Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Metode til kontrol koncentrationer af halogenerede gasser i kulturperler alveolær epitelceller

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Vi beskriver en let protokollen specielt designet til at nå præcist og kontrollerede koncentrationer af Sevofluran eller isofluran in vitro- for at forbedre vores forståelse af mekanismer involveret i epitelial lunge skade og teste roman behandlinger for akut respiratorisk distress syndrom.

Abstract

Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er et syndrom af diffuse alveolær skade med nedsat alveolær væske clearance og svær betændelse. Anvendelse af halogenerede stoffer, såsom Sevofluran eller isofluran, til sedation af intensiv afdeling (ICU) patienter kan forbedre udvekslingen af gas, mindske alveolær ødem og dæmpe betændelse under ARDS. Data om brugen af inhaleret agenter for kontinuerlig sedation i ICU at behandle eller forhindre lungeskader mangler dog. For at studere virkningerne af halogenerede agenter på alveolær epitelceller "fysiologisk" betingelser, vi beskriver en nem system til kultur celler på grænsefladen luft-væske og udsætte dem for halogenerede agenter til at give præcise kontrolleret "luft" brøker og "medium" koncentrationer for disse stoffer. Vi udviklede en forseglet lufttæt kammer hvor plader med menneskelige alveolær udødeliggjort epitelceller kunne blive udsat for en nøjagtig, kontrolleret brøkdel af Sevofluran eller isofluran ved hjælp af en kontinuerlig gasflow leveres af et bedøvelsesmiddel maskine kredsløb. Celler blev udsat for 4% af Sevofluran og 1% af isofluran i 24 timer. Gas massespektrometri blev udført for at bestemme koncentrationen af halogenerede stoffer opløses i mediet. Efter først var time, koncentrationen af Sevofluran og isofluran i mediet 251 mg/L og 25 mg/L, henholdsvis. De kurver, som repræsenterer koncentrationerne af både Sevofluran og isofluran opløst i medium viste lignende kurser over tid, med et plateau nås på en time efter eksponering.

Denne protokol var specielt designet til at nå præcist og kontrollerede koncentrationer af Sevofluran eller isofluran in vitro- at forbedre vores forståelse af mekanismer involveret i epitelial lunge skade i ARDS og til at teste nye behandlinger til den syndrom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er et klinisk syndrom karakteriseret ved diffus alveolær skade, lunge ødem og hypoxemic respirationssvigt. Selvom ARDS udgør mere end 10% af intensiv afdeling (ICU) indlæggelser og næsten 25% af ICU patienter med behov for mekanisk ventilation, er det stadig et under-anerkendte udfordring for klinikere, med et hospital dødelighed på 35-45%1. Trods intens forskning mislykkedes identifikation af en effektiv ARDS farmakologiske behandling eller forebyggelse til dato. To vigtige funktioner bidrage til dødelighed i ARDS: nedsat alveolær væske clearance (AFC) (dvs. den ændrede resorption af alveolær Ødem væske fra distale lunge luftrum) og alvorlig betændelse2. Da ARDS dødeligheden fortsat er høj, bør aktuelle initiativer også omfatte primær forebyggelse; dog er en central udfordring at identificere udsatte patienter i hvem ARDS er tilbøjelige til at udvikle, og som ville gavne hvis ARDS blev forhindret.

Flygtige halogenerede gasanæstetika, såsom Sevofluran og isofluran, er almindeligt anvendt til at yde generel anæstesi i operationsstuen. På verdensplan mere end 230 millioner patienter, som gennemgår større operationer hvert år kræver generel anæstesi og mekanisk ventilation3, og postoperative pulmonale komplikationer forringe kliniske resultater og healthcare udnyttelse4 . Brugen af Sevofluran i stedet for propofol var forbundet med forbedret lungebetændelse i patienter, der gennemgår thoraxkirurgi og betydelige fald i uønskede hændelser, såsom ARDS og postoperative pulmonale komplikationer5. Ligeledes havde forbehandling med isofluran beskyttende virkning på luftveje mekanik, iltning og Hæmodynamik i eksperimentel dyremodeller for ARDS6,7. Selv om yderligere undersøgelser er berettiget for at behandle virkning af inhalerede stoffer på resultater i noncardiac operation, et lignende fald i pulmonale komplikationer for nylig er blevet observeret i en meta-analyse, demonstrerer, at inhaleret bedøvelsesmiddel agenter — som i modsætning til intravenøs anæstesi — er signifikant forbundet med en reduktion i dødelighed for hjertekirurgi8.

Specifikke prospektive data om brugen af flygtige stoffer til sedation af ICU patienter til at forebygge eller behandle lungeskader mangler. Men flere forsøg nu støtte effekten og sikkerheden af inhaleret Sevofluran til sedation af ICU patienter, og prækliniske undersøgelser har vist, at inhaleret Sevofluran og isofluran7,9 forbedre udvekslingen af gas, mindske alveolær ødem, og dæmpe betændelse i eksperimentelle modeller af ARDS. Derudover afbøder Sevofluran type II epitelcelle skader10, hvorimod isofluran opretholder integriteten af den alveolære-kapillær barriere gennem graduering af stram vejkryds protein11. Dog yderligere undersøgelser er nødvendige for at kontrollere, hvorvidt den eksperimentelle bevismateriale af orgel beskyttelse fra inhalerede Sevofluran og isofluran kunne oversættes til mennesker. En første single-center randomiseret kontrolleret-forsøg (RCT) fra vores gruppe fandt, at tidlig brug af inhaleret Sevofluran hos patienter med ARDS var forbundet med bedre iltning, reducerede niveauer af nogle pro-inflammatoriske markører, og nedsat lunge epitelial skade, som vurderes af niveauer af opløselig form af receptoren for avanceret glykering slutprodukter (sRAGE) på plasma og alveolær væske12.

Taget sammen, kunne de gavnlige virkninger af Sevofluran og isofluran på lunge skade pege på flere biologiske veje eller funktionelle processer, der er afhængige af RASERI pathway, nemlig alveolær væske clearance (AFC), epithelial skade, translokation af nuklear factor (NF)-κB, og makrofag aktivering. Derudover kan Sevofluran påvirke udtryk for VREDE protein, selv. Da tidligere forskning af vores research team og andre understøtter centrale roller for RAGE i alveolær betændelse og lunge epitelial skade/reparation under ARDS, designet vi en eksperimentel model til at give en translationel forståelse af mekanismerne i Sevofluran i lunge skade og reparation13,14,15. In vitro- effekter af Sevofluran og isofluran blev undersøgt i en roman menneskelige alveolær primære epitelcelle linje specielt designet til at studere luft-blod barrieren af den perifere lunge, hAELVi (human alveolær epitelial LentiVirus udødeliggjort), med alveolær type-lignende egenskaber, herunder funktionelle stramme kryds16.

Samtidig med at forberede udformningen af vores in vitro- undersøgelser (fx kulturer alveolær epitelceller på grænsefladen air-liquid med eksponering for "inhalerede" Sevofluran eller isofluran, vi forstået fra tidligere offentliggjorte undersøgelser, brøkdele af Sevofluran er kun blevet vurderet i den "luft" interface17,18,19 bruger standard skærme (svarende til dem, der anvendes i kliniske omgivelser). Halogenerede agent koncentrationer blev normalt valgt efter minimum alveolær koncentration (MAC) værdier (f.eks. hos mennesker, for Sevofluran, 0,5, 1.1 og 2.2 vol %, der repræsenterer 0,25, 0,5 og 1 MAC, henholdsvis for isofluran, 0,6, 0,8, og 1.3 vol % repræsenterer 0,25, 0,5 og 1 MAC, henholdsvis)20. Faktisk, Sevofluran og isofluran koncentrationer er aldrig blevet undersøgt i substratet, hvilket begrænser gyldigheden af tidligere eksperimentelle modeller/instrumenter. Endvidere, de fleste forsøg anvendes en anaerob krukke, som blev forseglet efter luft blanding indeholdende Sevofluran havde været skyllet inde. Vores mål var at studere alveolær epitelceller "fysiologisk" betingelser, troede vi at sådan en anaerob stat kan ikke optimal og ville ikke være forenelig med lange eksperimentelle varigheder. Derfor, vi udviklet vores eget system til kultur celler på grænsefladen luft-væske og udsætte dem for halogenerede stoffer (Sevofluran og isofluran) med formålet at give præcise kontrolleret "luft" brøker og "medium" koncentrationer for disse stoffer. Efter vores mening er dette eksperimenterende trin, der ikke er blevet rapporteret til dato i litteraturen, obligatorisk forud for enhver yderligere in vitro- undersøgelser af Sevofluran og isofluran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. kultur af alveolær epitelceller (hAELVi)

  1. Optøning
    1. Der afpipetteres 4 mL af dyrkning klar-til-brug menneskelig alveolær epitel (huAEC) medium i en 15 mL plastik rør og hurtigt optø hætteglas i en forvarmet vandbad (37 ° C).
    2. Overføre den optøede cellesuspension til en 15 mL plastik rør indeholdende 4 mL af substratet inden centrifugering tube på 200 x g i 5 min.
    3. Opsug supernatanten og resuspenderes celle med 5 mL af dyrkning medium. Derefter, overføre cellerne til en T25 kolbe.
    4. Dyrke celler under standardbetingelser (5% CO2, 95% fugtet luft, 37 ° C)
  2. Opdele
    1. Kontrollere status for cellerne mikroskopisk. Når cellerne er 80-90% sammenflydende, Opdel celler, følgende trin 1.2.2 gennem 1.2.10.
    2. Opsug dyrkning medier af celler med en steril pipette.
    3. Cellerne vaskes en gang med 4 mL af Dulbeccos phosphat bufferet saltvand (DPBS) og Opsug DPBS.
    4. Der tilsættes 1 mL Trypsin/EDTA-oploesning (TE) til celler før inkubation ved 37 ° C i 3 min, indtil cellerne begynder at løsne sig; Check for udstationering under et mikroskop.
    5. Resuspend celler med 2 mL af substratet og centrifugeres celler på 200 x g i 5 min. Derefter Aspirér supernatanten og resuspenderes celle igen med 3 mL af dyrkning medium.
    6. Bruge trypan blå farvestof udstødelse assay for at fastlægge levedygtigheden af cellerne. Tage 30 µl af cellesuspension og tilføje 30 µl af en 0,4% opløsning af trypan blå i et rør. Efter dette, bland effektivt løsning 3 - 5 gange med 100 µl pipette. Tage 10 µl af opløsningen og læg det under coverslip af hemocytometer.
    7. Tæl antallet af levedygtige celler og antallet af døde celler (blå) i områderne af hemocytometer. Derefter beregne cellernes levedygtighed [%] ved hjælp af ligningen: cellernes levedygtighed = 100 – (100 / samlede antal celler x antallet af døde celler)
    8. Overføre alikvot med den resuspenderede celle pellet til en ny celle kultur T25 kolbe eller en 6 godt-plade. Tilføje dyrkning medium til cellerne til at opnå alt 5 mL af dyrkning medium i T25 kolben, eller 1 mL for hver brønd af 6 godt-plade.
    9. Dyrke celler i en inkubator under standardbetingelser (5% CO2, 95% fugtet luft, 37 ° C)
    10. Når cellerne er helt sammenflydende, er de klar til eksperimentet.

2. forberedelse af en lufttæt kammer

Bemærk: Byggeri planen for lufttæt salen er afbildet i figur 1.

  1. Bruge en hermetiske polypropylen boks med en kapacitet på 6,5 L. Længde, bredde og højde er 30 x 20 x 15,5 cm, henholdsvis. Bemærk venligst, at mængden af boksen er lavere end den teoretiske volumen på grund af de afrundede hjørner.
  2. Bor en 2,5 cm diameter hul på den nederste side af den laterale væg.
  3. Indsæt et bølgepap rør med en grøn mark, som vil tjene som gas-luft blanding input røret, og forsegle det med silicium.
  4. Bor et andet 2,5 cm diameter hul på oversiden af den modsatte laterale væg.
  5. Indsæt et andet bølgepap rør med et rødt mærke og forbinde det med en trækul filter, som vil tjene som gas-luft blanding output røret, og forsegle det med silicium.
  6. Bor en stram 4 mm diameter hul i midten af den gennemsnitlige væggen af kassen.
  7. Indsæt kort infusion slanger, der er forbundet ved en mangfoldighed med en roterende mandlige luer-lock, som vil blive sat i en gas analysator, og forsegle det med silicium.
  8. Placer et digital termometer/hygrometer inde i lufttæt kammeret.

3. Udsæt alveolær epitelceller til halogenerede stoffer (Sevofluran og isofluran)

Bemærk: En skematisk tegning af enheden er afbildet i figur 2.

Forsigtig: Selvom dyreforsøg har viste ingen tegn på føtal skade eller forringet forplantningsevne, og en meget lille undersøgelse i løbet af kejsersnit sektioner ikke udviste nogen uheldige virkninger på mor eller fosteret, sikkerhed ved hjælp af halogenerede agenter (f.eks. Sevofluran eller isofluran) under arbejdskraft og levering er ikke blevet påvist til dato. Desuden har ingen kontrollerede data blevet indsamlet under humane graviditeter. Derfor udfører eksperimenter med Sevofluran eller isofluran, mens gravide bør være stærkt frarådes.

  1. Arbejde under en laboratorium emhætte.
  2. Tilpasse et bedøvelsesmiddel maskine kredsløb for at skifte gas linjen af lattergas af kuldioxid (CO2).
  3. Sæt lufttæt salen med den grøn-mærket, bølgede rør i den tilpassede bedøvelsesmiddel maskine kredsløb. Indsæt en opvarmet luftfugter (som dem der bruges på ICU ventilatorer) ind i røret mellem bedøvelsesmiddel maskinen og lufttæt kammer at varme gas flow blandingen til ca. 37 ° C
  4. Installere lufttæt salen på en varmeplade, giver en varme plade ved 37° C.
  5. Sætte den 6 godt-plade, der indeholder hAELVI cellerne ind i en lufttæt kammer og forsegle låget.
  6. Regulere gas strømningshastigheder (dvs. blandingen af luft og CO2) du kan hurtigt få standardbetingelser, defineret som 5% af CO2 og 95% af befugtet luft.
  7. Åbn halogenerede agent fordamper, og vælg den ønskede procentdel (i den foreliggende undersøgelse testet koncentrationerne af Sevofluran og isofluran var 4% og 1%, henholdsvis).
  8. Bemærk sammensætningen af gas blandingen og Sevofluran eller isofluran koncentration som målt af en ekstern gas analysator og vises på skærmen.
  9. Når målværdierne er nået, reducere frisk af gasstrømmen til 1 L/min.
  10. Lufttæt salen kan opretholdes med denne gas flow så længe som nødvendigt til eksperimentet.

4. måle Sevofluran eller isofluran ved kromatografi

  1. Forberedelse af prøver
    1. På forskellige tidspunkter, meget kort åbne kammer til at tegne de undersøgte prøver (i den foreliggende undersøgelse, vi brugte en 6 godt-plade) og luk låget. Holde de andre prøver i boksen. Derefter Aspirér 1 mL af substratet indeholdt i hver enkelt prøve med en multi-volumen justerbar mikropipette.
    2. Læg mediet i 10 mL headspace kromatografi hætteglas, som bør være skruet hermetisk stramt med en Teflon-forseglet cap. Fryse kromatografi hætteglas ved-20 ° C, hvis du ikke bruger dem straks.
    3. Forbered en stamopløsning af Sevofluran og en anden stamopløsning af isofluran, både på 50 g/L i methanol. Samtidig Forbered en stamopløsning af chloroform (intern standard, IS) på 2 g/L i methanol. Gemme alle standard løsninger ved-20 ° C.
    4. Forberede arbejde løsninger Sevofluran og isofluran på 50, 500 og 5000 mg/L i ultrarent vand/dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v). For interne standardisering, er brugsopløsning fastsat til 100 mg/L i methanol.
  2. Analyse af cellulære prøver
    Bemærk: Ekstraktionsmetode er baseret på den tidligere valideret metode til gas chromatografi og massespektrometri fra Bourdeaux et al. 1 og bruger de samme parametre for følsomhed og specificitet. Sevofluran og chloroform (IS) blev brugt i denne protokol, og isofluran var forbundet med den multiparametric analysemetode. Kort, for massespektrometri erhvervelse, metoden blev udviklet efter ren løsning injektion. Derefter, m/z blev bekræftet med referencestandarder og litteraturen data. Tre m/z blev valgt for hver analysand (undtagen IS): en m/z for kvantificering (den mest udbredte og jo højere), hvortil overflod blev beregnet ved at integrere arealet under kurven for kvantificering og to m/z for bekræftelse. Ved hjælp af tre m/z kunne analysander være specifikt identificeret fordi alle m/z havde samme retentionstid, samt fordi alle m/z beløb (relativ ion bekræftelse vs bestemmelsesgrænsen) var de samme i ren standard og i alle prøver. Med denne erhvervelse mode, kunne analysander identificeres og kvantificeres med god specificitet.
    1. Konstruere en kalibreringskurverne er 8-punkt med koncentrationsintervaller 0,5-400 mg/L og flere kvalitet kontrol (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 og 400 mg/L).
      Bemærk: For at validere hver kalibrering, anvendtes fire kvalitetskontrol: den nedre grænse for kvantificering (C1 = 0,5 mg/L), to mellemliggende niveauer (C2 = 20 mg/L og C3 = 75 mg/L) og det endelige niveau (C4 på 400 mg/L, øvre niveau bestemmelsesgrænsen). Alle standarder og kontroller blev analyseret i kulturperler celle matricer til at undgå matrix effekten. For hver kalibreringskurven, blev en tom matrix analyseret for at validere, at der var ingen indblanding med kulturperler cellulære og interne standarder.
    2. Forbered en stamopløsning af Sevofluran og en anden stamopløsning af isofluran, både på 50 g/L i methanol. Samtidig Forbered en stamopløsning af chloroform (intern standard, IS) på 2 g/L i methanol. Gemme alle standard løsninger ved-20 ° C. Derefter forberede arbejde løsninger af blandet Sevofluran/isofluran på 50, 500 og 5000 mg/L i ultrarent vand / dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v). For IS fortyndingen arbejder på 100 mg/L i methanol.
    3. Kalibreringskurverne og kontrol, forberede prøverne ved spiking 50 µL af IS (100 mg/L) i 1 mL af cellulære prøve matricer.
    4. Forberede prøve løsninger med 200 µL af mættede natriumklorid opløsning i vand i en 10 mL headspace tube, skruet hermetisk stramt med en Teflon-forseglet cap.
  3. Gas chromatografi og massespektrometri
    1. For analyseresultat, skal du bruge headspace injektioner i en gaskromatografi, kombineret med den masse påvisningsmetode.
    2. Bære headspace rør i 10 min. ved 80 ° C med et varmelegeme shaker. Derefter, trække og injicere 1,5 mL i eksemplet gas i gaskromatografen. Sæt parameteren af injektoren ved 260 ° C med en split flow på 100 mL/min. for 2 min i starten af kromatografi run.
    3. Brug Split/splitless injektor med en transportør mode-programmeret pres. Første, holde gastryk på 40 kPa for 0,15 min. Derefter, øge sats program presset til 150 kPa ved 125 kPa/min før du angiver en hastighed på 16 kPa/min 300 kPa pres i 5 min.
    4. Samtidig at injektionen, starte med en ovntemperatur 60 ° c i 1 min og stigning indtil en temperatur på 140 ° C med en hastighed på 20 ° C/min. Derefter, øge temperaturen igen indtil 250 ° C opnås. Den samlede tid i flugt er 7 min.
    5. Udføre kromatografi adskillelse ved hjælp af fused silica kapillarkolonne (30 m x 1,4 µm, 0,25 mm ID). Udføre masse eksperimenter med en enkelt ion overvågning (SIM) betingelse, og overvåge ion kvantificering m/z 181 og ion kvalifikationer m/z 151 og 51 samtidig på en retentionstid (RT) på 2,30 min for Sevofluran, m/z 149 (ion kvantificering), m/z 115 og 87 (ion kvalifikationer) for isofluran på RT 2.8 min og m/z 83 (ion kvantificering) for chloroform på RT 3.70 min.
    6. Bestemme koncentrationen af Sevofluran og isofluran i cellekultur ved deres område nøgletal som IS ved hjælp af en vægt kvadratiske pasform. Den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) for Sevofluran og isofluran på 0,5 mg/L og den øvre grænse for kvantificering (ULOQ) var 400 mg/L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Koncentrationerne af Sevofluran og isofluran, som opløses i medium over tid, er rapporteret i tabel 1 og tabel 2, henholdsvis.

Kurser af Sevofluran og isofluran koncentrationer i mediet var ens over tid. Umiddelbart efter den nødvendige koncentration af halogenerede agent blev sat, steg koncentrationer over den første time. Et plateau nåede derefter, som varede indtil administration af halogenerede agent blev stoppet. Efter administration afbrydelse faldt koncentrationer inden for en time (figur 3).

Efter først var time, median koncentrationen af Sevofluran og isofluran i mediet 251 mg/L og 25 mg/L, henholdsvis. Ingen signifikant forskel fandtes mellem de forskellige eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: byggeri planen for lufttæt afdeling Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk tegning af enheden Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: koncentration af Sevofluran (n = 5) og isofluran (n = 5) over tid. A) koncentration af halogenerede agent over tid. Værdierne er udtrykt i mg/L. værdier udtrykkes i middelværdi og SEM. B) koncentration af halogenerede agent over tid for hvert forsøg. Værdien udtrykkes i mg/L. C) brøkdel af halogenerede agent over tid i lufttæt salen målt ved gas analysator. Værdier udtrykkes i procentsatser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tid Koncentrationen af Sevofluran på mellemlang Brøkdel af Sevofluran
(mg/L) i lufttæt salen
Median IC (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (stop) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 min 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stop + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tabel 1: Koncentrationer af Sevofluran opløst i medium over tid. Numeriske data er udtrykt som en median værdi med interkvartil område for koncentrationen og procent for fraktion. IQR (for interkvartil rækkevidde)

Tid Koncentrationen af isofluran på mellemlang Brøkdel af isofluran
(mg/L) i lufttæt salen
Median IC (%)
5min 2 [2 - 2.5] 0,8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0,9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (stop) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5min 19 [12 - 25] 0
Stop + 30min 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabel 2: Koncentrationer af isofluran opløst i medium over tid. Numeriske data er udtrykt som en median værdi med interkvartil område for koncentrationen og procent for fraktion. IQR (for interkvartil rækkevidde)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vores protokol beskriver en nem metode til at afsløre celler til en præcis brøkdel af en halogenerede bedøvende agent, Sevofluran eller isofluran. Endvidere rapporterer vi her – for første gang — en streng korrelation mellem både gas fraktion og koncentrationen af Sevofluran og isofluran inde næringssubstratet, selv. Denne grundlæggende skridt nu tillader os trygt bruge vores lufttæt kammer for at studere virkningerne af disse halogenerede stoffer i en kulturperler éncellelag af menneskelige alveolær epitelceller.

I øjeblikket bruger mest forskningshold at studere virkningerne af Sevofluran i alveolær celler en krukke, der er første mættet med halogenerede gas og derefter forseglet. I dette tilfælde Sevofluran kan blive metaboliseret, og det kunne være spekuleret på at brøkdel af flygtige agent kan falde lineært over tid, fører til en ustabil gas koncentration. Men sammenhængen mellem gas brøkdel af Sevofluran og dets koncentration i substratet er ikke klart rapporteret i litteraturen. Normalt, er koncentrationen af Sevofluran disse forsøgsdyr udvalgt på baggrund af et simpelt forhold mellem gas fraktion og MAC. MAC blev indført i 1965 og er koncentrationen af en damp i lungerne, der er nødvendige for at forhindre en motor respons (bevægelse) i 50% af emner som svar på en kirurgisk stimulus (smerte)22. MAC bruges til at sammenligne den styrke eller styrke, af bedøvelsesmiddel dampe. I ICU patienter, er MAC korreleret til FeSevo og den kliniske Richmond vurdering Agitation-Sedation skala (RASS)23. Selv om det er en nyttig indikator i daglig klinisk praksis, er relevansen af denne parameter aldrig blevet undersøgt i fastsættelsen af eksperimentel in vitro- forskning. I vores protokol, fastsat ved hjælp af kromatografi analyser af mediet, vi præcise sammenhængen mellem Sevofluran indeholdt i gas-fraktionen og Sevofluran opløst i mediet. Med denne metode, er den specifikke effekt af en flygtig agent udtrykt ifølge den reelle koncentration i medium snarere end baseret på tilnærmelse af en klinisk effekt. Dette vigtige element giver mulighed for undersøgelse af den specifikke effekt af en præcis koncentration af en halogenerede agent på celler vokser i en medie, for at sammenligne effekten af inhaleret agenter i forskellige koncentrationer. Desuden, som lufttæt salen er meget nem at bruge, denne metode giver forskere til at replikere eksperiment med præcision.

Et andet vigtigt punkt, der kan udelukke brugen af korrelation mellem gas fraktion og MAC i eksperimentel forskning er, at en halogenerede agent har lav Opløselighed i blodet (blod/gas fordelingskoefficienten ved 37 ° C = 0,63 til 0,69 for Sevofluran). En minimal mængde af Sevofluran er bemyndiget til at opløse i blodet før trykket i alveolerne opnår ligevægt med trykket i arteriel. Således under induktion af anæstesi stiger den alveolære (end-tidal) koncentration (AF, alveolær fraktion) af Sevofluran hurtigt omkring inspireret koncentrationen (FI, inspireret brøkdel). Men i vitro kultur betingelser tillader ikke sådanne mekanismer, og sædvanlige celle media består hovedsageligt af vandige opløsninger. Derudover er opløselighed koefficient mellem vand/gas (fordelingskoefficient ved 37 ° C = 0,36 for Sevofluran) lavere end mellem blod og gas, ligger til grund for den afgørende betydning af udfører kromatografi analyser.

Desuden, når en forseglet krukke bruges, er den atmosfæriske ilt i krukken absorberet af celler med den samtidige generation af kuldioxid. Denne effekt er formentlig ubetydelig i korte eksperimentelle procedurer, men for længere eksperimentel varigheder, celler, der er berøvet af ilt ville skifte til en anaerob metabolisme; denne ændring i stofskiftet kan fremkalde en vis skævhed i eksperimentel analyser. I modsætning til den lukkede krukke, når du bruger vores lufttæt kammer, kan både ilt og halogenerede agent strømme justeres over tid at fastholde det målrettede. Denne store kendetegner vores protokol derfor tillader udformningen af in vitro- eksperimenter i lang tidsperioder (f.eks. mere end én dag), gør det til et interessant værktøj til at undersøge de cellulære mekanismer involveret i lunge epitelial skade og reparere over tid, især når halogenerede stoffer anvendes. Faktisk, virkningerne af inhaleret bedøvelsesmiddel agenter på Lungeceller eller væv under alveolær skade forbliver dårligt undersøgte til dato, mens denne alternative terapi synes at vise meget opmuntrende resultater12.

Der er dog begrænsninger til denne teknik. Først, et bedøvelsesmiddel maskine kredsløb er nødvendig for at levere ilt, kuldioxid, og halogenerede agent gasstrømme. Ved hjælp af en sådan anordning er obligatorisk at angive strømningshastigheden og bevare stabil koncentrationer over tid. For det andet at prøve medium inden kromatografi analyser, lufttæt kammeret åbnes kortvarigt, som inducerer en forbigående fald i gaskoncentrationerne. Som vi bruger et bedøvelsesmiddel maskine kredsløb, øget gasstrømme derefter, indtil forventede koncentrationer opnås igen på gas analysator. For det tredje har vi målt koncentration i medium for kun en brøkdel af hver halogenerede agent, valgt på forhånd baseret på tidligere undersøgelse. For det fjerde for at stabilisere celle medium til vækst af alveolær epitelceller, skal vi bruge kuldioxid i en koncentration på 5%. Ja, ingen bedøvelsesmiddel maskine kredsløb giver sådan en koncentration af kuldioxid. Den bedøvende maskine kredsløb skal derfor tilpasses til at tillade forbindelsen mellem kuldioxid gasflow i stedet for lattergas. Sådan forbindelse bør anvendes udelukkende i fastsættelsen af eksperimentel forskning og forsigtigt bør være unplugged efter hvert forsøg. Desuden, for at undgå enhver risiko for mennesker, vi inviterer forskere at bruge en hengiven bedøvelsesmiddel maskine kredsløb til at udføre denne protokol og ikke at bruge en maskine dedikeret til klinisk anæstesi.

De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er forholdsvis billigt og meget let at vedtage, selv når forskere har aldrig manipuleret en lufttæt Parlamentet før. Desuden med vores protokol er resultaterne af opløste Sevofluran og isofluran koncentrationer reproducerbare, der repræsenterer en større kvalitetskriterium for eksperimentel forskning. Derudover vores system kunne give mulighed for undersøgelse af andre flygtige halogenerede stoffer, såsom desflurane. Faktisk, en simpel ændring af typen af gas fordamper enhed ville være tilstrækkelige i denne sag. På samme måde, vores system kunne give et middel til at studere koncentrationerne af Sevofluran eller isofluran opløst i enhver type af medium med forskellig opløselighed, såsom vand, blod eller olie.

Vores eksperiment udgør et grundlæggende skridt, som er en del af et større projekt med det formål at teste hypotesen at Sevofluran og isofluran kan lægge gavnlige virkninger på lunge skade, inflammation og AFC gennem RASERI-medieret veje. En primær kultur af human alveolær epitelceller vil blive brugt til Mekanistiske undersøgelser af transepithelial fluid transport, kanal-specifikke flydende transport (f.eks. ved hjælp af farmakologiske antagonisme), epithelial paracellular permeabilitet, sår repair, celle migration og spredning, med eller uden en halogenerede bedøvende agent (Sevofluran eller isofluran), alene eller kombineret med cytomix (in vitro- model af alveolær skade)24.

Til sidst, var denne protokol specielt designet til at nå præcist og kontrollerede koncentrationer af Sevofluran eller isofluran in vitro- til at forbedre vores forståelse af mekanismer involveret i epitelial lunge skade i ARDS og teste roman behandlinger for denne hyppige og liv-truende syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Auvergne regionalrådet ("programmet Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) og franske Agence Nationale de la Recherche og retning Générale de L'Offre de Soins ("programmet de Recherche Translationnelle en Santé" ANR-13-PRTS-0010) for tilskud. Finansieringskilderne ikke havde nogen indflydelse i undersøgelse design, adfærd og analyse eller i udarbejdelsen af denne artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>In Vitro</em> Metode til kontrol koncentrationer af halogenerede gasser i kulturperler alveolær epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter