Her presenterer vi streng montering gRNA kloning (STAgR), en metode for å enkelt multiplex gRNA vektorer for CRISPR/Cas9 nærmer seg. STAgR gjør gRNA multipleksing enkel, effektiv og kan tilpasses.
Bakteriell CRISPR/Cas9 systemet har betydelig økt metodologiske alternativer for life forskere. På grunn av dens utnyttelse ble genetisk og genomisk engineering gjelder for et stort utvalg av systemer. Dessuten, mange transcriptional og epigenomic engineering tilnærminger er nå generelt mulig for første gang. En årsak til bred anvendelse av CRISPR ligger i bipartite natur. Små gRNAs bestemme genomisk målene av komplekset, varianter av protein Cas9 og lokale molekylær konsekvensene. Men mange CRISPR tilnærminger, avhenger av samtidige levering av flere gRNAs i individuelle celler. Her presenterer vi en passelig protokoll for streng montering gRNA kloning (STAgR), en metode som tillater enkel, rask og effektiv generering av multiplex gRNA uttrykk vektorer i en enkelt kloning trinn. STAgR er kostnadseffektiv, siden (i denne protokollen) personlige målretting sekvensene er innført av kort overheng primere mens lang DNA malene av gRNA uttrykk kassettene kan brukes på nytt flere ganger. Videre kan STAgR enkelt trinn innlemmelse av en rekke gRNAs, samt kombinasjoner av ulike gRNA varianter, vektorer og arrangører.
Streng montering gRNA kloning (STAgR) er en metode som muliggjør effektiv overnatting generasjon av uttrykket vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassetter i én enkelt kloning trinn. STAgR protokollen avhenger ikke på spesialisert ekspertise eller materialer og tilbyr flere alternativer for tilpasning.
Bakteriell CRISPR protein Cas9 har en unik kapasitet. Det er mulig å finne og selektivt binde bare de DNA-sekvensene kodet i naturlig forekommende crRNAs eller utviklet gRNAs1. Dens utnyttelse som molekylære verktøy har aktivert en rekke tilnærminger som var umulig, unfeasible eller bare begrenset til visse mobilnettet modeller inntil nylig. Disse inkluderer målrettet genet mutasjoner2, genomet engineering3, epigenome4,5,6, transcriptional aktivisering og gene stanse7,8. Så vidt vi vet CRISPR er universelt deployerbare, som rapporter om sin søknad finnes for en rekke målområder, celletyper og arter. Men avhenger mange CRISPR programmer av direkte eller indirekte levering av flere gRNAs inkludert en rekke genomisk manipulasjoner (translocations9,10, medium11 og storskala genomisk endringer 12 , 13), genomet engineering (bruk Cas9 nickases14), generasjon av betinget alleler11,15 eller seriell mutasjoner16og sporing strategier17. Videre for andre tilnærminger (transcriptional engineering18, epigenome engineering19,20) flere målretting nettsteder ikke er strengt obligatorisk, men de når maksimal virkning ofte bare under denne tilstand.
Flere nyttige metoder har blitt beskrevet for å generere gRNA vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassett21,22,23,24,25,26, 27. Her presenterer vi en protokoll for STAgR, streng montering gRNA kloning, som er enestående i sin kombinasjon av enkelhet og hastighet (bare en overnatting kloning trinn kreves), lavpris (som DNA maler kan brukes på nytt flere ganger), customizability (for forskjellige gRNA systemer og arrangører) og effektivitet (lar generering av vektorer med høyt antall gRNA kassetter)28.
STAgR kan i prinsippet brukes til å generere uttrykk vektorer med noen (1-2 gRNAs), flere (3-5 gRNAs) og noen av flest uttrykk kassetter rapportert så langt (6-8 gRNAs)28. Tilsvarende gjelder STAgR for gRNA rekkefølge, ryggraden eller arrangøren. Siden imidlertid STAgR er hovedsakelig basert på polymerase kjedereaksjoner (PCR) og Gibson montering, skal gRNAs med høy sekvens likheter genereres ved hjelp av en alternativ metode.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for STAgR gir rask og enkel generering av gRNA uttrykk plasmider av varierende størrelse. Denne protokollen kan brukes for ett-trinns generasjon gRNA plasmider med 2-8 gRNA uttrykk kassetter (med eller uten to MS2 RNA-aptamers) i gRNA uttrykk vektoren STAgR_Neo og bruk av menneskelige U6, mus U6, human 7sK og menneskelige H1 arrangører28 ,32,33. Hvis mer enn fire kassetter er ønskelig, anbefales det å bruke minst to forskjellige promoter/stillaset typer for å øke effektiviteten. Andre vektorer, arrangører og promoter kombinasjoner, samt mer enn 8 gRNA kassetter kan være mulig. men er dette ikke testet. Selv om vår erfaring metoden fungerer pålitelig og reproduserbar, vi har bestemt avgjørende skritt og feilsøking strategier forventet resultat ikke umiddelbart skje. Vår erfaring noen trinn er avgjørende for suksess for tilnærmingen: først og fremst det er viktig å bruke riktig molar prosenter av setter inn til vektor ryggraden på Gibson montering trinn (3:1). Men merket vi at for noen gRNA sett en 1:1 ratio av innstikk til vektor er gunstig, selv når gRNA kassett nummeret overstiger to. Dernest perioden Gibson montering reaksjonen bør være langt nok (minst 45 min anbefales).
STAgR kan brukes med en rekke endringer. Målretting sekvenser, gRNA kan tall og stillaser, arrangører og vektor infrastruktur tilpasses og fritt kombinert. Men kan hver kombinasjon ha litt forskjellige krav. I vår erfaring, hvis middels eller høyt antall gRNA kassetter (> 4) er ønsket, men ikke fått umiddelbart, vanligvis den raskeste måten å overvinne problemet er å endre individuelle gRNA kassettene i vektoren. Tilsvarende kombinere ulike gRNA arrangører og stillaser forbedrer effektiviteten (og dermed reduserer antall koloni PCRene som måtte være scoret) når mange gRNA kassetter er klonet. Vi fant at feil kloner genereres vanligvis av spontane sammen med gjentatte sekvenser sammensetting Gibson. Selv om dette kan redusere effektiviteten av metoden, fører dette også til samtidige generering av vektorer med funksjonell gRNA delsett28.
Generasjon multipleksing gRNA vektorer som inneholder flere gRNA uttrykk kassett er rapportert med en rekke ulike metoder21,22,23,24,25, 26,27. Mens noen ansette simultan eller sekvensiell kloning av gRNA par22,34, avhenger andre av Golden Gate montering og flere sekvensielle kloning trinnene25,35. En spesiell adgang har blitt brukt av Xie et al., ved hjelp av endogene cellular tRNA behandling systemet å kutte flere gRNAs av en enkelt stamfar transkripsjon36. Advangetage av denne metoden er behovet av eneste selskapet; Ulempen er behovet av nylig syntetisert DNA fragmenter for hver kombinasjon av gRNA. Hver gRNA multipleksing metode har fordeler og ulemper; STAgR kombinerer enkelhet med effektivitet, høyt antall mulige gRNA kassetter med lave kostnader.
STAgR (og andre multipleksing systemer) sannsynligvis være medvirkende muliggjør effektiv (og samtidig) avbrudd flere gener i vivo, som i sebrafisk hjerner28. En annen fremtidig anvendelse av gRNA multipleksing vektorer er løftet manipulering av komplett transcriptional programmer i motsetning til induksjon eller undertrykkelse av enkelt gener. Sannsynlig, disse metodene kan transformere cellene og organene på vil i mye større grad enn det er mulig i dag.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne gjerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Jovica Ninkovic for innspill, hjelp og støtte i å utvikle metoden STAgR. Tobias Klötzer og Anna Köferle Valentin Baumann for nyttige kommentarer. Arbeidet har blitt støttet av DFG (STR 1385/1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |