Summary
Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.
Abstract
Die Hornhaut ist beträchtlich als Modellsystem benutzt worden, um die Wundheilung zu studieren. Die Fähigkeit zu generieren und nutzen primäre Säugerzellen in zwei dimensionale (2D) und drei dimensionale (3D)-Kultur hat eine Fülle von Informationen nicht nur über Hornhaut Biologie, sondern auch über Wunde heilen, Myofibroblast Biologie und Narbenbildung im Allgemeinen erzeugt. . Das Ziel des Protokolls ist ein Testsystem zur Quantifizierung der Myofibroblast Entwicklung, die Narbenbildung charakterisiert. Wir zeigen eine Hornhaut Orgel Kultur ex Vivo Modell mit Schwein Augen. In diesem vorderen Keratektomie gewickelt sind Hornhaut noch in der ganzen Welt mit einer kreisrunden Klinge genannt ein Trephine verwundet. Ein Stecker von ca. 1/3 der vorderen Hornhaut wird entfernt, einschließlich das Epithel, die Basalmembran und den vorderen Teil des Stroma. Nach Verwundung, sind Hornhaut geschnitten aus der ganzen Welt, montiert auf einem Sockel von Kollagen/Agar und für zwei Wochen im freien Medium ergänzt-Serum mit stabilisiertem Vitamin C, Zellproliferation und extrazelluläre Matrix Sekret vermehren von resident Fibroblasten kultiviert. Aktivierung des Myofibroblasts in der vorderen Stroma ist offensichtlich in der vernarbte Hornhaut. Dieses Modell lässt sich Wundverschluss, die Entwicklung von Myofibroblasts und fibrotische Marker und toxikologischen Untersuchungen zu bestimmen. Darüber hinaus können die Auswirkungen von kleinen Molekül-Inhibitoren sowie SiRNA Lipid-vermittelte Transfektion für gen-Knockdown in diesem System getestet werden.
Introduction
Narbenbildung in der Hornhaut, die aufgrund von Verletzungen, Trauma oder Infektion kann zu schwächenden Linsentrübungen und permanenten Sehverlust führen. Deshalb müssen Wege zu identifizieren, die für eine therapeutische Intervention ausgerichtet werden können. Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt und besteht hauptsächlich aus Hornhaut Transplantationen, die nicht auf der ganzen Welt für Patienten zugänglich sind. Mensch (Abbildung 1) und tierischen Hornhaut genutzt werden, für 2D und 3D Zellkultur Studien1,2. Menschliche Kadaver Hornhäute nicht geeignet für Transplantation erhalten Sie von Auge Banken oder zentralisierte Gewebebanken (National Disease Research Interchange (NDRI)) und Tieraugen erhalten Sie von einem Schlachthof. Primäre Epithelzellen der Hornhaut, stromale Fibroblasten und neuerdings auch endothelial Zellen isoliert und kultiviert aus diesen Geweben für die Wundheilung und Toxikologie Studien3,4,5. Neben der Bedeutung von Verständnis der molekularen Grundlagen der blendenden Augenkrankheit hat die Zugänglichkeit der Gewebe und die Fähigkeit zur primären Zellkulturen der Hornhaut ein wichtiges Modellsystem für Studie gemacht. Die Hornhaut ist ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Agenten auf Narben wie die normale Hornhaut durchsichtig ist und bestimmte Arten von Wunden schaffen, Trübungen oder fibrotische Narben (rezensiert in6). Mehrere in-Vivo Hornhaut Wunde heilende Modelle wurden auch ausgiebig genutzt, für die Narbenbildung Studien1. Weniger genutzt wurde die Ex Vivo Hornhaut verwunden heilende Modell7,8 , die hier ausführlich beschreiben. Das Ziel dieser Methode ist es, Narbenbildung Ergebnisse zeichnet sich durch fibrotische Entscheidungsträger in ein 3D mehrzelligen quantifizieren Hornhaut ex-Vivo-Modell-System.
Innerhalb von 24-72 h9schließt Hornhaut epithelialen Verwundung, die nicht der epithelialen Basalmembran Regel verstoßen. Bald nach der Verwundung beginnen die Zellen am Rand des Epithels Verbreitung und Migration in der epithelialen Oberfläche, epitheliale Barrierefunktion wieder herzustellen. Diese Aktivität folgt sequentiell durch Aktivierung der Hornhaut Basal-Zell-Proliferation zuerst und in einem späteren Stadium der Vorläuferzellen liegt im limbischen Außenzone, Wiederherstellung der Epithelzelle Masse10,11zu erreichen. Diese Wunden heilen oft ohne Narbenbildung ab. Allerdings führt eine Wunde, die oft die Basalmembran in das Stroma dringt Narbe Bildung1. Nach Hornhaut Stromazellen verletzt wurden, wird das Stroma mit Zellen mehrere Herkunft einschließlich resident Stromazellen Körperzellen sowie dem Knochenmark stammenden Fibrocytes12,13,14aufgefüllt. Fibrotische Narben zeichnet sich durch die Beharrlichkeit der Myofibroblasts in einer heilenden Wunde. Diese pathologischen Myofibroblasts zeigen erhöhte Adhäsion durch die Anhäufung von Integrine in fokalen Adhäsionen, kontraktilen α-glatten Aktin (α-SMA) Stress Muskelfasern und lokale Aktivierung der extrazellulären Matrix (ECM)-abgesondert latente Umwandlung Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ). Die Differenzierung der epithelialen gewonnenen Zellen, bekannt als epitheliale mesenchymale Transition (EMT), kann auch dazu beitragen, die Bildung6Narbe.
Es ist ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Zell-Differenzierung und Apoptose nach Verwundung. Wegen der Verletzung in der Basalmembran, Wachstum Faktoren wie Platelet-derived Wachstumsfaktor (PDGF) und TGFβ aus Tränen und das Epithel das Stroma Baden induzieren Myofibroblast Unterscheidung, eine nachhaltige autokrine Schleife der TGFβ Aktivierung, und die Sekretion von unorganisiert fibrotische ECM15,16. Die Persistenz von Myofibroblasts in der geheilte Wunde fördert Haze und Narbenbildung in der Hornhaut (Abbildung 2). Jedoch in regenerativ heilte Wunde obwohl Myofibroblasts entwickeln, sie Apoptose und somit fehlen oder in deutlich reduzierten Anzahl in das vernarbte Gewebe (rezensiert in Referenz6,10). So konzentrierte Forschung auf fibrotische Narben zumindest teilweise auf targeting Moleküle, die übermäßige Myofibroblast Entwicklung oder Myofibroblast Persistenz17,18zu verhindern. Weil Myofibroblast Persistenz Narbenbildung und fibrotischen Erkrankungen in allen Geweben19charakterisiert, kann die Hornhaut als Modellsystem, allgemeine zelluläre Mechanismen der Fibrose zu studieren nützlich.
In unserem Modellsystem wird die Hornhaut mit einer zylindrischen Klinge genannt gilt in der ganzen Welt verletzt. Mensch und Schwein Hornhaut können mit entweder eine 6 oder 7 mm Trephine; verwundet bei Kaninchen Hornhaut wird ein 6 mm Trephine bevorzugt. Die Schwein-Hornhaut ist ähnlich groß wie der menschlichen Hornhaut. Weil sie kostengünstig und in großen Stückzahlen verfügbar sind, werden routinemäßig Schwein Hornhäute für Orgel Kultur verwendet. Darüber hinaus haben Antikörper und SiRNAs gemacht mit Menschen reagieren konsequent mit Schwein7cross-reacted. Nach Verwundung, Hornhaut geschnitten aus der ganzen Welt mit dem Limbus intakt und montiert auf einem Agar/Kollagen-Basis. Die Hornhäute sind kultivierte in serumfreien Medien plus stabilisiert Vitamin C um Fibroblasten-Proliferation und ECM Ablagerung20zu simulieren. Weder die Zugabe von Serum Wachstumsfaktoren sind erforderlich, um Myofibroblast Bildung7induzieren. Hornhäute sind routinemäßig fixiert und nach zwei Wochen der Kultur für Histologie verarbeitet. Für gen-Knockdown, oder testen Sie die Auswirkungen eines Agenten auf die Wundheilung die Wunde mit SiRNA in der Wunde nach Verwundung7 behandelt werden kann oder ein löslicher Agent kann zu den Medien, bzw.8hinzugefügt werden.
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Protocol
1. Orgel-Kultur
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Vorbereitungen
- Agar-Lösung wie folgt vorbereiten. In ein kleines Fläschchen zubereiten, 1 % Agar und 1 mg/mL bovinen Kollagen in DMEM-F12 bis 20 mL. Auf einer Herdplatte zum Kochen bringen. Setzen Sie die Lösung in ein 50 mL konische Röhrchen. Legen Sie Rohr in einem Wasserbad auf einer heißen Platte, die Lösung von Verfestigung zu halten.
- Bereiten Sie ergänzte serumfreie Medien (SSFM) gemäß der Zusammensetzung in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
Hinweis: Die notwendige Menge an SSFM vorbereitet werden hängt von der Anzahl der Hornhaut verarbeitet werden. 30 mL ist in der Regel genügend Medien für 4 Hornhaut.
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Dissektion
Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einer Dissektion Kapuze oder eine chemische Kapuze. Die Augen werden mit Deckel noch in einzelne Taschen zum Schutz der Globen befestigt versandt.- Entfernen Sie Globen aus Deckel mit einer geraden Kante chirurgischen Klinge auf ein Schneidebrett mit Ethanol gereinigt. Entfernen Sie überschüssiges Fettgewebe aus dem Auge mit einer Klinge oder eine kleine Schere (Abb. 3A, 3 b).
- Nach dem Entfernen der ganzen Welt aus dem Deckel, halten Sie den Globus nach hinten mit Zange und Tauchen Sie sofort das Auge in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Schnell Tauchen sie 3 X in 10 % Jod (in 100 mL-Becherglas). Tauchen Sie schnell 2 X mit PBS-Puffer (~ 100 mL in ein Becherglas, Änderung PBS häufig).
- Mit einem sauberen Tuch oder Gewebe, wickeln Sie das Auge umlaufend mit genügend Druck, um eine straffe Hornhautoberfläche zum Schneiden mit der Trephine haben.
Hinweis: darauf achten Sie, um zu verhindern, dass das Handtuch oder Gewebe die Hornhaut zu kontaktieren.
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Verwundung
- Verwenden Sie ein 6 mm gilt, um das Zentrum der Hornhaut zu verwunden. Dringen Sie das Epithel und vorderen Stroma ohne eine voll-dicke Wunde durch die gesamte Hornhaut ein.
Hinweis: Wenn das Endothel eingedrungen ist, wird ein Druckverlust und auslaufende Flüssigkeit gesehen werden. In diesem Fall sollte das Auge entsorgt werden. - Legen Sie die gilt in der Mitte der Hornhaut, drehen 180 Grad im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn 5 X (jedes Mal, wenn die Richtung geändert wird es als ein Mal gezählt) und mit leichtem Druck auf die Wunde zu vertiefen.
Hinweis: Nun sollte die Wunde tief genug, um eine Gewebe-Klappe gehoben werden mit einer Zange zu ermöglichen. Ist dies nicht der Fall, wiederholen Sie Schritt 1.3.2. - Heben Sie die Klappe von den Rändern. Zur gleichen Zeit mit der anderen Hand oder mit einer zweiten Person, verwenden Sie eine Klinge schneiden parallel zu den Globus, um das Gewebe weggeschnitten, da die Zange weiterhin der vorderen Hornhaut innerhalb der Wundrand abheben. Am Ende dieses Schrittes sollte eine kreisförmige Wunde befindet sich in der Mitte der Hornhaut (siehe Abbildung 3 C, 3D).
- Verwenden Sie ein 6 mm gilt, um das Zentrum der Hornhaut zu verwunden. Dringen Sie das Epithel und vorderen Stroma ohne eine voll-dicke Wunde durch die gesamte Hornhaut ein.
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Schneiden und Entfernen der Hornhaut aus der ganzen Welt
- Halten Sie das Auge mit dem Gewebe, machen Sie einen kleinen Einschnitt 1 mm vom Rand der Hornhaut mit einer Klinge, so dass der Limbus in der Orgel-Kultur enthalten ist.
- Mit kleinen, zugreifen scharfen Schere den Schnitt erstellt in der vorherigen Schritt schneiden rund um den Globus, halten einen Millimeter Spielraum in der Hornhaut, der Limbus intakt zu halten.
- Legen Sie die Hornhaut in einer 60 mm Schale mit 1 mL PBS, Wunde Seite nach unten bis Montage.
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Montage
- Sicherstellen Sie, dass der Agar, eine warme Temperatur (ca. 25 ° C) gekommen ist.
- Erstellen Sie mit zwei Zangen eine Tasse von zwei Seiten der Hornhaut mit der endothelialen Seite hochhalten. Fügen Sie die erwärmten Agar-Lösung in die Hornhaut mit einer sterilen Transferpipette, bis es voll ist.
- Nachdem der Agar härtet (in der Regel ca. 30-45 s) sorgfältig drehen die Hornhaut mit dem Agar in 60 mm Platte (Abbildung 3E). Mit einem Deckel abdecken.
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Inkubation
- Fügen Sie 4 mL SSFM auf den Teller, Aufrechterhaltung Hornhaut an einer Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle an der limbischen Grenze in 5 % CO2 bei 37 ° C. Aktualisieren Sie Medien nach 24 h und danach jeden zweiten Tag.
Hinweis: Wenn eine Transfektion in die Wunde, lassen Sie die Antibiotika bis nach Transfektion Weg. - Befeuchten Sie die Hornhautoberfläche einmal täglich durch Zugabe von 1 Tropfen SSFM aus den konditionierten Medien in der Schale, die Feuchtigkeit zu halten. Dafür das Gericht aus dem Inkubator nehmen, legen Sie es unter der Haube, entfernen Sie den Deckel der Schüssel, nasse Oberfläche mit Medien vom Gericht mit einer sterilen Pipette, wieder abdecken und setzen Sie ihn wieder in den Inkubator.
- Für gen-Knockdown behandeln Sie die Wunde mit gen-targeting oder kontrollieren Sie SiRNA, die komplexiert Lipid-vermittelten Beförderer gemäß Anweisungen des Lieferanten (siehe unten) ist zu.
- Mix 5 µL (50 Pmol) von SiRNA in 50 µL reduziert Serum minimale wesentlichen Medien (zB., Opti-MEM). Mix 2 µL Transfection Reagens in 50 µL reduziert Serum Medien. Lassen Sie diese für 5 Minuten sitzen und dann mischen.
- Die Reagenz/SiRNA-Mischung 200 µL reduziert Serum minimale Medien hinzufügen.
- Pipette tropfenweise auf die Wunde und 3 h inkubieren.
- SiRNA von Hornhautoberfläche mit Medien in der Schale waschen. Ändern Sie die Inkubation Medien in SSFM + Antibiotika (siehe die Tabelle der Materialien). Weiter Inkubation wie bereits erwähnt (Schritte 1.6.1-1.6.2).
- Fügen Sie 4 mL SSFM auf den Teller, Aufrechterhaltung Hornhaut an einer Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle an der limbischen Grenze in 5 % CO2 bei 37 ° C. Aktualisieren Sie Medien nach 24 h und danach jeden zweiten Tag.
2. Histologie: Paraffin Abschnitte und Immunostaining
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Vorbereitung des Gewebes
- Nach einer zweiwöchigen Inkubation, wenn einige des Gewebes für quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse, vor der Befestigung, Halbierung die Hornhaut durch die Wunde. Legen Sie diese Hälfte oder nur ¼ (entweder ist genug Gewebe) in RNA-protect Reagenz zu stabilisieren.
- Mit einem standard Isolierungskit, isolieren Sie RNA und durchführen Sie qRT-PCR.
Hinweis: Alternativ der verletzte Teil nur isoliert und Genexpression getestet. - Setzen Sie die andere Hälfte der Hornhaut Gewebe Pathologie Kassetten und Tauchen in Fixativ (10 % Formalin) für 2-4 Tage bei Raumtemperatur (RT).
- Paraffin einbetten das die Hälfte der verletzten Hornhaut mit standard-Techniken.
Hinweis: Richten Sie die verletzte Hornhaut um sicherzustellen, dass die Gewebe schneiden einen Querschnitt der Hornhaut führen wird.
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Immunostaining mit 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB)
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Tag1
- Aufkleber Folien ordnungsgemäß mit einem Bleistift. De-paraffinize des Gewebes durch die Platzierung von Folien in ein Gefäß mit clearing Agent (2 Änderungen, 10 min).
- Rehydrieren Sie das Gewebe durch die Übertragung der Folien in Ethanol bei abnehmenden Konzentrationen (100 %, 100 %, 70 %, 50 %, dH2O, dH20, 5 min für jede Änderung).
- Durchführen Sie Antigen-Retrieval durch Mikrowelle Folien in ein Plastikglas mit Citrat-Puffer (10 mM, pH 6,4) für 5 min. Erster Zyklus 5 min bei 50 % Leistung. Füllen Sie das Glas mit Citrat-Puffer und wiederholen. 10 min. abkühlen.
- 3 X mit PBS, 2 min zu waschen. Permeabilize Gewebe mit 1 % Triton x-100 in PBS 10 min bei RT. Block mit 3 % normalem Ziegenserum (NGS) für 1 h bei RT in feuchte Kammer Abschnitte.
- Gewebe mit Primärantikörper inkubieren (1: 100 oder wie der Lieferant schon sagt) in 3 % NGS über Nacht bei 4 ° C (300 µL pro Folie).
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Tag2
- Spülen Sie Folien 3 X mit PBST (PBS plus 1 % Tween 20), 2 min. Legen Sie Folien in 3 % H2O2 für 10 min, endogene Peroxidase zu blockieren. 3 X mit PBST, 2 min zu waschen. Inkubieren Sie Abschnitte mit HRP Sekundärantikörper (1: 250) in 3 % NGS für 1 h bei RT (300 µL pro Folie).
- Waschen Sie Folien 3 X PBST, 2 min. Folien mit dem DAB-Kit zu behandeln. Fügen Sie 300 µL/Folie für 3 min. Waschen gleitet mit dH2O 2 x (schnelle Dips).
- Counterstain mit Hämatoxylin für 20 S. Waschen der Folie mit dH2O 2 x (schnelle Dips). Fleck mit Bläuen Agent für 20 S. Spülen in dH2O für 20 S. gelief Gewebe indem man gleitet in steigenden Konzentrationen von Ethanol (50 %, 70 %, 100 %, 100 %, alle schnelle Dips).
- Trocknen Sie Folien auf einem Papiertuch unter der Haube für 10-20 Minuten.
- Montieren Sie Folien mit 1 Tropfen der Montage Medien, mit Deckglas abdecken. Label und Shop bei RT
- Bild der Folien unter dem Mikroskop und Quantifizierung der DAB-Signal mit ImageJ7 (siehe Abschnitt 4).
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Tag1
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Immunostaining: Fluoreszenz
- Am 1. Tag Schritte in Schritt 2.2.1 beschrieben. Führen Sie die folgenden Schritte am Tag2.
- Spülen Sie Folien 3 X in PBST für 2 min. Inkubieren Sie Abschnitte mit Fluorophor-markierten Sekundärantikörper in 3 % NGS (1: 200) für 1 h bei RT
- 3 X 2 min in PBST, waschen. Montieren Sie Folien mit 1 Tropfen 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Montage Medien und Abdeckung mit einem Deckgläschen. Trocken auf Küchenpapier unter der Haube für 30 min. Store im Dunkeln bei 4 ° C bis Fluoreszenz-Bildgebung.
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Quantifizierung mit Bild J
- Laden Sie die "Fidschi" Version von ImageJ, umfasst die notwendigen Plugins für DAB Färbung Quantifizierung.
- Öffnen Sie ein Bild in Fidschi und wählen Sie → Bild → Farbe Farbe Dekonvolution.
- Wählen Sie "H DAB" als den Fleck, und klicken Sie dann auf "OK". Drei neue Bilder erscheinen. Wählen Sie das Bild, das nur DAB Färbung enthält.
- Stromazellen Färbung nur Quantifizierung verwenden Sie ImageJ-Radiergummi-Funktion, um das Epithel aus dem DAB-Bild zu entfernen.
- Wählen Sie analysieren → Maßnahme (oder Strg + M) und notieren Sie den Wert.
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Representative Results
Immunohistochemistry ist die primäre Assay genutzt, analysieren Sie den Erfolg der Ex Vivo verwunden heilende Experiment. Abbildung 4 zeigt die Epithel und vorderen Stroma in Kontrollgewebe (Abbildung 4A, 4 b). Sechs Stunden nach der Verletzung, war das Epithel abwesend (Abbildung 4, 4-D). Sechs Tage nach der Verwundung, wie erwartet, hatte das Epithel (Abbildung 4E, 4F) regrown. Dieses Gewebe wurde Immunostained für Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA), der Ausdruck Myofibroblasts charakterisiert. Gibt es ein dramatischer Anstieg der α-SMA Immunostaining in das Stroma wie von farbmetrischen DAB Substrat erkannt. Es gab auch eine Zunahme der epithelialen Reaktivität, die darauf hindeuten könnte, EMT Übergang7 (siehe Diskussion). Desorganisation im Epithel und Stroma zeigte. Eine Verwundung Experiment bei niedriger Vergrößerung und mit fluoreszierenden Immunostaining anstelle von DAB ist (Abbildung 4, 4 H) gezeigt. Wundrand ist sichtbar sowie ein Gefälle von aktiven Myofibroblasts vom vorderen zum hinteren Stroma.
Obwohl fibrotische Marker um eine Woche (Abbildung 4), exprimiert werden, um konsistente und zuverlässige Entwicklung von fibrotischen Markern zu erhalten war ein zwei Wochen Zeitpunkt gewählt. In Abbildung 5 zeigt ein Test mit einer einmaligen Anwendung der Kontrolle oder gen-targeting SiRNA getestet werden, für die Förderung regenerativer Heilung. In diesem Fall war die targeting SiRNA USP10, ein Deubiquitinase. Pathologische Myofibroblasts zeigte erhöhte Adhäsion durch die Anhäufung von αv-Integrine in fokalen Adhäsionen21. Unsere früheren Studien zeigten, dass αvβ1 und αvβ5 wichtige fibrotische Integrine in Hornhaut Stromazellen heilende7 sind. Integrine binden ECM außerhalb der Zelle und zusammen sind sie verinnerlicht. Die verinnerlichten Integrin Ubiquitinated ist und für den Abbau in den Lysosomen gesendet oder das Ubiquitin-Tag wird durch einen Deubiquitinase (DUB) entfernt und der Integrin wird an der Zelloberfläche. Wir entdeckten, dass eine Erhöhung der Genexpression von DUB (USP10) die Rate der Ubiquitin-Entnahme aus der Integrin-Untereinheiten β1 und β5 erhöht führt zu einer resultierenden Ansammlung von αv/β1/β5, auf der Zelloberfläche mit nachfolgenden TGFβ Aktivierung und Induktion fibrotische Marker7. Knockdown von USP10 in der Hornhaut Orgel Kultur verhindert das Erscheinungsbild der fibrotische Marker7. Ein Beispiel für diese Ergebnisse ist in Abbildung 5dargestellt. Als ist oben, α-SMA als Marker für Myofibroblasts genutzt. Ein weiterer Indikator für die Narbenbildung ist Fibronektin-EDA (FN-EDA), eine Spleißvariante der FN, die ein RGD αv Integrin bindende Domäne22,23,24enthält. Es ist auch zelluläre FN (c-FN) bezeichnet. Es dient als wichtige fibrotische Marker, da FN-EDA nicht zirkulierenden Plasma aber stattdessen ist nur zum Ausdruck gebracht und Zellen unter fibrotische Bedingungen25sezerniert. Abb. 5A-5 C Immunostaining für α-SMA zeigt. Im Vergleich zum unverletzten (Abb. 5A), Verwundung plus Steuerung SiRNA (Abb. 5 b) zeigte einen dramatischen Anstieg in α-SMA-Protein-Expression, während der Zusatz von USP10 SiRNA7 drastisch Ausdruck in das Stroma und Epithel. Ebenso zeigte im Vergleich zum unverletzten (Abbildung 5), Verwundung plus Steuerung SiRNA (Abbildung 5E) einen dramatischen Anstieg der Fibronektin-EDA-Protein-Expression im Vergleich zur Behandlung mit USP10 SiRNA (Abbildung 5F). Immunhistologie für das Zielprotein (in diesem Fall USP10) wurde verwendet, um erfolgreiche Knockdown7zeigen. Darüber hinaus kann die Durchführung qRT-PCR gen-Knockdown im Gewebe oder auch für andere fibrotische Marker7assay versichern. ImageJ kann verwendet werden, um Signal in das Stroma nur oder Gesamtsignal (Abbildung 5) zu quantifizieren. Mindestens 3 Hornhäute für jede Bedingung getestet sollte verwendet werden, um Immunostaining um statistische Signifikanz zu erzeugen, wie wir hier gezeigt haben und zuvor veröffentlicht7zu quantifizieren. Andere Proteine, die routinemäßig für fibrotische Marker verwendet worden sind Kollagen III Ausdruck und eine Zunahme der Integrin Ausdruck1,26.
In Abbildung 6zeigt die Verwendung von ex-Vivo Hornhaut Kultur als eine Toxikologie-Assay. In diesem Experiment Hornhaut waren entweder links unverletzt (Abbildung 6A), (Abbildung 6 b), verwundet oder verwundet und behandelt mit 10 µM Spautin-127, die den Zellkulturmedien für Zeiträume vor dem auswaschen ( Erhöhung hinzugefügt wurde Abbildung 6-6F). Spautin-1 ist ein Medikament, das richtet sich nicht speziell USP1027. Aufgrund unseres Erfolges mit USP10 SiRNA wurde Spautin Behandlung für Wirksamkeit bei der Verhinderung von Narben getestet. Anders als die SiRNA war Spautin bei dieser Konzentration giftig für das Gewebe. Erhöhung der Zeit mit Spautin-1 in Kultur verhindert erneute Epithelisierung und führte zu qualitativen Zelltod, unorganisiert Matrix und Stromazellen Vakuolen, die darauf hindeutet, dass Spautin-1 nicht fördert Heilung bei der Konzentration untersucht. Standard histologischen Assays einsetzbar, Zellproliferation und Apoptose zu quantifizieren.
Abbildung 1 : Querschnitt durch ein menschliches Auge mit einem erweiterten Blick auf die Hornhaut. In Primaten und Hühner, histologisch gibt es fünf verschiedene Schichten: Epithel, Bowman Membran Stroma, Decement der Membran und Endothel28,29. Bei allen anderen Säugetieren ist Bowman Membran histologisch nicht sichtbar. Auf mikroskopischer Ebene Übertragung Elektronen wird eine Basalmembran trennt das Hornhaut-Epithel und Stroma in alle Hornhaut einschließlich derjenigen mit einem Bowman Membran beobachtet. Eine intakte Bowman Membran oder Basalmembran trennt das Stroma das Epithel ist eine notwendige zu verhindern Narbenbildung bei allen Säugetieren. Bild abgedruckt mit freundlicher Genehmigung von AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Schematische Darstellung der zelluläre Ereignisse, die zu Hornhautnarben führen. Dieses Diagramm zeigt die grundlegenden Ereignisse, die in der vorderen Hornhaut nach Verwundung zu entfalten. (A) Darstellung der Basalmembran, das Epithel, Stroma und die ruhenden Zellen eingebettet im Stroma, dh, Keratozyten. ()B) das rote Dreieck zeigt eine Wunde, die mechanische sein kann, ein Geschwür, Virus oder persistierende Infektion. (C) nach Verwundung, in denen die Bowman oder Basalmembran durchbrochen wird, die Zellen um die Wunde Apoptose. (D und E) ein Zustrom von Zellen wieder zu bevölkern die Wunde von resident Keratozyten oder dem Knochenmark stammenden Fibroblasten und Übergang in aktivierten Fibroblasten oder direkt in Myofibroblasts. (F) diese Anhänger pathologische Myofibroblasts schaffen eine autokrine Schleife von TGFβ Aktivierung und Sekretion von unorganisiert fibrotische Matrix, die Hornhaut Dunst und Narbe Bildung fördert. In einer regenerativ geheilte Wunde Myofibroblasts scheinen aber haben Sie Apoptosed in das vernarbte Gewebe6,29,30. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Annahme und Bearbeitung der Hornhaut für Orgel Kultur. (A) Schwein Augen empfangen werden, mit Deckel, um die Hornhaut während des Transports zu schützen. (B) Bild von der ganzen Welt nach Gewebe entfernt wird. (C) Bild von einem 6 mm gilt. (D) daraus der zentralen Hornhaut mit einer Trephine. (E) Bild der montierten Hornhaut nach der Entnahme aus der ganzen Welt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Hornhautgewebe nach Verwundung. Immunohistologische Analyse der unverletzten (Kontrolle) oder verletzte Hornhaut. Schwein Hornhaut wurden entweder links unverletzten (Kontrolle) oder verwundet. Gewebeschnitte wurden Immunostained mit Antikörper gegen Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA), Myofibroblasts zu identifizieren. (A und B) Kontrolle, unverletzt. (C und D) Wounded und 6 h nach Verwundung festgesetzt. Epithel ist entfernt (Pfeil). (E und F) Wounded und 6 Tage nach Verwundung festgesetzt. Stroma hat ausfüllen und das Epithel hat regrown (Pfeilspitze). Repräsentative aktivierten Myofibroblasts sind mit Sternchen (*) gekennzeichnet. (G, H) Niedrige Vergrößerung Bilder von α-SMA Immunostaining 2 Wochen nach der Verwundung: α-SMA (rot), DAPI (blau). Die Bilder wurden mit einem aufrechten Fluoreszenz/Hellfeld-Mikroskop mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Testen regenerative Heilung Agenten. Schwein-Hornhaut waren entweder (A und D) unverletzt (Kontrolle), (B und E) verwundet und mit Kontrolle SiRNA behandelt, oder (C und F) verwundet und mit USP10 SiRNA behandelt. Immunostaining für (A-C) α-SMA oder (D-F) Fibronektin-EDA. Nach der Behandlung mit USP10 SiRNA, α-SMA wurde von 2,2 ± 0,6 Falten reduziert *** p < 0,001 und FN-EDA 3,3 ± 1,2 fache ** p < 0,01. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Fluoreszenz/Hellfeld-Mikroskop mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 µm. (G) Hornhaut Stromazellen Färbung, wie von ImageJ quantifiziert. Statistischer Signifikanz wurde durch einfache ANOVA mit Bonferroni Test berechnet. Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Gillespie angepasst wurde Et Al.7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Test-Agents für Auswirkungen auf die Reepithelialisation - toxikologischen Untersuchungen. Immunostaining für α-SMA. Schwein Hornhaut waren unverletzt (A) und (B) verwundet. (C-F) Hornhaut wurden verwundet und inkubiert mit 10 µM Spautin-1. Die Inhibitor wurde ausgewaschen und 2 Tage, (D) 4 Tage (E) 6 Tage (F) 14 Tage nach (C) durch Medien ersetzt. Alle Medien Änderungen während der Inkubationszeit inbegriffen und Spautin. Alle Hornhaut wurden behoben und nach 2 Wochen in Kultur in Paraffin eingebettet. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Fluoreszenz/Hellfeld-Mikroskop mit einer CCD-Kamera aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Modell für die Wundheilung in einer natürliche geschichteten 3D-Umgebung zu studieren. Verwendung der Orgel Kultur als Zwischenprodukt zwischen Zellkultur und in vivo Studien reduziert Kosten sowie reduzierende Verfahren an lebenden Tieren. Andere 3D Modelle haben von großem Nutzen für das Feld einschließlich Self Synthese von Kollagen Gele aus primären menschlichen Hornhaut Fibroblasten2 oder diese dieselben Zellen hergestellt in Gele hergestellt aus tierischen kollagenen31eingebettet. Das Organsystem Kultur Modell eignet sich besonders zum vermeintlichen heilende Wirkstoffe testen, da die Wunde lokalisiert und somit deutlich zwischen Verwundeten und nicht verletzte Gewebe in der gleichen Hornhaut (Abbildung 4). Darüber hinaus ermöglicht eine mechanische Trephine Wunde direkten Zugriff auf das Stroma, die eignet sich hervorragend für Verwaltung von SiRNAs in die Wunde (Abbildung 5). Obwohl es hier nicht angezeigt wird, wurde virale Transduktion in Hornhautgewebe in Orgel Kultur auch nachgewiesene32,33,34. Eine andere Permutation des Assays wäre die Hornhaut mit einem Reporter-Konstrukt der Interesse und Bild Genexpression in Echtzeit nach Verwundung zu infizieren. In Bezug auf die Übersetzung in vivo Studien dieses Verfahren in Kaninchen35 und somit Orgel Kultur auf Mensch, Schwein erreicht werden kann, oder Kaninchen Hornhäute können in-vivo Ergebnisse verglichen werden. Nach unserer Erfahrung sind die Daten, die wir mit dem Orgel-Kultur-Modell mit SiRNA Behandlung in ähnliche Ergebnisse in Vivo (unveröffentlichte Daten) übersetzt. Da die Orgel Kultur Hornhaut eine funktionale limbisches Gefäßsystem, Tränen und Kammerwasser fehlt, muss jeder Prüfer beurteilen, ob dies ein nützliches Modell für ihr Studium sein wird. Resident Aktivierung von Immunzellen ist demonstriert worden, aber die exaktere Parallel zur in-vivo-Studien ist noch nicht klar1.
Ein wichtiger Schritt in das Protokoll soll nicht die Hornhaut zu durchdringen, indem zu tief verwundet. Dies wird offensichtlich, da in diesem Fall die Vorderkammer Flüssigkeit auslaufen wird. In diesem Fall sollte die ganzen Welt verworfen. Um eine noch mechanische Wunde zu erzeugen, greifen Sie die Lippe des abgegrenzten Gewebes innerhalb des trephined Bereichs mit einem Forcep und verschieben Sie das chirurgische Messer parallel zu der Hornhautoberfläche weggeschnitten werden die Gewebe innerhalb der Grenzen der Wunde gilt. Die Hornhautoberfläche sollte nicht austrocknen, damit wir empfehlen, die nach der Wunde und Ausschneiden der Hornhaut aus der ganzen Welt, legen Sie die Hornhaut verdeckte in PBS, bis die Agar-Mischung bei der richtigen Temperatur ist. Darauf achten, dass der Agar nicht zu heiß wird Endothelschäden vermeiden.
Eine Einschränkung dieses Modells ist, dass die Verwendung von einem gilt, eine Wunde zu produzieren uneben ist und kann nicht reproduziert werden, gleich gegenüber von Hornhaut, Hornhaut laserinduzierte Wunden36. Aber natürlich auftretende Wunden sind nicht alle gleichwertig in die Tiefe und ein großer Bestand an Daten legen nahe, dass eine Verletzung in die Basalmembran in das Stroma Myofibroblast Entwicklung und Haze erzeugt während der Regeneration von der Basalmembran führt zu vermindert Narbenbildung37,38,39. Dieses Schwein Hornhaut Orgel Kultur Modell beschäftigt eine schwere Wunde, bei der der Basalmembran im Bereich der Trephine entfernt wird. Entwicklung von Myofibroblasts und fibrotische Marker in der Hornhaut Stroma wurden konsequent und Reproduzierbarkeit erreicht mit diesem Modellsystem. Einige epithelialen Färbung ist in der Regel deutlich, dass in den Verwundeten und nachgewachsene Epithel verdunkelt. Dies ist demonstriert worden, in anderen Hornhaut Orgel Kultur berichten40 aber fehlen in den meisten Hornhaut von in Vivo Maus und Kaninchen Studien41,42. Eine Studie, durchgeführt in einem in-vivo Eckzahn Modell zeigte jedoch, starke epithelialen α-SMA Färbung in das Epithel nach Verwundung43. Die SiRNA, die höher gestuft, regenerative Heilung in unseren Studien auch deutlich reduziert diese epithelialen Immunostaining, was darauf hindeutet, dass das Epithel EMT (fibrotische Narben) unterzogen werden kann wenn es nachwächst, in der Orgel-Kultur. Darüber hinaus ergaben sich Auslassung eines primären Antikörpers in der Färbung Protokoll der verletzte Hornhaut in das völlige Fehlen von Färbung7 darauf hindeutet, dass die Immunostaining spezifisch ist. Gefrierschnitte (nicht dargestellt) waren ähnlich Abschnitte in dieser Hinsicht paraffin. Jedoch weil leichte aber Variable Hintergrund Färbung in das Epithel, unserem Labor nur die stromale Färbung quantifiziert hat, Probleme die keine histologischen Hintergrund zu haben scheint7.
Wenn menschliche Hornhaut verletzt wurden, kann Hornhaut nicht zur Transplantation anstelle von voller Kugeln mehr kostengünstige40sein. In diesem Fall wird die Hornhaut ohne die Hilfe des Drucks durch den Globus gewährte verwundet zu werden. Weitere verletzte Strategien können Hornhaut Verbrennungen gehören, die ausgiebig in-vivo, eine Narbe42zu produzieren verwendet worden sein.
Zusammenfassend lässt sich sagen die Vorteile dieses Systems für eine 3D Gewebe Wundheilung Assay ist seine Reproduzierbarkeit und Kosteneinsparungen mit nur standard Ausrüstung braucht, so dass es eine hervorragende Ressource für die Beobachtung und Quantifizierung der Auswirkungen des Agenten auf die Heilung des Gewebes.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH-NEI R01 EY024942, Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit, Upstate Medical University Research Eigenkapital, und Lions Distrikt 20-Y. Mikroskopie und Bildanalyse von Paraffin Abschnitte wurden durchgeführt in der Mikroskopie-Kern und histologischen Folie Vorbereitung erfolgte am Biorepository und Pathologie Kern der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100x |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100x |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100x |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100x |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200x |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10 mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera |
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