Summary

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Published: February 15, 2019
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Summary

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Abstract

Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.

Introduction

AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid Doenà (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.

Doenças de CNS diferentes exigem diferentes estratégias de entrega AAV, devido a várias regiões afectadas do CNS e tipos de células. As regiões de CNS e célula tipos que AAV pode transduce varia dependendo do serótipo bem como método de entrega. Por exemplo, rAAVrh10 tem demonstrado transduce predominantemente astrócitos quando entregue por sistêmica injeção intravenosa (IV), Considerando que ele nao tanto neurônios e glia quando entregue por intratecal injeção4,7. Além disso, a injeção de parênquima resultou na transdução de local para as imediações do local da injeção, Considerando que a injeção no fluido cerebrospinal (CSF) através de intraventricular ou injeção intratecal resultou na transdução generalizada de CNS8 . Estudos também demonstraram potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração9,10,11. Em doenças que afetam grandes áreas do SNC tais como ALS, injeção intratecal para o CSF foi mostrada para cobrir a maior parte das áreas que são afectados pela doença com uma dose mais baixa, em comparação com um método de entrega sistêmica4,10. Estudos recentes têm mostrado também que a punção lombar pode ser usada para injetar o vírus adeno-associados em modelos do rato para ALS, que evita lesões potenciais associados com laminectomia e intratecal cateterismo4.

Experimental punção direta foi usada primeiramente para entregar agentes anestésicos, especialmente, para a medula espinhal para analgesia e anestesia em 188512,13. Neste relatório, podemos ilustrar a punção lombar método de injeção é em ratos adultos, com o auxílio de 1% de cloridrato de lidocaína, um anestésico local Amida derivada, na solução de injeção para avaliar e monitorar a qualidade de injeção. Injeções bem sucedidas foram marcadas por paralisia transitória induzida por lidocaína, Considerando que a falha de injeções não mostrou esse comportamento. Estamos classificados o nível de fraqueza transitória, como uma das cinco classes para ajudar a prever a eficiência de injeção. Finalmente, mostramos que o nível de transdução de rAAVrh10 pode ser previsto pelo grau de paralisia. Portanto, este método de entrega AAV intratecal pode ser usado para melhorar a AAV-mediada gene-entrega para terapia experimental das doenças do CNS.

Protocol

Camundongos FVB/NJ foram criados na instalação de animais de laboratório chave de Neurologia de Hebei. Todos os experimentos de rato foram aprovados pelo segundo Hospital de Hebei médica Universidade Comitê de ética e realizados de acordo com os regulamentos de animais de laboratório, promulgada pelo Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China. 1. preparação da solução-mãe cloridrato de lidocaína 20% Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione …

Representative Results

Camundongos mostraram graus diferentes de fraqueza transitória logo após ele injeção da solução AAV no cloridrato de lidocaína 1% devido a vários qualidade de injeção intratecal. De acordo com o semigrau 5 sistema de pontuação que estabelecemos, nós testamos os padrões de transdução da AAV em camundongos com graus diferentes de fraqueza induzida por lidocaína membro (Pontuação 0, n = 2; escore 1, n = 1; marcar 4, n = 4; Pontuação 5, n = 3). EGFP imunocoloração de es…

Discussion

Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia tra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.

Materials

FVB/NJ mice Charles River Laboratories China
Lidocaine hydrochloride monohydrate HEOWNS 73-78-9
AAV Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School
25µL  Hamilton syringe/27-30g needle GASTIGHT 1702
O.C.T compond SAKURA 4583
H 2O 2 SHUI HUAN PAI 170401
Goat serum Solarbio S9070
Triton X-100 LIFE SCIENCES T8200
Rabbit anti-GFP Life tech G10362 1:333 dilution
The second antibody (goat-anti rabbit) Jackson Immuno Research 111-005-144 1:1000 dilution
VECTASTAIN ABC REAGENT Vector Lab PK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit Vector Lab SK-4105
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectorshield H-1200
NaCl Yong Da Chemical
NaH2PO4·2H2O Yong Da Chemical
Na2HPO4·12H2O Yong Da Chemical
Paraformaldehyde Yong Da Chemical 307699
Adhesion Microscope Slides CITOGLAS 17083 25*75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLAS Electro Microscopy Siences 72236-60 24*60 mm
15 ml Centrifuge tube CORNING 430790
96 well cell culture cluster Coster 3599
24 well cell culture cluster Coster 3524
70% Ethanol WEN ZHI
Gauze Wei AN 05171112 8cm*10cm*12cm
1mL syringe Hong Da
Microtubes Plasmed
Micropipet  eppendorf
Peppet tips Rainin
Centirifuge eppendorf 5427R
Regerator Haier BCD-539WT
Filter MILLEX GP R4PA42342
Pump LongerPump BT-100-2J/YZ1515X
Microscope Olympus BX53
Freezing-microtome Leica CM1520

References

  1. Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
  2. Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
  3. Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
  4. Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
  5. Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success–a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
  6. Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
  7. Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
  8. Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
  9. Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
  10. Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
  11. Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
  12. Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
  13. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
  14. Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
  15. Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, 1-10 (2016).

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Cite This Article
Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice. J. Vis. Exp. (144), e58565, doi:10.3791/58565 (2019).

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