

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