Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

במבחנה שיטת שליטה ריכוזי גזים הלוגניים בתרבית תאים אפיתל מכתשי

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

אנו מתארים פרוטוקול קל שתוכננה במיוחד כדי להגיע ריכוז מבוקר ומדויק של sevoflurane או איזופלוריין במבחנה על מנת לשפר את ההבנה שלנו של המנגנונים המעורבים הפגיעה ריאות אפיתל, כדי לבדוק את הרומן טיפולים עבור תסמונת מצוקה נשימתית חריפה.

Abstract

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא תסמונת של ' מאטום לשקוף ' מכתשי פגיעה עם לקוי סיווג נוזלים מכתשי, דלקת חמורה. השימוש סוכנים הלוגניים, כגון sevoflurane או איזופלוריין, הרגעה מהמטופלים יחידת טיפול נמרץ (ICU) יכול לשפר את חילוף הגזים, להפחית בצקת מכתשי ו להחליש דלקת במהלך ARDS. עם זאת, נתונים על השימוש סוכנים בשאיפה הרגעה רציפה בטיפול נמרץ כדי לטפל או למנוע נזק לריאות לוקה בחסר. לחקור את ההשפעות של סוכנים הלוגניים בתאי אפיתל מכתשי בתנאים "הפיזיולוגיות", אנו לתאר מערכת נוחה לתאים תרבות-הממשק אוויר נוזלי ולחשוף אותם לסוכנים הלוגניים לספק מדויק ומבוקר "אוויר" שברים, ריכוז "בינוני" עבור הסוכנים האלה. פיתחנו תא אטום לאוויר שבו צלחות עם האדם מכתשי מונצחים בתאי אפיתל יכול להיות חשופים לשבר מדויק, מבוקרת של sevoflurane או איזופלוריין באמצעות זרם הגז רציף שסופקו על-ידי מעגל מכונת הרדמה. תאים נחשפו ל 4% sevoflurane ו 1% של איזופלוריין במשך 24 שעות. ספקטרומטר מסה גז בוצעה כדי לקבוע הריכוז של סוכנים הלוגניים מומס המדיום. לאחר הראשונה שעה, את ריכוזי sevoflurane איזופלוריין במדיום היו 251 מ ג/ליטר, 25 מ"ג/ליטר, בהתאמה. העקומות המייצג את ריכוזי הן sevoflurane והן איזופלוריין מומס המדיום הראה קורסים דומים לאורך זמן, עם מישור הגיע-שעה אחת לאחר החשיפה.

פרוטוקול זה תוכנן במיוחד להגיע ריכוז מבוקר ומדויק של sevoflurane או איזופלוריין במבחנה כדי לשפר את ההבנה שלנו של המנגנונים המעורבים ריאות אפיתל פציעה במהלך ARDS, כדי לבדוק טיפולים חדשניים תסמונת.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא תסמונת קלינית המאופיינת מכתשי פגיעה ' מאטום לשקוף ', בצקת ריאות, כשל נשימתי hypoxemic. למרות ARDS מייצג יותר מ-10% של יחידת טיפול נמרץ (ICU) הקבלה כמעט 25% של טיפול נמרץ חולים הנזקקים להנשמה, זה עדיין מהווה אתגר תחת-מזוהה עבור רופאים, חולים התמותה של 35-45%1. למרות מחקר אינטנסיבי, הזיהוי של טיפול תרופתי יעיל של ARDS או מניעת נכשל עד כה. שתי תכונות עיקריות לתרום התמותה ב- ARDS: ליקויי סיווג מכתשי נוזלים (AFC) (קרי, ספיגת מסולף של נוזל מכתשי בצקת ריאות דיסטלי airspaces) ודלקת חמורה2. מאז ARDS התמותה נותר גבוה, יוזמות הנוכחית לכלול גם מניעה ראשונית; אולם, אתגר המפתח היא לזהות חולים בסיכון למי ARDS הוא לפתח, מי ירוויח אם ARDS היו.

הרדמה הלוגניים נדיפים, כגון sevoflurane ואיזופלוריין, נמצאים בשימוש נרחב כדי לספק הרדמה כללית בחדר הניתוח. ברחבי העולם, יותר מ- 230 מיליון חולים שעברו ניתוח רציני בכל שנה לדרוש הרדמה כללית ואוורור מכני3, לאחר הניתוח סיבוכים ריאתי להשפיע לרעה על התוצאות הקליניות וסילוק הבריאות4 . השימוש sevoflurane במקום propofol היה קשור לדלקת ריאות משופר בחולים שעברו ניתוח החזה, ירידות משמעותיות תופעות לוואי, כגון ARDS, לאחר הניתוח סיבוכים ריאתי5. באופן דומה, רעלני עם איזופלוריין היו ההשפעות המגנות על מכניקת הנשימה, חמצון ספיקת הדם במודלים חייתיים ניסיוני של ARDS6,7. למרות מחקרים נוספים הם מוצדקת כדי להתייחס להשפעת סוכנים בשאיפה על תוצאות בניתוח noncardiac, ירידה דומה ריאתית סיבוכים נצפתה לאחרונה ב מטא אנליזה, הממחיש זאת בשאיפה סוכנים הרדמה – כמו מתנגד הרדמה תוך ורידי – קשורים באופן משמעותי עם ירידה בתמותה כירורגיית8.

נתונים ספציפיים פוטנציאליים על השימוש סוכנים הנפיצה הרגעה מהמטופלים בטיפול נמרץ כדי למנוע או לטפל נזק לריאות לוקה בחסר. עם זאת, מספר ניסויים כעת תמיכה את היעילות והבטיחות של sevoflurane בשאיפה הרגעה מהמטופלים בטיפול נמרץ, פרה מחקרים הראו כי sevoflurane בשאיפה ו-7,איזופלוריין9 לשפר את חילוף הגזים, להפחית עיצור מכתשי, בצקת, דלקת attenuate ניסיוניות של ARDS. בנוסף, sevoflurane מפחית את הסיכון של סוג II תאים אפיתל נזק10, ואילו איזופלוריין שומר על השלמות של המכשול מכתשי-נים דרך אפנון של צומת חזק חלבון11. עם זאת, מחקרים נוספים נדרשים כדי לוודא באיזו מידה הראיות ניסיוני של איברים הגנה מפני בשאיפה sevoflurane ואיזופלוריין יכול להיות מתורגם לבני אדם. הראשון מרכז יחיד מבוקר-ניסוי אקראי (RCT) מקבוצת שלנו נמצא כי בתחילת השימוש בשאיפה sevoflurane בחולים עם ARDS המשויך חמצון משופרת, רמות מופחתת של כמה סמנים הפרו דלקתיים והריאות מופחתת אפיתל לגרום נזק, כפי מוערך על ידי הרמות של הטופס מסיסים של הקולטן עבור מוצרים (sRAGE) glycation מתקדם נוזלים, פלאזמה ומכתשי12.

יחדיו, ההשפעות המיטיבות של sevoflurane ואיזופלוריין על פגיעת ריאות יכול להצביע על מספר מסלולים ביולוגיים או פונקציונלי תהליכים התלויים מסלול זעם, כלומר אישור מכתשי נוזלים (AFC), פגיעה אפיתל, טרנסלוקציה של גרעיני גורם (NF)-κB, מקרופאג ההפעלה. בנוסף, sevoflurane עשויים להשפיע את הביטוי של החלבון זעם עצמה. מאז מחקרים קודמים על ידי צוות המחקר שלנו ואחרים תומך מרכזי תפקידים עבור זעם בין מכתשי דלקת ריאות אפיתל פציעה/תיקון במהלך ARDS, עיצבנו מדגם ניסיוני לספק הבנה translational על מנגנוני sevoflurane ריאות פציעה ותיקון13,14,15. ההשפעות במבחנה של sevoflurane איזופלוריין נחקרו בקו הרומן האנושי מכתשי אפיתל התא הראשי שתוכננה במיוחד כדי ללמוד המכשול אוויר-דם של הריאות היקפיים, hAELVi (האדם LentiVirus אפיתל מכתשי מונצחים), עם מאפיינים כמו סוג מכתשי כולל צמתי צר פונקציונלי16.

בעת הכנת העיצוב של החקירות שלנו במבחנה (למשל, תרבויות של תאי אפיתל כנגד מכתשי-הממשק אוויר נוזלי עם חשיפה sevoflurane "בשאיפה" או איזופלוריין, היינו מבינים של שפורסמו קודם לכן לומד את זה שברים של sevoflurane רק היה להעריך את "אוויר" ממשק17,18,19 שימוש רגיל צגים (בדומה לאלה ששימשו בקביעת קליני). הסוכן הלוגניים ריכוזים נבחרו בדרך כלל על ערכי ריכוז מכתשי מינימלי (MAC) (למשל, אצל בני אדם, עבור sevoflurane, 0.5, 1.1 ו- 2.2 vol %, המייצג 0.25, 0.5 ו- 1 MAC, בהתאמה; עבור איזופלוריין, 0.6, 0.8, ו 1.3 vol % ייצוג 0.25, 0.5 ו- 1 MAC, בהתאמה)20. אכן, ריכוזי sevoflurane ואיזופלוריין מעולם לא נחקרו במדיום התרבות עצמו, ובכך יגביל את תוקפו של מודלים ניסיוני הקודם/מכשירים. יתר על כן, רוב הניסויים השתמשו צנצנת אנאירובית שהיה סגור לאחר sevoflurane המכיל תערובת האוויר היה כבר סמוקות בפנים. המטרה שלנו הייתה ללמוד מכתשי בתאי אפיתל בתנאים "הפיזיולוגיות", האמנו כי מצב כזה אנאירובית לא יכול להיות אופטימלי, לא יהיה תואם עם משכי זמן ניסיוני. לכן, אנו פיתחה מערכת שלנו על התרבות תאים-הממשק אוויר נוזלי, לחשוף אותם סוכנים הלוגניים (sevoflurane ואיזופלוריין), במטרה לספק שברים "אוויר" מבוקרת מדויקת וריכוזי "בינוני" עבור הסוכנים האלה. לדעתנו, שלב זה ניסיוני, אשר לא דיווחו עד כה בספרות, הוא חובה לפני נוספת במבחנה חקירות של sevoflurane ושל איזופלוריין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. התרבות של תאים אפיתל מכתשי (hAELVi)

  1. מפשיר
    1. פיפטה 4 מ של טיפוח בינוני מוכן לשימוש אנושי מכתשי אפיתל (huAEC) בצינור פלסטיק 15 מ"ל, במהירות להפשיר את המבחנה באמבט מים טרופה (37 מעלות צלזיוס).
    2. העברה התליה תא המופשרים צינור פלסטיק 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של המדיום לפני צריך שתוציאו את הצינור ב- g x 200 עבור 5 דקות.
    3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא 5 מ של המדיום הטיפוח-תרגול. לאחר מכן, העבר את התאים בקבוקון T25.
    4. לטפח את התאים בתנאים סטנדרטיים (5% CO2, 95% humidified אוויר, 37 ° C)
  2. פיצול
    1. לבדוק את המצב של התאים ברמה המיקרוסקופית. כאשר התאים הם 80-90% confluent, לפצל את התאים, בצע את הפעולות 1.2.2 דרך 1.2.10.
    2. האחות התקשורת הטיפוח של התאים עם פיפטה סטרילי.
    3. לשטוף את התאים פעם אחת עם 4 מ"ל של Dulbecco פוספט Buffered מלוחים (DPBS), וארוקן את DPBS.
    4. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין/EDTA פתרון (TE) התאים לפני המקננת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות עד התאים נתחיל לנתק; בדוק אם הניתוק תחת מיקרוסקופ.
    5. Resuspend התאים עם 2 מ"ל של המדיום תרבות, centrifuge את התאים ב g x 200 במשך 5 דקות. לאחר מכן, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא שוב עם 3 מ"ל של המדיום הטיפוח-תרגול.
    6. השתמש וזמינותו אי-הכללה של צבע כחול trypan כדי לקבוע את הכדאיות של התאים. לקחת 30 µl של התליה תא ולהוסיף µl 30 של 0.4% פתרון של trypan blue בשפופרת. לאחר מכן, מערבבים ביעילות הפתרון 3 - 5 פעמים באמצעות פיפטה של 100 µl. לקחת 10 µl של הפתרון, שימי אותה מתחת coverslip של hemocytometer.
    7. לספור את המספר הכולל של התאים קיימא והן את מספר תאים מתים (כחול) באזורים של hemocytometer. לאחר מכן, לחשב את הכדאיות תא [%] באמצעות המשוואה: תא הכדאיות = 100 – (100 / הכולל מספר התאים x מספר תאים מתים)
    8. להעביר את aliquot עם בגדר תא resuspended בקבוקון T25 החדש של התרבות תאים או צלחת-טוב 6. הוסף המדיום טיפוח לתאים כדי להשיג סכום כולל של 5 מ של טיפוח בינוני הבקבוק T25, או 1 מ"ל במשך כל צלחת-טוב 6.
    9. לטפח את התאים בתוך אינקובטור בתנאים סטנדרטיים (5% CO2, 95% humidified אוויר, 37 ° C)
    10. ברגע שהתאים confluent לחלוטין, הם מוכנים לניסוי.

2. הכנת חדר אוויר חזק

הערה: תוכנית הבנייה עבור תא אוויר חזק מתואר באיור 1.

  1. השתמש בתיבה פוליפרופילן הרמטי עם קיבולת של ל' 6.5 האורך, הרוחב והגובה הם 30 x 20 x 15.5 ס מ, בהתאמה. שימו לב, הנפח של התיבה הוא נמוך יותר מאשר אמצעי האחסון תיאורטי בגלל הפינות מעוגלות.
  2. לקדוח חור בקוטר 2.5 ס מ בצד התחתון של הקיר לרוחב.
  3. הכנס צינור קרטון עם סימן ירוק, אשר לשמש הצינור קלט של תערובת דלק-אוויר, לאטום אותו עם סיליקון.
  4. לקדוח חור בקוטר 2.5 ס מ השנייה בצד העליון של הקיר ממול לרוחב.
  5. להוסיף עוד צינור קרטון עם סימון אדום וחבר אותו עם מסנן פחם, אשר משמשים הצינור פלט של תערובת דלק-אוויר, לאטום אותו עם סיליקון.
  6. לקדוח חור בקוטר 4 מ מ חזק במרכז הקיר אכזרי של התיבה.
  7. להוסיף צנור קצר אינפוזיה המחוברת יריעה עם סיבוב זכר סכינים סטריליים-מנעול, אשר להיות פקוק לתוך מנתח גז, לאטום אותו עם סיליקון.
  8. המקום מד חום דיגיטלי/מד לחות בתוך החדר לאוויר.

3. לחשוף מכתשי תאים אפיתל לסוכנים הלוגניים (Sevoflurane ואיזופלוריין)

הערה: שרטוט ציור של המכשיר מתוארת באיור 2.

התראה: למרות מחקרים שנעשו בבעלי חיים חשפו אין עדות לפגיעה בעובר או ליקויי פוריות, מחקר קטן מאוד במהלך קיסרי לא הראה שום תופעות םיענ-האם או העובר, בטיחות השימוש הלוגניים (למשל, סוכנים sevoflurane או איזופלוריין) במהלך לידה לא הוכח עד כה. יתר על כן, אין נתונים מבוקרים שנאספו במהלך הריונות אנושי. לכן, ביצוע ניסויים באמצעות sevoflurane או איזופלוריין בעוד בהריון צריכה להיות מומלצת בחום.

  1. לעבוד תחת ברדס extractor מעבדה.
  2. התאמה אישית של מעגל מכונת הרדמה כדי לעבור את הגז של תחמוצת החנקן על ידי פחמן דו-חמצני (CO2).
  3. חבר תא אוויר חזק עם הצינורית המסומן ירוק, גלי המעגל מכונת הרדמה מותאמים אישית. הכנס מעשיר לחות (כגון אלה נעשה שימוש בטיפול נמרץ מאווררים) לתוך הצינור בין מכונת הרדמה תא אוויר חזק כדי לחמם את התערובת זרימת גז עד כ 37 מעלות צלזיוס.
  4. התקנת תא אוויר חזק על פלטה חמה, המספק חימום צלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. לשים היטב-צלחת 6 את המכיל התאים hAELVI האוויר חזק קאמרית, לסגור את המכסה.
  6. לווסת את תעריפי זרימת גז (קרי, התערובת של אוויר ו- CO2) כדי לקבל במהירות את תנאים סטנדרטיים, כהגדרתו 5% של CO2 ו- 95% של אוויר humidified.
  7. פתחו המאייד הסוכן הלוגניים ובחרו את האחוז הרצוי (במחקר הנוכחי, שנבדקו ריכוזי sevoflurane איזופלוריין היו 4%, 1%, בהתאמה).
  8. הערה ההרכב של גז תערובת לבין sevoflurane או איזופלוריין הריכוז נמדד מנתח גז חיצוניים, המוצג על המסך.
  9. ברגע ערכי היעד מושגות, להפחית את קצב זרימת גז טרי ל- 1 ליטר/דקה.
  10. תא אוויר חזק שניתן לתחזק את קצב הזרימה הזה גז זמן רב ככל הדרוש לניסוי.

4. למדוד Sevoflurane או איזופלוריין על ידי כרומטוגרפיה

  1. הכנת דוגמאות
    1. בנקודות זמן שונות, מאוד בקצרה לפתוח את התא כדי להוציא את הדגימות למדה (במחקר הנוכחי, השתמשנו היטב-צלחת 6) ולסגור את המכסה. שומרים את הדגימות אחרים בתיבה. לאחר מכן, תשאף 1 מ"ל של המדיום הכלולות בכל מדגם עם micropipette מתכווננת אמצעי אחסון מרובים.
    2. מכניסים את המדיום 10 מ"ל קראוון כרומטוגרפיה הבקבוקונים, אשר צריך להידפק הרמטית חזק עם כובע אטום טפלון. להקפיא את הבקבוקונים כרומטוגרפיה ב-20 ° C, אם אתם לא משתמשים בהם באופן מיידי.
    3. להכין פתרון מניות של sevoflurane ופתרון מלאי נוסף של איזופלוריין, שניהם-50 גר'/L במתנול. במקביל, להכין פתרון מניות של כלורופורם (תקן פנימי, IS)-2 g/L במתנול. לאחסן כל פתרונות סטנדרטיים ב-20 ° C.
    4. הכנת עבודה הפתרונות של sevoflurane ואיזופלוריין-50, 500 ו 5000 מ ג/ליטר של מים הנדסה גנטית/דימתיל sulfoxyde (חצי; וי/v). התקינה פנימי, הפתרון עובד קבוע-100 mg/L ב מתנול.
  2. ניתוח דוגמאות הסלולר
    הערה: ההליך החילוץ מבוססת על שיטת בעבר מאומתים של גז כרומטוגרפיה, ספקטרומטר מסה של מורדים. et al. 1 ושימושים באותם הפרמטרים של רגישות וספציפיות. Sevoflurane, כלורופורם (IS) שהיו בשימוש פרוטוקול זה, איזופלוריין היה קשור עם השיטה האנליטית multiparametric. בקצרה, עבור רכישת ספקטרומטר מסה, השיטה פותחה לאחר ההזרקה פתרון טהור. לאחר מכן, מ/z אושר עם הפניה תקנים ונתונים ספרות. מ 3/z נבחר עבור כל analyte (למעט IS): אחד מ/z על כימות (הנפוץ ביותר, גבוה יותר), אשר שפע מחושב על ידי שילוב השטח מתחת העקומה על כימות ו- m/z שני לאישור. באמצעות שלושה מ/z, analytes במיוחד לזהות כי כל ז ז היה באותו זמן השמירה, וכן כי מ/z כל הסכומים (היחסי של אישור כימות נ' יון) היו זהים תקן טהור, כל הדגימות. במצב זה רכישה, analytes יכול להיות מזוהה, לכמתו טוב ירידה לפרטים.
    1. לבנות של עקומות מתומן כיול עם הטווחים בריכוז של 0.5-400 mg/L ואיכות מספר הוראות (0.5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 ו- 400 מ"ג/ליטר).
      הערה: כדי לאמת את כל כיול, פקדים איכות ארבע שימשו: הגבול התחתון של כימות (C1 = 0.5 מ ג/ליטר), שניים ביניים רמות (C2 = 20 mg/L ו- C3 = 75 מ ג/ליטר) ואת רמת הסופי (C4-400 mg/L; הקומה העליונה של כימות). כל תקני והפקדים נותחו ב תאים בתרבית מטריצות כדי למנוע אפקט המטריקס. עבור כל עקומת כיול, נותחו מטריצה ריקה לאימות שהיה שם ללא הפרעה עם סטנדרטים הסלולר ופנימיים בתרבית.
    2. להכין פתרון מניות של sevoflurane ופתרון מלאי נוסף של איזופלוריין, שניהם-50 גר'/L במתנול. במקביל, להכין פתרון מניות של כלורופורם (תקן פנימי, IS)-2 g/L במתנול. לאחסן כל פתרונות סטנדרטיים ב-20 ° C. לאחר מכן, להכין עבודה הפתרונות של sevoflurane/איזופלוריין מעורב ב 50, 500 ו 5000 מ ג/ליטר במים הנדסה גנטית / דימתיל sulfoxyde (חצי; וי/v). עבור IS, הפתרון עובד הוא מדולל-100 mg/L ב מתנול.
    3. עקומות כיול ובפקדים, הכן את הדוגמאות על ידי עולה µL 50 של IS (100 מ ג/ליטר) לתוך 1 מ"ל של מטריצות דגימה תאית.
    4. להכין פתרונות מדגם µL 200 בפתרון מים רוויים נתרן כלורי בשפופרת קראוון 10 מ"ל, דפק אותו הרמטית חזק עם כובע אטום טפלון.
  3. גז כרומטוגרפיה, ספקטרומטר מסה
    1. עבור ניתוחים לדוגמה, השתמש זריקות קראוון גז כרומטוגרפיה, בשילוב עם שיטת זיהוי המוני.
    2. נושא צינורות קראוון עבור 10 דקות ב 80 ° C עם מטרף מחמם. לאחר מכן, לסגת, להזריק mL 1.5 המדגם גז לתוך שמוצאים. להגדיר את הפרמטר של מזרק 260 ° C עם זרם פיצול ב- 100 מ ל/דקה למשך 2 דקות בתחילת המרוץ כרומטוגרפיה.
    3. השתמש מזרק פיצול/splitless עם לחץ מתוכנת מצב מנשא. ראשית, לשמור על לחץ הגז ב kPa 40 דקות 0.15. לאחר מכן, להגביר את הלחץ התוכנית קצב ל 150 kPa ב kPa 125/דקה לפני קביעת שיעור של kPa 16/min ללחץ kPa 300 במשך 5 דקות.
    4. בו זמנית כדי הזריקה, להתחיל עם תנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה ולהגדיל עד לטמפרטורה של 140 ° C בקצב של 20 ° C/min. לאחר מכן, מעלה את הטמפרטורה שוב עד 250 מעלות צלזיוס מושגת. הזמן הכולל הפעלה הוא 7 דקות.
    5. לבצע את ההפרדה כרומטוגרפיה באמצעות עמודה נימי סיליקה התמזגו (30 מ' x 1.4 מיקרומטר, מזהה 0.25 mm). ביצוע ניסויים המוני עם יון בודד פיקוח על תנאי (SIM), ולעקוב אחר יון כימות מ/z 181 ויון כישורים m/z 151 ו 51 בו זמנית בזמן השמירה (RT) של 2.30 דקות עבור sevoflurane, מ/z 149 (יון כימות), מ/z 115 ו 87 (יון תנאי הזכאות) עבור איזופלוריין-RT 2.8 min ו- m/z 83 (יון כימות) עבור כלורופורם ב RT 3.70 דקה.
    6. לקבוע את ריכוזי sevoflurane איזופלוריין בתרבות התא על ידי יחסי שטח שלהם לזה של IS באמצעות התאמה ריבועית משקל. הגבול התחתון של כימות (LLOQ) sevoflurane, איזופלוריין היה ב 0.5 מ ג/ליטר, הגבול העליון של כימות (ULOQ) 400 מ ג/ל'

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ריכוז של sevoflurane ו איזופלוריין, אשר מומס המדיום לאורך זמן, מדווחים טבלה 1 ו לטבלה 2, בהתאמה.

הקורסים של ריכוז sevoflurane ואיזופלוריין במדיום היו דומות לאורך זמן. מיד לאחר הריכוז הנדרש של הסוכן הלוגניים הוגדר, ריכוזים עלה במהלך השעה הראשונה. מישור הושגה לאחר מכן, אשר התעקש עד המינהל של הסוכן הלוגניים הופסק. לאחר הפרעה ניהול, ריכוז ירד בתוך שעה אחת (איור 3).

לאחר הראשונה שעה, הריכוזים החציוני של sevoflurane ואיזופלוריין במדיום היו 251 מ ג/ליטר, 25 מ"ג/ליטר, בהתאמה. נמצא הבדל משמעותי בין ניסויים שונים.

Figure 1
איור 1: תוכנית הבנייה של תא אוויר חזק אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הסכימטי של המכשיר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ריכוז של sevoflurane (n = 5) ואיזופלוריין (n = 5) לאורך זמן. A) ריכוז של הסוכן הלוגניים לאורך זמן. הערכים מבוטאים במ ג/ל' הערכים מבוטאים וב ב- SEM B) ריכוז של הסוכן הלוגניים לאורך זמן עבור כל ניסוי. ערך מבוטאים מ ג/ל' C) שבר של סוכן הלוגניים לאורך זמן בבית הבליעה לאוויר נמדדת במנתח גז. הערכים מבוטאים באחוזים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

זמן ריכוז של sevoflurane בטווח הבינוני שבר sevoflurane
(mg/L) בבית הבליעה לאוויר
חציון IC (%)
5 דקות 27 [19 - 31] 4.6
30 דקות 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 שעות 259 [256 - 271] 4.2
8 שעות 265 [237 - 280] 4.2
h 24 שעות ביממה (stop) 218 [196 - 247] 4.3
עצירה + 5 דקות 237 [214 - 241] 0
עצירה + 30 דקות 92 [91 - 104] 0
עצירה + 1 h 57 [42 - 58] 0

טבלה 1: ריכוזי sevoflurane מומס המדיום לאורך זמן. נתונים מספריים באים לידי ביטוי ערך החציוני עם טווח בין רבעוני על הריכוז וכן את אחוזי השבר. IQR (עבור טווח בין רבעוני)

זמן ריכוז של איזופלוריין בטווח הבינוני שבר איזופלוריין
(mg/L) בבית הבליעה לאוויר
חציון IC (%)
5 דקות 2 [2 - 2.5] 0.8
30 דקות 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0.9
4 שעות 30 [25 - 31] 1.4
8 שעות 22 [15 - 26] 1.2
h 24 שעות ביממה (stop) 26 [23 - 27] 1.1
עצירה + 5 דקות 19 [12 - 25] 0
עצירה + 30 דקות 4 [4 - 4] 0
עצירה + 1h 1 [0.8 - 1] 0

בטבלה 2: ריכוזי איזופלוריין מומס המדיום לאורך זמן. נתונים מספריים באים לידי ביטוי ערך החציוני עם טווח בין רבעוני על הריכוז וכן את אחוזי השבר. IQR (עבור טווח בין רבעוני)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול שלנו מתאר שיטה קלה כדי לחשוף תאים לשבר מדויק של סוכן הרדמה הלוגניים, כגון sevoflurane או איזופלוריין. יתר על כן, אנו מדווחים כאן – בפעם הראשונה – מתאם קפדני בין השבר גז והן את הריכוז של sevoflurane ואיזופלוריין בתוך המדיום התרבות עצמה. שלב בסיסי זה עכשיו מאפשר לנו להשתמש בבטחה קאמרית לאוויר שלנו כדי לבחון את השפעות אלה סוכנים הלוגניים טפט בתרבית של תאי אפיתל מכתשי אדם.

כיום, רוב צוותי המחקר ללמוד את השפעות sevoflurane בתאים מכתשי להשתמש צנצנת קודם רווי גזים הלוגניים, לאחר מכן, ננעל. במקרה זה, sevoflurane עשוי להיות מטבוליזם, זה יכול להיות העריך כי השבר של הסוכן הנדיף עלולה להפחית באופן ליניארי לאורך זמן, המוביל ריכוז גז לא יציב. עם זאת, הקשר בין השבר גז של sevoflurane לבין הריכוז שלו במדיום תרבות לא ברור מדווח בספרות. בדרך כלל, הריכוז של sevoflurane להשתמש בניסויים אלה נבחר בהתבסס על קשר פשוט בין השבר גז ו- MAC. מק הוצג בשנת 1965, ריכוז האדים של הריאות מה שצריך כדי למנוע תגובה מוטורית (תנועת) ב- 50% מהנושאים בתגובה לגירוי כירורגי (כאב)22. MAC משמש כדי להשוות את כוח, או העוצמה, של ואדים הרדמה. חולי טיפול נמרץ, MAC הוא מתואם כדי FeSevo קליניים בקנה מידה עצבנות-הרגעה הערכת ריצ'מונד (רז)23. למרות מחוון שימושי יומי הקלינית, הרלוונטיות של פרמטר זה לא נחקר בסביבה של מחקר ניסיוני במבחנה . הפרוטוקול שלנו באמצעות כרומטוגרפיה ניתוחים של המדיום, קבענו את מתאם מדויק בין את sevoflurane הכלול השבר גז את sevoflurane נמס לתוך האמצעי. בשיטה זו, ההשפעה הספציפית של סוכן נדיף הביע לפי ריכוז אמיתי במדיום ולא סמך על קירוב של אפקט קליני. רכיב חשוב זה מאפשר חקר השפעת ריכוז מדויק של סוכן הלוגניים בתאים הגדלים בינוני, על מנת להשוות את השפעת ריכוזים שונים של סוכנים בשאיפה ספציפיים. יתר על כן, כפי תא לאוויר היא קלה מאוד לשימוש, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לשחזר את הניסוי עם דיוק.

נקודה חשובה נוספת שיש עשוי למנוע את השימוש המתאם בין שבר גז ו- MAC במחקר ניסיוני הוא סוכן הלוגניים יש מסיסות נמוכה בדם (מקדם מחיצת דם/גז-37 ° C = 0.63 ל 0.69 עבור sevoflurane). כמות מינימלית של sevoflurane הוא המנדט כדי להמיס הדם לפני הלחץ alveoli משיג שיווי משקל עם הלחץ העורקים. לפיכך, במהלך אינדוקציה של הרדמה, מכתשי (end-גאות) הריכוז (AF, שבר מכתשי) sevoflurane במהירות מגביר סביב הריכוז השראה (פי, בהשראת שבר). עם זאת, in vitro לקשרי תרבות התנאים אינם מאפשרים מנגנונים אלה, המדיה הרגיל תא מורכב בעיקר פתרונות מימית. יתר על כן, המקדם מסיסות בין מים/דלק (מקדם החלוקה ב 37 ° C = 0.36 עבור sevoflurane) הוא נמוך יותר מאשר בין הדם לבין גז, שבבסיס את החשיבות הקריטית של ביצוע ניתוחים כרומטוגרפיה.

בנוסף, בעת צנצנת אטומה, חמצן אטמוספרי בצנצנת נספג על ידי התאים עם הדור בו זמנית של פחמן דו-חמצני. אפקט זה הוא כנראה חשיבות בקיצור בצרות, אבל עבור עוד ניסיוני משכים, התאים הם משוללי חמצן צריך לעבוד מטבוליזם אנארובי; שינוי בחילוף החומרים עלול לגרום מידה מסוימת של הטיה ב ניתוח ניסיוני. בניגוד הצנצנת אטום, בעת השימוש שלנו קאמרית לאוויר, חמצן וזורמת הסוכן הלוגניים הם מתכוונן לאורך זמן, כדי לשמור על רמת יישוב. זה מאפיין מרכזי של פרוטוקול שלנו ולכן מאפשר את העיצוב של ניסויים במבחנה לתקופות זמן זמן (למשל, יום אחד או יותר), שהופך אותו מעניין כלי כדי לחקור את המנגנונים התאיים מעורב בפציעה אפיתל ריאות ו תיקון לאורך זמן, במיוחד כאשר סוכנים הלוגניים משמשים. ואכן, ההשפעות של סוכנים הרדמה נשאפים על ריאות תאים או רקמות במהלך מכתשי פגיעה נותרו לקוי ובדוקים לתאריך בזמן טיפול חלופי זה נראה תוצאות מאוד מעודד12.

עם זאת, קיימות מגבלות על טכניקה זו. ראשית, מעגל מכונת הרדמה נדרש לספק חמצן, פחמן דו חמצני, הלוגניים סוכן גז זורם. באמצעות מכשיר כזה הוא חובה להגדיר את קצב הזרימה ולשמור על ריכוזים יציבים לאורך זמן. השנייה, כדי לטעום את המדיום לפני ניתוחים כרומטוגרפיה, תא אוויר חזק בקצרה נפתח, אשר גורם לירידה ארעית ריכוזי גזים. כפי שאנו משתמשים מעגל מכונת הרדמה, זורם גז לאחר מכן הוגדלה עד ריכוזים הצפוי מושגות שוב במנתח גז. שלישית, אנו יש למדוד את ריכוז האמצעי עבור חלק אחד בלבד של כל סוכן הלוגניים, נבחר א-פריורי על סמך לימודים קודמים. רביעית, לייצב את המדיום תא לצמיחה של תאי אפיתל מכתשי, עלינו להשתמש פחמן דו-חמצני בריכוז 5%. אכן, אין מעגל מכונת הרדמה מספקת כזה ריכוז פחמן דו-חמצני. לכן, המעגל מכונת הרדמה צריך להיות מותאם אישית כדי לאפשר את החיבור של זרימת גז פחמן דו-חמצני במקום תחמוצת החנקן. קשר כזה צריך לשמש באופן בלעדי ההגדרה של מחקר ניסיוני, בזהירות צריך להיות מנותק לאחר ניסוי. יתר על כן, כדי למנוע כל סיכון עבור בני אדם, אנו מזמינים החוקרים להשתמש מעגל מסורה מכונת הרדמה כדי לבצע פרוטוקול זה ולא להשתמש מכונת המוקדש יוצא.

היתרונות העיקריים של שיטה זו הן כי זה זול יחסית וקל מאוד לאמץ, אפילו כאשר חוקרים יש אף פעם לא מניפולציות חדר אטום לפני. יתר על כן, עם פרוטוקול שלנו, התוצאות של ריכוזי מומסים sevoflurane ואיזופלוריין הן לשחזור, אשר מייצג את קריטריון איכות הגדולות עבור מחקר ניסיוני. בנוסף, המערכת שלנו עלולה לאפשר לחקר סוכנים הלוגניים נדיפים אחרים, כגון desflurane. אכן, שינוי פשוט של סוג המכשיר מפזר גז יהיה מספיק במקרה זה. בדומה לכך, המערכת שלנו יכול לספק אמצעי ללמוד את ריכוזי sevoflurane או איזופלוריין התפרקה בכל סוג של בינוני עם solubilities שונים, כגון מים, דם או שמן.

הניסוי שלנו מייצג צעד מהותי המהווה חלק מפרוייקט גדול יותר שנועד לבחון את ההשערה כי sevoflurane ואיזופלוריין לנצל השפעות מועילות על פגיעת ריאות, דלקת AFC דרך מסלולים בתיווך זעם. תרבות העיקרי של תאי אפיתל מכתשי אדם ישמש עבור חקירות מכניסטית transepithelial נוזלים תחבורה, תחבורה נוזלים ערוץ ספציפי (למשל, באמצעות אנטגוניזם תרופתי), paracellular אפיתל פרמאביליות, הפצע נדידת תאים ותיקון, התפשטות, עם או בלי סוכן הרדמה הלוגניים (sevoflurane או איזופלוריין), לבד או בשילוב עם cytomix (במבחנה מודל של מכתשי פגיעה)24.

לסיכום, פרוטוקול זה תוכננה במיוחד כדי להגיע ריכוז מבוקר ומדויק של sevoflurane או איזופלוריין במבחנה כדי לשפר את ההבנה שלנו של מנגנונים המעורבים ריאות אפיתל פציעה במהלך ARDS, כדי לבדוק את הרומן טיפולים עבור תסמונת זו בתדירות גבוהה, סכנת חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחברים אישור המועצה האזורית אוברן ("תכנית נובו Chercheur de la Région אוברן" 2013), את צרפתי סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש, כיוון Générale דה L'Offre דה סוואן ("תוכנית דה רשרש Translationnelle en Santé" ANR-13-PRTS-0010) עבור המענקים. התורמים שחיים היה אין השפעה תכנון המחקר, התנהגות, ולאחר ניתוח או בהכנת המאמר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>במבחנה</em> שיטת שליטה ריכוזי גזים הלוגניים בתרבית תאים אפיתל מכתשי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter