Summary
Her præsenterer vi en direkte Intratekal injektionsteknik bruger 1% lidocain hydrochlorid i en viral løsning at sikre effektiv adeno-associeret virus levering til små dyr og indføre et pointsystem for at forudsige transduktion effektivitet i centralt nervesystemet forhold til graden af forbigående svaghed induceret af lidocain.
Abstract
Intratekal (IT) injektion af adeno-associeret virus (AAV) har tiltrukket betydelig interesse i CNS genterapi i kraft af dets sikkerhed, noninvasiveness og fremragende transduktion effekt i CNS. Tidligere undersøgelser har påvist den terapeutiske styrken af AAV-leveret genterapi i neurodegenerative sygdomme af det administration. Men høje priser af uforudsigelige fejl på grund af en teknisk begrænsning af IT-administration i små dyr er blevet rapporteret. Her, etableret vi et pointsystem for at indikere succes omfanget af lumbalpunktur i små dyr ved at tilføje 1% lidocain hydrochlorid oploesningen injektion. Vi viser yderligere, at omfanget af forbigående svaghed efter injektion kan forudsige AAV transduktion effektivitet. Således, denne IT injektion metode kan bruges til at optimere terapeutiske forsøg i musemodeller af CNS-sygdomme, der plager bred regioner i CNS.
Introduction
AAV kan mægle langsigtede og udbredt genekspression i CNS transduktion med få bivirkninger, og derfor er blevet en af de mest lovende køretøjer for genterapi til behandling af CNS sygdomme herunder Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sygdom (HD), Alzheimers sygdom (AD), opbevaring af lysosomale sygdomme (LSD), Gaucher sygdom (GD) og neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. I øjeblikket er mere end 100 AAV serotyper isoleret fra mennesker og dyr. Blandt disse, mindst 12 har været brugt i prækliniske og kliniske forsøg, herunder de mest almindeligt anvendte gen vektorer som AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8, og rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Forskellige CNS sygdomme kræver forskellige AAV levering strategier på grund af de forskellige berørte CNS regioner og celletyper. CNS regioner og celle typer der AAV kan transduce varierer afhængigt af serotype og leveringsmetode. For eksempel, har rAAVrh10 vist sig at transduce overvejende astrocytter når leveret af systemisk intravenøs injektion (IV), der henviser til, at det transduced både neuroner og glia når leveret ved Intratekal injektion4,7. Derudover resulterede parenkym injektion i lokale transduktion til omegnen af injektionsstedet, mens indsprøjtning i cerebrospinalvæske (CSF) gennem intraventrikulært eller Intratekal injektion resulterede i udbredt CNS transduktion8 . Undersøgelser har også vist terapeutiske styrken af AAV-leveret genterapi i neurodegenerative sygdomme af det administration9,10,11. I sygdomme, der påvirker store områder af CNS som ALS, har Intratekal injektion i EFSR'EN vist sig at dække de fleste områder, der er ramt af sygdommen med en lavere dosis, sammenlignet med en systemisk levering metode4,10. Nylige undersøgelser har også vist, at lumbalpunktur kan bruges til at injicere AAV i musemodeller for ALS, som undgår potentielle skader forbundet med laminektomi og Intratekal kateterisation4.
Eksperimentelle direkte lumbalpunktur blev første gang brugt til at levere agenter, især anæstetika, rygmarven til analgesi og anæstesi i 188512,13. I denne rapport viser vi den lumbal punktur IT injektion metode i voksen mus ved hjælp af 1% lidocain hydrochlorid, en lokal AMID-afledte anæstesi, i opløsningen injektion til at evaluere og overvåge injektion kvalitet. Vellykket injektioner var præget af lidocain-induceret forbigående lammelse, mens mislykkede injektioner ikke viste dette problem. Vi klassificerede niveau af forbigående svaghed som en af fem karakterer til at hjælpe med at forudsige injektion effektivitet. Endelig viser vi, at rAAVrh10 transduktion niveau kan forudsiges af kvaliteten af lammelse. Derfor, denne Intratekal AAV leveringsmetode kan bruges til at forbedre AAV-medieret gen-levering for eksperimentel behandling af CNS sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FVB/NJ mus blev avlet i Dyrefacilitet af nøglen laboratorium af Hebei neurologi. Alle mus eksperimenter blev godkendt af det andet Hospital af Hebei medicinske universitet etiske udvalg og udført efter reglerne i laboratorium animalsk management bekendtgjort ved ministeriet for videnskab og teknologi i People's Republic af Kina.
1. forberedelse af 20% lidocain hydrochlorid stamopløsning
- Vej 2 g af lidocain hydrochlorid. 5 – 6 mL sterilt vand og vortex tilsættes forsigtigt. Øge lydstyrken til ialt 10 mL sterilt vand.
- 1.2 filtrere stamopløsningen gennem 0,2-micron filtre. Alikvot stamopløsning, 1 mL pr. 1,5 mL microcentrifuge rør, og forsegle det med en forsegling film. Opbevares ved 4 ° C.
2. direkte Intratekal AAV levering i vågen mus
- Tør arbejdsområdet ved hjælp af steril gaze med 70% ethanol og forberede de nødvendige forsyninger som nævnt i tabel 1.
- Forberede 100 µL af AAVrh.10/1% lidocain hydrochlorid komplekse ved at tilføje 95 µL af rAAVrh10 stamopløsning (5 x 1012 genom kopier/mL) i en steril 200 µL microcentrifuge rør, og tilsæt 5 µL af 20% lidocain hydrochlorid stamopløsning. Bland godt af pipettering op og ned. Derefter gemme virus løsning på is (4 ° C).
Bemærk: 8 µL pr. musen4 vil blive brugt. -
Forberede sprøjte med AAV løsning til injektion
- Samle en 25 µL Hamilton sprøjten med en 27 G kanyle og justere den skrå spids af nålen med den volumetriske skala på sprøjten.
- Tegne 8 µL med 4 x 1010 genom kopier af virus løsning ind i sprøjten forsigtigt. Sørg for at fjerne luftbobler.
-
Forberedelse til mus
Bemærk: mandlige eller kvindelige FVB/NJ mus (30-70 dage gammel) blev anvendt i denne undersøgelse. IT injektion blev opereret i hætten.- Sterilisere arbejdsområde i en hætte med 70% ethanol. Sæt awake musen (mand eller kvinde, 30-70 dage gamle, 13 – 20 g vægt) på en bedpiece i en udsat position i hætten. Dække overkroppen med steril gaze til at berolige musen og undgå at blive bidt.
- Fix dyret af gribende behørigt og fuldt og fast på sin bækken bælte med en tommelfinger på en side og pegefinger/midterste finger på anden siden. Holde huden mellem bilaterale bækken hofteholdere henslængt med tommel- og pegefinger. Hold forsigtigt på overkroppen dyret med håndfladen.
- Barbere pels på ryggen mellem de bilaterale bækken hofteholdere, så sterilisere hudoverfladen med en Iodid-baserede krat og 70% ethanol.
-
Intratekal injektion12
- Føler den intervertebrale plads langs den midterste linie mellem de bilaterale bækken hofteholdere med tommelfingeren eller pegefingeren af anden side og tryk en fordybning med en fingernegl til at angive L5-L6 intervertebrale plads (Find injektionsstedet).
- Rotere base af halen lidt og forsigtigt at angive midterlinjen af rygsøjlen. Justere nålen facet mod hovedet af dyret før injektion (nævnt i trin 2.3.1).
- Sørg for, at dyrene er fast fast og justere nålen langs midterlinjen af rygsøjlen.
- Indsætte nålen forsigtigt og lodret (eller vippe lidt 70 – 80°) i skæringspunktet for indrykning og holde sprøjte i en central sagittale flyet. Reducere vinkel til ca. 30° langsomt når det forbinder knoglen, så glider nålen ind i intervertebrale rummet.
Bemærk: En tydelig pludselige hale flick er et tegn på vellykket indrejse i det intradural rum. Når kanylen træder den intervertebrale plads, nål-spids vil føle sig fast fastspændt. 27 G nålen bruges i denne undersøgelse er velegnet til IT levering i mus men ikke rotter. - Injicere vektor løsningen (nævnt i trin 2.2). Start timeren og injicere 8 µL af vektor løsningen ved en hastighed på 1 µL/4 s. Behold nålen ca 1 min. efter endt levering. Hæve nålen med blide rotation til at undgå utæt.
- Score musen forbigående svaghed lemmer umiddelbart efter levering til at evaluere injektion kvalitet4.
Bemærk: Standarden er som følger4. Score 0: ingen svaghed; score 1: mindre svaghed af hind lemmer uden gangart abnormitet; score 2: moderat svaghed af hind lemmer med indlysende gangart abnormitet; score 3: komplet lammelse af hind lemmer; score 4: komplet lammelse af hind arme og ben, åndenød, og moderat svaghed i forgrunden lemmer; og score 5: komplet lammelse af alle 4 lemmer og indlysende åndenød. - Flytte musen tilbage til buret til nyttiggørelse fra lammelse.
-
Oprydning
- Skyl sprøjte med 1 mL sterilt vand. Sortere laboratorie forsyninger og samle alle ikke-disponible materialer til autoklaveres sterilisation. Ren bænk med 70% ethanol.
3. væv forberedelse til immunhistokemiske farvning
-
Væv samling
- Bedøver mus på 21 dage efter injektion med 3% Kloral hydrat (0,1 mL/10 g) dybt ved intraperitoneal injektion.
- Perfuse transcardially med 20 mL iskold 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) for det første, derefter 4% iskolde PARAFORMALDEHYD (i 0,01 M PBS) med pumpe (10 mL/min. i 1 min., derefter 5 mL/min. 9 min).
Forsigtighed: PARAFORMALDEHYD er kræftfremkaldende og giftige. Håndtere det kun i stinkskab mens iført handsker.
-
Dissektion af rygmarven og hjernen
- Løse lemmer og leder af hvert enkelt dyr i en udsat position på en skum kasse dække med sprøjte nåle, derefter strimler og fjern skindet fra hovedet til korsbenet med saks.
- Klip kraniet mellem øjnene, skæres sammen med den midterste rute af kraniet og horisontal linje på lillehjernen, derefter åbne kraniet til hver side.
- Løft nakkeknude med pincet og åbne rygmarvskanalen bilateralt med oftalmologiske saks. Afbrød ribbenene på begge sider og fjerne den øverste halvdel af ryghvirvler omhyggeligt.
- Løft hjernen med buet pincet og afbryde nerver af kraniet basen, så dissekere ud hele hjernen og rygmarven omhyggeligt. Post løse væv i 4% PARAFORMALDEHYD i 24 timer.
-
Forberedelse af væv skiver
- Cryoprotect hjernen og cervikale og lumbale rygmarven i 30% rørsukkeropløsning natten over ved 4 ° C. Integrere vævet i optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte og fryse fast med flydende kvælstof.
- Skære væv på 25 µm ved hjælp af en kryostaten og gemme de frosne sektioner i 0,01 M PBS ved 4 ° C til brug.
4. Immunohistokemi
- Forbehandle frit svævende sektioner i 1% H2O2 i 10 min og derefter vaske i PBS for 10 min. Incubate i en blokerende løsning indeholdende 5% serum og 0,3% nonionisk detergent i PBS for 1 h.
- Inkuber skiver med tilsvarende primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Vaske sektioner i PBST (0,2% Tween 20 i PBS) i 30 min (3 gange i 10 min hver).
- Inkuber skiver med tilsvarende biotin-sekundær antistof ved stuetemperatur for 1 h. vask i PBST i 30 min (3 gange i 10 min hver).
- Inkuber sektioner med affinitet biotin peroxidase kompleks i 40 min, og pletten med achromogenic agent. Montere sektioner på dias og tørre ordentligt.
- Sættetid dias i vandfri ethanol i 5 min og xylen i 10 min., derefter forsegle dias med en montering medium. Endelig billede dias med et mikroskop udstyret med en afgift - sammen enhed (CCD) på 100 x 200 x og 400 x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus viste forskellige grader af forbigående svaghed lige efter det injektion af AAV løsning i 1% lidocain hydrochlorid på grund af forskellige kvalitet af Intratekal injektion. Ifølge den semi-kvantitative 5-grade pointsystem har vi etableret, vi testede transduktion mønstre af AAV i mus med forskellige grader af lidocain-induceret lemmer svaghed (score 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). EGFP immunfarvning af rygmarv viste enten ingen eller lille transduktion i lumbal rygmarven af mus scoring 0, lidt forbedret transduktion i mus scoring 1 og stærk og udbredt transductions i mus scorede 4 eller 5 (fig. 1A). Vi kvantificeret normal god landbrugspraksis farvning intensiteten af disse mus viser forskellige grader af forbigående lemmer svaghed (figur 1B) og konkluderede, at sværhedsgraden af svaghed efter injektion korreleret tæt med omfanget af rygmarven transduktion.
Vi yderligere udforsket den detaljerede transduktion profil af rAAVrh10 i hele CNS, og bemærket, at fuld længde af rygmarven og store områder af hjernen var godt transduced i godt injiceres mus, som scorede 4 eller 5. I hjernen, robust EGFP signaler blev opdaget i olfaktoriske pære (fig. 2A), dorsolateral præfrontale cortex (figur 2B), dentate gyrus og CA3 zone af hippocampus (tal 2 c og 2D), cerebellare Cortex (figur 2E), og marginale områder af hjernestammen herunder facial kernen (figur 2F), plexus chorioideus og ependymal epitelceller (fig. 2G). Imidlertid blev færre EGFP-positive celler opdaget i dybe områder af hjernen. I rygmarven og ventrale og dorsale horn var de ventrale spildevand motor axoner og dorsale velhavende sensoriske axoner stærkt normal god landbrugspraksis-positive. Motoriske neuroner i de forreste horn var stærkt transduced i forskellige niveauer af rygmarven (tal 2 H-2J). Derudover normal god landbrugspraksis-positive neuroner i cortex herunder pyramideformet celler blev fundet (tal 3A og 3B). Forskellige glial celletyper, herunder mikroglia, astrocytter, og oligodendrocytes, fandtes også for at være EGFP-positive (tal 3 C-3E).
Figur 1 : Lidocain-induceret svaghed omfang forudsiger transduktion effektivitet. AAV med 1% lidocain eller PBS (kontrol) blev sprøjtet ved direkte IT injektion. Mus blev ofret og undersøges for normal god landbrugspraksis udtryk af Immunhistokemi 3 uger senere (score 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4; score 5, n = 3). (A) NGL farvning af livmoderhalskræft (CSC) og lumbal spinal cord (LSC) sektioner er vist. (B) NGL farvning intensitet i både LSC og CSC var direkte korreleret med graden af forbigående svaghed. Hver mark repræsenterer værdier (mener ± SD) fra en mus. Dette tal er blevet tilpasset fra en tidligere publikation4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Udbredte transduktion af rAAVrh10 i hjernen og rygmarven. (A) lugtekolben; (B) cortex; (C) dentate gyrus4; og (D) CA3 af hippocampus; (E) cerebellare cortex; (F) facial kernen; (G) lateral ventrikel; (H) cervikal forreste horn4; (jeg) thorax forreste horn4; og (J) lumbal forreste horn4. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Transduktion af forskellige celletyper i hjernen efter direkte Intratekal rAAVrh10 injektion. (A) pyramideformet celler; (B) multipolær neuron; (C) microglial celle; (D) astrocyte; og (E) oligodendrocyte. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknisk, der er flere kritiske trin under IT-injektion i vågen mus. Første, ordentlig gestus og fast kontrol med mus under hele hele operationen er en forudsætning for vellykket levering. For det andet føler det vanskeligste punkt den intervertebrale plads med nål-spids, som det er nødvendigt ikke at indsætte for dybt uden modstand eller indsætte med magt under stærk modstand i tilfælde af sårede dyr eller bøjet nål-spids. Tredje, selv om den forbigående lammelse på grund af lidocain giver en objektiv indikator for det injektion kvalitet, mere praksis er nødvendig for at opnå konsistente og succesfulde resultater.
I denne betænkning, har vi udviklet en direkte Intratekal injektion metode i vågen mus til levering af AAV, hvor lidocain fungerer som en indikator for omfanget af IT injektion succes og som en prædiktor for energieffektiviteten af genterapi. Eksperimentelle direkte lumbalpunktur blev første gang brugt til at levere agenter, især anæstetika, rygmarven til analgesi og anæstesi, og det har været stærkt anbefales til genterapi for CNS sygdomme. I betragtning af vanskeligheden af IT injektion i mindre dyr som mus, vi kombineret de to ansøgninger af direkte lumbalpunktur og valgte lokalanalgetika (lidocain, som har været udbredt i klinikker som objektive indikator for injektion kvalitet ved at evaluere forbigående og restaurere lammelse). Derudover vi defineret en standard for at forudsige levering af AAV effektivitet gennem lammelse niveauer og bekræftet dette ved immunfarvning. Vi viste, at godt injiceres dyrene havde højere niveauer af rAAVrh10-EGFP transduktion i CNS i voksen mus.
Sammenlignet med den tidligere Intratekal leveringsmetode med dyb bedøvelse af dyr og Intratekal kateterisation med laminektomi14,15, har vores nuværende metode flere fordele. Først, enkle lumbalpunktur procedure kan være afsluttet inden for et par minutter for hvert dyr, der henviser til, at den tidligere procedure tager ~ 1 h pr. dyr. For det andet, den nuværende metode anvender ikke anæstesi og kirurgi, og derfor reducerer risikoen for skade4. For det tredje ved tilsætning af 1% lidocain hydroklorid at AAV løsning, vi etableret en fem-punkts pointsystemet til rang forbigående lammelse efter injektionen og bevist, at graden af svaghed induceret af lidocain kan bruges til at forudsige omfanget af CNS transduktion af hver injektion. Vores data viser, at godt injiceres dyrene har høje niveauer af rAAVrh10-EGFP transduktion i CNS af voksen mus. Transduktion er også udbredt i den tidligere metode med laminektomi og Intratekal kateterisation lignende omfang. Sammenlignet med eksisterende IT punktering metoder i vågen mus, vi giver en objektiv indikator for injektion kvalitet ved hjælp af lidokain og undgå blindhed mislykkede injektion eller efterfølgende indblanding i terapeutiske virkning.
Taget sammen, de nuværende Intratekal levering indeholdende 1% er lidocain en lovende metode i eksperimentelle behandlinger for CNS sygdomme ved at levere gener eller lægemidler i mus. Derudover er det en praktisk og nem tilgang til at praktisere det indsprøjtning i små dyr som mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra HEBEI provinsen Institut for Human Resources og Social sikkerhed (CY201605) og et tilskud fra Natural Science Foundation i Hebei provinsen (H2017206101), og vi er meget taknemmelige for Dr. Guangping Gao, der har givet AAV for denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).
