Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

In Vitro Metod för att kontrollera koncentrationerna av halogenerade gaser i odlade alveolära epitelceller

doi: 10.3791/58554 Published: October 23, 2018

Summary

Vi beskriver ett enkelt protokoll som särskilt utformade för att nå exakt och kontrollerad koncentrationer av sevofluran eller isofluran i vitro för att förbättra förståelsen av mekanismer som är involverade i den epitelial lungskada och testa roman terapier för akut respiratoriskt distressyndrom.

Abstract

Akut andnödssyndrom (ARDS) är ett syndrom av diffusa alveolära skada med nedsatt alveolär vätska clearance och svår inflammation. Användningen av halogenerade ämnen, såsom sevofluran eller isofluran, för sedering på intensivvårdsavdelning (IVA) patienter kan förbättra gasutbyte, minska alveolära ödem och dämpa inflammation under ARDS. Dock saknas data från användning av inhalerade medel för kontinuerlig sedering på IVA att behandla eller förebygga lungskador. För att studera effekterna av halogenerade agenter på alveolära epitelceller ”fysiologiska” villkor, vi beskriva ett enkelt system att odla celler på gränssnittet luft-vätska och utsätta dem för halogenerade ombud att ge exakt kontrollerad ”air” fraktioner och ”medium” koncentrationer för dessa agenter. Vi utvecklade en förseglad lufttät kammare där plattor med mänskliga alveolära epitelceller till förevigade kan utsättas för en exakt, kontrollerad bråkdel av sevofluran eller isofluran använder en kontinuerlig gasflödet som tillhandahålls av en narkos maskin krets. Celler exponerades för 4% av sevofluran och 1% av isofluran i 24 timmar. Gas masspektrometri utfördes för att bestämma koncentrationen av halogenerade agenter upplöst i mediet. Efter först var timme, koncentrationerna av sevofluran och isofluran i mediet 251 mg/L respektive 25 mg/L. Kurvor som representerar koncentrationerna av både sevofluran och isofluran upplöst i det medium som visade liknande kurser över tid, med en platå som nås på en timme efter exponeringen.

Detta protokoll utformades för att nå exakt och kontrollerad koncentrationer av sevofluran eller isofluran i vitro att förbättra förståelsen av mekanismer som är involverade i epitelial lungskada under ARDS och testa nya terapier för den syndrom.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut andnödssyndrom (ARDS) är ett kliniskt syndrom som kännetecknas av diffusa alveolära skada, lung ödem och hypoxemisk andningssvikt. Även om ARDS utgör mer än 10% av intensivvårdsavdelningen (IVA) antagning och nästan 25% av ICU patienter som kräver mekanisk ventilation, är det fortfarande en under erkända utmaning för kliniker, med en dödlighet på sjukhus av 35-45%1. Trots intensiv forskning, har identifiering av en effektiv ARDS farmakologisk behandling eller förebyggande misslyckats hittills. Två stora funktioner bidrar till dödlighet i ARDS: nedsatt alveolär vätska clearance (AFC) (dvs. förändrad resorption av alveolära ödem vätska från distala lung luftrum) och svår inflammation2. Eftersom ARDS dödlighet förblir hög, bör nuvarande initiativ även omfatta primärprevention; en viktig utmaning är dock att identifiera at-risk patienter i vilken ARDS är benägna att utveckla och vem gynnas om ARDS hindrades.

Flyktiga halogenerade anestetika, såsom sevofluran och isofluran, används ofta för att tillhandahålla generell anestesi i operationssalen. Hela världen, mer än 230 miljoner patienter som genomgår större operationer varje år kräver narkos och mekanisk ventilation3och postoperativa lungkomplikationer påverka negativt kliniska resultat och hälso-och utnyttjande4 . Användning av sevofluran i stället för propofol förknippades med förbättrad lunginflammation hos patienter som genomgår thoraxkirurgi och betydande minskning av negativa händelser, såsom ARDS och postoperativa lungkomplikationer5. Likaså hade förbehandling med isofluran skyddande effekter på luftvägarna mekanik, syresättning och hemodynamik i experimentella djurmodeller av ARDS6,7. Även om ytterligare studier är berättigade för att hantera effekterna av inhalerade medel på resultat i noncardiac kirurgi, en liknande minskning av lungkomplikationer nyligen har observerats i en meta-analys, visar att inandning bedövningsmedel — som motsats till intravenös anestesi — är signifikant associerade med en minskning i dödlighet för hjärtkirurgi8.

Det saknas specifika prospektiva data om användning av flyktiga agenter för sedering av ICU patienter för att förebygga eller behandla lungskador. Men flera studier har nu stöd effekt och säkerhet av inhaleras sevofluran för sedering av ICU patienter och prekliniska studier har visat att inhaleras sevofluran och isofluran7,9 förbättra gasutbyte, minska alveolära ödem och dämpar inflammation i experimentella modeller av ARDS. Sevofluran mildrar dessutom typ II epitelial cell skada10, medan isofluran upprätthåller integriteten för den alveolära-kapillär barriären genom modulering av åtsittande föreningspunkt protein11. Dock behövs ytterligare studier för att kontrollera i vilken utsträckning den experimentella bevisen av orgel skydd från inhaleras sevofluran och isofluran kunde översättas till människor. En första singel-center randomiserad kontrollerad-studie (RCT) från vår grupp fann att tidig användning av inhalerade sevofluran hos patienter med ARDS var associerat med förbättrad syresättning, reducerade nivåer av vissa pro-inflammatoriska markörer och nedsatt lung epitelial skador, enligt bedömning av nivåerna av löslig form av receptorn för avancerad glykation end-produkter (sRAGE) i plasma och alveolär vätska12.

Sammantaget kunde de positiva effekterna av sevofluran och isofluran på lungskada peka på flera biologiska spridningsvägar eller funktionella processer som är beroende av RASERI vägen, nämligen alveolär vätska clearance (AFC), epitelial skador, flyttning av nuclear factor (NF)-κB, och makrofag aktivering. Sevofluran kan dessutom påverka uttrycket av RAGE protein själv. Eftersom tidigare forskning av vår forskargrupp och andra stöder avgörande roller för RAGE alveolär inflammation och lung epitelial skador och reparera under ARDS, utformade vi en experimentell modell att tillhandahålla en translationell förståelse av mekanismer sevofluran i lungorna skada och reparation13,14,15. In vitro- effekterna av sevofluran och isofluran undersöktes i en roman mänsklig alveolära epitelceller primär cell linje särskilt utformade för att studera luft-blod-barriären av perifera lungan, hAELVi (mänskliga Alveolar Epithelial LentiVirus förevigat), med alveolära typ jag-liknande egenskaper inklusive funktionella åtsittande föreningspunkter16.

Medan du förbereder utformningen av våra in vitro- undersökningar (t.ex. kulturer av alveolära epitelceller vid luft-vätska gränssnitt med exponering för ”inhalerade” sevofluran eller isofluran, vi förstått från tidigare publicerats studier som fraktioner av sevofluran har endast utvärderats i ”luften” gränssnitt17,18,19 använder standard övervakare (liknande dem som används i en klinisk miljö). Halogenerade agent koncentrationer valdes oftast enligt de minsta alveolära koncentrationen (MAC) värdena (t.ex. i människor, för sevofluran, 0,5 och 1,1 2,2 Vol.%, vilket motsvarar 0,25, 0,5 och 1 MAC, respektive, för isofluran, 0,6, 0,8, och 1.3 Vol.% vilket motsvarar 0,25, 0,5 och 1 MAC, respektive)20. Sevofluran och isofluran koncentrationer har faktiskt aldrig undersökts i odlingsmediet själv, vilket begränsar giltigheten av tidigare experimentella modeller och instrument. Dessutom används de flesta experiment en anaerob burk som var förseglad efter den luft blandning innehållande sevofluran hade rensats inuti. Som vårt mål var att studera alveolära epitelceller ”fysiologiska” villkor, trodde vi att sådana anaeroba tillståndet inte kan vara optimal och skulle inte vara förenligt med länge experimentell varaktigheter. Därför vi utvecklat våra egna system för att odla celler på gränssnittet luft-vätska och utsätta dem för halogenerade ombud (sevofluran och isofluran) med syfte att ge exakt kontrollerad ”air” bråk och ”medium” koncentrationer för dessa agenter. Vi anser är detta experimentella steg, som inte har rapporterats hittills i litteraturen, obligatoriskt innan eventuella ytterligare in vitro- undersökningar av sevofluran och isofluran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. kultur av alveolära epitelceller (hAELVi)

  1. Upptining
    1. Pipettera 4 mL odling redo-till-använda mänskliga alveolära epitelceller (huAEC) medium i en 15 mL plaströr och snabbt Tina injektionsflaskan i en förvärmd vattenbad (37 ° C).
    2. Överför tinade cellsuspensionen till ett 15 mL plaströr som innehåller 4 mL av medium innan centrifugering röret vid 200 x g i 5 min.
    3. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 5 mL av odling medium. Överför sedan cellerna till en T25-kolv.
    4. Odla cellerna under standart villkorar (5% CO2, 95% fuktad luft, 37 ° C)
  2. Dela
    1. Kontrollera status för cellerna mikroskopiskt. När cellerna är 80-90% konfluenta, dela celler, följande steg 1.2.2 genom 1.2.10.
    2. Aspirera odling media av cellerna med en steril pipett.
    3. Tvätta cellerna en gång med 4 mL av Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS) och aspirera på DPBS.
    4. Tillsätt 1 mL Trypsin/EDTA-lösning (TE) på celler före inkubation vid 37 ° C för 3 min tills cellerna börjar lossna; Kontrollera om avskildhet under ett mikroskop.
    5. Omsuspendera cellerna med 2 mL odlingssubstrat och centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min. Sedan Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten igen med 3 mL av odling medium.
    6. Använd trypan blått färgämne utslagning analysen för att bestämma lönsamheten för cellerna. Ta 30 µl cellsuspension och tillsätt 30 µl av en 0,4% lösning av trypan blå i ett rör. Efter att effektivt blanda lösningen 3 - 5 gånger med 100 µl pipett. Ta 10 µl av lösningen och sätter det under täckglaset av hemocytometer.
    7. Räkna både det totala antalet livskraftiga celler och antalet döda celler (blå) i hemocytometer områdena. Sedan beräkna den cellviabilitet [%] med hjälp av ekvation: cellviabilitet = 100-(100 / totala antalet celler x antal döda celler)
    8. Överföra alikvoten med återsuspenderade cellpelleten till en ny cell kultur T25 kolv eller en 6 väl-platta. Lägg till odling mediet i cellerna för att uppnå totalt odling medium i kolven, T25 5 mL eller 1 mL för varje brunn av 6 väl-plattan.
    9. Odla cellerna i en inkubator under standart villkorar (5% CO2, 95% fuktad luft, 37 ° C)
    10. När cellerna är helt konfluenta, är de redo för experimentet.

2. beredning av en lufttät kammare

Obs: Konstruktionsplanen för lufttät kammare avbildas i figur 1.

  1. Använda en hermetisk polypropylen låda med en kapacitet på 6,5 L. Den längd, bredd och höjd är 30 x 20 x 15,5 cm, respektive. Observera att volymen av rutan är lägre än den teoretiska volymen på grund av de runda hörnen.
  2. Borra ett 2,5 cm diameter hål på undersidan av den laterala väggen.
  3. Infoga en korrugerad slang med en grön markering, som kommer att tjäna som gas-luft blandningen ingående röret, och försegla det med kisel.
  4. Borra ett andra 2,5 cm diameter hål på ovansidan av den motsatta laterala väggen.
  5. Sätt en annan korrugerade röret med ett rött märke och Anslut den med ett kolfilter, som kommer att tjäna som gas-luft blandningen utdata röret, och försegla det med kisel.
  6. Borra ett tight 4 mm diameter hål i mitten av den genomsnittliga väggen i lådan.
  7. Infoga kort infusion slang som är ansluten vid ett samlingsrör med en roterande manlig luer-lock, som kommer att anslutas till en Gasanalysator, och försegla det med kisel.
  8. Placera en digital termometer/hygrometer inuti lufttät kammare.

3. exponera alveolära epitelceller för halogenerade ombud (sevofluran och isofluran)

Obs: En schematisk ritning av enheten avbildas i figur 2.

Varning: Även Djurstudier har visat några tecken på skada på fetus eller försämrad fertilitet, och en mycket liten studie under cesarean avsnitt visade inte några ogynnsamma effekter på modern eller fostret, säkerhet med hjälp av halogenerade ombud (t.ex. sevofluran eller isofluran) under arbete och leverans har inte visats hittills. Dessutom har ingen kontrollerade data samlats under mänskliga graviditeter. Därför utför experiment med sevofluran eller isofluran medan gravida bör avråder.

  1. Arbeta under en laboratorium köksfläkt.
  2. Anpassa en narkos maskin krets för att växla den gasar fodrar av dikväveoxid av koldioxid (CO2).
  3. Anslut den lufttät kammaren med grön-markerade, korrugerade röret till anpassade bedövningsmedel maskin kretsen. Infoga en uppvärmd befuktare (som används på ICU ventilatorer) in i röret mellan maskinens bedövningsmedel och lufttät kammare att värma flöde gasblandningen till ca 37 ° C
  4. Installera den lufttät kammaren på en värmeplatta, som ger en värme platta temperatur av 37° C.
  5. Sätta den 6 väl-skylt som innehåller de hAELVI cellerna i en lufttät kammare och Förslut locket.
  6. Reglera gas flödesområde (dvs blandningen av luft och CO2) för att snabbt få de standardvillkor, definierat som 5% av CO2 och 95% av fuktad luft.
  7. Öppna halogenerade agent förångaren och välj den procentandel som önskas (i den aktuella studien, testade koncentrationerna av sevofluran och isofluran var 4% 1%, respektive).
  8. Observera sammansättningen av blandningen och sevofluran och isofluran gaskoncentrationen som mäts av en extern Gasanalysator och visas på skärmen.
  9. När målvärdena är uppnått, minska färska gasflödet till 1 L/min.
  10. Lufttät kammare kan upprätthållas med denna gasflödet så länge som nödvändigt för experimentet.

4. Mät sevofluran eller isofluran genom kromatografi

  1. Beredning av prover
    1. Vid olika tidpunkter, mycket kortfattat öppna kammaren för att ta ut de studera proverna (i den aktuella studien, använde vi en 6 väl-plattan) och Stäng locket. Håll de andra proverna i rutan. Sug sedan upp 1 mL av det medium som finns i varje prov med ett multi-volym justerbar mikropipett.
    2. Sätta på medellång i 10 mL injektionsflaskor headspace kromatografi, som bör skruvas hermetiskt tätt med en Teflon-förseglad kapsyl. Frysa kromatografi injektionsflaskorna vid-20 ° C om du inte använder dem omedelbart.
    3. Förbereda en stamlösning av sevofluran och en annan stamlösning av isofluran, både på 50 g/L i metanol. Samtidigt förbereda en stamlösning kloroform (intern standard, IS) på 2 g/L i metanol. Lagra alla standardlösningar vid-20 ° C.
    4. Förbereda fungerande lösningar av sevofluran och isofluran på 50, 500 och 5000 mg/L i ultrarent vatten/dimetyl sulfoxyde (50/50; v/v). För interna standardisering, är arbetslösning fast vid 100 mg/L i metanol.
  2. Analys av cellulära prover
    Obs: Extraktionsmetod baseras på tidigare validerade metoden för gaskromatografi och masspektrometri från Bourdeaux et al. 1 och använder samma parametrar känslighet och specificitet. Sevofluran och kloroform (IS) användes i detta protokoll, och isofluran var associerade med den multiparametric analysmetoden. Kort, för masspektrometri förvärv, metoden utvecklades efter ren lösning injektion. Sedan bekräftades m/z med referensstandarder och litteraturdata. Tre m/z valdes ut för varje analyt (utom IS): en m/z för kvantifiering (den vanligast förekommande och de högre), för vilket överflöd beräknades genom att integrera området under kurvan för kvantifiering och två m/z för bekräftelse. Med hjälp av tre m/z, kunde analyter specifikt identifieras eftersom alla m/z hade samma retentionstid, samt eftersom alla m/z belopp (släkting till ion bekräftelse vs. kvantifiering) var samma i ren standard och alla prover. Med detta förvärv läge, kunde analyter identifieras och kvantifieras med god specificitet.
    1. Konstruera en kalibrering 8 punkters kurvor med koncentration spänner av 0,5-400 mg/L och flera kvalitet kontroller (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 och 400 mg/L).
      Obs: För att validera varje kalibrering, fyra kvalitetskontroller användes: den nedre gränsen för kvantifiering (C1 = 0,5 mg/L), två mellanliggande nivåer (C2 = 20 mg/L och C3 = 75 mg/L) och den slutliga nivån (C4 på 400 mg/L; övre nivå för kvantifiering). Alla standarder och kontroller analyserades i odlade cell matriser till undvika matrix effekt. För varje kalibreringskurvan analyserades en tom matris för att validera att det inte fanns någon inblandning med odlade cellulära och interna standarder.
    2. Förbereda en stamlösning av sevofluran och en annan stamlösning av isofluran, både på 50 g/L i metanol. Samtidigt förbereda en stamlösning kloroform (intern standard, IS) på 2 g/L i metanol. Lagra alla standardlösningar vid-20 ° C. Förbered sedan, fungerande lösningar av blandade sevofluran/isofluran på 50, 500 och 5000 mg/L i ultrarent vatten / dimetyl sulfoxyde (50/50; v/v). För IS späds fungerande lösningen till 100 mg/L i metanol.
    3. För kalibreringskurvor och kontroller, att bereda proverna av tillsatta 50 µL av IS (100 mg/L) i 1 mL av de cellulära provmatriser.
    4. Förbereda provlösning med 200 µL mättad natriumkloridlösning vatten i en 10 mL headspace tube, skruvas hermetiskt tätt med en Teflon-förseglad kapsyl.
  3. Gaskromatografi och masspektrometri
    1. För provtagning, använda headspace injektioner i en gaskromatografi, tillsammans med den massa detektionsmetoden.
    2. Bära rör headspace för 10 min vid 80 ° C med en värmare shaker. Sedan återkalla och injicera 1,5 mL gasprovet till gaskromatografen. Ange parametern av injektorn vid 260 ° C med en split flöde vid 100 mL/min i 2 min i början av kromatografi kör.
    3. Använd Split/splitless-injektor med en transportör läge-programmerad tryck. Först hålla gastrycket vid 40 kPa för 0,15 min. Sedan, öka hastighet program trycket till 150 kPa vid 125 kPa/min innan du ställer in en hastighet av 16 kPa/min 300 kPa tryck i 5 min.
    4. Samtidig till injektion, börja med en Ugnstemperatur av 60 ° C i 1 min och öka tills temperaturen 140 ° C uppnås med en hastighet av 20 ° C/min. Sedan öka temperaturen igen tills 250 ° C uppnås. Den totala tiden för körningen är 7 min.
    5. Genomföra kromatografi separationen med en smält-kisel kapillärkolonn (30 m x 1,4 µm, 0,25 mm ID). Utföra massa experiment med en enda ion övervakning (SIM) tillstånd och övervaka ion kvantifiering m/z 181 och ion kvalifikationer m/z 151 och 51 samtidigt på en retentionstid (RT) på 2.30 min för sevofluran, m/z 149 (ion kvantifiering), m/z 115 och 87 (ion kvalifikationer) för isofluran på RT 2,8 min och m/z 83 (ion kvantifiering) för kloroform RT 3,70 min.
    6. Bestäm koncentrationerna av sevofluran och isofluran i cellkulturen genom deras område nyckeltal som av IS med hjälp av en vikt kvadratisk passform. Den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) för sevofluran och isofluran var på 0,5 mg/L och den övre gränsen för kvantifiering (ULOQ) 400 mg/L.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Koncentrationerna av sevofluran och isofluran, som upplöst i medium över tid, redovisas i tabell 1 och tabell 2, respektive.

Jagar av sevofluran och isofluran koncentrationerna i mediet var jämförbara över tid. Omedelbart efter önskad koncentration av halogenerade agent sattes, ökade koncentrationer över den första timmen. En platå nåddes sedan, som kvarstod tills administrationen av halogenerade agenten stoppades. Efter administrering avbrott minskade koncentrationer inom en timme (figur 3).

Efter först var timme, de median koncentrationerna av sevofluran och isofluran i mediet 251 mg/L respektive 25 mg/L. Ingen signifikant skillnad sågs mellan de olika experimenten.

Figure 1
Figur 1: konstruktionsplanen av lufttät kammare Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk ritning av enheten Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: koncentrationen av sevofluran (n = 5) och isofluran (n = 5) över tiden. A) koncentration av halogenerade agent över tid. Värdena uttrycks i mg/L. värden uttrycks i medelvärde och SEM. B) koncentration av halogenerade agent över tiden för varje experiment. Värdet uttrycks i mg/L. C) bråkdel av halogenerade agent över tid i lufttät kammaren mäts i gas Analyzer. Värdena uttrycks i procent. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tid Koncentrationen av sevofluran på medellång Bråkdel av sevofluran
(mg/L) i lufttät kammare
Median IC (%)
5 min 27 [19 - 31] 4.6
30 min 152 [142 - 152] 4.1
1 h 251 [243 - 332] 4.1
4 h 259 [256 - 271] 4.2
8h 265 [237 - 280] 4.2
24 h (stopp) 218 [196 - 247] 4.3
Stop + 5 min 237 [214 - 241] 0
Stop + 30 min 92 [91 - 104] 0
Stop + 1 h 57 [42 - 58] 0

Tabell 1: Koncentrationer av sevofluran upplöst i medium över tid. Numeriska data uttrycks som en medianvärdet med interkvartilintervall för koncentrationen och som procentandel för bråket. IQR (för interkvartilintervall)

Tid Koncentrationen av isofluran på medellång Bråkdel av isofluran
(mg/L) i lufttät kammare
Median IC (%)
5min 2 [2 - 2.5] 0,8
30min 16 [4 - 18] 1.3
1h 22 [18 - 27] 0,9
4h 30 [25 - 31] 1.4
8h 22 [15 - 26] 1.2
24h (stopp) 26 [23 - 27] 1.1
Stop + 5min 19 [12 - 25] 0
Stop + 30min 4 [4 - 4] 0
Stop + 1h 1 [0,8 - 1] 0

Tabell 2: Koncentrationer av isofluran upplöst i medium över tid. Numeriska data uttrycks som en medianvärdet med interkvartilintervall för koncentrationen och som procentandel för bråket. IQR (för interkvartilintervall)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Våra protokollet beskriver en enkel metod för att exponera celler till en exakt bråkdel av en halogenerade bedövningsmedel, såsom sevofluran eller isofluran. Dessutom redovisar vi här – för första gången — ett strikt samband mellan både andelen gas och koncentrationen av sevofluran och isofluran inuti odlingssubstratet själv. Detta grundläggande steg nu tillåter oss att tryggt använda vår lufttät kammare för att studera effekterna av dessa halogenerade agenter i en odlade enskiktslager av mänskliga alveolära epitelceller.

De flesta forskarlag studera effekter av sevofluran i alveolära celler använder för närvarande, en burk som är först mättad med halogenerade gas och sedan försluts. I det här fallet sevofluran kan vara metaboliseras, och det kunde vara spekulerade att fraktionen av flyktiga lösningar kan minska linjärt med tiden leder till en instabil gaskoncentration. Korrelationen mellan gas fraktionen av sevofluran och dess koncentration i odlingsmediet redovisas dock inte tydligt i litteraturen. Vanligtvis, väljs koncentrationen av sevofluran som används i dessa experiment utifrån en enkel relation mellan andelen gas och MAC. MAC introducerades 1965 och är koncentrationen av en ånga i lungorna som behövs för att förhindra ett motoriskt svar (rörelse) hos 50% av försökspersonerna som svar på en kirurgiskt stimulus (smärta)22. MAC används för att jämföra den styrka eller potens, av bedövningsmedel ångor. ICU patienter, är MAC korrelerad till FeSevo och den kliniska Richmond bedömning Agitation-Sedation Scale (RASS)23. Men det är en användbar indikator i daglig klinisk praxis, har relevansen av denna parameter aldrig undersökts i fastställandet av experimentella in vitro- forskning. I våra protokoll, fastställt med hjälp av kromatografi analyser av mediet, vi exakta sambandet mellan den sevofluran som finns i gas-fraktionen och den sevofluran upplöst till medium. Med denna metod, är effekten av en flyktig agent uttryckt enligt verkliga koncentrationen på medellång snarare än baserat på tillnärmning av en klinisk effekt. Denna viktiga del tillåter studier av effekten av en exakt koncentration av en halogenerade agent på celler som växer i ett medium, för att jämföra effekterna av olika koncentrationer av inhalerade agenter. Dessutom så lufttät kammare är mycket lätt att använda, tillåter denna metod forskare att replikera experimentet med precision.

En annan viktig punkt som utesluter användning av korrelationen mellan gas bråk och MAC i experimentell forskning är att en halogenerade agent har låg löslighet i blod (blod/gas Fördelningskoefficient vid 37 ° C = 0,63 till 0,69 för sevofluran). En minimal mängd sevofluran är mandat för att upplösa i blodet innan trycket i alveolerna uppnår jämvikt med trycket i arterial. Således under induktion av anestesi ökar den alveolära (end-tidal) koncentrationen (AF, alveolära bråkdel) av sevofluran snabbt runt inspirerad koncentrationen (FI, inspirerat bråkdel). Dock i vitro kultur villkor tillåter inte sådana mekanismer, och vanliga cell media består huvudsakligen av vattenlösningar. Dessutom är löslighet koefficienten mellan vatten/gas (Fördelningskoefficient vid 37 ° C = 0,36 för sevofluran) lägre än mellan blod och gas, för kritiska betydelsen av kromatografi analyser.

Dessutom, när en förseglad burk används, är det atmosfäriska syret i burken absorberas av cellerna med samtidig framställning av koldioxid. Denna effekt är troligen obetydliga kort experimentella rutiner, men för längre experimentell varaktigheter, celler som berövas syre skulle byta till en anaerob metabolism; Denna förändring i ämnesomsättningen kan framkalla en viss partiskhet i experimentell analyser. I motsats till förseglade burken, när du använder vår lufttät kammare, är både syre och halogenerade agent flöden justerbar över tid att upprätthålla den riktade. Detta stora kännetecken av våra protokoll tillåter därför utformningen av in vitro- experiment för långa tidsperioder (t.ex. mer än en dag), vilket gör det en intressant verktyg för att studera de cellulära mekanismerna som är involverade i epitelial lungskada och reparera över tiden, speciellt när halogenerade ämnen används. Effekterna av inhalerade bedövningsmedel på lungceller eller vävnad under alveolära skada kvar faktiskt dåligt undersökta hittills medan detta alternativ behandling verkar Visa mycket uppmuntrande resultat12.

Det finns dock begränsningar för denna teknik. Först en narkos maskin krets som behövs för att tillhandahålla syre, koldioxid, och halogenerade agent gasflöden. Med en sådan anordning är obligatoriskt att ställa flödet och underhålla stabil koncentrationer över tid. För det andra att prova medlet före kromatografi analyser, lufttät kammare kort öppnas, som inducerar en övergående minskning av gaskoncentration. Som vi använder en narkos maskin krets, ökas gasflöden därefter tills förväntade koncentrationer uppnås igen på gas analyzer. Vi för det tredje har mätt koncentrationen i mediet för endast en bråkdel av varje halogenerade agent, valt en priori baserat på tidigare studie. För det fjärde för att stabilisera cellen medellång till tillväxten av alveolära epitelceller, behöver vi använda koldioxid vid en koncentration på 5%. Faktum är att ingen narkos maskin krets ger sådan koncentration av koldioxid. Bedövningsmedel maskin kretsen måste därför anpassas för att tillåta anslutningen av koldioxid gasflödet i stället för lustgas. Sådan anslutning bör användas uteslutande i inställningen för experimentell forskning och ska försiktigt kopplas efter varje experiment. Dessutom, för att undvika all risk för människor, vi inbjuder forskare att använda en hängiven bedövningsmedel maskin krets utför detta protokoll och inte för att använda en maskin som är dedikerad till kliniska anestesi.

De främsta fördelarna med denna teknik är att det är relativt billigt och mycket lätt att anta, även när forskare aldrig har manipulerat en lufttät kammare innan. Dessutom, med våra protokoll, resultaten av upplöst sevofluran och isofluran koncentrationer är reproducerbara, som representerar en stor kvalitets-kriterium för experimentell forskning. Dessutom möjliggör vårt system för studier av andra flyktiga halogenerade ämnen, såsom desflurane. Faktiskt skulle en enkel ändring av typen av gas förångare enhet vara tillräcklig i detta fall. På samma sätt kan vårt system ger ett sätt att studera koncentrationerna av sevofluran eller isofluran upplöst i någon typ av medium med olika lösligheter, såsom vatten, blod eller olja.

Vårt experiment utgör ett grundläggande steg som ingår i ett större projekt som syftar till att testa hypotesen att sevofluran och isofluran kan utöva gynnsamma effekter på lungskada, inflammation och AFC genom RAGE-medierade vägar. En primär kultur av mänskliga alveolära epitelceller kommer att användas för mekanistiska undersökningar av transepithelial vätsketransport, kanalspecifika vätsketransport (t.ex. använda farmakologiska antagonism), epitelial paracellular permeabilitet, såret reparation, cellmigration och spridning, med eller utan en halogenerade bedövningsmedel (sevofluran eller isofluran), enskilt eller i kombination med cytomix (in vitro- modell av alveolära skada)24.

Avslutningsvis var detta protokoll särskilt utformade för att nå exakt och kontrollerad koncentrationer av sevofluran eller isofluran i vitro att förbättra förståelsen av mekanismer som är involverade i epitelial lungskada under ARDS och testa roman terapier för detta täta och livshotande syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författarna erkänner Auvergne regionala rådet (”programmet Nouveau Chercheuren de la Région Auvergne” 2013) och den franska Agence Nationale de la Recherche och den riktning Générale de L'Offre de Soins (”programmet de Recherche Translationnelle sv Santé” ANR-13-PRTS-0010) för bidragen. Finansiärerna hade inget inflytande i studiens utformning, genomförande och analys eller i utarbetandet av denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sevoflurane Baxter Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane Virbac Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells InScreenex INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use) InScreenex INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit Drager Fabius
Gas analyzer Drageer Vamos Plus
Anesthetic gas filter SedanaMedical FlurAbsord
Heated Humifier Fisher&Paykel MR850
Chamber Curver 00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID) Restek, Lisses, France Rxi-624Sil MS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315, (8), 788-800 (2016).
  2. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377, (6), 562-572 (2017).
  3. Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
  4. Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242, (3), 341-343 (2005).
  5. De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110, (6), 1316-1326 (2009).
  6. Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41, (8), 415-421 (2015).
  7. Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
  8. Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124, (6), 1230-1245 (2016).
  9. Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
  10. Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
  11. Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
  12. Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. (2016).
  13. Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7, (1), (2017).
  14. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192, (2), 191-199 (2015).
  15. Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10, (8), e0135857 (2015).
  16. Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33, (3), 251-260 (2016).
  17. Yue, T., Roth Z'graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31, (1), 118-125 (2008).
  18. Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
  19. Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
  20. Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91, (2), 170-174 (2003).
  21. Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878, (1), 45-50 (2010).
  22. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26, (6), 756-763 (1965).
  23. Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3, (Suppl 1), (2015).
  24. Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (11), L975-L985 (2014).
<em>In Vitro</em> Metod för att kontrollera koncentrationerna av halogenerade gaser i odlade alveolära epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).More

Blondonnet, R., Paquette, B., Richard, D., Bourg, R., Laplace, G., Segurel, R., Pouvelle, H., Belville, C., Blanchon, L., Godet, T., Constantin, J. M., Bazin, J. E., Sapin, V., Jabaudon, M. In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (140), e58554, doi:10.3791/58554 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter