Summary

En passelig protokoll for streng montering gRNA kloning (STAgR)

Published: December 26, 2018
doi:

Summary

Her presenterer vi streng montering gRNA kloning (STAgR), en metode for å enkelt multiplex gRNA vektorer for CRISPR/Cas9 nærmer seg. STAgR gjør gRNA multipleksing enkel, effektiv og kan tilpasses.

Abstract

Bakteriell CRISPR/Cas9 systemet har betydelig økt metodologiske alternativer for life forskere. På grunn av dens utnyttelse ble genetisk og genomisk engineering gjelder for et stort utvalg av systemer. Dessuten, mange transcriptional og epigenomic engineering tilnærminger er nå generelt mulig for første gang. En årsak til bred anvendelse av CRISPR ligger i bipartite natur. Små gRNAs bestemme genomisk målene av komplekset, varianter av protein Cas9 og lokale molekylær konsekvensene. Men mange CRISPR tilnærminger, avhenger av samtidige levering av flere gRNAs i individuelle celler. Her presenterer vi en passelig protokoll for streng montering gRNA kloning (STAgR), en metode som tillater enkel, rask og effektiv generering av multiplex gRNA uttrykk vektorer i en enkelt kloning trinn. STAgR er kostnadseffektiv, siden (i denne protokollen) personlige målretting sekvensene er innført av kort overheng primere mens lang DNA malene av gRNA uttrykk kassettene kan brukes på nytt flere ganger. Videre kan STAgR enkelt trinn innlemmelse av en rekke gRNAs, samt kombinasjoner av ulike gRNA varianter, vektorer og arrangører.

Introduction

Streng montering gRNA kloning (STAgR) er en metode som muliggjør effektiv overnatting generasjon av uttrykket vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassetter i én enkelt kloning trinn. STAgR protokollen avhenger ikke på spesialisert ekspertise eller materialer og tilbyr flere alternativer for tilpasning.

Bakteriell CRISPR protein Cas9 har en unik kapasitet. Det er mulig å finne og selektivt binde bare de DNA-sekvensene kodet i naturlig forekommende crRNAs eller utviklet gRNAs1. Dens utnyttelse som molekylære verktøy har aktivert en rekke tilnærminger som var umulig, unfeasible eller bare begrenset til visse mobilnettet modeller inntil nylig. Disse inkluderer målrettet genet mutasjoner2, genomet engineering3, epigenome4,5,6, transcriptional aktivisering og gene stanse7,8. Så vidt vi vet CRISPR er universelt deployerbare, som rapporter om sin søknad finnes for en rekke målområder, celletyper og arter. Men avhenger mange CRISPR programmer av direkte eller indirekte levering av flere gRNAs inkludert en rekke genomisk manipulasjoner (translocations9,10, medium11 og storskala genomisk endringer 12 , 13), genomet engineering (bruk Cas9 nickases14), generasjon av betinget alleler11,15 eller seriell mutasjoner16og sporing strategier17. Videre for andre tilnærminger (transcriptional engineering18, epigenome engineering19,20) flere målretting nettsteder ikke er strengt obligatorisk, men de når maksimal virkning ofte bare under denne tilstand.

Flere nyttige metoder har blitt beskrevet for å generere gRNA vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassett21,22,23,24,25,26, 27. Her presenterer vi en protokoll for STAgR, streng montering gRNA kloning, som er enestående i sin kombinasjon av enkelhet og hastighet (bare en overnatting kloning trinn kreves), lavpris (som DNA maler kan brukes på nytt flere ganger), customizability (for forskjellige gRNA systemer og arrangører) og effektivitet (lar generering av vektorer med høyt antall gRNA kassetter)28.

STAgR kan i prinsippet brukes til å generere uttrykk vektorer med noen (1-2 gRNAs), flere (3-5 gRNAs) og noen av flest uttrykk kassetter rapportert så langt (6-8 gRNAs)28. Tilsvarende gjelder STAgR for gRNA rekkefølge, ryggraden eller arrangøren. Siden imidlertid STAgR er hovedsakelig basert på polymerase kjedereaksjoner (PCR) og Gibson montering, skal gRNAs med høy sekvens likheter genereres ved hjelp av en alternativ metode.

Protocol

1. utformingen av STAgR kloning strategi Bestemme på hvor mange gRNA kassetter vil være inkludert i ett uttrykk vektor og i hvilken rekkefølge. Avgjøre hvilke arrangører og gRNA stillaser skal brukes for hver av gRNAs. Design av gRNAs av alle online verktøy (f.eks www.benchling.com). 2. utformingen av STAgR kloning primere med overheng Merk: Forstand protospacer rekkefølgen av de siste gRNA og antisense av den første gRNA henholdsvis legges til PCR primere brukt for forsterking av vektor ryggraden (figur 1). Gjenværende sekvensene er forsterket fra strengene, og dermed feste følelse og antisense gRNAs i ønsket rekkefølge. Den første strengen stykke forsterkes med en frem primer som inneholder den første gRNA N20 sekvensen som en klippe og en omvendt primer med de andre gRNA N20 sekvensen (omvendt supplement) som en klippe. Alle følgende deler genereres tilsvarende. Legge til N20 gRNA sekvenser frem forsterkning primerne for STAgR DNA-strengen som overhangs (tabell 1). Legge til fornuftig gRNA sekvenser 5′ frem primer “scf-FP” (for en konvensjonell stillas) eller “sam-FP” (for en MS2 som inneholder stillas). FP primere anneal til stillaset/MS2 del av respektive STAgR strengen (figur 1). Legge til det omvendte supplement N20 gRNA rekkefølgen omvendt primer sekvenser. Velg RP primere avhengig av spesifikke arrangører og strengene som brukes (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. generasjon STAgR kloning fragmenter Vil generere individuelle kloning fragmenter for Gibson samling, utføre PCRene ved å sette opp 10 µL Hi-Fi (HF) buffer, 1 µL av 10 mM dNTPs, 0,25 µL av overheng-primer (100 µM), 10 ng av det DNA mal (streng eller vektor), 0,5 µL HF utvalg , 1,5 µL av dimethyl sulfoxide (DMSO) og legge til H2O for å gjøre en siste bind i 50 µL.Merk: Plasmider “STAgR_Neo” som en mal for ryggraden PCR for å innlemme gRNA stillaset til den siste gRNA, SAM Scaffold velges, bruk “STAgR_SAM”. For en STAgR plasmider med seks gRNA kassetter for eksempel er seks PCRene nødvendig, fem med DNA strenger som maler og med vector ryggraden som mal. Inkuber reaksjoner på en thermocycler med følgende: 1 syklus av 98 ° C for 1 min 30 s; 38 sykluser av 98 ° C for 10 s, 59 ° C (for gRNA stillas) / 68 ° C (for SAM loop) for 10 s, 72 ° C for 30 s (for inserts) / 1 min 30 s (for vektorer); 1 syklus av 72 ° C i 10 min. Fjerne 5,5 µL PCR reaksjonen, legge til lasting fargestoff og analysere forsterket fragmenter på en 1% agarose gel. Last en passende DNA stigen for skalering (100 bp DNA stigen/1 kb DNA stiger) og Kjør gel i en passende gel kjører buffer (f.eks, TLE buffer) ved 120 V i 30 min. Mens gel kjører, legge 5 µL av bufferen begrensning enzymet og 0,5 µL DpnI (10 enheter) til gjenværende 44,5 µL PCR reaksjonen og Inkuber i 30 minutter til 1 h på 37 ° C. Utføre DNA rensing med magnetiske perler. Legg 1,8 µL magnetiske perler per 1 µL av PCR produkt og bland av pipettering opp og ned. Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur (RT). Separate perler og DNA fragmenter fra gjenværende væske med en magnet. Vask perler to ganger med 70% etanol ved å skylle pellet uten resuspending helt. Fjern alle etanol med en pipette og la pellet luften tørr. Oppløse pellet i 15-20 µL H2O av pipettering opp og ned og separat perler fra væsken ved hjelp av en magnet. Overføre klart nedbryting til en ny tube.Merk: Alternativt, kolonnen-baserte reaksjon oppryddingen kits kan brukes. Bestemme DNA konsentrasjoner bruker et spektrofotometer som beskrevet andre steder29. 4. Gibson montering reaksjon og bakteriell transformasjon Merk: Følgende er tilpasset fra Gibson et al. 30. Forberede en hjemmelaget Gibson reaksjon blande eller bruke en kommersiell Gibson kloning kit. Kombinere 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl ved pH 7.5 300 µL av 1 M MgCl, 60 µL av 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat), 60 µL av 100 mM dATP (deoxyadenosine trifosfat), 60 µL av 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat), 60 µL av 100 mM dCTP ( deoxycytidine trifosfat), 300 µL av 1 M DTT (dithiothreitol), 1,5 g av PEG-8000 (polyetylenglykol), 300 µL av 100 mM NAD (nikotinamid adenine dinucleotide) og legge til H2O for å få 6 mL av 5 × isotermiske reaksjon buffer.Merk: Aliquoted buffer kan lagres på 20 ° C i minst 12 måneder. For Gibson montering master bland, kombinere 320 µL 5 x isotermiske reaksjon bufferen med 697 µL av H2O og tilsett 3 µL av 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL av 2 U/µL DNA polymerase og 160 µL av 40 U/µL Taq DNA ligase.Merk: Denne blandingen kan være aliquoted og lagret ved 20 ° C i minst 12 måneder. Bruke 7,5 µL av montering master mix med 2,5 µL av sett inn og vektor. Bruke en molar vektor for å sette forholdet 1:1, men ikke mer enn 0,2 pmol DNA totalt for en 2 x STAgR reaksjon. For mer enn 2 gRNA uttrykk kassetter, bruk en vektor sette forholdet 1:3 men ikke overstiger et totalbeløp for DNA av 0,5 pmol.Merk: Alle forsterket gRNA uttrykk kassetter bør brukes i ekvimolare mengder. Inkluder en plasmider kontroll med identiske mengden vektor men ingen setter inn kontrollen for ufordøyd mal vector (og/eller selv ligation). Inkuber eksempler på 50 ° C for 45 til 60 min. butikken prøver på is eller på 20 ° C for påfølgende transformasjon.Merk: Protokollen kan pauses her. Direkte transformere halvparten av blandingen i kjemisk kompetent bakterier. Tine kjemisk kompetent TOP10 E. coli bakterier på is. Legge til 5 µL av Gibson miksen 50 µL av kompetente bakterier. Bland forsiktig ved å sveipe bunnen av røret. Ruge på is 30 min. Utføre en varme sjokk ved å plassere røret i en 42 ° C vannbad og varme blokk for 45 s. Satte rørene tilbake på isen. Legge til 250 µL av SOC medium bakterier og la dem komme til 37 ° C i en risting inkubator i 30-45 minutter. Etter gjenoppretting plate transformert bakterier på 1,5% lysogeny kjøttkraft (LB) agar plater som inneholder ampicillin (100 µg / mL) og ruge over natten på 37 ° C. 5. velge STAgR kloner av bakterie kolonien PCR Forbered minst to sett med 200 µL PCR reaksjon rør (mellom 3 og 24) for hver konstruksjonen som kalles identisk. Fylle ett sett med 100 µL LB medium som inneholder 100 µg / mL ampicillin. Bruk et sterilt pipette tips til bunnen av biologisk materiale av en bakterie kolonien og spre den i bunnen av Tom 100 µL PCR reaksjon røret. Øyeblikkelig overføre spissen til andre tilsvarende reaksjon røret som inneholder LB medium. Swirl spissen rundt forsiktig for å sikre noen av bakterier overføres til LB media og ruge på 37 ° C for senere bruk. Definere en PCR master blanding (10 µL per reaksjon). 10 reaksjoner, kombinere 10 µL Taq buffer, 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL av primer (100 µM), 0,5 µL av Taq utvalg og legge til H2O til et volum av 100 µL. Bruk følgende primerne: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Legge til 10 µL av PCR master mix merket PCR reaksjon rørene uten LB media. Inkuber reaksjoner på en thermocycler med følgende: 1 syklus 94 ° c for 5 min, 38 sykluser av 94 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min; 1 syklus av 72 ° C i 10 min.Merk: Forlengelse tid (72 ° C trinn) skal økes med antall gRNA uttrykk kassetter. Beregne teoretisk størrelsen på innlegg bruker tabell 2 og bruke 1 min per 1 kb ved 72 ° C. Legg lasting fargestoff og analysere forsterket fragmenter på en 1% agarose gel. Laste inn en passende DNA stigen for skalering (1kb DNA stige) og kjøre i aktuelle gel kjører buffer (f.eksTLE Buffer) på 120 V i 30 min. Beregne teoretisk størrelsen på amplicon ved hjelp av tabell 2 ved å legge sammen individuelle filstørrelser brukt arrangører, gRNA stillaser og antall N20 sekvenser. Fra resultatene av kolonien PCR, identifisere bakteriell kloner basert på riktig bandet størrelsen og om de er sannsynlig å havn riktig vektorer. Vaksinere en 2,5 mL overnatting LB kultur (med 100 µg/mL ampicillin) med tilsvarende 100 µL kultur, definert tidligere. Inkuber ved 37 ° C i 12 h. Ekstra plasmider DNA ved hjelp av en kommersiell plasmider mini kit og produsentens instruksjoner31. Sekvens plasmider bruker følgende primerne: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) og StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) av Sanger sekvensering.

Representative Results

Følger protokollen for hånden gjør generering av tilpassede multipleksing gRNA vektorer mulig (figur 1). Representant resultatene av STAgR med seks ulike gRNA kassetter er avbildet i figur 2. Figur 2 En viser en typisk utfallet av PCRene brukes til å innhente STAgR brikkene (protocol 3.1 3,3). Seks amplicons (BB, S1-S5) representerer lineær DNA stykker som inneholder den personlige gRNA N20 sekvenser på endene. Plasmider ryggraden (BB) er nå utvidet med målretting sekvenser av gRNA1 og gRNA6 og derfor har de nødvendige overlapper til to andre PCRene (S1 og S5) for Gibson samlingen (figur 2A, tabell 3). Etter rensing oppnås en DNA avkastning på minst 1 µg vektorer og setter inn. Etter Gibson montering, skal bakteriell transformasjon resultere i 100 til 700 bakteriell koloniene. Figur 2 B viser en representant analyse av 10 bakteriell koloniene via kolonien PCR, etter en STAgR protokoll med seks gRNA kassetter. Gel geleelektroforese angir at tre kloner viser forventede amplicon for hele samlingen (tabell 2). Andre kloner trolig mottatt STAgR vektorer som inneholder ett til fem gRNA kassetter, mens en klone (figur 2B, No.18) er tom. Figur 1 : Oversikt over STAgR primer design. Første gRNA nummer og stillasene er valgt, så gRNA rekkefølge og arrangøren og siste, hvilken vektor skal brukes. For hver gRNA, er en bestemt frem primer med gRNA målretting rekkefølgen følelse orientering og vanlig del av “scf-FP” eller “sam-FP” utformet. Tilsvarende for å generere den personlige omvendte primeren tilsvarende promoter sekvensen (RP) er smeltet sammen med omvendt komplement N20 sekvens med den neste gRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2 : Representant resultatene av STAgR med seks ulike gRNA kassetter. (A) representativt eksempel på en PCR fem setter samt vektoren STAgR_Tomato. (B) kolonien PCR en 6 x STAgR reaksjon med hU6 og mU6 arrangører og Kanonisk gRNA samt SAM stillaser. 22 bakteriell koloniene ble analysert, hvorav 7 viste forventet bandet som angir fullstendig samlingen. Stigen: 1 kb pluss tall i base parene (bp). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Videre primer for streng og vektor scaffold_fwd GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT SAM_fwd GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG Snu primer for streng og vektor hU6_rev CGGTGTTTCGTCCTTT mU6_rev CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG hH1_rev CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA h7SK_rev CCGAGGTACCCAAGCGG Tabell 1: Primer sekvenser for gRNA stillaser og arrangører. Størrelser av arrangørene og stillaser. hU6 265 bp hH1 225 bp mU6 316 bp h7SK 245 bp gRNA stillaset 83 bp SAMloop + gRNA stillas 143 bp Tabell 2: Teoretisk størrelsene av hver uttrykk kassett beregne kolonien PCR utfallet. hU6 hH1 mU6 h7SK STAgR_Neo STAgR_tdTomato gRNA Scf 400 bp 360 bp 451 bp 380 bp 3722 bp 4487 bp SAM 460 bp 420 bp 511 bp 440 bp – – Tabell 3: Størrelser av arrangørene og stillaser. hU6 hH1 mU6 h7SK STAgR_Neo STAgR_tdTomato gRNA Scf 368 bp 328 bp 419 bp 348 bp +74 bp + 67 bp SAM 428 bp 388 bp 479 bp 408 bp Tabell 4: Beregnet størrelser av STAgR etter PCR.

Discussion

Her presenterer vi en detaljert protokoll for STAgR gir rask og enkel generering av gRNA uttrykk plasmider av varierende størrelse. Denne protokollen kan brukes for ett-trinns generasjon gRNA plasmider med 2-8 gRNA uttrykk kassetter (med eller uten to MS2 RNA-aptamers) i gRNA uttrykk vektoren STAgR_Neo og bruk av menneskelige U6, mus U6, human 7sK og menneskelige H1 arrangører28 ,32,33. Hvis mer enn fire kassetter er ønskelig, anbefales det å bruke minst to forskjellige promoter/stillaset typer for å øke effektiviteten. Andre vektorer, arrangører og promoter kombinasjoner, samt mer enn 8 gRNA kassetter kan være mulig. men er dette ikke testet. Selv om vår erfaring metoden fungerer pålitelig og reproduserbar, vi har bestemt avgjørende skritt og feilsøking strategier forventet resultat ikke umiddelbart skje. Vår erfaring noen trinn er avgjørende for suksess for tilnærmingen: først og fremst det er viktig å bruke riktig molar prosenter av setter inn til vektor ryggraden på Gibson montering trinn (3:1). Men merket vi at for noen gRNA sett en 1:1 ratio av innstikk til vektor er gunstig, selv når gRNA kassett nummeret overstiger to. Dernest perioden Gibson montering reaksjonen bør være langt nok (minst 45 min anbefales).

STAgR kan brukes med en rekke endringer. Målretting sekvenser, gRNA kan tall og stillaser, arrangører og vektor infrastruktur tilpasses og fritt kombinert. Men kan hver kombinasjon ha litt forskjellige krav. I vår erfaring, hvis middels eller høyt antall gRNA kassetter (> 4) er ønsket, men ikke fått umiddelbart, vanligvis den raskeste måten å overvinne problemet er å endre individuelle gRNA kassettene i vektoren. Tilsvarende kombinere ulike gRNA arrangører og stillaser forbedrer effektiviteten (og dermed reduserer antall koloni PCRene som måtte være scoret) når mange gRNA kassetter er klonet. Vi fant at feil kloner genereres vanligvis av spontane sammen med gjentatte sekvenser sammensetting Gibson. Selv om dette kan redusere effektiviteten av metoden, fører dette også til samtidige generering av vektorer med funksjonell gRNA delsett28.

Generasjon multipleksing gRNA vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassett er rapportert med en rekke ulike metoder21,22,23,24,25, 26,27. Mens noen ansette simultan eller sekvensiell kloning av gRNA par22,34, avhenger andre av Golden Gate montering og flere sekvensielle kloning trinnene25,35. En spesiell adgang har blitt brukt av Xie et al., ved hjelp av endogene cellular tRNA behandling systemet å kutte flere gRNAs av en enkelt stamfar transkripsjon36. Advangetage av denne metoden er behovet av eneste selskapet; Ulempen er behovet av nylig syntetisert DNA fragmenter for hver kombinasjon av gRNA. Hver gRNA multipleksing metode har fordeler og ulemper; STAgR kombinerer enkelhet med effektivitet, høyt antall mulige gRNA kassetter med lave kostnader.

STAgR (og andre multipleksing systemer) sannsynligvis være medvirkende muliggjør effektiv (og samtidig) avbrudd flere gener i vivo, som i sebrafisk hjerner28. En annen fremtidig anvendelse av gRNA multipleksing vektorer er løftet manipulering av komplett transcriptional programmer i motsetning til induksjon eller undertrykkelse av enkelt gener. Sannsynlig, disse metodene kan transformere cellene og organene på vil i mye større grad enn det er mulig i dag.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne gjerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Jovica Ninkovic for innspill, hjelp og støtte i å utvikle metoden STAgR. Tobias Klötzer og Anna Köferle Valentin Baumann for nyttige kommentarer. Arbeidet har blitt støttet av DFG (STR 1385/1-1).

Materials

Phusion High- Fidelity DNA Polymerase NEB M0530L Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs
dNTPs Life Technology R0191 dNTPs for all PCRs
dATP Life Technology R0141 dNTPs for Gibson Master Mix
dCTP Life Technology R0151 dNTPs for Gibson Master Mix
dGTP Life Technology R0161 dNTPs for Gibson Master Mix
dTTP Life Technology R0171 dNTPs for Gibson Master Mix
Agarose VWR 443666A
DpnI NEB R0176S
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881 for DNA clean up
Tris HCL Roth 9090.2 for Gibson Master Mix
DTT Life Technology R0861 for Gibson Master Mix
PEG 8000 VWR RC- 077 for Gibson Master Mix
NAD Cayman Chemicals Company 16077 for Gibson Master Mix
T5 Exonuclease NEB M0363S for Gibson Master Mix
Taq DNA Ligase NEB M0208S for Gibson Master Mix
Ampicilin SigmaAldrich PHR1393-1G
DNA Ladder 1kb Plus Thermo Scientific SM0311
Plasmid Mini Kit Thermo Scientific K0503
Plasmid and Primer Sequences All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTA PanReacAppliChem 6381-92-6 for TLE Buffer
MgCl2 SigmaAldrich M8266 for Gibson Master Mix
Top10 chemically competent bacteria Thermo Scientific C404003
S.O.C. Medium Thermo Scientific 15544034
Yeast- Extract SigmaAldrich Y1625 for lysogenic broth (LB Media)
NaCl SigmaAldrich S7653 for lysogenic broth (LB Media)
Peptone SigmaAldrich 91249 for lysogenic broth (LB Media)
Agar-Agar SigmaAldrich 5040 for lysogenic broth (LB Media)
Taq DNA Polymerase Quiagen 201203

References

  1. Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247 (2015).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
  5. Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59 (2015).
  6. Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  9. Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739 (2016).
  10. Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918 (2016).
  11. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  12. Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517 (2015).
  13. Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396 (2015).
  14. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  15. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  16. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  19. Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
  20. Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
  21. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  22. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  23. Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
  24. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
  25. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147 (2014).
  26. Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
  27. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  28. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015 (2018).
  29. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
  30. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  31. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (1982).
  32. Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917 (2016).
  33. Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264 (2017).
  34. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
  35. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400 (2014).
  36. Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).

Play Video

Cite This Article
Breunig, C. T., Neuner, A. M., Giehrl-Schwab, J., Wurst, W., Götz, M., Stricker, S. H. A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR). J. Vis. Exp. (142), e58556, doi:10.3791/58556 (2018).

View Video