Summary
Un roman et une simple variante de la méthode de shake-flacon a été développé pour la mesure précise lipophilie de composés fluorés par 19F RMN.
Abstract
La fluoration est devenu un outil efficace pour optimiser les propriétés physico-chimiques des composés bioactifs. Une des applications d’introduction de fluor est de moduler la lipophilie du composé. Dans notre groupe, nous nous intéressons à l’étude de l’impact de la fluoration sur lipophilie de fluorohydrins aliphatiques et hydrates de carbone fluoré. Ce ne sont pas UV-active, ce qui entraîne une détermination de lipophilie difficile. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure de la lipophilie de composés fluorés par RMN du 19F. Cette méthode ne nécessite aucun UV-activité. Masse de soluté précise, volume de solvant et aliquot doivent également pas être mesuré. En utilisant cette méthode, nous avons mesuré le lipophilicities d’un grand nombre des alcanols fluorés et des glucides.
Introduction
Lipophilie est un paramètre clé physico-chimiques des molécules médicamenteuses qui influe sur les propriétés des candidats-médicaments dans de nombreux aspects, y compris la solubilité de la drogue, la biodisponibilité et la toxicité1. Lipophilie est mesuré comme le logarithme (logP) du rapport des concentrations composés après le partitionnement entre n-octanol et l’eau. Plages de lipophilie optimal ont été proposées, basées sur des données statistiques des médicaments administrés par voie orale, dont la « règle de 5'' de Lipinski est le plus célèbre exemple2,3. En effet, contrôlant la lipophilie s’avéré indispensable pour améliorer la perspective de candidats-médicaments. Affinité de liaison de drogue a augmenté de lipophilie élevée a été identifié comme l’un des principaux problèmes dans les projets de découverte de médicaments au cours des dernières décennies, conduisant à une usure accrue des taux3. Par conséquent, il a été suggéré que le développement de médicaments réussie est associé à garder la lipophilie moléculaire des candidats médicaments dans des limites optimales au cours de l’affinité optimisation processus3,4. À cet égard, les nouveaux concepts (comme les indices d’efficacité lipophiles) ont été introduites5,6.
Il est donc très important de mesurer précisément la lipophilie pendant le processus de développement de médicaments. En outre, la disponibilité des méthodes simples pour la mesure de la lipophilie est en demande comme recherche fondamentale vise à identifier des solutions pour connecterP modulation. Actuellement, nombreuses méthodes établies sont accessibles pour la lipophilie dosage1. La méthode standard « shake-fiole (SF) »7et ses variations sont couramment employées pour mesurer des valeurs de logP directement, qui, dans la plupart des cas, dépendent de la spectroscopie UV-Vis pour la quantification. Le principal inconvénient de cette méthode classique de la SF est son caractère fastidieux. En outre, la formation d’émulsions peut-être survenir, en particulier pour les composés lipophiles hautement8,9. Plusieurs méthodes ont été développées pour contourner ces problèmes, comme en utilisant l’analyse par injection de flux, tube à dialyse, etc.. 9,10. Toutefois, aucune de ces méthodes sont simples ou facilement applicable dans les laboratoires non spécialisés.
Il y a également plusieurs méthodes indirectes utilisables, tels que le titrage potentiométrique11, méthodes électrophorétiques12,13, RP-HPLC-basé des méthodes chromatographiques, méthodes basées sur la spectrométrie de masse14, etc.. Ce sont des méthodes indirectes, comme les valeurs de logP sont obtenues par les courbes d’étalonnage. Parmi ces méthodes, la méthode CLHP-pi a été largement utilisée car il est facile à utiliser et gagner du temps. Néanmoins, sa précision dépend de l’ensemble d’apprentissage utilisée pour établir la courbe d’étalonnage et la lipophilie estimée dépend de la partition système utilisé13,15.
Il y a un certain nombre de méthodes RMN H 1rapportées dans la littérature pour la détermination du caractère lipophile. Mo et coll. mis au point une méthode de mesure avec 1H RMN sans solvants deutérés le logP . L’eau et l’octanol, comme les solvants de la partition, ont été utilisés comme références pour la quantification de la concentration en soluté dans chaque phase16. Herth et ses collègues a également signalé une approche, par lequel l’expérience de la partition est produite directement dans un tube de NMR, où les données de la RMN de la couche inférieure D2O aqueuse ont été prélevées avant et après l’extraction avec 1-octanol, afin d’obtenir la distribution 17de coefficient. En outre, Soulsby et coll. exploités 1H RMN comme un outil d’analyse, de déterminer l’amplitude des signaux à l’aide de réduction complète au logiciel de table amplitude / fréquence. Le rapport des amplitudes en deux couches a conduit à la partition mesurée coefficient18. Ces méthodes sont relativement simples à utiliser, mais nécessitent souvent l’étalonnage des impulsions sélectives et niveaux de puissance ou l’utilisation d’en forme d’impulsions dégradées pour assurer la répression solvant appropriée et de sélectivité du signal.
Les valeurs deP (sabotP) calculée pour les composés peuvent aussi être obtenues. Plusieurs méthodes de calcul et logiciel disponible dans le commerce sont disponibles. Ces valeurs de sabotP sont utilisés couramment dans l’industrie pharmaceutique lors de l’évaluation d’un grand nombre de molécules de médicaments. Cependant, des erreurs importantes de sabotP valeurs ne sont pas rare19,20.
Les exigences de l’UV-activité d’analyse de la concentration et l’établissement des courbes d’étalonnage pour le calcul de logP entravent les progrès de la recherche dans ce domaine. En particulier, c’est le cas pour les composés aliphatiques non-UV-actifs. Moitiés aliphatiques fluorés sont devenus plus en plus attrayantes pour la conception de médicaments au cours des dernières années, et leur influence sur la lipophilie globale du composé est un sujet de recherche dans notre groupe21. En outre, 19F est un noyau de NMR actifs hautement sensible, faisant 19F RMN un outil utile pour l’analyse des composés fluorés. Il a également une plus grande portée de déplacement chimique par rapport à celle de 1H. Il est donc utile de développer une méthode simple pour logP détermination de composés fluorés non UV-actifs par RMN du 19F. L’objectif général de cette méthode est donc, pour atteindre la détermination pratique lipophilie de composés fluorés.
Le principe-clé de nos 19méthode basée sur la RMN F consiste à ajouter une référence de fluorés composée présent dans la partition expérience (Figure 1)21. Composé X et composé de référence (réf) sont répartis entre l’eau et le n- octanol. Après équilibration, une partie aliquote de chaque phase est prise dans un tube de NMR, et des expériences de RMN F 19sont exécutées sur les deux échantillons de NMR. L’intensité des pics de fluor est proportionnelle au composé concentration (C) et le nombre d’atomes de fluor (n) des composés. Entre le composé X et ref, les ratios intégrale peuvent être obtenus pour les deux phases. Le ratio de n- octanol couche désigne ρoctet ρaq pour la couche d’eau (EQ. 1). Le rapport des valeurs ρ est égal au rapport des coefficients de partage (P) du composé X et ref (EQ. 2). Cela conduit à l’équation finale (EQ 4) pour logP mesure du composé X. Donc, afin de déterminer la valeur de logP d’un composé inconnu X, seulement des rapports de l’intégration (ρoct et ρaq) dans les deux couches sont nécessaires pour être mesurées par 19F RMN.
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Protocol
1. partitionnement
- Ajouter 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X, ca. 6,0 mg) et 2,2,2-trifluoroéthanol (référence composé, env. 3,0 mg) dans une fiole en forme de poire de 10 mL, dissoudre dans le n- octanol (qualité HPLC, ca. 2 mL) et ajouter de l’eau (qualité CLHP, ca. 2 mL).
Remarque : Cette expérience est exécutée en trois exemplaires. Composé solubilité dans l’eau et le n- octanol doit être vérifiée. La quantité du composé utilisé pour la partition doit être examinée attentivement afin d’éviter la sursaturation du composé dans n’importe quel calque. Le rapport de masse entre le composé X et réf composé doit également être examiné afin d’éviter que les ratios intégrale d’un échantillon donné de NMR sont à l’extérieur d’une gamme de 10/1 au 1/10. Par exemple, s’il y a une différence de < 2 unités logarithmiquesP entre composé X et ref, ratio masse optimal peut assurer que les rapports d’intégration dans des échantillons de l’eau et le 1-octanol NMR varient dans une fourchette de 10/1 au 1/10. En revanche, si un rapport d’intégration de 50/1 dans une couche est obtenu, il y aura plus probables erreurs relativement plus importantes dans l’intégration pour le sommet avec la plus faible concentration. L’équation suivante peut servir à prédire le ratio optimal de masse composé :
mX / mref = {(cP X/Préf)-0,5 * (MX/ Mref) * [(1 + cPX) / (1 + Préf)]} / (NX / Nréf)
m, masse ; M, masse moléculaire ; N, le nombre d’atomes de fluor ; P, coefficients de partage ; cP, coefficient calculé. - Placer les fioles à l’intérieur un récipient isotherme au-dessus d’un stirplate et se connecter à un refroidisseur de recirculation. Remuez le mélange biphasique à 25 ° C pendant 2 h, avec en mélangeant vitesse fixée à 600 tr/min.
- Equilibrer le mélange à 25 ° C durant la nuit (env. 16 h), pour permettre à la séparation de phase complète.
Remarque : Dans certains cas, peut être observée la formation d’une mousse entre la frontière de l’eau et le n- octanol. Dans ce cas, le mélange a été transféré dans un flacon de verre de 4 mL et centrifugé jusqu'à la disparition de la mousse. Le mélange biphasique était alors gauche s’équilibrer à nouveau à 25 ° C la nuit.
2. préparation de l’échantillon RMN
- Fixer le ballon à un statif avec une pince.
- Prendre une partie aliquote de ca. 0,70-0,85 mL de l’eau et le n- octanol couches, en utilisant des seringues en plastique de 1 mL avec longues aiguilles.
- Pour prendre l’eau aliquote, aspirer env. 0,02 mL d’air dans la seringue avant de mettre l’aiguille dans le mélange. Tout en déplaçant l’aiguille à travers la haute n- octanol couche dans la couche d’eau, poussez doucement l’air pour empêcher l’entrée de l’aiguille de n- octanol solution.
- Retirez l’aiguille longue du mélange. Jetez une petite quantité d’échantillon d’eau, laisser env. 0,6 mL d’échantillon de gauche dans la seringue. Essuyer soigneusement l’aiguille avec le tissu sec et l’injecter env. 0,5 mL d’échantillon d’eau dans un tube propre de NMR. Fermer rapidement le tube NMR avec une casquette.
- Pour l’échantillon de n- octanol, retirez l’aiguille longue de la couche de n- octanol. Jetez une petite quantité de n- octanol échantillon, laissant env. 0,6 mL d’échantillon de gauche dans la seringue. Essuyer l’aiguille avec tissu sec soigneusement et injecter env. 0,5 mL de n- octanol échantillon dans un tube propre de NMR. Fermer rapidement le tube NMR avec une casquette.
- Inspecter visuellement les deux échantillons de n- octanol et l’eau de toute contamination (e.g., petites gouttelettes de n- octanol dans l’échantillon d’eau ou de petites gouttelettes d’eau dans le n- octanol échantillon).
Remarque : Si il n’y a aucune contamination, l’aliquote doit être re-prêt du mélange biphasique. Comme la mesure se faite en trois exemplaires, six tubes de NMR sont obtenus. - Dans chaque tube de NMR, ajouter 0,1 mL de solvant deutéré NMR qui est miscible avec la n- octanol et l’eau (p. ex.., acétone-d6) pour activer le signal verrouillage lors de l’acquisition de NMR.
- Pour les composés à faible point d’ébullition (e.g., < 120 ° C), sceller le NMR de tubes à l’aide d’un chalumeau et, après refroidissement, inverser le tube pour vérifier les éventuelles fuites. Soigneusement inverser que la RMN scellée ou non scellées tubes 20 fois pour obtenir une solution homogène pour 19F RMN expériences.
3. des expériences RMN
- Exécuter, à l’aide des paramètres standards NMR (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), expériences de F {1H} RMN de 19pour identifier les déplacements chimiques des 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X) et 2,2,2-trifluoroéthanol (composé de référence) dans les deux n échantillons de NMR - octanol et l’eau.
- Mesurer le temps de relaxation spin-réseau (T1) pour les noyaux de fluor diagnostique en utilisant une inversion-récupération séquence22. Évaluer le niveau de temps de retard d’impulsions approprié (D1, défini comme ≥ 5 * T1) depuis les valeurs de T1 obtenues pour l’intégration de NMR quantitative précise.
Note : Ceci est très long, mais une D1 de 60 s pour l’échantillon de phase de l’eau et de 30 s pour l’échantillon de phase octanol, sont des paramètres conservateurs qui remplissent en toute sécurité la D1 ≥ 5 * T1 critérium. - Exécutez 19expériences RMN F {1H} à nouveau avec ajusté des paramètres comme suit : un) utilisation D1 ≥ 5 * T1 ; b) centre la fréquence décaler point (O1P) entre les deux signaux de diagnostic fluor donc les deux noyaux peut être tout aussi excité ; c) définir la largeur spectrale (SW) que 300 ppm, mais réduire si un meilleur rapport SNR le cas échéant ; d) définir le nombre de transitoires (NS) en 64 mais augmenter si SNR plus élevé est requis.
Remarque : Non découplé 19F RMN expériences peuvent être utilisés également pour l’acquisition de données de NMR. Cependant, des expériences de F RMN proton-découplé 19on préfère ici car il simplifie les signaux de fluor en enlevant les couplages proton-fluor qui augmente également le rapport signal-sur-bruit. Nous utilisons l’inverse-dépendants de découplage pour obtenir un spectre découplé sans nOe (effet Overhauser nucléaire) améliorations23. Pour intégration quantitative, un rapport signal-bruit (≥300) est souhaité. 24
4. traitement des données
- Traiter les données obtenues à l’aide de ACD/NMR Processor Academic Edition ou autre logiciel de traitement de NMR personnalisé.
- Ouvrez le fichier de données de NMR, puis ouvrez le dossier pdata , suivi de dossier 1. Supprimez le fichier 1r .
- Retourner au fichier de données NMR et glissez le fichier de dif dans la fenêtre ACD/NMR Processor.
- Cliquez sur le bouton WFunctions , sélectionnez exponentiel, valeur LB 2et cliquez sur le bouton OK .
- Cliquez sur le bouton de Remplissage de zéro , augmenter le Nombre de Points pour 4 fois de son Nombre de Points initial en cliquant sur un petit bouton à côté du nombre, puis cliquez sur OK bouton.
- Cliquez sur le bouton Tr. transformée de Fourier .
- Cliquez sur le bouton de Phase , puis cliquez sur le bouton de la Souris Tél. , cliquez et maintenez le bouton gauche de la souris, déplacez la souris vers l’avant ou vers l’arrière jusqu'à ce que le pic important du spectre est éliminé correctement.
- Cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, déplacez la souris vers l’avant ou vers l’arrière jusqu'à ce que les autres pics du spectre est éliminé correctement. Puis décochez le bouton de la Souris Ph. , zoomez sur la zone spectrale avec les pics de fluor, cliquez sur Affiner, effectuer la correction de phase si nécessaire comme décrit précédemment, jusqu'à ce que tous les sommets sont correctement éliminés et puis cliquez sur la coche bouton.
- Cliquez sur le bouton de base , puis sur le bouton Options . Sélectionnez l’Étalement de spectre pour les modèles automatiques, ajuster le nombre de points pour boîte de demi-largeur si nécessaire (en particulier pour le spectre avec faible ratio S/R), cliquez sur OK | Automatiqueet puis cliquez sur le bouton de la tique .
- Cliquez sur intégration, intégrer les pics de fluor diagnostique et cliquez sur le bouton de la tique .
Remarque : Si la courbe intégrale n’est pas parallèle à la ligne de base, cliquez sur le bouton Corr. de partialité et régler l’inclinaison et la pente jusqu'à ce que la courbe est parallèle à la ligne de base.
- Obtenir les rapports d’intégration de n- octanol et NMR échantillons d’eau et utiliser dans l’équation de calcul logarithmiqueP (Figure 1, EQ 4) pour obtenir la valeur de logP du 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X).
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Representative Results
Deux ensembles de données des expériences de contrôle sont indiquées dans la Figure 221. En utilisant 2,2,2-trifluoroéthanol comme composé de référence, logP valeurs ont été obtenues pour le 2-fluoroéthanol et 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0,75 et +1.20, respectivement (Figure 2 a). Par la suite, la lipophilie du 2-fluoroéthanol a été déterminée à nouveau mais avec 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol comme référence (à l’aide de son journal précédent mesurée expérimentalementP valeur +1.20). Le journal mesuré valeurP a -0,76, qui avait seulement une différence de 0,01 unités logarithmiques deP par rapport à la valeur mesurée en utilisant 2,2,2-trifluoroéthanol comme référence.
Même, pour le cis-2,3-difluoro-1, 4-butanediol, la différence mesurée valeurs logP à l’aide de 2-fluoroéthanol et son isomère trans est également très faible (0,01 logP unités, Figure 2 b). Cela démontre que la sélection de référence composé n’a pas d’incidence sur la mesure de logP . En outre, un écart plutôt faible (< 0,01) indiqué bonne reproductibilité de notre méthode.
En utilisant notre méthode, une série de composés avec des valeurs connues logP a été mesurée comme indiqué au tableau 1. La différence entre les données de la littérature et les valeurs mesurées à l’aide de notre méthode est montrée dans la dernière colonne du tableau. Dans l’ensemble, les valeurs obtenues expérimentalement logP (à 25 ° C) ont de bonne à excellente conformité avec les valeurs de la littérature, qui outre validé notre méthode.
Autres exemples sélectionnés21 ont été montrées dans la Figure 3. Tous ces non-UV-actifs composés aliphatiques (à partir de glucides fluorés à fluorohydrins) peuvent être facilement mesurées avec notre méthode.
Figure 1 : Principe du journalP méthode de détermination. Ce chiffre a été reproduit avec la permission de Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 21. cette méthode shake-flacon repose sur 19F RMN. Un composé de référence est utilisé pour l’expérience de la partition. Aliquotes pour n- octanol et phase aqueuse ont été prises pour expérience de NMR. Intégration de rapports entre composé de référence et le composé à mesurer est obtenues pour la détermination de la valeurP du log. Détaillée déduction mathématique des équations, qui conduit à l’équation finale pour la mesure, sont également indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : exemples de validation interne 21. deux séries d’expériences de contrôle, à l’aide de deux composés de référence différentes pour mesurer la valeur de logP d’un seul composé, ont été menées. Le logP différence entre ces expériences est négligeable. Écart-type (< 0,01) des expériences de course en triple exemplaire montre bonne reproductibilité de la méthode. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Plus loin quelques exemples de logP mesure en utilisant notre méthode. En appliquant cette méthode, les valeurs de logP pour 8 composés fluorés (tels que les hydrates de carbone fluoré, alcanols acycliques et fluorohydrins conformation restreinte) ont été obtenus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Comparaison entre les données de la littérature et les valeurs expérimentales logP en utilisant notre méthode21. valeurs de logP pour 14 composés fluorés (avec log connuP données) ont été mesurées à l’aide de cette nouvelle méthode. Les composés de référence utilisés pour chaque mesure ont été également été compilés. Comparaison (logP) entre les valeurs de la littérature et les résultats de logP de notre méthode a démontré la bonne précision de cette méthode. un2,2,2-éthanol (TFE), 2-Fluoroéthanol (FE) ; b Journal de moyenne valeurP depuis au moins trois expériences ; c Mesurées expérimentalementP valeur par notre méthode (-0,75) a été utilisée comme référence. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole décrit dans le livre est une méthode simple pour logP mesure de composés fluorés. Cette méthode est applicable aux composés fluorés avec un logP valeur de -3 à 3. Pour en savoir plus hydrophile (logP < -3) ou composés lipophiles (logP > 3), cette méthode peut encore être utilisée mais il faudra beaucoup plus longtemps d’expérience NMR comme grand nombre de transitoires est nécessaires pour obtenir un bon rapport signal sur bruit. Par conséquent, il s’agit d’une limitation de la méthode. Il n’y a aucune exigence pour la fréquence du spectromètre RMN, tant que les conditions (les paramètres NMR et SNR suffisante) pour intégration quantitative sont remplies. Comme pour n’importe quelle méthode de fiole de secousse, il est essentiel d’éviter la sursaturation et contamination pendant l’échantillonnage de la couche.
Par rapport à la précédente méthode shake-fiole et ses variantes, il y a plusieurs avantages dans notre méthode en ce qui concerne les méthodes existantes. 1) mesures de masse de soluté, volume de solvants de partition et parties aliquotes pour l’échantillon de NMR ne sont pas nécessaires. 2) le composé pour la mesure peut être impur, pourvu que les déplacements chimiques du fluor des impuretés sont différentes de celles du composé mesuré. 3) en raison de l’effet de compensation intrinsèque lorsque vous travaillez avec le ratio d’un ratio, élimine les erreurs systématiques. 4) cette méthode est applicable aux composés fluorés non UV-actifs. 5) cette méthode est facile à utiliser avec équipement NMR accessible car aucun paramètres NMR spéciaux ne sont nécessaires (tels que la suppression de solvant, appliquer un angle faible excitation, etc.).
Actuellement, nous utilisons cette méthode pour mesurer les lipophilicities des hydrates de carbone fluoré, amides fluorohydrins et fluorés, afin d’étudier l’influence de fluoration sur lipophilie et d’identifier les fractions fluoré avec effet d’abaisser la lipophilie. Élaboration de méthodes pour logP mesurer plus de composés lipophiles (logP > 3) et amines fluorés est en cours dans notre groupe.
Il peut être souligné que 19F NMR peut également être utilisé pour de détermination (CMC) de concentration micellaire critique30.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche est financée comme partie de EPSRC accorde EP/K016938/1 et EP/P019943/1 (ZW, HRF) et d’un prix de conversion de cas EPSRC/AstraZeneca (MJ). L’Université de Southampton est remerciée pour un soutien supplémentaire. L’EPSRC est remercié en outre une subvention de capacité de noyau EP/K039466/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe | Bruker | n/a | AVIIIHD400 |
| NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe | Bruker | n/a | |
| DrySyn Snowstorm reactor | Asynt | ADS13-S | |
| recirculating chiller | Asynt | n/a | model:Grant-LTC2 |
| magnetic stirplate | Asynt | ADS-HP-NT | |
| ACD/NMR processor software | ACD/Labs | n/a | ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015 |
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