Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Metode for å kontrollere konsentrasjoner av halogenerte gasser i kulturperler Alveolar epitelceller

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Vi beskriver en enkel protokoll utviklet til presis og kontrollert konsentrasjoner av desflurane eller isoflurane i vitro for å forbedre vår forståelse av mekanismer involvert i epithelial lunge skaden og teste roman behandling for akutt respiratory distress syndrom.

Abstract

Akutt respiratory distress syndrom (ARDS) er et syndrom diffus alveolar skader med nedsatt alveolar vann Demovarer og alvorlig betennelse. Bruk av halogenerte stoffer, som desflurane eller isoflurane, for sedasjon intensivavdelingen (ICU) pasienter kan forbedre gassutveksling, redusere alveolar ødem og attenuere betennelse under ARDS. Imidlertid mangler data på bruk av inhalert agenter for kontinuerlig sedasjon i ICU å behandle eller forebygge lungeskade. For å studere virkningene av halogenerte agenter på alveolar epitelceller under "fysiologiske" forhold, vi beskriver et enkelt system kultur celler i luft-flytende grensesnittet og utsette dem for halogenerte agenter å gi presise kontrollert "air" fraksjoner og "medium" konsentrasjoner for disse agentene. Vi utviklet en forseglet lufttett kammer som plater med menneskelige alveolar udødeliggjort epitelceller kan bli utsatt for en presis, kontrollert brøkdel av desflurane eller isoflurane med en kontinuerlig gasstrømmen fra en anesthetic maskin krets. Cellene ble utsatt for 4% av desflurane og 1% av isoflurane i 24 timer. Gass massespektrometri ble utført for å bestemme konsentrasjonen av halogenerte agenter oppløst i mediet. Etter først var time, konsentrasjonen av desflurane og isoflurane i medium 251 mg/L og 25 mg/L, henholdsvis. Kurvene som representerer konsentrasjonen av både desflurane og isoflurane oppløst i medium viste lignende kurs over tid, med et platå nådd på én time etter eksponering.

Denne protokollen ble spesielt utformet å nå presis og kontrollert konsentrasjoner av desflurane eller isoflurane i vitro å forbedre vår forståelse av mekanismer involvert i epithelial lungen skade under ARDS og teste romanen terapi for den syndrom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akutt respiratory distress syndrom (ARDS) er et klinisk syndrom preget av diffus alveolar skade, lunge ødem og hypoxemic respirasjonssvikt. Selv ARDS representerer mer enn 10% av intensivavdelingen (ICU) innleggelser og nesten 25% av ICU pasienter som krever mekanisk ventilasjon, er det fortsatt en under-anerkjent utfordring for klinikere, med en hospital dødelighet 35-45%1. Til tross for intens forskning, har identifikasjon av en effektiv ARDS pharmacologic terapi eller forebygging ikke datoen. To større vise egenskaper bidra til dødelighet i ARDS: svekket alveolar vann Demovarer (AFC) (dvs. den endrede benresorpsjon alveolar ødem væske fra distale lunge Luftromsklassifisering) og alvorlig betennelse2. Siden ARDS dødelighet er fortsatt høy, bør gjeldende tiltak også inkludere primærforebygging; men er en viktig utfordring å identifisere i risikosonen pasienter hvem ARDS er sannsynlighet for å utvikle og som ville ha nytte hvis ARDS ble forhindret.

Flyktige halogenerte bedøvelse, som desflurane og isoflurane, brukes til å gi generell anestesi i operasjonssalen. Over hele verden, mer enn 230 millioner pasienter gjennomgå større kirurgi hvert år krever narkose og mekanisk ventilasjon3, og postoperativ lunge komplikasjoner påvirke kliniske utfall og helsetjenester utnyttelse4 . Bruk av desflurane i stedet for propofol var assosiert med bedre lungebetennelse i pasienter som gjennomgår thorax kirurgi og betydelig nedgang i uønskede hendelser, som ARDS og postoperativ lunge komplikasjoner5. Tilsvarende hadde forbehandling med isoflurane beskyttende effekt på luftveiene mekanikk og oksygenering hemodynamics i eksperimentell dyremodeller ARDS6,7. Selv om videre studier er garantert for å ta effekten av inhalert agenter på resultater i noncardiac kirurgi, en tilsvarende reduksjon i lunge komplikasjoner er observert nylig i en meta-analyse, demonstrere som inhalert bedøvende agenter, som motsetning til intravenøs anestesi, er betydelig forbundet med en nedgang i dødeligheten for kirurgi8.

Spesifikke potensielle data om bruk av flyktige agenter for beroligende ICU pasienter for å forebygge eller behandle lungeskade mangler. Imidlertid flere forsøk støtter nå effekt og sikkerhet av inhalert desflurane for beroligende ICU pasienter og prekliniske studier har vist at inhalert desflurane og isoflurane7,9 bedre gassutveksling, redusere alveolar ødem, og attenuere betennelse i eksperimentelle modeller av ARDS. I tillegg begrenser desflurane type II epithelial celle skade10, mens isoflurane opprettholder integriteten til alveolar-kapillære barrieren gjennom modulering av tett krysset protein11. Men er videre studier nødvendig å kontrollere i hvilken grad den eksperimentelle beviset på orgel beskyttelse inhalert desflurane og isoflurane kan oversettes til mennesker. En første single-senter randomisert kontrollert-studie (RCT) fra vår gruppe fant at tidlig bruk av inhalert desflurane hos pasienter med ARDS var assosiert med bedre oksygenering, reduserte nivåer av noen pro-inflammatoriske markører, og redusert lunge epithelial skade, som vurdert av nivåer av løselig form av reseptoren for avanserte glycation sluttprodukter (sRAGE) i plasma og alveolar væske12.

Sammen kunne de gunstige effektene av desflurane og isoflurane på lunge skade peke til flere biologiske banene eller funksjonelle prosesser som er avhengige av RASERI veien, nemlig alveolar vann Demovarer (AFC), epithelial skade, translokasjon av kjernefysiske faktor (NF)-κB, og macrophage aktivisering. I tillegg kan desflurane påvirke uttrykket av RASERI protein selv. Siden tidligere forskning av vår forskningsteam og andre støtter avgjørende roller for RASERI i alveolar betennelse og lunge epithelial skade/reparasjon under ARDS, utviklet vi en eksperimentell modell å gi en translational forståelse av mekanismer for desflurane i lungen skade og reparasjon13,14,15. I vitro effekten av desflurane og isoflurane ble undersøkt i en roman human alveolar epithelial primære celle linje designet spesielt luft-blod barrieren av eksterne lungene, hAELVi (menneskelige Alveolar Epithelial LentiVirus udødeliggjort), med alveolar-lignende egenskaper inkludert funksjonelle stramt veikryss16.

Klargjøring av utformingen av våre i vitro undersøkelser (f.eks kulturer av alveolar epitelceller på luft-flytende grensesnittet med eksponering for "innånding" desflurane eller isoflurane, vi forsto fra tidligere publiserte studier som deler av desflurane har bare blitt vurdert i "luften" grensesnitt17,18,19 bruker standard skjermer (ligner på de som brukes i en klinisk setting). Halogenerte agent konsentrasjoner ble vanligvis valgt i henhold til minimum alveolar konsentrasjon (MAC) verdiene (f.eks i mennesker, for desflurane, 0,5, 1.1 og 2.2 vol %, som representerer 0,25 0,5 og 1 MAC, henholdsvis; for isoflurane, 0,6, 0.8, og 1.3 vol % representerer 0,25 0,5 og 1 MAC, henholdsvis)20. Faktisk, desflurane og isoflurane konsentrasjoner har aldri vært undersøkt i kultur medium, dermed begrense gyldigheten av tidligere eksperimentelle modeller/instrumenter. Videre brukt de fleste eksperimenter en anaerob glasset som var forseglet etter luft blanding som inneholder desflurane hadde blitt tømt inne. Som målet var å studere alveolar epitelceller under "fysiologiske" forhold, trodde vi at slik en anaerob stat ikke kan optimal og ville ikke være kompatibel med lang eksperimentelle varigheter. Derfor vi utviklet vår egen kultur celler i luft-flytende grensesnittet og utsette dem for halogenerte agenter (desflurane og isoflurane) med sikte på å gi presise kontrollert "air" fraksjoner og "medium" konsentrasjoner for disse agentene. Etter vår mening er denne eksperimentelle trinnet, som ikke har blitt rapportert i litteraturen hittil, obligatorisk før noen videre i vitro undersøkelser av desflurane og isoflurane.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. kultur Alveolar epitelceller (hAELVi)

  1. Tiner
    1. Pipetter 4 mL dyrking klar-å-bruke menneskelige alveolar epiteliale (huAEC) medium i et 15 mL plastrør og raskt tine ampullen i en forvarmet vannbad (37 ° C).
    2. Overføre tinte celle suspensjon til et 15 mL plastrør som inneholder 4 mL av mediet før sentrifugering røret på 200 x g i 5 min.
    3. Sug opp nedbryting og resuspend celle pellets med 5 mL dyrking medium. Deretter overføre cellene til en T25 kolbe.
    4. Dyrke cellene under standard betingelser (5% CO2, 95% fuktet luft, 37 ° C)
  2. Deling
    1. Kontrollere statusen for cellene mikroskopisk. Når cellene er 80-90% confluent, dele cellene, følgende 1.2.2 gjennom 1.2.10.
    2. Sug opp dyrking media av cellene med en bakteriefri pipette.
    3. Vask cellene gang med 4 mL av Dulbeccos fosfat bufret saltvann (DPBS) og Sug opp DPBS.
    4. Legge til 1 mL av Trypsin/EDTA løsning (TE) i cellene før rugende ved 37 ° C i 3 minutter til cellene begynner å koble; se etter avdeling under et mikroskop.
    5. Resuspend cellene med 2 mL kultur medium og sentrifuge cellene på 200 x g i 5 min. Deretter Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet igjen med 3 mL dyrking medium.
    6. Bruk trypan blå fargestoff utelukkelse analysen for å bestemme levedyktigheten til cellene. Ta 30 µl av cellen suspensjon og legge 30 µl av en 0,4% løsning av trypan blå i et rør. Etter det, effektivt bland løsning 3 - 5 ganger ved hjelp av en 100 µl pipette. Ta 10 µl av løsningen og setter det under dekkglassvæske av hemocytometer.
    7. Telle både antall levedyktige cellers og antall døde celler (blå) innen hemocytometer. Deretter beregne celle levedyktigheten [%] ved hjelp av formelen: celle levedyktighet = 100-(100 / totalt antall celler x antall døde celler)
    8. Overføre aliquot med resuspended celle pellets til en ny celle kultur T25 kolbe eller en 6 vel-plate. Legge til dyrking mediet cellene å oppnå totalt 5 mL av dyrking medium T25 kolbe eller 1 mL for hver brønn av 6 vel-plate.
    9. Dyrke cellene i en inkubator under standard betingelser (5% CO2, 95% fuktet luft, 37 ° C)
    10. Når cellene er helt confluent, er de klar for eksperimentet.

2. forberedelse av en lufttett kammer

Merk: Bygging plan for lufttett kammeret er avbildet i figur 1.

  1. Bruk en hermetiske polypropylen bokse med en kapasitet på 6,5 L. Lengde, bredde og høyde er 30 x 20 x 15.5 cm, henholdsvis. Merk volumet av boksen er lavere enn det teoretiske volumet på grunn av avrundede hjørner.
  2. Bore 2,5 cm diameter hull på undersiden av den laterale veggen.
  3. Sett inn en korrugert rør med et grønt merke, som vil tjene som gass-luft blandingen inn røret, og forsegle den med silisium.
  4. Bore andre 2,5 cm diameter hull på toppen av motsatt laterale veggen.
  5. Sett inn en annen korrugert rør med et rødt merke og koble den med et kull filter som vil tjene som gass-luft blanding produksjon røret, og forsegle den med silisium.
  6. Bore et stramt 4 mm diameter hull i midten av mener veggen av boksen.
  7. Sett inn kort infusjon rør som er koblet på en manifold med en roterende mannlige luer-lock, som vil være koblet til en gass analysator, og forsegle den med silisium.
  8. Plass et digitalt termometer/hygrometer inne lufttett kammeret.

3. vise Alveolar epitelceller til halogenerte agenter (desflurane og Isoflurane)

Merk: En skjematisk tegning av enheten er avbildet i figur 2.

Advarsel: Selv om dyrestudier har avdekket ingen bevis for fosterskader eller redusert fruktbarhet, og en svært liten studie under cesarean deler ikke viser noen uheldige effekter på mor eller Foster, sikkerheten ved bruk av halogenerte agenter (f.eks desflurane eller isoflurane) under fødsel og levering er ikke blitt påvist hittil. Videre har ingen kontrollerte data blitt innsamlet under menneskelige svangerskap. Derfor utføre eksperimenter ved hjelp av desflurane eller isoflurane mens gravid bør være sterkeste.

  1. Arbeid under et laboratorium vifte.
  2. Tilpasse en anesthetic maskin krets for å bytte gassledningen lystgassutslipp av karbondioksid (CO2).
  3. Koble lufttett kammeret med grønn-merket, korrugerte røret til tilpasset bedøvende maskin krets. Sette inn en oppvarmet luftfukter (for eksempel de som brukes på ICU ventilatorer) inn i røret mellom bedøvende maskinen og lufttett kammeret å varme flyt gassblanding ca 37 ° c
  4. Installere lufttett kammer på en kokeplate, gir en oppvarming plate temperaturen på 37° C.
  5. Lagt til 6 vel-plate inneholder hAELVI cellene i lufttett kammer og forsegle lokket.
  6. Regulere gass strømningshastigheter (dvs. blanding av luft og CO2) for å raskt få standardvilkår, definert som 5% av CO2 og 95% av fuktet luft.
  7. Åpne halogenerte agent fordamperen og velg ønsket ønsket (i studien, testet konsentrasjonen av desflurane og isoflurane var 4% til 1% henholdsvis).
  8. Merk sammensetningen av gass blanding og desflurane eller isoflurane konsentrasjon som målt ved en ekstern gass analyserer og vises på skjermen.
  9. Når verdiene som målet er oppnådd, redusere infusjonshastigheten frisk gass til 1 L/min.
  10. Lufttett kammeret kan vedlikeholdes med denne gass flow rate så lenge som nødvendig for eksperimentet.

4. måle desflurane eller Isoflurane av kromatografi

  1. Forberedelse av prøver
    1. På forskjellige tidspunkt, veldig kort åpne kammeret å ta ut studerte prøvene (studien, vi brukte en 6 vel-plate) og lukke lokket. Behold de andre prøvene i boksen. Deretter Sug opp 1 mL av mediet i hvert utvalg med multi-volum justerbar brønnene.
    2. Sette mediet i 10 mL headspace kromatografi ampuller, som bør være skrudd hermetisk tett med en Teflon-forseglet cap. Fryse kromatografi hetteglass på 20 ° C hvis du ikke bruker dem umiddelbart.
    3. Forbered en lager løsning av desflurane og en annen lager løsning av isoflurane, både på 50 g/L i metanol. Samtidig, Forbered en lagerløsning av kloroform (intern standard, er) på 2 g/L i metanol. Lagre alle standard løsninger på 20 ° C.
    4. Forbered arbeidet løsninger for desflurane og isoflurane på 50 og 500 5000 mg/L i ultrapure vann/dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v). For interne standardisering fast fungerende løsning på 100 mg/L i metanol.
  2. Analyse av mobilnettet prøver
    Merk: Utvinning prosedyren er basert på den tidligere godkjent metoden for gass kromatografi og massespektrometri fra Bourdeaux et al. 1 og bruker samme parametre for følsomhet og spesifisitet. Desflurane og kloroform (IS) ble brukt i denne protokollen, og isoflurane var forbundet med den multiparametric analysemetode. Kort, til massespektrometri oppkjøp, metoden ble utviklet etter ren løsning injeksjon. Deretter ble m/z bekreftet med referanse standarder og litteratur data. Tre m/z ble valgt for hver analytt (unntatt IS): en m/z for kvantifisering (de mest tallrike og høyere), som overflod ble beregnet ved å integrere området under kurven for kvantifisering og to m/z for bekreftelse. Bruker tre m/z, kunne analytter være spesifikt identifisert fordi alle m/z hadde samme oppbevaringsperioden, samt fordi alle m/z beløp (slektning av ion bekreftelse vs kvantifisering) var de samme i ren standarden og alle prøvene. Med dette oppkjøpet-modus, kan analytter identifiseres og kvantifisert med fint spesifisitet.
    1. Konstruere en kalibrering 8-punkts kurver med konsentrasjon intervaller på 0,5-400 mg/L og flere kontroller (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 og 400 mg/L).
      Merk: For å validere hver kalibrering, fire kvalitetskontroll ble brukt: den laveste grensen for kvantifisering (C1 = 0,5 mg/L), to middels nivåer (C2 = 20 mg/L og C3 = 75 mg/L) og det siste nivået (C4 på 400 mg/L, øvre nivået for kvantifisering). Alle standarder og kontroller ble analysert i kulturperler celle matriser å unngå matrix effekten. For hver kalibreringskurven, var en tom matrise analysert for å bekrefte at det ikke var noen inngrep i kulturperler mobilnettet og interne standarder.
    2. Forbered en lager løsning av desflurane og en annen lager løsning av isoflurane, både på 50 g/L i metanol. Samtidig, Forbered en lagerløsning av kloroform (intern standard, er) på 2 g/L i metanol. Lagre alle standard løsninger på 20 ° C. Deretter forberede arbeider løsninger for blandet desflurane/isoflurane på 50 og 500 5000 mg/L i ultrapure vann / dimethyl sulfoxyde (50/50; v/v). For IS, er fungerende løsning utvannet på 100 mg/L i metanol.
    3. For kalibrering kurver og kontroller, forberede prøvene av skyter 50 µL av er (100 mg/L) i 1 mL av mobilnettet eksempel matriser.
    4. Forberede prøven løsninger med 200 µL av mettet natriumklorid vann løsning i en 10 mL headspace tube, skrudd hermetisk tett med en Teflon-forseglet cap.
  3. Gass kromatografi og massespektrometri
    1. For eksempel analyser, kan du bruke headspace injeksjoner i en gass Ture, kombinert med masse gjenkjennings-metoden.
    2. Bære headspace rør for 10 min på 80 ° C med en ovn shaker. Deretter trekke og injisere 1,5 mL av gass utvalget i gasskromatograf. Angi parameteren injektoren ved 260 ° C med en delt flyt på 100 mL/min i 2 minutter ved starten av kromatografi kjøre.
    3. Bruke Split/splitless injektoren med en transportør modus-programmert press. Først holde gasstrykket på 40 kPa i 0,15 min. Deretter øke hastighet programmet presset til 150 kPa 125 kPa/minutter før en rate på 16 kPa/min 300 kPa press i 5 min.
    4. Samtidig til injeksjon, start med en ovn temperatur på 60 ° C i 1 min og økning til en temperatur på 140 ° C med en hastighet på 20 ° C/min. Deretter øke temperaturen igjen til 250 ° C er oppnådd. Den totale tiden for Kjør ligger 7 minutter.
    5. Utføre kromatografi separasjon bruker en smeltet silica kapillær kolonne (30 m x 1.4 µm, 0,25 mm ID). Utføre masse eksperimenter med en enkelt ion overvåking (SIM) tilstand og overvåke ion kvantifisering m/z 181 og ion kvalifikasjoner m/z 151 og 51 samtidig samtidig oppbevaring (RT) 2.30 min for desflurane, m/z 149 (ion kvantifisering), m/z 115 og 87 (ion kvalifikasjoner) for isoflurane RT 2.8 min og m/z 83 (ion kvantifisering) for kloroform RT 3.70 minutter.
    6. Bestemme konsentrasjonen av desflurane og isoflurane i cellekultur ved sine området prosenter som av er med en vekt kvadratisk plass. Nedre grense for kvantifisering (LLOQ) for desflurane og isoflurane var på 0,5 mg/L og øvre grense for kvantifisering (ULOQ) var 400 mg/L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konsentrasjonen av desflurane og isoflurane, som oppløst i medium over tid, rapporteres i tabell 1 og tabell 2, henholdsvis.

Kursene for de desflurane og isoflurane i medium var like over tid. Straks den nødvendig konsentrasjonen av halogenerte agent ble satt, økte konsentrasjoner over den første timen. Et platå ble deretter nådd, som varte til administrasjonen av halogenerte agent ble stoppet. Etter administrasjon avbrudd redusert konsentrasjonene innen én time (Figur 3).

Etter først var time, median konsentrasjonen av desflurane og isoflurane i medium 251 mg/L og 25 mg/L, henholdsvis. Fant ingen signifikant forskjell mellom forskjellige eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: bygging plan lufttett kammeret Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk tegning av enheten Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: konsentrasjonen av desflurane (n = 5) og isoflurane (n = 5) over tid. A) konsentrasjon av halogenerte agent over tid. Verdiene uttrykkes i mg/L. verdiene uttrykkes i gjennomsnitt og SEM. B) konsentrasjon av halogenerte agent over tid for hvert eksperiment. Verdien uttrykkes i mg/L. C) brøkdel av halogenerte agent over tid i lufttett kammeret målt ved gass analyzer. Verdiene uttrykkes i prosenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tid Konsentrasjonen av desflurane i medium Brøkdel av desflurane
(mg/L) i lufttett kammeret
Median KI (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (stopp) 218 [196 - 247] 4.3
Opphøre + 5 min 237 [214 - 241] 0
Opphøre + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stopp + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tabell 1: Konsentrasjoner av desflurane oppløst i medium over tid. Numeriske data uttrykkes som en median verdien med interquartile rekkevidde for konsentrasjonen og prosent for brøken. IQR (for interquartile rekkevidde)

Tid Konsentrasjonen av isoflurane i medium Brøkdel av isoflurane
(mg/L) i lufttett kammeret
Median KI (%)
5min 2 [2 - 2,5] 0,8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0,9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (stopp) 26 [23 - 27] 1.1
Opphøre + 5min 19 [12 - 25] 0
Opphøre + 30min 4 [4 - 4] 0
Stopp + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabell 2: Konsentrasjoner av isoflurane oppløst i medium over tid. Numeriske data uttrykkes som en median verdien med interquartile rekkevidde for konsentrasjonen og prosent for brøken. IQR (for interquartile rekkevidde)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Våre protokollen beskriver en enkel metode for å avsløre cellene til en presis brøkdel av en halogenerte bedøvende agent, for eksempel desflurane eller isoflurane. Videre rapporterer vi her-for første gang, en streng sammenheng mellom både gass brøken og konsentrasjonen av desflurane og isoflurane innenfor kultur mediet i seg selv. Denne grunnleggende trinn kan nå oss trygt bruke våre lufttett kammer for å studere virkningene av disse halogenerte agenter i en kultivert monolayer av menneskelig alveolar epitelceller.

Foreløpig bruker mest forskning lagene studerer effekten av desflurane i alveolar celler en krukke som først mettet med halogenerte gass og deretter forseglet. I dette tilfellet desflurane kan være metabolized, og det kan være spekulert at brøkdel av flyktige agent reduseres lineært over tid fører til en ustabil gass konsentrasjon. Men er korrelasjonen mellom gass brøkdel av desflurane og konsentrasjonen i kultur medium ikke klart rapportert i litteraturen. Vanligvis er konsentrasjonen av desflurane brukes i disse eksperimentene valgt basert på en enkel relasjon mellom gass brøken og MAC. MAC ble innført i 1965 og konsentrasjonen av en damp i lungene som er nødvendig for å hindre motor svar (bevegelse) i 50% av fagene som svar på en kirurgisk stimulans (smerte)22. MAC brukes til å sammenligne styrke, eller styrke, av bedøvende damp. I ICU pasienter, er MAC korrelert til FeSevo og klinisk Richmond vurdering agitasjon-sedasjon skala (RASS)23. Selv om det er en nyttig indikator på daglige praksis, har relevansen av denne parameteren aldri blitt undersøkt i innstillingen for eksperimentell i vitro forskning. I vår protokollen, bestemt bruker kromatografi analyser av mediet, vi presis sammenhengen mellom desflurane i gass brøken og desflurane oppløst i mediet. Med denne metoden er bestemte effekten av en flyktige agent uttrykt i henhold til ekte konsentrasjonen i medium stedet basert på tilnærming av en klinisk effekt. Dette viktig element kan studiet av bestemte effekten av en presis konsentrasjon av en halogenerte agent på celler vokser i et medium, for å sammenligne effekten av ulike konsentrasjoner av inhalert agenter. Videre lufttett kammeret er svært enkel å bruke, tillater denne metoden forskere å gjenskape eksperimentet med presisjon.

Et annet viktig punkt som kan være til hinder for bruk av sammenhengen mellom gass brøk og MAC i eksperimentell forskning er at en halogenerte agent har lav oppløselighet i blodet (blod/gass partisjon koeffisient på 37 ° C = 0,63 til 0.69 for desflurane). En minimal mengde desflurane er lovpålagt å oppløse i blodet før trykket i alveoler oppnår likevekt med trykket i hovedveier. Dermed under induksjon av anestesi øker alveolar (slutten-tidevanns) konsentrasjonen (AF, alveolar brøkdel) av desflurane raskt rundt inspirert konsentrasjonen (FI inspirert brøkdel). Men i vitro oppdrettsforholdene tillater ikke slike mekanismer, og vanlige cellen media består hovedsakelig av vandige løsninger. Videre er løselighet koeffisient mellom vann/gass (partisjon koeffisient på 37 ° C = 0,36 for desflurane) lavere enn mellom blod og gass, underliggende den kritiske viktigheten av utføre kromatografi analyser.

I tillegg når en forseglet krukke, er atmosfærisk oksygen i glasset absorbert av cellene med samtidige generasjon av karbondioksid. Denne effekten er sannsynligvis ubetydelig kort eksperimentelle prosedyrer, men for lenger eksperimentelle varigheter, celler som er fratatt oksygen vil bytte til en anaerob metabolisme; Denne endringen i metabolismen kan indusere en viss grad av skjevhet i eksperimentell analyser. I motsetning til i forseglet glasset, ved våre lufttett kammer, både oksygen og halogenerte agent strømmer kan justeres over tid å opprettholde målrettet. Denne store karakteristisk for våre protokollen tillater derfor design i vitro eksperimenter lange tidsperioder (f.eks mer enn én dag), gjør det en interessant verktøy for å studere de cellulære mekanismene involvert i lunge epithelial skade og reparere over tid, særlig når halogenerte agenter brukes. Faktisk, effekten av inhalert bedøvende agenter på lunge celler og vev under alveolar skade fortsatt dårlig undersøkt ennå mens dette alternativ terapi synes å vise svært oppmuntrende resultater12.

Det er imidlertid begrensninger på denne teknikken. Først en anesthetic maskin krets er nødvendig for å skaffe oksygen, karbondioksid, og halogenerte agent gass flyter. Bruke en slik enhet er obligatorisk å sette infusjonshastigheten og vedlikeholde stabil konsentrasjoner over tid. Sekund, prøve mediet før kromatografi analyser, lufttett kammeret kort åpnes, som induserer en forbigående nedgang i gasskonsentrasjoner. Som vi bruker en anesthetic maskin krets, økt gasstrøm deretter til forventet konsentrasjoner er oppnådd igjen på gass analyzer. Tredje har vi målt konsentrasjonen i medium for bare en brøkdel av hver halogenerte agent, valgt en priori basert på tidligere studie. Fjerde for å stabilisere celle mediet til vekst av alveolar epitelceller, må vi bruke karbondioksid i en konsentrasjon på 5%. Faktisk gir ingen bedøvende maskin krets så konsentrasjon av karbondioksid. Derfor må bedøvende maskin kretsen tilpasses for å tillate tilkobling av karbondioksid gasstrømmen i stedet for lystgass. Slik forbindelse skal brukes utelukkende i innstillingen for eksperimentell forskning og forsiktig skal være frakoblet etter hvert eksperiment. Videre, for å unngå risiko for mennesker, vi inviterer forskere bruke en viet bedøvende maskin krets å utføre denne protokollen og ikke bruke en maskin dedikert til kliniske anestesi.

De viktigste fordelene med denne teknikken er at det er relativt billig og lett å oppta, selv når forskere har aldri manipuleres en lufttette kammer før. Videre med våre protokollen er resultatene for oppløst desflurane og isoflurane reproduserbare, som representerer et stort kvalitet kriterium for eksperimentell forskning. I tillegg kan systemet tillate studiet av andre flyktige halogenerte agenter, som pasienten. Faktisk ville en enkel endring av typen gass fordamperen enhet være tilstrekkelig i dette tilfellet. Tilsvarende kunne systemet gi et middel for å studere konsentrasjonen av desflurane eller isoflurane oppløst i noen form for medium med forskjellige solubilities, som vann, blod eller olje.

Eksperimentet vårt representerer en grunnleggende trinn som er del av et større prosjekt for å teste hypotesen at desflurane og isoflurane kan utøve gunstige effekter på lunge skade, inflammation og AFC gjennom RASERI-mediert trasé. En primær kultur for menneskelig alveolar epitelceller brukes for mekanistisk undersøkelser av transepithelial væske transport, kanal-spesifikke væske transport (f.eks bruker farmakologiske antagonisme), epithelial paracellular permeabilitet, såret reparasjon, celle migrasjon og spredning, med eller uten en halogenerte bedøvende agent (desflurane eller isoflurane), alene eller kombinert med cytomix (i vitro modell av alveolar skade)24.

Avslutningsvis var denne protokollen spesielt beregnet på nå presis og kontrollert konsentrasjoner av desflurane eller isoflurane i vitro å forbedre vår forståelse av mekanismer involvert i epithelial lungen skade under ARDS og teste roman terapi for denne hyppige og livstruende syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter Auvergne Regional Council ("programmet Nouveau Chercheur de la Région Auvergne" 2013) og fransk Agence Nationale de la Recherche og retning Générale de L'Offre de Soins ("programmet de Recherche Translationnelle no Santé" ANR-13-PRTS-0010) for tilskudd. Fond ikke hadde noen innflytelse i studien design, gjennomføring og analyse eller i utarbeidelsen av denne artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>In Vitro</em> Metode for å kontrollere konsentrasjoner av halogenerte gasser i kulturperler Alveolar epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter