Summary
蓄積 N2o. アセチレン阻害法とマイクロ センサー測定を用いた堆積土砂脱窒率を推定しています。プロトコルは、アセチレン阻害を実行する、センサーのキャリブレーションを行うコアを収集するための手順を説明します N2O 蓄積を測定および脱窒速度を計算します。
Abstract
脱窒は、生物圏からの反応性窒素除去主の生物地球化学的プロセスです。このプロセスの定量的評価と人為的変更地球窒素循環と (すなわちN2O) の温室効果ガスの排出量を評価するために特に関連なっています。脱窒を測定するいくつかの方法がありますが、それらのどれも完全に満足。既存手法と問題十分な感度で、基板レベルを変更するプロセスを使用しての物理構成を変える必要性妨害のサンプルがあります。この作品は、コアリング組み合わせた土砂脱窒率、アセチレン阻害、および蓄積された N2o. のマイクロ センサー測定を推定する方法をについて説明しますこの方法の主な利点は、堆積構造の低擾乱と N2O の蓄積の連続レコードのコレクションこれらは、最低値は 0.4 1 最大信頼性の高い脱硝率の推定値を有効にする µmol N2O m-2 h-1。重要な要因を操る能力は、実験的洞察力を取得するための追加の利点をあります。プロトコルは、アセチレン阻害を実行する、センサーのキャリブレーションを行うコアを収集するための手順を説明します N2O 蓄積を測定および脱窒速度を計算します。メソッド取得の堆積物コアを持つ任意の水生システムの脱窒速度の推定に適しています。N2O 濃度センサーの検出限界を超える場合は、脱窒の代わりに N2O の放出を推定するアセチレン阻害ステップを省略できます。プロセスの温度依存性と同様、硝酸の可用性を高めることによって両方の実際および潜在的な脱窒率を推定する方法を示します。山湖の堆積物を使用して手順を説明し、利点と他の方法と比較して技術の短所を話し合います。このメソッドは、特定の目的のため変更できます。例えば、硝化と脱窒またはフィールドの in situ測定脱窒率を評価するために15N トレーサーと結合できます。
Introduction
窒素循環の人為的な変化は、地球システムの1の最も困難な問題の一つです。人間の活動は、バイオスフィア2に利用可能な窒素酸化物のレベルを少なくとも倍増しています。ただし、グローバルの N サイクルの評価方法に関する大きな不確実性が残っています。誤差 ± 20%、以下いくつかフラックス推定を定量化しているされて、多くは ± 50% と大きく3の不確実性。これらの不確実性は、生態系変動メカニズムの理解、脱窒速度の正確な推定のための必要性を示します。脱窒は、窒素酸化物、硝酸、亜硝酸、主が減り、窒素ガス、N2O および N24に微生物の活動です。経路は、除去5の主なプロセスだから反応性窒素の生物圏の可用性に関連性の高いです。N2O は、温室効果ガスの地球温暖化の潜在性のほぼ 300 回 co2 100 年、それは大量放出6,7をされているため成層圏オゾン層破壊の現在の主な原因。
以下では、堆積物の脱窒率実験コアと N2O マイクロ センサーを使用して (図 1) を推定するためのプロトコルを提案します。脱窒速度の推定には、アセチレン阻害法8,9と (図 2および図 3) に定義された期間中に N2O の蓄積の測定を使用しています。山湖堆積物にそれを適用することによってメソッドを示します。このケース スタディは、堆積物の物理的な構造の攪乱を最小限で比較的低料金の自動検出法の性能を強調表示します。
脱窒は10を測定する特に困難です。いくつかの代替的なアプローチと方法は、それぞれ長所と短所があります。利用可能な方法の欠点、高価なリソース、十分な感度と基板レベルを変更したり、妨げられたサンプル10を使用してプロセスの物理的な構成を変更する必要があります。N2を測定するさらにもっと基本的な課題は、環境10上昇背景レベルです。N2N2 O の削減は、アセチレン (C2H2)8,9によって阻害されます。したがって、脱窒は環境 N2O レベルが低いため可能な蓄積された N2O C2H2の存在下での測定によって定量化することができます。
C2H2堆積物における脱窒率を測定するための使用が開発された約 40 年前11、および N2O センサー定款発生した約 10 年後12。最も広く適用されるアセチレン ベースのアプローチは、「静的コア」です。蓄積された N2O は、C2H2が封印された堆積物コア10のヘッド スペースに追加された後、24 h までの潜伏期間中に測定されます。ここで説明する方法いくつかの技術革新とこの手順に従います。我々 はいくつかの分のコアの水の段階でガスをバブリングによって C2H2を追加、我々 は N2O マイクロ センサーとの蓄積を測定する前にサンプル水とすべてのヘッド スペースを埋めます。我々 は、堆積物を再することがなく水の成層を防止する攪拌システムがあります。プロシージャを定量化堆積物表面積あたりの脱窒速度 (例えばµmol N2O m-2 h-1)。
脱窒の高時空の変化は、その正確な数量10で別の難易度を示します。通常、N2O の蓄積は、孵化中に収集されるサンプルをヘッド スペース ガスクロマトグラフィーによって順番に測定されます。説明した方法は、マイクロ センサーは、連続的な信号を提供するため、N2O 蓄積の変化の監視機能の向上を提供します。マイクロ センサー マルチメータは、インターフェイスをセンサーとコンピューター (図 1、) デジタル マイクロ アンプ (picoammeter) です。マルチメータは、同時に使用するいくつかの N2O マイクロ センサーをことができます。例えば、4 つの底まで同じ研究サイトからコアが同時測定可能空間の可変性をアカウントに。
中核的なアプローチは、堆積構造のいくつかの他の方法 (例えばスラリー) と比べてほとんど妨げます。堆積物の整合性が変更された場合、これはあくまで相対的な比較に適切な非現実的な脱窒率13につながります。後者基板拡散15によって脱窒の制限が保持されますので、率が高い、常にコア メソッド14に比べてスラリー法が得られます。スラリー対策は、その場で料金16; の代表を考慮することはできません。彼らは正確に同じ手順で作られて比較のための相対的な時間を提供します。
記載されているメソッドは芯が土砂タイプで脱窒率を推定するためです。特に、いくつかの運転の要因の実験的操作の実行方法をお勧めします。例としては、硝酸可用性とエネルギーの活性化 (E、) 脱窒17 (図 2) を推定するため必要に応じて温度を変更する実験です。
図 1: 実験のセットアップ。コアと N2O マイクロ センサーを使用して土砂脱窒率を推定する (、) 一般的な実験のセットアップ。培養室は、闇と制御温度 (± 0.3 ° C) の条件を確保します。5 そのまま堆積物コアは、同時に彼らのそれぞれの N2O センサーを使用して処理できます。(b) N2O センサー校正室。ゴム栓と N2O の水を混ぜて注射器適応我々 (プロトコル手順 3.4.3 参照)。水の温度を制御する温度計があります。(c) センサーと底質コア試料のクローズ アップは、PVC カバーと粘着テープで密閉接合部の中央の穴に挿入。水のかくはんがぶら下がっていると電磁石が、それに近い、アクリル管の外部の部分に固定します。(d) N2O マイクロ センサーのクローズ アップのヒント金属片によって保護されて。(e) 堆積物コア回収されてちょうど。それは、深い湖でボートから採取コアでは、アクリルのパイプはメッセンジャー適応重力ピストンコアラー19にまだ固定されます。このメソッドを実行するために必要なすべての項目のための材料表を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 準備
注: 測定は前日にこれを開始します。
- 測定セットアップを組み立てる (図 1、材料の表を参照してください)。
注意: 定数と高品質の電力供給のため、経由でグリップに接続は測定デバイス バックアップとして機能することができますも無停電電源装置 (UPS) です。長時間の停電の場合、車のバッテリーは、余分な電源として機能します。 - センサーのソフトウェアを起動して適用-0.8 V N2O マイクロ センサーを分極する電圧。信号は急速な降下およびそれに続く上昇を示し、それが最終的には低く、安定まで減少します。
注: マイクロ センサー製造元が推奨する偏波、少なくとも一晩 (またはそれ以上) センサーの信号の安定性を確保します。別の勧告は偏光測定が複数計画されて場合センサーを保つためにまたは日連続18。 - インキュベーション室と実験条件を調整する(例えば、選択したライトをオフ、フィールドで期待に類似する設定温度) に切り替えます。チャンバー内脱イオン水を容器に置き、水は測定温度センサーの校正に後で利用できます。
注: この手順のコアを収集するために出発前に計画の測定の同じ日を行うことができます。標準的な測定は、暗い条件を使用することをお勧めします。 - パックのフィールドのコア資料: ピストンコアラー デバイス、サンプリング チューブ、ゴム栓、ポリ塩化ビニル (PVC) タップ、ドライバー、グローバル ポジショニング システム (GPS) 装置、温度計、携帯魚群探知機、歩く人、および膨脹可能なボート (テーブルを参照してくださいの材料)。チェックリストを使用すると、すべての材料が含まれていることを確認します。
2. 堆積物コアのコレクション
- 水の深さに応じて 2.1.1 または 2.1.2 に従ってください。
-
深い水域の
- ボートやプラットフォーム (図 1e) からメッセンジャー適応重力ピストンコアラー19を使用します。
- サンプリング チューブを修正 (アクリル、ø 6.35 cm、長さ ≥ 50 cm) ドライバーで芯抜き器に。
- 調査目的に応じてサンプリング ポイントを選択します。(例えば、GPS 座標を使用して) の位置の測定深さ (例えば、携帯魚群探知機を使用して) 注意してください。ボートからサンプリング、コア コレクション中に漂流を避けるために (例えば、石袋) アンカーを使用します。
- サンプリング チューブが堆積物から 〜 1 m まで掘削システムを展開します。サンプリング装置の深さ位置を制御する (例えば、1 m 間隔) 正規のマークでロープを使用します。
- 60 のサンプリング装置を安定させる s (例えばボートの動きを最小限に抑える)。これは、正しい土砂侵入とやっとのことで妨げられた堆積物コアの回復が保証されます。
- サンプリング チューブ貫通堆積物解放、~ 1 m をさらにロープに。サンプリング チューブはあまり浸透し場合、は、水/土砂インターフェイスを乱すことがそれに注意します。
- 芯抜き器が固定されたまま、ロープの張力を維持しようとしながら、垂直にメッセンジャーをリリースします。メッセンジャー、芯抜き器に影響を与えるとき、は、ロープの張力の小さな違いを感じることができます。その時、芯抜き器堆積物コアの回復のための真空を生成するを閉じます。
- 常に、ゆっくりロープを引いて、芯抜き器を回復します。
- 一度コアが表面に近いが、まだ完全に水没 (真空により芯抜き器のゴム部分を含む) は、試料採取管の下部にゴム栓を配置します。水/土砂インタ フェースを検査します。それはクリアされ、目に見えていない (図 1e) を邪魔しました。場合はない場合は、コアを破棄、チューブを洗浄、手順 2.1.1.4-9 を繰り返します。
- 水からコアリング システム全体を高揚させます。芯抜き器からサンプリング チューブを解放し、PVC カバーを上に配置します。それを粘着テープで封印します。空気空間の形成を避けるため。
-
沿岸生息地や浅い水域の
- 非常に浅い海域でサンプリングの歩く人の服装 (< 0.6 m)。
- 深いサンプリングのシュノーケ リングやスキューバ ダイビングのギアを使用 (最大 3 m)。
- 調査目的に応じてサンプリング ポイントを選択します。(例えば、GPS 座標) の位置の注意してください。手動で、試料採取管を挿入 (例えば、アクリル、ø 6.35 cm) 堆積物に。
- 真空を得るにサンプリング チューブの上面にゴム栓を配置します。
- 堆積物からコアを外し、チューブ下部に別のゴム栓を迅速に紹介します。
注: すべての回でチューブを水中で動作する必要があります。非常に浅いサイトで短縮 20 cm ダウン チューブをお勧めします。時々 底に高水内容があり排水土砂ベッドからチューブが削除されます。この場合、底外側のコアを高揚することがなく下部ストッパーを導入する必要があります。これを行うには、手動で管の周りの土砂でストッパーに没頭し、チューブの底を閉じるに慎重にそれを配置します。 - 水の代わりに PVC カバー付きトップサイド ゴム栓と粘着テープとの接合部のシールします。
-
深い水域の
- 回転を最小限に抑え、揺れによって研究所へ転送される間にコアを保護します。
3. 亜酸化窒素 (N2O) マイクロ センサーのキャリブレーション
- センサーの信号が安定しており、ことを確認コンピューター (ストリップ ・ チャート、センサー ・ ソフトウェア) を使用して (< 20 mV)。
- 校正値とセンサーの信号を記録する (例えば日付とサンプリング サイト (130903_Redon_Lake) で) 新しいファイルを作成します。
注: センサーの信号 (図 4) の温度に敏感です。測定とセンサーのキャリブレーションのための同じ温度を使用します。センサーは 0%-2.5% N2O20線形応答します。したがって、2 点校正は十分な18です。 - キャリブレーション値ゼロの笑気と、センサー先端部を維持するセンサー信号水没 N2O 無料水 (純水) を読みます。
- 望ましい集中で N2O の水とを調整します。
注: 定義された N2O 濃度を潜伏中に予想される最大の濃度を多少上回ると水を準備します。私たちは、校正値として 〜 25 μ M N2O を使用します。500 N2O μ m 最大センサー範囲濃度を超えない注意します。- 取得 N2O 飽和水バブル N2O に脱イオン水に数分間。
注: N2O の水容解性によって異なります水温・塩分21;センサー マニュアル18付録の表を参照してください。 - N2O の飽和量を脱イオン水のボリュームに追加することによって N2O の飽和水を希釈します。たとえば、20 ° C で 28.7 mM N2O は、375 mL の水、22.9 μ M N2O 濃度の合計の濃度がある飽和 N2O 水の 0.3 mL を追加します。メモその 375 mL は、校正室 (図 1b) の総ボリュームです。
- 優しく N2O を混合した後希望の濃度に希釈するキャリブレーション容器内の脱イオン水で飽和水は一定だとセンサー信号を読みます。これを読んで、 X µM N2O の水と校正値です。溶液の混合しているとき、は、N2O 校正ソリューションからなくなるように、泡を生成しないように注意します。
注: N2O の水は、空気の中にエスケープゆっくりことを注意したがって、準備された校正ソリューションは、数分間だけ使用できます。
- 取得 N2O 飽和水バブル N2O に脱イオン水に数分間。
4. コア ・準備、アセチレン阻害
- ポリ塩化ビニール カバーの変更をぶら下げマグネチックスターラーと中心の穴に別のカバーによって各堆積物コアの上部にあります。再粘着テープとの接合部をシールします。
- 12 cm のおおよその高さに各サンプルの水相を減らす (ボリューム ≈ 380 mL)。このため、まず、中央の穴にシリコン チューブを挿入します。円柱の堆積物コアを配置し、圧力を作成するボトムのボタンをプッシュします。ストッパーおよび堆積物のサンプルが上がるし、余分な水をチューブ内を通過します。受け側容器の中の水を収集します。
注: この手順中に粒度の粗いとサンプルが問題があります。ストッパーとチューブの間に堆積物の粒子はストッパーを変形し、空気泡は渡して、サンプルを邪魔できます穴を開くできます。この問題を避けるためには、下部ストッパー部にシリンダーを置くし、一定の力でプッシュしてみてください。余分な水を避難させるためのシリコン チューブのジョイントと PVC カバー シリコン チューブに挿入されます (例えば、その狭い終わりのない 5 mL ピペット チップ) 固体部分で構成されています。 - 約 10 分のコアの水相のアセチレン ガスをバブリングによってアセチレン阻害を実行します。再堆積物は避けてください。
メモ: メソッドの可能な変更は、追加基板 (硝酸) 高濃度液体培地を介してバブル前に潜在的な脱窒測定 (例えば図 3b、cのように) アセチレン。
5. 脱窒素 (N2O 蓄積測定)
- 前の残り水でサンプルのすべての空気スペースを埋めます。トップサイド PVC カバーの中央の穴を堆積物にセンサーを配置します。攪拌機 (図 1c) 上記水段階でセンサーの先端にあります。
注: アクリル試料採取管のすべての関節を測定 (図 1、c) の中にガスと水漏れを避けるために密封されなければなりません。管の下の部分のゴム栓はこれに対して十分です。トップサイド部分をシールすることは難しくなります。PVC カバーを調整する必要があります。トーチで加熱する必要がありますその後、素材に柔軟な焦げがない場合は、カバーはその形状を成形することができますので、チューブに配置されます。冷却した後、カバー (を除いて 2.1.1.10 または 2.1.2.6 手順で研究室にサンプルを輸送するために使用カバー) の変更が必要です。センサーが挿入されて中央の穴を掘削する必要があります。順番は癒着して接着剤カバーの内側に水 (図 1c) の釣り糸にハングアップする、攪拌、釣り糸でかくはんを保持できます。また、すべての関節 (PVC カバー チューブや PVC カバー センサー) は、粘着テープでシールされています。ポリ塩化ビニール カバーの中央の穴とセンサー (図 1c) 間の表面接触をシールするためにセンサーの直径を調整する伸縮性粘着テープを置きます。 - 攪拌システムの一部である電磁パルス回路に切り替えます。
注意: 攪拌システムの妨害 (再) なし水相の成層を防ぐ堆積物。攪拌システムは磁気攪拌の魅了/リリースする電磁石のオンオフのスイッチ回路で構成されています (詳細については材料の表を参照してください)。 - 粘着テープ (図 1c) を使ってその場で固定し、かくはんが連続的に移動するまで、アクリル管の外部の部分のまわりの電磁石を移動します。
- 一定の温度 (例えば、± 0.3 ° C の変化) を確保するため培養室を閉じます。
- センサー信号の記録を開始するレコード ボタン (センサー ソフトウェア) を押します。測定値は通常、5 分ごとに記録されます。
- 測定期間の終わりに停止ボタンを押します。
6. 最終的な測定手順
- 無料の N2O 水 (純水) ゼロの N2O の校正測定の信号を読む前に沈んでセンサーの先端で少なくとも 〜 10 分を待ちます。
- 最終的なセンサーのキャリブレーションを実行します。これは、センサーのキャリブレーションは、次のセクション 3 が、3.3 のステップに開始を繰り返します。
- (センサー ソフトウェア) ファイルを保存します。
7. 脱窒率の計算
- MV と μ N2O は、校正データにおけるセンサーの信号の記録を含んでいるセンサー ソフトウェアによって生成された集計出力ファイルで開始します。
- (例えば図 2は) N2O の蓄積傾向を可視化する時間とセンサーの信号をプロットします。
- 線形の蓄積サンプルと基板の制限 (例えば図 2のb) のための可能な最終的な彩度の初期の馴化期間を除く期間だけを使用します。時間 (h) をかけてセンサー信号 (μ M) の線形モデルを作成します。
注: 斜面は脱窒速度 (μ M N2O コア-1 h-1)、μ M N2O m-2でレート変換コア (πr2) の面積で分割されている場合 h-1で乗算されるときと、水量 (πr2h、 hは水層の高さ、 rはアクリル チューブの内側の半径この場合 0.12 m、0.03175 m、それぞれ) µmol N2O m-2でレートに変換h-1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
468 脱窒率の合計は、期間 2013-2014 ピレネー山脈山湖堆積物中の上記プロトコルを使用して推定しました。(図 2および図 3) 手順を説明するためにこれらの結果のいくつかを紹介します。一般に、N2O 濃度と時間の線形モデルは良い相関 (R2 ≥ 0.9) を持っています。斜面関係の脱窒速度 (ステップ 7.3 の見積もりを提供します。例えば図 2のd)。脱窒活性が非常に低い場合、センサーの電子ノイズがより重要になるし、の適合度が低下 (例えばセンサー図 2 b 、図 3 aの 4 と 5)。N2O のベースライン検出限界は ~0.1 μ M 水22、中間体である代替方法23ノイズをフィルター処理する観測の蓄積の何千もの可能性に関する値1 ~ µmol N2O m-2までの比較的低い脱窒率で推定を許可 h-1 (図 2と図3)。低金利 (すなわち、 ~0.4 µmol N2O の m-2 h-1) 8 cm の高さにコア試料の水相を狭くすることによって推定することができます (プロトコル手順 4.2 参照)。
図 2: 温度依存性の実験では脱窒率計算します。(Aとb) の実績および潜在的な脱窒の測定 (c-f) が表示されます。測定温度が低下 (c)、最初のサンプルの冷却と温度依存は、センサーの信号は低下します。実際脱窒の測定で培養開始時 (、) A の同様のイベントが発生します暖かい所環境においては培養条件は、センサー信号の減少が伴うサンプルの冷却を生成します。(e) 温度の増加、最初サンプルを暖めるし、センサー信号は線形ではなく指数関数的に増加します。サンプルが一定の温度に達したら、センサー信号がいつものように線形増加します。すべてのケースで単線形 N2O 蓄積 (b d、および f) の期間を使用して脱窒率を計算することが可能です。(b) 非アクティブ サンプル 3 は表示されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 脱窒の例率計算します。実績 (、) および潜在的な (bとc) 脱窒率を推定しました。線形 N2O 累積時間範囲を使用されるのみ脱窒速度 (線形モデルの斜面) を計算します。ただし、(、) の教育目的のためより少ない成功とすべての測定 (モデル) を表示我々 はセンサーとサンプル 2 N2O 蓄積の飽和のための高い不安定なため 3 サンプルを破棄します。4 および 5 (、) のサンプル率の 0.5 と 0.7 µmol N2O m-2 h-1、それぞれが測定法の検出限界に近い場合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この方法の主な利点は、妨げた最小限堆積物コア試料の使用と N2O 蓄積の連続記録です。これらはそれらに発生する上皮内に似ています可能性が比較的低い脱窒率の推定ができます。それにもかかわらず、コアリング、センサーの性能、および潜在的な改善に関するいくつかの側面を説明します。
メソッドのどうやら単純だが重要なステップが良いコア回復です。土砂/水インターフェイスは 3 つの条件を満たす必要があります: (i) (ii)、水分や空隙率には変化と (iii) 構造摂動により24、その化学物質や成分の組成に変更。間に全体のプロトコルより現実的な条件はその場に近いサンプルで苦しんだ少数の妨害測定脱窒速度であります。堆積物コア コレクション25、いくつかデバイス/技術があるし、水の深さに依存する彼らの選択。重力のメッセンジャー適応芯抜き器19深いサンプル (図 1e) 適度に軽量デバイス (≥10 cm のコア堆積物は十分以上を網羅する短いコア25回復できますので好気と脱窒層堆積物26,27,28)。専門用語をコアリングで「感じる」多くの場合と呼ばれます (かどうかは、まだ水の列または既に堆積物中)、芯抜き器の位置を知る能力と開いているかどうかだか25を閉じています。中間の水の深さ (5-50 m) の通常がない困難感です。深い水の中に喪失感が発生します (> 50 の m) 水の列の動きは、芯抜き器25の場所をマスク可能性がありますので。浅い水の中、感覚を失っても可能性があります (< 3 m) 横漂流と波アクション25;だからこそ、浅瀬、スキューバ ダイビングでコアリングやドレッシング、歩く人の直接手動で異なるメソッドを使用してます。このシステムは、サンプリングを実行するユーザーことができます堆積物を参照してくださいし、コアリング; する前に正確な場所を選択これにより、例えば、植物を含む堆積物コアのサンプリングです。サンプリング後、研究者はバブリングによってアセチレン阻害を実行するときに特にプロトコルの残りの間に底質コア試料を最低限邪魔する慎重に作業を続ける必要があります。
N2O マイクロ センサーを使用する場合は、いくつかの詳細を考慮されなければなりません。センサーのソフトウェアは、センサー信号 (背景周波数 1000 Hz)29の連続可視化 (ストリップ ・ チャート) を提供します。これらの生データと (例えば図 2は)、ストリップ ・ チャートを保存できます。(例えば手順 4 の前にフィールド コレクションから返すとき) その分極後センサーの正しい動作を確認する必要があります。特に、低 (< 20 mV) N2O 無料水に浸漬には定数ベース信号が必要と。その使用を開始した後まもなく (~ 2 h) センサーを再調整します。それは、いくつかの日に既に使用されています、間隔が (~ 24 h)18拡張できます。Recalibrations を最小限に抑えるため、センサーを保つためにいくつかの日18の実行されていない限り、円偏波。時間をかけて、センサー信号の変化が発生するで 50% までヶ月、その膜の18の異なる透磁率のためであります。研究室より多くの定数が低いほどの電子波干渉と安定したセンサー信号になります。その意味で、UPS を使用して電源の電圧変動をフィルタ リングによって測定装置に達すると電気エネルギーの品質が向上します。ロガー] タブで選択したサンプリング間隔のバック グラウンドの頻度も違います。各登録のポイントは、多くの測定値の平均から生成されます。サンプリング間隔 (最大 10 秒) データ ポイントを記録する頻度を示します。なかに使用する時間の単位測定の数は、バック グラウンド周波数29によって定義されます。たとえば、5 のサンプリング周波数を設定した場合 s と、1 秒あたり 500 測定データ ポイントの背景頻度記録すべての 5 s と平均毎秒 500 サンプルの前の 5 時に測定 s。我々 はセンサー信号 (サンプリング間隔) 5 分ごとの記録、バック グラウンドの頻度を 1 秒あたり 1000 回の計測に設定します。研究システムは、「平均」予想される変動せず正しいサンプリング間隔を選択する知られている必要があります。非常にアクティブなシステムでは、間隔を長くできるコンピューターのメモリの29の最適化中に短いサンプリング間隔を推奨します。いくつかの可能な干渉物質 (H2S、NO、CO2) は22N2O センサーの信号に影響を与えます。脱イオン水でセンサーを校正、サンプルが妨害物質を含むおよびセンサーの基準信号を変更できます。このような状況は、なぜ否定的な値は、それぞれにサンプル 2 および図 2 b 図 3 a5 で表示されますを説明できます。しかし、目的が脱窒率を推定すると、正確なレベル N2O のパラメーターはないキー。キーとは (N2O の線形蓄積を証する) 線形モデルの斜面です。最後に、温度 (図 4) N2O センサーの応答が変化するので、一定の温度で動作する必要があります。
簡単な修正やプロトコルに追加 (i) 特性測定脱窒率を制御する環境条件の運転への応答をシミュレートすることによって潜在的な脱窒速度の推定 (ii) 有効にするもいくつかの相補的な測定を行うことができます (例えば、硝酸態窒素)、グラデーション、研究目的に応じて C2H2阻害活性をスキップして土砂 N2O の放出率推定 (iii): (i) だけ回復した後、コア、その場の条件、例えば温度;(ii) [3-];例えば、水の相のサンプル測定前(iii) p. t. シュヴィングらで押し出し、異なる解像度 (mm cm)25、30、手順に従ってコアのスライスは、測定後説明30。
潜在的な脱窒率を測定するには、c. Palacin-Lizarbe、l. Camarero、j. カタロニア語17に記載 (例えば図 2および図3) コアの水相に硝酸を追加します。そう、C2H2阻害活性 (ステップ 4.3) 前に硝酸を追加します。また、硝酸態窒素を追加すると、それはまた炭素 (C; を追加することをお勧めは例えば酢酸) やリン (P)その場でC、N、P (例えば、表層堆積物) の化学量論組成比率を維持します。これはこれら要素31,32によって脱窒の制限を防止、また硝酸消費プロセス (すなわち、脱の優位性に影響を与えることができる C/N 比を維持対アンモニウム (DNRA) に異化の硝酸還元)4。無酸素は酸素脱窒の干渉を防ぐために、硝酸添加後数分間 N2-CO2混合物をバブリングによって固定することができます。ただし、これは硝化の閉塞につながることに注意してください。土砂 N2O の放出率を計算するには、C2H2阻害活性 (ステップ 4.3) を省略します。しかし、覚えておいて、限りでは、現在、それは水生生態系で知られている、N2O 排出量比例して低 N2排出量 (0%-4.3%)33に比べると下蓄積 N2O が可能です。検出限界。この場合、オプションは、放出される N2O、N2O の潜在的な排出量の計算を増加する硝酸を追加します。
メソッドの主な弱点は、C2H210,34硝化作用の抑制です。、インキュベーション中に硝化抑制作用と不完全な N2O 低減阻害が明らかになる、両方とも非常に時間に依存しました。たとえば、開始 N2O の蓄積率必要があります本当の脱窒速度を明らかにし、硝酸の可用性が減少して N2O を削減35だ硝酸フリーゾーンに拡散を徐々 に崩壊します。したがって、推定脱窒速度測定値 N2O10の線形の蓄積を示す場合にのみ有効考慮することができます。
記載されている推定堆積物全体の活動を統合した面積当たりの脱窒速度。この点で、サンプルの液相中のガスをバブリングするときアセチレン阻害の行動半径についてのいくつかの不確実性があります。それは、少なくとも、堆積物の表層地盤の阻害の発生を最も高い脱窒率26,27と一つであると見なされます。
このメソッドの可能な改善は15N トレーサーと脱窒の場測定できる変更を組み合わせて使用します。15N トレーサー法を使用して硝化-脱窒サンプル36, で発生する結合の割合を判断できます、脱窒以外他の N フラックスのプロセスも説明できます (例えばanammox と異化硝酸アンモニウム (DNRA) に還元)13,37。ただし、これらのメソッドは、基質濃度10の変更の欠点を持っています。A. ベーレント、D. ・ デ ・ ビール、P. Stief 26異化硝酸還元の垂直活動分布を分析するのに N2O マイクロ センサー、C2H2阻害と15N トレーサー法を使用します。プロセス (脱窒と DNRA) 堆積物中の彼らはセンサーと堆積物を貫通して堆積物中の鉛直分布をしました。脱窒の in situ測定の主な難しさは、定数ではない温度環境を処理する能力です。N2O の蓄積と温度を同時に記録し、脱窒速度計算時に温度依存性によって N2O センサーの信号を修正する必要は。この修正には、センサーごとに N2O シグナルの温度依存性の以前の分析が必要です。センサーは、手作りと各 1 つは異なる温度に応答する (例えばセンサー 1図 2c, eで他よりも高い温度依存性を示しています)。
図 4: N2O マイクロ センサー応答の温度依存性です。センサー信号と線形モデルの異なる斜面各 N2O 濃度で温度センサーの信号における温度の影響を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
スペイン政府は、C.P L (FPU12-00644) と Ministerio デ エコノミア y Competitividad の研究助成金にまた、博士課程フェローシップとして Ministerio デ Educación を通じて資金を提供: NitroPir (CGL2010 19737)、ラクス (CGL2013 45348 P) 転送 (CGL2016-80124-C2-1-P)。REPLIM プロジェクト (INRE - INTERREG プログラム。EUUN - 欧州連合。EFA056/15) プロトコルの最終書き込みをサポートします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Messenger-adapted gravity corer | - | - | Reference in the manuscript. Made by Glew, J. |
| Sampling tube | - | - | Acrylic. Dimensions: 100 cm (h) × 6.35 cm (d) × 6.50 cm (D). Sharpen the edge of the sampling tube that penetrates into the sediment to minimize the disturbance in the recovered sediment core sample. |
| Handheld sounder | Plastimo | 38074 | Echotest II Depth Sounder. |
| Rubber stopper | VWR | DENE1012114 | With two holes, used to mix the N2O-water in the calibration chamber. Dimensions: 20 mm (h) × 14 mm (d) × 18 mm (D) (3 mm hole (D)). |
| Rubber stopper | VWR | 217-0125 | To seal the bottom part of the methacrylate tube and to sample in shallow water bodies. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). |
| Rubber stopper | VWR | 217-0126 | Place the rubber stopper in the top side of the sampling tube to obtain a vacuum for sampling in littoral zones and shallow water bodies. Dimensions: 50 mm (h) x 60 mm (d) x 70 mm (D). |
| PVC cover | - | - | To seal the top side part of the acrylic tube. Dimensions: 45 mm (h) × 56 mm (d) × 65 mm (D). Dimensions: 65 mm (D). |
| Adhesive tape | - | - | Waterproof. To ensure all joints (PVC cover sampling tube and PVC cover sensor) and to avoid water leaks. |
| Thermometer | - | - | Portable and waterproof, to measure the temperature in the water overlying the sediment just after sampling the cores. |
| GPS | - | - | To save the location of a new sampling site or to arrive at a previous site. |
| Wader | - | - | For littoral or shallow site samplings. |
| Boat | - | - | An inflatable boat is the best option for its lightness if the sampling site is not accessible by car. |
| Rope | - | - | Rope with marks showing its length (e.g., marked with a color code to distinguish each meter). |
| N2O gas bottle and pressure reducer | Abelló Linde | 32768-100 | Gas bottle reference. |
| C2H2 gas bottle and pressure reducer | Abelló Linde | 32468-100 | Gas bottle reference. |
| Tube used to evacuate the excess of water | - | - | Consists of a solid part (e.g., a 5 ml pipette tip without its narrowest end) inserted in a silicone tube. |
| Nitrous Oxide Minisensor w/ Cap | Unisense | N2O-R | We use 4 sensors at a time. |
| Microsensor multimeter 4 Ch. 4 pA channels | Unisense | Multimeter | Picoammeter logged to a laptop. The standard device allows for 2 sensor picoammeter connections (e.g., N2O sensor), one pH/mV and a thermometer. We ordered a device with four picoammeter connections, allowing the use of 4 N2O sensors simultaneously. |
| SensorTrace Basic 3.0 Windows software | Unisense | Sensor data acquisition software. | |
| Calibration Chamber incl. pump | Unisense | CAL300 | Calibration chamber. We tuned it with rubber stoppers and syringes to mix the N2O-water without making bubbles. |
| Incubation chamber | Ibercex | E-600-BV | Indispensable equipment for working at a constant temperature (±0.3 °C). It also allows control of the photoperiod. |
| Electric stirrer | - | - | Part of the stirring system. It hangs in the water, overlying the sediment subject, by a fishing line that is hooked to the PVC cover. |
| Electromagnet | - | - | Part of the stirring system. It is fixed to the outside of the acrylic tube, approximately at the same level as the stirrer. It is activated episodically (ca. 1 on-off per s) by a circuit, attracting the stirrer when it is on and releasing it when it is off, thereby generating the movement that agitates the water. |
| Electromagnetic pulse circuit | - | - | Part of the stirring system. It is connected by wires to the electromagnet and sends pulses of current that turn the electromagnet on and off. |
| Uninterruptible power supply (UPS) | - | - | It improves the quality of the electrical energy that reaches the measurement device, filtering the highs and low of the voltage, thereby ensuring a more constant and stable N2O sensor signal. |
References
- Rockstrom, J., et al. A safe operating space for humanity. Nature. 461 (7263), 472-475 (2009).
- Erisman, J. W., Galloway, J., Seitzinger, S., Bleeker, A., Butterbach-Bahl, K. Reactive nitrogen in the environment and its effect on climate change. Current Opinion in Environmental Sustainability. 3 (5), 281-290 (2011).
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Tiedje, J. M. Ch. 4. Ecology of denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Environmental Microbiology of Anaerobes. Vol. 717. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
- Seitzinger, S., et al. Denitrification across landscapes and waterscapes: A synthesis. Ecological Applications. 16 (6), 2064-2090 (2006).
- Contribution of Working Group I to the fifth assessment report of the intergovernmental panel on climate change. IPCC. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. , Cambridge University Press. (2013).
- Ravishankara, A. R., Daniel, J. S., Portmann, R. W. Nitrous Oxide (N2O): The Dominant Ozone-Depleting Substance Emitted in the 21st Century. Science. 326 (5949), 123-125 (2009).
- Balderston, W. L., Sherr, B., Payne, W. Blockage by acetylene of nitrous oxide reduction in Pseudomonas perfectomarinus. Applied and Environmental Microbiology. 31 (4), 504-508 (1976).
- Yoshinari, T., Knowles, R. Acetylene inhibition of nitrous-oxide reduction by denitrifying bacteria. Biochemical and Biophysical Research Communications. 69 (3), 705-710 (1976).
- Groffman, P. M., et al. Methods for measuring denitrification: Diverse approaches to a difficult problem. Ecological Applications. 16 (6), 2091-2122 (2006).
- Sorensen, J. Denitrification rates in a marine sediment as measured by the acetylene inhibition technique. Applied and Environmental Microbiology. 36 (1), 139-143 (1978).
- Revsbech, N. P., Nielsen, L. P., Christensen, P. B., Sorensen, J. Combined oxygen and nitrous-oxide microsensor for denitrification studies. Applied and Environmental Microbiology. 54 (9), 2245-2249 (1988).
- Jorgensen, K. S. Annual pattern of denitrification and nitrate ammonification in estuarine sediment. Applied and Environmental Microbiology. 55 (7), 1841-1847 (1989).
- Laverman, A. M., Van Cappellen, P., van Rotterdam-Los, D., Pallud, C., Abell, J. Potential rates and pathways of microbial nitrate reduction in coastal sediments. FEMS Microbiology Ecology. 58 (2), 179-192 (2006).
- Ambus, P. Control of denitrification enzyme-activity in a streamside soil. FEMS Microbiology Ecology. 102 (3-4), 225-234 (1993).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21 (1), 73-84 (2000).
- Palacin-Lizarbe, C., Camarero, L., Catalan, J. Denitrification Temperature Dependence in Remote, Cold, and N-Poor Lake Sediments. Water Resources Research. 54 (2), 1161-1173 (2018).
- Nitrous Oxide sensor user manual. , UNISENSE A/S. (2011).
- Glew, J. Miniature gravity corer for recovering short sediment cores. Journal of Paleolimnology. 5 (3), 285-287 (1991).
- Andersen, K., Kjaer, T., Revsbech, N. P. An oxygen insensitive microsensor for nitrous oxide. Sensors and Actuators B-Chemical. 81 (1), 42-48 (2001).
- Weiss, R. F., Price, B. A. Nitrous oxide solubility in water and seawater. Marine Chemistry. 8 (4), 347-359 (1980).
- Nitrous Oxide Microsensors Specifications. , UNISENSE A/S. (2018).
- Koike, I. Ch. 18. Measurement of sediment denitrification using 15-N tracer method. Denitrification in Soil and Sediment 10.1007/978-1-4757-9969-9 F.E.M.S. Symposium Series. Revsbech, N. P., Sørensen, J. , Springer US. 291-300 (1990).
- Hvorslev, M. J. Subsurface Exploration and Sampling of Soils for Civil Engineering Purposes. , American Society of Civil Engineers, Waterways Experiment Station, Corps of Engineers, U.S. Army. 521 (1949).
- Glew, J. R., Smol, J. P., Last, W. M. Ch. 5. Sediment Core Collection and Extrusion. Tracking Environmental Change Using Lake Sediments: Basin Analysis, Coring, and Chronological Techniques. Last, W. M., Smol, J. P. 1, Springer. Netherlands. 73-105 (2001).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Laverman, A. M., Meile, C., Van Cappellen, P., Wieringa, E. B. A. Vertical distribution of denitrification in an estuarine sediment: Integrating sediment flowthrough reactor experiments and microprofiling via reactive transport modeling. Applied and Environmental Microbiology. 73 (1), 40-47 (2007).
- Melton, E. D., Stief, P., Behrens, S., Kappler, A., Schmidt, C. High spatial resolution of distribution and interconnections between Fe- and N-redox processes in profundal lake sediments. Environmental Microbiology. 16 (10), 3287-3303 (2014).
- SensorTrace BASIC 3.0 user manual. , UNISENSE A/S. (2010).
- Schwing, P. T., et al. Sediment Core Extrusion Method at Millimeter Resolution Using a Calibrated, Threaded-rod. Journal of visualized experiments. (114), 54363 (2016).
- Bernhardt, E. S. Ecology. Cleaner lakes are dirtier lakes. Science. 342 (6155), 205-206 (2013).
- Finlay, J. C., Small, G. E., Sterner, R. W. Human influences on nitrogen removal in lakes. Science. 342 (6155), 247-250 (2013).
- Seitzinger, S. P. Denitrification in fresh-water and coastal marine ecosystems- ecological and geochemical significance. Limnology and Oceanography. 33 (4), 702-724 (1988).
- Seitzinger, S. P., Nielsen, L. P., Caffrey, J., Christensen, P. B. Denitrification measurements in aquatic sediments - a comparison of 3 methods. Biogeochemistry. 23 (3), 147-167 (1993).
- Christensen, P. B., Nielsen, L. P., Revsbech, N. P., Sorensen, J. Microzonation of denitrification activity in stream sediments as studied with a combined oxygen and nitrous-oxide microsensor. Applied and Environmental Microbiology. 55 (5), 1234-1241 (1989).
- Peter, N. L. Denitrification in sediment determined from nitrogen isotope pairing. FEMS Microbiology Ecology. 9 (4), 357-361 (1992).
- Risgaard-Petersen, N., Nielsen, L. P., Rysgaard, S., Dalsgaard, T., Meyer, R. L. Application of the isotope pairing technique in sediments where anammox and denitrification coexist. Limnology and Oceanography-Methods. 1, 63-73 (2003).
