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Medicine

इन विट्रो में प्रसंस्कृत वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं में Halogenated गैसों की सांद्रता को नियंत्रित करने के लिए विधि

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

हम विशेष रूप से sevoflurane या isoflurane की सटीक और नियंत्रित सांद्रता तक पहुंचने के लिए डिज़ाइन किया गया एक आसान प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो में उपकला फेफड़ों की चोट में शामिल तंत्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए और उपन्यास का परीक्षण करने के लिए तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम के लिए चिकित्सा ।

Abstract

तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) बिगड़ा वायुकोशीय द्रव निकासी और गंभीर सूजन के साथ फैलाना वायुकोशीय चोट का एक सिंड्रोम है । इस तरह के sevoflurane या isoflurane के रूप में halogenated एजेंटों के उपयोग, गहन देखभाल इकाई (आईसीयू) रोगियों गैस विनिमय में सुधार, वायुकोशीय सूजन को कम कर सकते हैं, और ARDS के दौरान सूजन क्षीणन के लिए बेहोश । हालांकि, इलाज या फेफड़ों के नुकसान को रोकने के लिए आईसीयू में लगातार बेहोशी के लिए साँस एजेंटों के उपयोग पर डेटा की कमी है । "शारीरिक" शर्तों के तहत वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं पर halogenated एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम हवा में संस्कृति कोशिकाओं के लिए एक आसान प्रणाली का वर्णन तरल इंटरफेस और उन्हें halogenated एजेंटों को बेनकाब करने के लिए सटीक नियंत्रित "हवा" भिन्न प्रदान करने के लिए और इन एजेंटों के लिए "मध्यम" सांद्रता । हम एक सील हवा तंग कक्ष जिसमें मानव वायुकोशीय उपकला अमर कोशिकाओं के साथ प्लेटें एक संवेदनाहारी मशीन सर्किट द्वारा प्रदान की एक सतत गैस प्रवाह का उपयोग कर sevoflurane या isoflurane के एक सटीक, नियंत्रित अंश को उजागर किया जा सकता है विकसित की है । कोशिकाओं को sevoflurane के 4% और 24 घंटे के लिए isoflurane के 1% से अवगत कराया गया । गैस मास स्पेक्ट्रोमेट्री माध्यम में भंग halogenated एजेंटों की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया. पहले घंटे के बाद, sevoflurane और isoflurane की सांद्रता मध्यम में क्रमशः २५१ मिलीग्राम/l और 25 mg/ दोनों sevoflurane और मध्यम में भंग isoflurane की सांद्रता का प्रतिनिधित्व घटता समय के साथ समान पाठ्यक्रम दिखाया, एक पठार के साथ प्रदर्शन के बाद एक घंटे में पहुंच गया ।

इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से ARDS के दौरान उपकला फेफड़े की चोट में शामिल तंत्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए और के लिए उपंयास उपचार परीक्षण करने के लिए इन विट्रो में sevoflurane या isoflurane की सटीक और नियंत्रित सांद्रता तक पहुंचने के लिए डिज़ाइन किया गया था सिंड्रोम.

Introduction

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तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (ARDS) फैलाना वायुकोशीय चोट, फेफड़ों की सूजन, और hypoxemic श्वसन विफलता द्वारा विशेषता एक नैदानिक सिंड्रोम है । हालांकि ARDS गहन देखभाल इकाई के 10% से अधिक का प्रतिनिधित्व करता है (आईसीयू) प्रवेश और आईसीयू के लगभग 25% यांत्रिक वेंटिलेशन की आवश्यकता के रोगियों, यह अभी भी चिकित्सकों के लिए एक के अंतर्गत मांयता प्राप्त चुनौती है, 35-45%1के एक अस्पताल मृत्यु दर के साथ । गहन अनुसंधान के बावजूद, एक प्रभावी ARDS औषधीय चिकित्सा या रोकथाम की पहचान की तारीख में विफल रहा है । दो प्रमुख विशेषताएं ARDS में मृत्यु दर में योगदान: बिगड़ा वायुकोशीय द्रव निकासी (एएफसी) (यानी, वायुकोशीय शोफ द्रव के बाहर फेफड़े के airspaces से बदल अवशोषण) और गंभीर सूजन2. चूंकि ARDS मृत्युदर अधिक बनी हुई है, वर्तमान पहलों में प्राथमिक रोकथाम भी शामिल होनी चाहिए; हालांकि, एक प्रमुख चुनौती में जोखिम वाले रोगियों की पहचान करना है जिनमें ARDS विकसित होने की संभावना है और अगर ARDS को रोका गया तो लाभ होगा ।

अस्थिर halogenated निश्चेतक, जैसे sevoflurane और isoflurane, व्यापक रूप से ऑपरेटिंग कमरे में सामान्य संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है । दुनिया भर में, अधिक से अधिक २३०,०००,००० हर साल मेजर सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों सामान्य संज्ञाहरण और यांत्रिक वेंटिलेशन3की आवश्यकता, और पश्चात फुफ्फुसीय जटिलताओं प्रतिकूल नैदानिक परिणाम और स्वास्थ्य देखभाल के उपयोग को प्रभावित4 . propofol के बजाय sevoflurane के उपयोग वक्ष शल्य चिकित्सा और प्रतिकूल घटनाओं में महत्वपूर्ण कमी के दौर से गुजर रोगियों में फेफड़े की सूजन में सुधार के साथ जुड़ा हुआ था, जैसे ARDS और पश्चात फुफ्फुसीय जटिलताओं5. इसी तरह, isoflurane के साथ उपचार श्वसन यांत्रिकी, ऑक्सीजन, और ARDS6,7के प्रायोगिक पशु मॉडलों में hemodynamics पर सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ा । हालांकि आगे के अध्ययन के लिए हृदय शल्य चिकित्सा, फुफ्फुसीय जटिलताओं में एक समान कमी में परिणामों पर सांस एजेंटों के प्रभाव का पता वारंट है हाल ही में एक मेटा में मनाया गया है विश्लेषण, कि सांस संवेदनाहारी एजेंटों का प्रदर्शन-के रूप में नसों में संज्ञाहरण के लिए विरोध किया-काफी हृदय शल्य चिकित्सा के लिए मृत्यु दर में कमी के साथ जुड़े रहे हैं8.

आईसीयू रोगियों को रोकने या फेफड़ों की क्षति का इलाज करने के लिए बेहोशी की बात के लिए अस्थिर एजेंटों के उपयोग के बारे में विशिष्ट संभावित डेटा की कमी है । हालांकि, कई परीक्षणों अब आईसीयू रोगियों की बेहोशी के लिए साँस sevoflurane की प्रभावकारिता और सुरक्षा का समर्थन, और नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि साँस sevoflurane और isoflurane7,9 सुधार गैस विनिमय, कम वायुकोशीय शोफ, और ARDS के प्रयोगात्मक मॉडल में सूजन क्षीणन । इसके अतिरिक्त, sevoflurane कम प्रकार द्वितीय उपकला कोशिका क्षति10, जबकि isoflurane तंग जंक्शन प्रोटीन11के मॉडुलन के माध्यम से वायुकोशीय-केशिका बाधा की अखंडता का कहना है. हालांकि, आगे के अध्ययन के लिए किस हद तक सांस sevoflurane और isoflurane से अंग संरक्षण के प्रायोगिक सबूत मनुष्यों के लिए अनुवाद किया जा सकता है सत्यापित करने की जरूरत है । हमारे समूह से एक पहली एकल केंद्र यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षण (RCT) पाया कि ARDS के साथ रोगियों में साँस sevoflurane के प्रारंभिक उपयोग में सुधार ऑक्सीजन के साथ जुड़ा हुआ था, कुछ समर्थक भड़काऊ मार्कर के कम स्तर, और कम फेफड़ों उपकला क्षति, के रूप में उंनत glycation अंत के लिए रिसेप्टर के घुलनशील रूप के स्तर के द्वारा मूल्यांकन-उत्पादों (sRAGE) प्लाज्मा में और वायुकोशीय द्रव12.

एक साथ ले लिया, sevoflurane और फेफड़ों की चोट पर isoflurane के लाभकारी प्रभाव कई जैविक रास्ते या कार्यात्मक प्रक्रियाओं है कि क्रोध मार्ग, अर्थात् वायुकोशीय द्रव निकासी (एएफसी), उपकला चोट पर निर्भर कर रहे हैं करने के लिए बिंदु सकता है, translocation ऑफ न्यूक्लियर फैक्टर (NF)-κB, और मैक्रोफेज सक्रियण । इसके अलावा, sevoflurane क्रोध प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है । हमारे अनुसंधान टीम द्वारा पिछले अनुसंधान और दूसरों के बाद से वायुकोशीय सूजन और फेफड़े उपकला चोट में क्रोध के लिए निर्णायक भूमिकाओं का समर्थन/ARDS के दौरान मरम्मत, हम एक प्रयोगात्मक मॉडल के तंत्र का एक शोधों समझ प्रदान करने के लिए डिजाइन फेफड़ों की चोट और मरंमत13,14,15में sevoflurane । sevoflurane और isoflurane के इन विट्रो प्रभाव में एक उपंयास मानव वायुकोशीय उपकला प्राथमिक सेल लाइन विशेष रूप से परिधीय फेफड़ों के वायु रक्त बाधा का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन में जांच की गई, hAELVi (मानव वायुकोशीय उपकला LentiVirus अमर), वायुकोशीय प्रकार मैं कार्यात्मक तंग16जंक्शनों सहित विशेषताओं की तरह के साथ ।

जबकि हमारे इन विट्रो जांच के डिजाइन की तैयारी (जैसे, हवा में वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं की संस्कृतियों-जोखिम के साथ तरल अंतरफलक "साँस" sevoflurane या isoflurane, हम पहले से प्रकाशित अध्ययनों से समझ में है कि sevoflurane के अंशों केवल "हवा" इंटरफेस17,18,19 मानक पर नज़र रखता है (एक नैदानिक सेटिंग में इस्तेमाल करने वालों के समान) का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया है । Halogenated एजेंट सांद्रता आमतौर पर न्यूनतम वायुकोशीय एकाग्रता (मैक) मूल्यों के अनुसार चुना गया (जैसे, मनुष्यों में, sevoflurane के लिए, ०.५, १.१, और २.२ vol%, ०.२५, ०.५ का प्रतिनिधित्व, और 1 मैक, क्रमशः isoflurane के लिए, ०.६, ०.८, और १.३ vol% का प्रतिनिधित्व ०.२५, ०.५, और 1 मैक, क्रमशः)20. वास्तव में, sevoflurane और isoflurane सांद्रता संस्कृति माध्यम में ही कभी नहीं जांच की गई है, इस प्रकार पिछले प्रयोगात्मक मॉडल की वैधता सीमित/ इसके अलावा, सबसे प्रयोगों एक anaerobic जार कि हवा के बाद सील किया गया था sevoflurane युक्त मिश्रण के अंदर फ्लश गया था । जैसा कि हमारा लक्ष्य "शारीरिक" शर्तों के तहत वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं का अध्ययन किया गया था, हम मानते हैं कि इस तरह के एक anaerobic राज्य इष्टतम नहीं हो सकता है और लंबे प्रयोगात्मक अवधि के साथ संगत नहीं होगा. इसलिए, हम हवा में संस्कृति कोशिकाओं को अपनी प्रणाली विकसित तरल अंतरफलक और उंहें halogenated एजेंटों को बेनकाब (sevoflurane और isoflurane) सटीक नियंत्रित "हवा" भागों और इन एजेंटों के लिए "मध्यम" सांद्रता प्रदान करने के उद्देश्य के साथ । हमारी राय में, यह प्रायोगिक कदम है, जो साहित्य में तारीख को सूचित नहीं किया गया है, sevoflurane और isoflurane के इन विट्रो जांच में किसी भी आगे से पहले अनिवार्य है ।

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Protocol

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1. वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं की संस्कृति (hAELVi)

  1. विगलन
    1. पिपेट 4 मिलीलीटर खेती के लिए तैयार-उपयोग मानव वायुकोशीय उपकला (huAEC) एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में मध्यम और जल्दी से एक गरम पानी स्नान (३७ डिग्री सेल्सियस) में शीशी गल ।
    2. 5 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक से पहले मध्यम के 4 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए गल सेल सस्पेंशन स्थानांतरण ।
    3. महाप्राण supernatant और खेती मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली resuspend । फिर, कोशिकाओं को एक T25 कुप्पी में स्थानांतरित ।
    4. मानक शर्तों के तहत कोशिकाओं की खेती (5% CO2, ९५% humidified वायु, ३७ ° c)
  2. विभाजन
    1. कक्ष microscopically की स्थिति की जाँच करें । जब कोशिकाओं 80-90% धाराप्रवाह हैं, कोशिकाओं को विभाजित, 1.2.10 के माध्यम से 1.2.2 चरणों का पालन ।
    2. महाप्राण कोशिकाओं के खेती मीडिया बाँझ पिपेट के साथ ।
    3. Dulbecco के फास्फेट (DPBS) और महाप्राण DPBS के 4 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
    4. कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू जब तक 3 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन से पहले Trypsin/EDTA समाधान (ते) के 1 मिलीलीटर जोड़ें; एक खुर्दबीन के नीचे टुकड़ी के लिए जांच करें ।
    5. संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend और 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । फिर, महाप्राण supernatant और सेल गोली फिर से resuspend खेती मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ ।
    6. कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए trypan नीले रंग अपवर्जन परख का प्रयोग करें । सेल सस्पेंशन के 30 µ l लें और एक ट्यूब में trypan ब्लू के ०.४% सॉल्यूशन के 30 µ l को डालें । उसके बाद, प्रभावी ढंग से हल 3-5 बार एक १०० µ एल पिपेट का उपयोग मिश्रण । हल के 10 µ l ले और उसे hemocytometer के coverslip के नीचे रख दे ।
    7. hemocytometer के क्षेत्रों में व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या और मृत कोशिकाओं की संख्या (नीला) गिनती । फिर, कक्ष व्यवहार्यता [%] समीकरण का उपयोग कर परिकलित करें: कक्ष व्यवहार्यता = १०० – (१००/कुल कोशिकाओं की संख्या एक्स मृत कोशिकाओं की संख्या)
    8. एक नया सेल संस्कृति T25 कुप्पी या एक अच्छी प्लेट 6 के लिए resuspend सेल गोली के साथ aliquot स्थानांतरण । खेती के माध्यम कोशिकाओं को जोड़ने के लिए T25 कुप्पी में खेती मध्यम के 5 मिलीलीटर की कुल प्राप्त करने के लिए, या 6 अच्छी तरह से एक अच्छी प्लेट के लिए 1 मिलीलीटर ।
    9. मानक शर्तों के तहत एक मशीन में कोशिकाओं की खेती (5% CO2, ९५% humidified वायु, ३७ ° c)
    10. एक बार कोशिकाओं को पूरी तरह से धाराप्रवाह हैं, वे प्रयोग के लिए तैयार हैं ।

2. एक हवा तंग चैंबर की तैयारी

नोट: एयर टाइट चैंबर के लिए निर्माण की योजना चित्रा 1में दर्शाई गई है

  1. ६.५ एल की क्षमता के साथ एक hermetic के लिए बॉक्स का उपयोग करें । लंबाई, चौड़ाई, और ऊंचाई 30 x 20 x १५.५ सेमी, क्रमशः कर रहे हैं । कृपया ध्यान दें, बॉक्स की मात्रा के कारण गोल कोनों की सैद्धांतिक मात्रा से कम है ।
  2. पार्श्व दीवार के नीचे की ओर एक २.५ सेमी व्यास छेद ड्रिल ।
  3. एक हरे निशान के साथ एक नालीदार ट्यूब डालें, जो गैस हवा मिश्रण इनपुट पाइप के रूप में काम करेंगे, और यह सिलिकॉन के साथ सील ।
  4. विपरीत पार्श्व दीवार के ऊपर की ओर एक दूसरे २.५ सेमी व्यास छेद ड्रिल ।
  5. एक लाल निशान के साथ एक और नालीदार ट्यूब डालें और यह एक लकड़ी का कोयला फिल्टर है, जो गैस हवा मिश्रण उत्पादन पाइप के रूप में सेवा करेंगे के साथ कनेक्ट, और यह सिलिकॉन के साथ सील ।
  6. बॉक्स का मतलब दीवार के केंद्र में एक तंग 4 मिमी व्यास छेद ड्रिल ।
  7. डालें लघु अर्क टयूबिंग कि एक कई गुना पर जुड़ा हुआ है एक घूर्णन पुरुष luer-ताला, जो एक गैस विश्लेषक में खामियों को दूर किया जाएगा के साथ, और यह सिलिकॉन के साथ सील ।
  8. एयर टाइट चैंबर के अंदर एक डिजिटल थर्मामीटर/आर्द्रतामापी रखें ।

3. बेनकाब वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं Halogenated एजेंटों के लिए (Sevoflurane और Isoflurane)

नोट: डिवाइस का एक योजनाबद्ध आरेखण चित्र 2में दर्शाया गया है.

चेतावनी: हालांकि पशु अध्ययन भ्रूण नुकसान या बिगड़ा प्रजनन के कोई सबूत से पता चला है, और सीजेरियन सेक्शन के दौरान एक बहुत छोटे अध्ययन मां या भ्रूण पर कोई अप्रिय प्रभाव नहीं दिखा था, halogenated एजेंटों का उपयोग करने की सुरक्षा (जैसे, श्रम और प्रसव के दौरान sevoflurane या isoflurane) को आज तक प्रदर्शित नहीं किया गया है । इसके अलावा, कोई नियंत्रित डेटा मानव गर्भधारण के दौरान एकत्र किया गया है । इसलिए, sevoflurane या isoflurane का उपयोग करते हुए प्रयोगों का प्रदर्शन करते हुए गर्भवती दृढ़ता से हतोत्साहित किया जाना चाहिए.

  1. एक प्रयोगशाला चिमटा हुड के तहत काम करते हैं ।
  2. एक संवेदनाहारी मशीन सर्किट अनुकूलित करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) द्वारा नाइट्रस ऑक्साइड की गैस लाइन स्विच ।
  3. अनुकूलित संवेदनाहारी मशीन सर्किट में हरी-चिह्नित, नालीदार ट्यूब के साथ हवा तंग चैंबर प्लग । डालें एक गरम humidifier (जैसे उन आईसीयू वेंटीलेटर पर इस्तेमाल के रूप में) संवेदनाहारी मशीन और हवा तंग चैंबर के बीच पाइप में लगभग ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गैस प्रवाह मिश्रण गर्म
  4. एक गर्म थाली पर हवा तंग चैंबर स्थापित करें, 37 डिग्री सेल्सियस के एक हीटिंग प्लेट तापमान प्रदान करते हैं ।
  5. 6 अच्छी प्लेट वाले hAELVI कोशिकाओं को एयर टाइट चैंबर में रखें और ढक्कन को सील कर दें ।
  6. गैस प्रवाह दरों को विनियमित (यानी, हवा और सह2के मिश्रण) जल्दी मानक शर्तों को प्राप्त करने के लिए, सह के 5% के रूप में परिभाषित2 और humidified हवा के ९५% ।
  7. halogenated एजेंट वाष्पर खोलें और वांछित प्रतिशत का चयन (वर्तमान अध्ययन में, sevoflurane और isoflurane का परीक्षण सांद्रता 4% और 1% थे, क्रमशः).
  8. गैस मिश्रण और sevoflurane या isoflurane एकाग्रता के रूप में एक बाहरी गैस विश्लेषक द्वारा मापा और स्क्रीन पर प्रदर्शित की संरचना ध्यान दें ।
  9. लक्ष्य मूल्यों को प्राप्त कर रहे हैं एक बार, 1 L/मिनट के लिए ताजा गैस प्रवाह की दर को कम.
  10. जब तक प्रयोग के लिए आवश्यक हो, इस गैस प्रवाह दर के साथ वायु-चुस्त चैंबर को बनाए रखा जा सकता है ।

4. क्रोमैटोग्राफी द्वारा नाप Sevoflurane या Isoflurane

  1. नमूनों की तैयारी
    1. अलग समय बिंदुओं पर, बहुत संक्षेप में अध्ययन के नमूनों को बाहर ले चैंबर खुला (वर्तमान अध्ययन में, हम एक अच्छी तरह से प्लेट का इस्तेमाल किया) और ढक्कन बंद । दूसरे नमूने बॉक्स में रखें । फिर, महाप्राण एक बहु मात्रा समायोज्य micropipette के साथ प्रत्येक नमूने में निहित माध्यम के 1 मिलीलीटर ।
    2. मीडियम को 10 मिलीलीटर headspace क्रोमैटोग्राफी शीशियों में डालिये, जो Teflon की सील वाली टोपी के साथ टाइट hermetically से चुदी होनी चाहिये. -20 ° c पर क्रोमैटोग्राफी शीशियों फ्रीज यदि आप उंहें तुरंत उपयोग नहीं करते ।
    3. sevoflurane के एक शेयर समाधान तैयार है और isoflurane के एक और शेयर समाधान, दोनों में ५० g/L पर मेथनॉल । इसके साथ ही, मेथनॉल में क्लोरोफॉर्म (इंटरनल स्टैण्डर्ड, IS) पर 2 g/L का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी मानक समाधान की दुकान ।
    4. ५०, ५०० पर sevoflurane और isoflurane के कार्य समाधान तैयार करें और ultrapure water/dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v) में ५००० mg/L आंतरिक मानकीकरण के लिए, कार्य समाधान मेथनॉल में १०० मिलीग्राम/L पर स्थिर है ।
  2. सेलुलर नमूनों का विश्लेषण
    नोट: निष्कर्षण प्रक्रिया गैस क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री की Bourdeaux एट अल से पहले से मांय विधि पर आधारित है । 1 और संवेदनशीलता और विशिष्टता के एक ही मापदंडों का उपयोग करता है । Sevoflurane और क्लोरोफॉर्म (IS) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया था, और isoflurane multiparametric विश्लेषणात्मक विधि के साथ संबद्ध किया गया था । संक्षेप में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण के लिए, विधि शुद्ध समाधान इंजेक्शन के बाद विकसित किया गया था । उसके बाद, m/z संदर्भ मानकों और साहित्य डेटा के साथ की पुष्टि की थी । तीन m/z प्रत्येक analyte के लिए चुना गया था (सिवाय): एक m/z ठहराव के लिए (सबसे प्रचुर मात्रा में और अधिक), जिसके लिए बहुतायत ठहराव के लिए वक्र के तहत क्षेत्र को एकीकृत करके गणना की गई थी, और पुष्टि के लिए दो एम/ तीन m/z का उपयोग कर, analytes विशेष रूप से पहचाना जा सकता है क्योंकि सभी m/z एक ही प्रतिधारण समय था, साथ ही क्योंकि सभी एम/z मात्रा (आयन पुष्टि बनाम ठहराव के सापेक्ष) शुद्ध मानक में एक ही थे और सभी नमूनों में । इस अधिग्रहण मोड के साथ, analytes और अच्छी विशिष्टता के साथ quantified पहचाना जा सकता है ।
    1. 0.5-400 मिलीग्राम/l और एकाधिक गुणवत्ता नियंत्रण (०.५, 1, 5, 10, 20, ७५, २००, और ४०० मिलीग्राम/l) की एकाग्रता पर्वतमाला के साथ एक अंशांकन 8 बिंदु घटता निर्माण ।
      नोट: प्रत्येक अंशांकन को मान्य करने के लिए, चार गुणवत्ता नियंत्रण का उपयोग किया गया: ठहराव की निचली सीमा (C1 = ०.५ mg/l), दो मध्यवर्ती स्तर (C2 = 20 mg/l और C3 = ७५ mg/l) और अंतिम स्तर (C4 पर ४०० mg/l; ऊपरी स्तर के ठहराव). मैट्रिक्स प्रभाव से बचने के लिए सभी मानकों और नियंत्रणों को कल्चर्ड सेल मैट्रिक्स में विश्लेषण किया गया था । प्रत्येक अंशांकन वक्र के लिए, एक रिक्त मैट्रिक्स को मांय करने के लिए कि वहां संस्कृतिपूर्ण सेलुलर और आंतरिक मानकों के साथ कोई हस्तक्षेप नहीं था विश्लेषण किया गया ।
    2. sevoflurane के एक शेयर समाधान तैयार है और isoflurane के एक और शेयर समाधान, दोनों में ५० g/L पर मेथनॉल । इसके साथ ही, मेथनॉल में क्लोरोफॉर्म (इंटरनल स्टैण्डर्ड, IS) पर 2 g/L का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें । -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी मानक समाधान की दुकान । फिर, ultrapure जल/dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v) में ५०, ५००, और ५००० mg/L पर मिश्रित sevoflurane/isoflurane के कार्य समाधान तैयार करें । के लिए है, काम समाधान मेथनॉल में १०० mg/L पर पतला है ।
    3. अंशांकन curves और नियंत्रण के लिए, spiking द्वारा नमूनों तैयार ५० µ एल के है (१०० mg/l) सेलुलर नमूना मैट्रिक्स के 1 मिलीलीटर में.
    4. एक 10 मिलीलीटर headspace ट्यूब में संतृप्त सोडियम क्लोराइड पानी समाधान के २०० µ एल के साथ नमूना समाधान तैयार, एक Teflon सील टोपी के साथ तंग hermetically ।
  3. गैस क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री
    1. नमूना विश्लेषण के लिए, एक गैस क्रोमैटोग्राफी में headspace इंजेक्शन का प्रयोग करें, सामूहिक जांच विधि के साथ युग्मित ।
    2. एक हीटर शेखर के साथ ८० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए headspace ट्यूबों कैर्री । फिर, गैस chromatograph में १.५ मिलीलीटर गैस के नमूने निकालकर इंजेक्ट करें । २६० डिग्री सेल्सियस पर एक विभाजन के प्रवाह के साथ क्रोमैटोग्राफी के शुरू में 2 मिनट के लिए १०० एमएल/मिनट पर इंजेक्टर के पैरामीटर सेट करें ।
    3. एक वाहक मोड-क्रमादेशित दबाव के साथ विभाजन/ सबसे पहले, ०.१५ मिनट के लिए ४० केपीए पर गैस का दबाव रखें । फिर, दर कार्यक्रम दबाव बढ़ाने के लिए १२५ केपीए/मिनट की दर की स्थापना से पहले १५० केपीए करने के लिए ३०० केपीए दबाव 5 मिनट के लिए 16 केपीए/
    4. इंजेक्शन के लिए एक साथ, 1 मिनट के लिए ६० ° c के एक ओवन तापमान के साथ शुरू और १४० डिग्री सेल्सियस का तापमान 20 डिग्री सेल्सियस की दर पर पहुंच गया है जब तक वृद्धि/ फिर, जब तक २५० डिग्री सेल्सियस हासिल किया है फिर से तापमान में वृद्धि । रन का कुल समय 7 मिनट है ।
    5. एक जुड़े-सिलिका केशिका कॉलम (30 एम x १.४ µm, ०.२५ mm आईडी) का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी जुदाई बाहर ले । एक एकल आयन निगरानी (सिम) हालत के साथ सामूहिक प्रयोगों प्रदर्शन, और मॉनिटर आयन ठहराव m/z १८१, और आयन योग्यता m/z १५१ और ५१ एक साथ एक अवधारण समय (RT) sevoflurane के लिए २.३० min के, m/z १४९ (आयन ठहराव), m/z ११५ और ८७ (आयन rt २.८ मिनट पर isoflurane के लिए योग्यता), और m/z ८३ (आयन ठहराव) rt ३.७० मिनट पर क्लोरोफॉर्म के लिए.
    6. सेल संस्कृति में sevoflurane और isoflurane की सांद्रता का निर्धारण अपने क्षेत्र के अनुपात से है कि एक वजन द्विघात फिट का उपयोग कर रहा है । sevoflurane और isoflurane के लिए ठहराव (LLOQ) की निचली सीमा ०.५ mg/l पर थी और ठहराव (ULOQ) की ऊपरी सीमा ४०० मिलीग्राम/

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Representative Results

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sevoflurane और isoflurane, जो समय के साथ मध्यम में भंग की सांद्रता, क्रमशः तालिका 1 और तालिका 2में सूचित कर रहे हैं ।

माध्यम में sevoflurane और isoflurane सांद्रता के पाठ्यक्रम समय के साथ समान थे । halogenated एजेंट की आवश्यकता एकाग्रता के तुरंत बाद सेट किया गया था, सांद्रता पहले घंटे से अधिक गुलाब । इसके बाद एक पठार पहुंच गया, जो halogenated एजेंट के प्रशासन के रोके जाने तक कायम रहा । प्रशासन व्यवधान के बाद, सांद्रता एक घंटे (आंकड़ा 3) के भीतर कम हो गई ।

पहले घंटे के बाद, मध्यम में sevoflurane और isoflurane के औसत सांद्रता थे २५१ mg/l और 25 mg/l, क्रमशः । विभिन्न प्रयोगों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया.

Figure 1
चित्रा 1: हवा तंग चैंबर के निर्माण की योजना कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: उपकरण के योजनाबद्ध ड्राइंग कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: sevoflurane की एकाग्रता (n = 5) और isoflurane (n = 5) समय के साथ. एक) समय के साथ halogenated एजेंट की एकाग्रता । मान mg/L में व्यक्त कर रहे हैं मान मतलब और SEM. B में व्यक्त कर रहे हैं ) प्रत्येक प्रयोग के लिए समय पर halogenated एजेंट की एकाग्रता. मान एमजी में व्यक्त कर रहे हैं/एल सी) halogenated एजेंट के अंश हवा तंग गैस विश्लेषक द्वारा मापा चैंबर में समय के साथ । मूल्यों प्रतिशत में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समय मध्यम में sevoflurane की एकाग्रता sevoflurane के अंश
(mg/L) हवा में चुस्त चैंबर
औसत आईसी (%)
5 min 27 [19-31] ४.६
30 min १५२ [१४२-१५२] ४.१
1 ज २५१ [२४३-३३२] ४.१
4 ज २५९ [२५६-२७१] ४.२
8h २६५ [२३७-२८०] ४.२
24 ज (रोक) २१८ [१९६-२४७] ४.३
5 मिनट रोकें २३७ [२१४-२४१] 0
+ 30 मिनट रोकें ९२ [९१-१०४] 0
रोक + 1 ज ५७ [४२-५८] 0

तालिका 1: sevoflurane की सांद्रता समय के साथ-साथ मध्यम में घुलजाती है । संख्यात्मक डेटा एकाग्रता के लिए interquartile रेंज के साथ एक औसत मूल्य के रूप में और अंश के लिए प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । IQR (interquartile श्रेणी के लिए)

समय मध्यम में isoflurane की एकाग्रता isoflurane के अंश
(mg/L) हवा में चुस्त चैंबर
औसत आईसी (%)
5min 2 [2-२.५] ०.८
30min 16 [4-18] १.३
1h 22 [18-27] ०.९
4h 30 [25-31] १.४
8h 22 [15-26] १.२
24 (बंद) 26 [23-27] १.१
Stop + 5min 19 [12-25] 0
Stop + 30min 4 [4-4] 0
रोकें + a 1 [०.८-1] 0

तालिका 2: isoflurane की सांद्रता समय के साथ-साथ मध्यम में घुलजाती है । संख्यात्मक डेटा एकाग्रता के लिए interquartile रेंज के साथ एक औसत मूल्य के रूप में और अंश के लिए प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । IQR (interquartile श्रेणी के लिए)

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Discussion

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हमारे प्रोटोकॉल halogenated संवेदनाहारी एजेंट, जैसे sevoflurane या isoflurane का एक सटीक अंश करने के लिए कक्षों को अरक्षित करने के लिए एक आसान विधि का वर्णन करता है । इसके अलावा, हम यहां रिपोर्ट-पहली बार के लिए-दोनों के बीच एक कठोर संबंध गैस अंश और संस्कृति माध्यम ही अंदर sevoflurane और isoflurane की एकाग्रता । यह मौलिक कदम अब हमें सुरक्षित रूप से हमारे हवा तंग चैंबर का उपयोग करने के लिए मानव वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं की एक संस्कृति monolayer में इन halogenated एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है ।

वर्तमान में, सबसे अनुसंधान टीमों वायुकोशीय कोशिकाओं में sevoflurane के प्रभाव का अध्ययन एक जार है कि पहले halogenated गैस के साथ संतृप्त है और फिर सील का उपयोग करें । इस मामले में, sevoflurane metabolized हो सकता है, और यह अनुमान लगाया जा सकता है कि अस्थिर एजेंट के अंश रेखीय समय के साथ कम हो सकता है, एक अस्थिर गैस एकाग्रता के लिए अग्रणी । हालांकि, sevoflurane के गैस अंश और संस्कृति माध्यम में उसकी एकाग्रता के बीच सहसंबंध स्पष्ट रूप से साहित्य में सूचित नहीं है । आमतौर पर, इन प्रयोगों में इस्तेमाल sevoflurane की एकाग्रता गैस अंश और मैक के बीच एक सरल संबंध के आधार पर चुना जाता है. मैक १९६५ में पेश किया गया था और फेफड़ों में एक वाष्प की एकाग्रता है कि एक शल्य उत्तेजना (दर्द)22के जवाब में विषयों के ५०% में एक मोटर प्रतिक्रिया (आंदोलन) को रोकने की जरूरत है । मैक शक्ति, या शक्ति, संवेदनाहारी वाष्पों की तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । आईसीयू रोगियों में, मैक FeSevo और नैदानिक रिचमंड आकलन आंदोलन के लिए संबंधित है-बेहोशी स्केल (ञास)23। हालांकि यह दैनिक नैदानिक अभ्यास में एक उपयोगी संकेतक है, इस पैरामीटर की प्रासंगिकता में प्रयोगात्मक की सेटिंग में कभी नहीं जांच की गई है इन विट्रो अनुसंधान हमारे प्रोटोकॉल में, माध्यम के क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हम गैस अंश में निहित sevoflurane और माध्यम में भंग sevoflurane के बीच सटीक सहसंबंध निर्धारित किया है । इस विधि के साथ, एक अस्थिर एजेंट के विशिष्ट प्रभाव एक नैदानिक प्रभाव के सन्निकटन पर आधारित बजाय माध्यम में वास्तविक एकाग्रता के अनुसार व्यक्त की है. यह महत्वपूर्ण तत्व एक मध्यम में बढ़ रही कोशिकाओं पर एक halogenated एजेंट की एक सटीक एकाग्रता के विशिष्ट प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है, आदेश में साँस एजेंटों के विभिन्न सांद्रता के प्रभाव की तुलना करने के लिए. इसके अलावा, के रूप में हवा तंग चैंबर बहुत उपयोग करने के लिए आसान है, इस विधि शोधकर्ताओं परिशुद्धता के साथ प्रयोग को दोहराने के लिए अनुमति देता है ।

एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा है कि गैस अंश और प्रायोगिक अनुसंधान में मैक के बीच सहसंबंध का उपयोग बाधा हो सकता है कि एक halogenated एजेंट रक्त में कम घुलनशीलता है (रक्त/37 डिग्री सेल्सियस पर sevoflurane के लिए ०.६९ के लिए ०.६३ alveoli में दबाव से पहले रक्त में भंग करने के लिए sevoflurane की एक न्यूनतम मात्रा धमनी में दबाव के साथ संतुलन प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है । इस प्रकार, संज्ञाहरण के प्रेरण के दौरान, वायुकोशीय (अंत ज्वार) एकाग्रता (वायुसेना, वायुकोशीय अंश) sevoflurane के तेजी से प्रेरित एकाग्रता के आसपास बढ़ जाती है (FI, प्रेरित अंश). हालांकि, इन विट्रो में संस्कृति की स्थिति ऐसे तंत्र की अनुमति नहीं है, और सामांय सेल मीडिया मुख्य रूप से जलीय समाधान से मिलकर बनता है । इसके अलावा, पानी/गैस के बीच घुलनशीलता गुणांक (37 डिग्री सेल्सियस पर विभाजन गुणांक = ०.३६ sevoflurane के लिए) रक्त और गैस के बीच की तुलना में कम है, क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण प्रदर्शन के महत्वपूर्ण महत्व अंतर्निहित ।

इसके अतिरिक्त, जब एक सील जार प्रयोग किया जाता है, जार में वायुमंडलीय ऑक्सीजन कार्बन डाइऑक्साइड की एक साथ पीढ़ी के साथ कोशिकाओं द्वारा अवशोषित कर लेता है । यह प्रभाव शायद कम प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में नगण्य है, लेकिन अब प्रयोगात्मक अवधि के लिए, कोशिकाओं है कि ऑक्सीजन से वंचित कर रहे हैं एक anaerobic चयापचय के लिए स्विच; चयापचय में यह परिवर्तन प्रयोगात्मक विश्लेषण में पूर्वाग्रह की एक निश्चित डिग्री पैदा कर सकता है । सील जार के विपरीत, जब हमारे हवा तंग चैंबर, दोनों ऑक्सीजन और halogenated एजेंट प्रवाह का उपयोग करने के लिए लक्षित स्तर को बनाए रखने के लिए समय के साथ समायोज्य रहे हैं । हमारे प्रोटोकॉल की यह प्रमुख विशेषता इसलिए लंबे समय अवधियों के लिए इन विट्रो प्रयोगों के डिजाइन की अनुमति देता है (जैसे, एक दिन से अधिक), यह एक दिलचस्प उपकरण सेलुलर फेफड़ों उपकला चोट में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए बना रही है और समय के साथ मरंमत, खासकर जब halogenated एजेंटों का उपयोग किया जाता है । दरअसल, वायुकोशीय चोट के दौरान फेफड़े की कोशिकाओं या ऊतक पर साँस संवेदनाहारी एजेंटों के प्रभाव खराब तारीख करने के लिए जांच की है, जबकि इस वैकल्पिक चिकित्सा के लिए बहुत उत्साहजनक परिणाम12दिखाने लगता है रहते हैं ।

हालांकि, इस तकनीक की सीमाएं हैं । सबसे पहले, एक संवेदनाहारी मशीन सर्किट के लिए ऑक्सीजन, कार्बन डाइऑक्साइड, और halogenated एजेंट गैस प्रवाह प्रदान करने की जरूरत है । इस तरह के एक उपकरण का उपयोग करने के लिए प्रवाह की दर निर्धारित और समय के साथ स्थिर सांद्रता बनाए रखना अनिवार्य है । दूसरा, क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण करने से पहले माध्यम नमूना करने के लिए, हवा तंग कक्ष संक्षेप में खोला गया है, जो गैस सांद्रता में एक क्षणिक कमी लाती है. जैसा कि हम एक संवेदनाहारी मशीन सर्किट का उपयोग करें, गैस प्रवाह के बाद उंमीद की सांद्रता फिर से गैस विश्लेषक पर प्राप्त कर रहे है वृद्धि हुई है । तीसरा, हम प्रत्येक halogenated एजेंट के केवल एक अंश के लिए मध्यम में एकाग्रता मापा है, एक पिछले अध्ययन के आधार पर प्राथमिकताओं चुना । चौथा, वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के विकास के लिए सेल माध्यम को स्थिर करने के लिए, हम 5% की एकाग्रता पर कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करने की जरूरत है । दरअसल, कोई संवेदनाहारी मशीन सर्किट कार्बन डाइऑक्साइड की ऐसी एकाग्रता प्रदान करता है । इसलिए, संवेदनाहारी मशीन सर्किट के लिए नाइट्रस ऑक्साइड के स्थान पर कार्बन डाइऑक्साइड गैस के प्रवाह के कनेक्शन की अनुमति अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस तरह के एक कनेक्शन विशेष रूप से प्रयोगात्मक अनुसंधान की सेटिंग में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और सावधानी से प्रत्येक प्रयोग के बाद अनप्लग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, मनुष्यों के लिए किसी भी जोखिम से बचने के लिए, हम शोधकर्ताओं को आमंत्रित करने के लिए एक समर्पित संवेदनाहारी मशीन सर्किट का उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन और एक नैदानिक संज्ञाहरण के लिए समर्पित मशीन का उपयोग नहीं है ।

इस तकनीक का मुख्य लाभ कर रहे है कि यह अपेक्षाकृत सस्ती और बहुत अपनाने के लिए आसान है, यहां तक कि जब शोधकर्ताओं ने पहले एक वाटरप्रूफ चैंबर हेरफेर नहीं किया है । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल के साथ, भंग sevoflurane और isoflurane सांद्रता के परिणाम reproducible हैं, जो प्रयोगात्मक अनुसंधान के लिए एक प्रमुख गुणवत्ता कसौटी का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा, हमारी प्रणाली ऐसे desflurane के रूप में अंय अस्थिर halogenated एजेंटों, के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है । दरअसल, गैस वाष्पक डिवाइस के प्रकार का एक सरल परिवर्तन इस मामले में पर्याप्त होगा । इसी प्रकार, हमारी प्रणाली विभिन्न solubilities के साथ किसी भी प्रकार के माध्यम में घुल sevoflurane या isoflurane की सांद्रता का अध्ययन करने का साधन प्रदान कर सकती है जैसे पानी, रक्त, या तेल ।

हमारा प्रयोग एक बुनियादी कदम है कि एक बड़ी परिकल्पना है कि sevoflurane और isoflurane फेफड़ों की चोट, सूजन, और एएफसी के माध्यम से क्रोध-मध्यस्थता रास्ते पर लाभकारी प्रभाव डालती है परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया परियोजना का हिस्सा है का प्रतिनिधित्व करता है । मानव वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति transepithelial द्रव परिवहन की यंत्रवत जांच के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, चैनल विशेष द्रव परिवहन (जैसे, औषधीय विरोध का उपयोग करते हुए), उपकला paracellular पारगम्यता, घाव की मरम्मत, सेल प्रवास और प्रसार, के साथ या बिना एक halogenated संवेदनाहारी एजेंट (sevoflurane या isoflurane), अकेले या cytomix के साथ संयुक्त (इनविट्रो में वायुकोशीय चोट के मॉडल)24.

अंत में, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से ARDS के दौरान उपकला फेफड़ों की चोट में शामिल तंत्र की हमारी समझ में सुधार करने के लिए और परीक्षण करने के लिए इन विट्रो में sevoflurane या isoflurane की सटीक और नियंत्रित सांद्रता तक पहुँचने के लिए डिज़ाइन किया गया था इस बार और जीवन की धमकी सिंड्रोम के लिए चिकित्सा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक Auvergne क्षेत्रीय परिषद ("कार्यक्रम नोव्यू Chercheur de la Région Auvergne" २०१३) और फ्रेंच Agence नेशनल डे ला सभ्य और दिशा Générale de L'Offre de Soins ("कार्यक्रम de सभ्य Translationnelle en Santé" स्वीकार करते हैं ANR-13-PRTS-0010) के लिए अनुदान । funders अध्ययन डिजाइन, आचरण में कोई प्रभाव नहीं था, और विश्लेषण या इस लेख की तैयारी में ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

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References

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इन <em>विट्रो में</em> प्रसंस्कृत वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं में Halogenated गैसों की सांद्रता को नियंत्रित करने के लिए विधि
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Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

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