Этот протокол обеспечивает эффективный подход к измерению LDL холестерина поглощения с показателями притока реального времени с использованием живой клетки системы в различных типах клеток. Эта техника обеспечивает платформу для фармакологической активности соединений, затрагивающих ЛПНП приток во время мониторинга для морфологии клеток и поэтому потенциальные цитотоксичность на экране.
Регулирование LDL холестерина поглощения через LDLR-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования в различных основных патологий, включая метаболические расстройства, сердечно-сосудистые заболевания и заболевания почек. В настоящее время существует не доступный метод для оценки поглощения ЛПНП при одновременно мониторинга здоровья клеток. Настоящее исследование представляет протокол, с помощью системы анализа изображений живой клетки, приобрести последовательных измерений ЛПНП притока с параллельного мониторинга здоровья клеток. Этот роман технику испытывается в трех линий клеток человека (печеночная, почечная трубчатых эпителиальных и коронарной артерии эндотелиальных клеток) за 4-часовой курс. Кроме того чувствительность этого метода проверяется с известным ингибиторы, Dynasore и рекомбинантных белков PCSK9 ЛПНП, а также ЛПНП поглощение промоутер, симвастатин. Вместе взятые, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активностью, а также мониторинг морфологии клеток, поэтому цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП. Анализ может использоваться с различными системами визуализации и аналитического программного обеспечения.
ЛПНП, низкой плотности липопротеинов LDLR рецептор-опосредованный эндоцитоз является важной областью исследования, поскольку циркулирующего уровня холестерина ЛПНП в ядро1сердечно-сосудистых заболеваний, почечной болезни2 , а также различных воспалительных болезни3 и генетических расстройств с мутациями в холестерин транспорта генов4,5,6,7. Исследования в LDLR-опосредованной холестерина приток привели к идентификации нескольких исследовательских инструментов, например ингибиторов Динамин, включая химические Dynasore8,9,10, а также ЛПНП регулирующая белки такие Proprotein конвертазы Субтилизин/Kexin тип 911,(PCSK9)12.
Пути эндоцитоза ЛНП-LDLR начинается с поглощения ЛНП-LDLR комплекс на поверхности клеток в Клатрин покрытием ямы-13. Везикулы образуются затем invagination клеточной поверхности мембраны интернализации ЛНП-LDLR комплекс в вакуолей для транспорта внутри клетки. Как сформированные везикул созревает в ранний и поздний затем endosomes, рН капель внутри конце endosome, вызывая диссоциации ЛПНП от его рецептор14. В прошлом методы количественной оценки ЛПНП приток зависит от Радио меченых 125-ЛПНП Сопредседатель инкубации с клетки и последующего извлечения из клеток для количественной оценки15цианокобаламина, меченного белка. Это затем был заменен использование дневно помечены ЛПНП белков например DiI-ЛПНП и последующей иммуноокрашивания или извлечения белков для флуоресцентных чтений, используя спектрофотометр или пластины читателя15,16. Дневно помечены ЛПНП также использовался в активируемых флуоресценции клеток, сортируя (FACS) для анализа интернализации ЛПНП и клеток поверхности ЛПНП привязки17. Хотя эти методы позволяют сбора данных после лечения, мониторинг жизнеспособность клеток во время лечения не возможен.
Кислой рН в конце endosome позволяет использовать рН активированный флуоресцентного ЛПНП зонда как pHrodo красный ЛПНП, которая флуоресцирует после интернализации18,19. Это свойство позволяет курс время непрерывной оценки поглощения ЛПНП в живых клеток. Таким образом этот протокол использует pHrodo красный-ЛПНП флуоресценции изображений в жить анализа клеток для серийно мера ЛПНП поглощения с параллельного мониторинга здоровья клеток. Результаты свидетельствуют о надежности этой новой техники как протестированного 4-часовой курс в три разных человека клеточных линий, клетки человека рак печени (HepG2), человека почечных клеток эпителия (HK2) и человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAEC ). Эти клеточные линии клинически значимых для ЛПНП Распродажа20,21,,2223,24,25,26,27 , почечной болезни28,,2930,31и болезни сердца32,33, соответственно. Помимо контроля за притоком ЛПНП, этот протокол включает в себя лечение с двух известных ЛПНП ингибиторы, Dynasore гидрата и Рекомбинантный белок PCSK9, а также статинов индуктором выражение LDLR и поглощения ЛПНП, симвастатин. Dynasore и рекомбинантные PCSK9 каждого работать через различные пути, чтобы уменьшить поглощение ЛПНП.
Dynasore – это небольшая молекула ингибитор Dynamins10 и уменьшает поглощение ЛПНП, блокируя Клатрин зависимых эндоцитоза ЛНП-LDLR комплекс10,34. Рекомбинантных PCSK9, с другой стороны, является членом пептидаза S8 семьи, которая связывается с LDLR и препятствует его переработки на поверхности клеток после выпуска ЛПНП от интернализированных комплекса, блокируя необходимые конформационные изменения35,36 . Поверхностная плотность LDLR снижение клеток в конечном итоге приводит к снижение ЛПНП поглощения в ячейке. Статины, хотя непосредственно блокирования фермента редуктазы 3-гидрокси-3-methylglutaryl кофермент (HMG-CoA) и таким образом биосинтез холестерина, также известны upregulate выражение LDLR25,38 ведет к увеличению поглощения ЛПНП. Чувствительность этого протокола проверяется путем обнаружения значительных сокращений в ЛПНП приток в трех клинически значимых человека клеточных линий, HK2, HepG2 и HCAECs, Dynasore и/или рекомбинантные PCSK9 и заметное увеличение поглощения ЛПНП в HepG2 клетках СИМВАСТАТИН в 4-часовой курс с мониторинга для морфологии клеток/здоровья. Взятые вместе, этот метод обеспечивает платформу средняя высокая пропускная способность для одновременно скрининг фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующих потребление LDL в живых клетках.
В текущем протоколе мы демонстрируем использования изображений живой клетки как новый и более эффективный метод для измерения реального времени ЛПНП поглощение время курс в различных линий клеток человека. Клетки человека рак печени (HepG2) обычно используются в исследованиях, скрининг гиполипидемической терапии21,,2223,24,25,26, , 39–40. Поэтому мы выбрали этот тип ячейки для тестирования возможностей визуализации системы живой клетки для ЛПНП приток исследований. Наши результаты показывают, что HepG2 клетки, совместимы с этой новой техники и результат в сигмовидной кишки, как кривая, указывающее непрерывное поглощение ЛПНП на время приток assay до 4,33 h как на финальную конечную точку (рисунок 2A и Рисунок 3 ).
Холестерин гомеостаза играет важную роль в патофизиологии различных нефропатии. Действительно накопление холестерина в почечной ткани является крупный вклад почечной фиброз, приводит к хронической болезнью почек и основных патологии в различных нефропатии28,,2930,31. Следовательно мы изучили наш метод в клетках человека эпителия почек (HK2) как популярные и надежные клеточная линия, используемых в области нефрологии. Наши данные также поддерживает возможности живой клетки тепловизионные системы для измерения ЛПНП приток в HK2 клетках. Как показано на рисунке 2B, HK2 клетки take up ЛПНП линейно на всем протяжении приток исследования (4 часа).
Ввиду важности метаболизм холестерина в развитии и прогрессировании атеросклероза32,,3341, ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний, которые в свою очередь является убийцей номер один во всем мире 42, мы направлены для проверки нашего метода в типе атеросклероз соответствующие ячейки. Мы использовали человека коронарных артерий эндотелиальных клеток (HCAECs), поскольку они являются одним из первых типов клеток подвергаться воздействию холестерина оскорбление в просвет коронарной артерии пациента атеросклероза. Наши данные, показан на рис. 2C указывает, что этот метод приток ЛПНП также работает эффективно с HCAECs. Полученный график является кривой сигмовидной кишки как похож на что из HepG2 клеток.
Чтобы проверить действительность и чувствительности этот повышение ЛПНП приток assay для проверки соединений, влияющих на LDL-холестерина поглощения, мы использовали три управления, ЛПНП снижение поглощения агентов Dynasore и rPCSK9 и ЛПНП приток активатор симвастатин. Здесь, мы рассматривали выше упомянутых клеточных линий (HepG2, HK2 и HCAECs) с оптимизированной концентрации Dynasore или rPCSK9 до приток assay. Наши результаты показали, что все три испытания клеточных линий ответил на лечения с значительного сокращения притока ЛПНП над 4-часовой курс (рис. 2). К примеру, 4.33 h в последний момент, лечение с Dynasore на 40 мкм значительно сократить приток ЛПНП в HepG2 клетки, клетки HK2 и HCAECs на 53%, 68% и 54%, соответственно (p < 0,0001; Рисунок 2 A-C и Таблица 2A-C). Кроме того, rPCSK9 на 10 мкг/мл вызвало заметное сокращение 55% ЛПНП приток в HK2 клетках (p < 0,0001; Рисунок 2 B и Таблица 2B). Кроме того наши исследования показали, что лечение HepG2 клетки с СИМВАСТАТИН привели к заметному увеличению поглощения ЛПНП (рис. 3), поддерживая чувствительность этого метода для обнаружения значительных изменений в ЛПНП приток. Исследования лечения с rPCSK9 в HepG2 и HCAEC клетки не включаются в этот протокол, как rPCSK9 используется в качестве дополнительного контроля лечения с документально результаты, но дорого купить в небольших количествах. Поэтому rPCSK9 использовался только для проверки этот протокол в HK2 клетках.
Живой клетки визуализации анализа, а также функциональные и своевременного измерение притока ЛПНП, допускается для непрерывного мониторинга здоровья и морфологию клеток. Это преимущество может эффективно обнаруживать потенциальные цитотоксичность применяемых соединений, что делает этот метод идеальной техникой одновременно мониторинга фармакологической активности и цитотоксичность. Цифры 5-7 иллюстрируют представитель образы трех проверенных клеточных линий на финальную конечную точку (4.33 h) как визуальную ссылку для эффекта лечения на чистый приток ЛПНП, а также показывает здорового морфологию клеток после испытания лечение. Мы рекомендуем визуальный осмотр всех изображений из каждой скважины заверить вересковый морфологию клеток на время исследования. Например, в данных не отображаются, когда изображения HepG2 клеток лечение с 80 мкм Dynasore были проверены, мы наблюдали признаки клеток отряд, как по краям клетки представляется, отрывая пластину, предлагая мобильный отряд в более высоких концентрациях Dynasore. Кроме того высокие концентрации препарата СИМВАСТАТИН (3-10 мкм), также привело к указанием измененных морфология индуцированного апоптоза как сообщалось на высоких дозах статины45. Этот протокол был использован для выполнения титрование Dynasore лечения на 20-80 мкм, и симвастатин в концентрации 0,5-10 мкм, после чего ячейка изображения были использованы для анализа здоровье клеток и определения потенциальных ctotoxicity лечения на различные концентрации. Результаты предложили использовать 40 мкм для Dyansore и 1 мкм для СИМВАСТАТИН как оптимальной концентрации.
И наконец мы предлагаем, выполняя исследования титрования плотность клеток, если другая линия клетки должна быть протестированы с помощью этого метода для того, чтобы определить оптимальное ячейки номер в хорошо для получения согласованных результатов. Наши клетки плотность оптимизации исследование показало, что 10 000 клеток/хорошо в пластине 24-ну привести к последовательной ЛПНП приток результаты для HK2 и HCAE клеток. Важно отметить, что этот assay приток ЛПНП, с использованием живой клетки изображений системы, монослой клеток не притока, равномерно распределены на скважинах желательно как скопления клеток может привести к ошибкам в окончательный нормализованных значений приток ЛПНП. Причина этого заключается в том, что для нормализации данных приток, области объекта фаза используется как мера плотность клеток и этот параметр может пострадать при образуются скопления клеток. Мы наблюдали, что HepG2 клетки имеют тенденцию к форме сгустки когда осеменены на плотности выше 5000 клеток/хорошо вызывая несовместимым приток результаты; Таким образом мы использовали 5000 клетки в колодец в пластине 24-Ну как оптимальной плотности для HepG2 клеток.
Коллективно наш метод предоставляет платформу средняя высокая пропускная способность для скрининга фармакологической активности и цитотоксичность соединений, регулирующий приток ЛПНП одновременно. Этот метод может быть легко адаптирована для использования с другими дневно меченых лиганды, которые ввести лизосомальных отсек для оценки поглощения лиганд в режиме реального времени. Хотя этот протокол предлагает спецификации для InCucyte живут визуализации и анализа системы, протокол может быть адаптирован для альтернативных систем тепловидения, например целломике.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана следующие гранты ЛАГ: Национальный институт здравоохранения (R56HL132209 и 1R01HL140468) и Майами сердца исследовательского института. KY является получателем американского сердца ассоциации лектор стипендий (18PRE33960070). HepG2 клетки были любезно предоставленных д-р Томас Эммануэль, Университет Майами-Миллер школа медицины46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |