Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.
Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.
AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid Doenà (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Doenças de CNS diferentes exigem diferentes estratégias de entrega AAV, devido a várias regiões afectadas do CNS e tipos de células. As regiões de CNS e célula tipos que AAV pode transduce varia dependendo do serótipo bem como método de entrega. Por exemplo, rAAVrh10 tem demonstrado transduce predominantemente astrócitos quando entregue por sistêmica injeção intravenosa (IV), Considerando que ele nao tanto neurônios e glia quando entregue por intratecal injeção4,7. Além disso, a injeção de parênquima resultou na transdução de local para as imediações do local da injeção, Considerando que a injeção no fluido cerebrospinal (CSF) através de intraventricular ou injeção intratecal resultou na transdução generalizada de CNS8 . Estudos também demonstraram potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração9,10,11. Em doenças que afetam grandes áreas do SNC tais como ALS, injeção intratecal para o CSF foi mostrada para cobrir a maior parte das áreas que são afectados pela doença com uma dose mais baixa, em comparação com um método de entrega sistêmica4,10. Estudos recentes têm mostrado também que a punção lombar pode ser usada para injetar o vírus adeno-associados em modelos do rato para ALS, que evita lesões potenciais associados com laminectomia e intratecal cateterismo4.
Experimental punção direta foi usada primeiramente para entregar agentes anestésicos, especialmente, para a medula espinhal para analgesia e anestesia em 188512,13. Neste relatório, podemos ilustrar a punção lombar método de injeção é em ratos adultos, com o auxílio de 1% de cloridrato de lidocaína, um anestésico local Amida derivada, na solução de injeção para avaliar e monitorar a qualidade de injeção. Injeções bem sucedidas foram marcadas por paralisia transitória induzida por lidocaína, Considerando que a falha de injeções não mostrou esse comportamento. Estamos classificados o nível de fraqueza transitória, como uma das cinco classes para ajudar a prever a eficiência de injeção. Finalmente, mostramos que o nível de transdução de rAAVrh10 pode ser previsto pelo grau de paralisia. Portanto, este método de entrega AAV intratecal pode ser usado para melhorar a AAV-mediada gene-entrega para terapia experimental das doenças do CNS.
Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia tra…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.
FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
Goat serum | Solarbio | S9070 | |
Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
NaCl | Yong Da Chemical | ||
NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
70% Ethanol | WEN ZHI | ||
Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
1mL syringe | Hong Da | ||
Microtubes | Plasmed | ||
Micropipet | eppendorf | ||
Peppet tips | Rainin | ||
Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
Regerator | Haier | BCD-539WT | |
Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
Microscope | Olympus | BX53 | |
Freezing-microtome | Leica | CM1520 |