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Chemistry

Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (logP) usando 19espectroscopia RMN de F

doi: 10.3791/58567 Published: January 30, 2019

Summary

Um romance e uma variação simples do método agitar-balão foi desenvolvido para a medição exata Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F 19.

Abstract

Fluoração tornou-se uma ferramenta eficaz para otimizar as propriedades físico-químicas de compostos bioativos. Uma das aplicações da introdução de flúor é de modular a lipofilicidade do composto. No nosso grupo, estamos interessados no estudo do impacto da fluoração na Lipofilicidade da fluorohydrins alifáticos e fluorados hidratos de carbono. Estes não são UV-ativo, resultando em uma determinação de Lipofilicidade desafiador. Aqui, apresentamos um método simples para a medição da Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F 19. Este método não requer nenhuma atividade-UV. Massa exata de soluto, solvente e alíquota volume também não são obrigados a ser medido. Usando esse método, Nós medimos as lipophilicities de um grande número de alkanols de gases fluorados e hidratos de carbono.

Introduction

Lipofilicidade é um parâmetro chave e físico-químico das moléculas de drogas que influencia as propriedades de candidatos da droga em muitos aspectos, incluindo a solubilidade da droga, biodisponibilidade e toxicidade1. Lipofilicidade é medida como o logaritmo (logP) da razão de concentrações de compostos após particionamento entre n-octanol e água. Intervalos de Lipofilicidade ideal têm sido propostos com base em dados estatísticos de medicamentos administrados por via oral, de que a regra de Lipinski"de 5 ' é o mais famoso exemplo2,3. Com efeito, controlar Lipofilicidade mostrou para ser essencial para melhorar a perspectiva de candidatos da droga. Aumentando a afinidade de ligação da droga pela elevada Lipofilicidade foi identificado como um dos principais problemas em projetos de descoberta de drogas durante as últimas décadas, levando ao aumento do atrito taxas3. Portanto, sugeriu-se que o desenvolvimento de drogas bem sucedida é associado com manter a lipofilicidade molecular dos candidatos dentro dos limites ideais droga durante o processo de otimização do afinidade3,4. A esse respeito, novos conceitos (tais como índices de eficiência lipofílicos) foram introduzidos5,6.

Assim, é de grande importância para medir com precisão a lipofilicidade durante o processo de desenvolvimento de drogas. Além disso, a disponibilidade de métodos simples para medição Lipofilicidade está na demanda como investigação fundamental visa identificar soluções para logP modulação. Actualmente, numerosos métodos estabelecidos são acessíveis para Lipofilicidade determinação1. O método de 'agitar-aferido (SF)'7e suas variações são comumente empregadas para medir valores logP diretamente, o que, na maioria dos casos, dependem de espectroscopia UV-Vis para quantificação. A principal desvantagem deste método clássico de SF é a sua natureza de trabalho intensiva. Além disso, pode ocorrer a formação de emulsões, especialmente para compostos altamente lipofílicos8,9. Vários métodos foram desenvolvidos para contornar esses problemas, tais como utilizando análise de injeção de fluxo, tubulação da diálise, etc. 9,10. No entanto, nenhum desses métodos são simples ou facilmente aplicável em laboratórios não especializados.

Existem também muitos métodos indiretos disponíveis para uso, tais como titulação potenciométrica11métodos eletroforética12,13, métodos cromatográficos baseados em RP-HPLC, métodos baseados em massa-espectrometria de14, etc. Estes são os métodos indiretos, como os valores de logP são obtidos por curvas de calibração. Entre esses métodos, o método de RP-HPLC foi amplamente utilizado porque é fácil de usar e economia de tempo. No entanto, sua precisão depende do conjunto de treinamento usado para estabelecer a curva de calibração, e a lipofilicidade estimada depende a partição sistema utilizado13,15.

Há um número de métodos baseados em H NMR de 1relatados na literatura para determinação de Lipofilicidade. Et al . mo desenvolveu um método para a medição de logP usando 1H NMR sem solventes deuterados. Água e octanol, como solventes de partição, foram utilizados como referências para a quantificação da concentração de soluto em cada fase16. Heath e colegas de trabalho também relataram uma abordagem, por que o experimento de partição ocorreu diretamente num tubo NMR, onde os dados NMR da camada aquosa inferior D2O foram coletados antes e após a extração com o 1-octanol, para obter a distribuição coeficiente de17. Além disso, Soulsby et al explorados 1H NMR como uma ferramenta de análise, determinar a amplitude dos sinais por meio de redução completa ao software de tabela de frequência de amplitude. A relação entre as amplitudes em ambas as camadas que levou para o coeficiente de partição medido18. Estes métodos são relativamente simples de usar, mas muitas vezes requerem a calibração de pulsos seletivos e os níveis de energia ou o uso de em forma de pulsos de gradientes para garantir a supressão de solvente apropriado e seletividade do sinal.

Valores deP (Pde tamanco) log calculado para compostos também podem ser obtidos. Estão disponíveis vários métodos de cálculo e software comercialmente disponível. Tais valores de tamancoP são comumente usados na indústria farmacêutica, ao avaliar um grande número de moléculas de drogas. No entanto, grandes erros de entupirP valores não são incomuns19,20.

Os requisitos de UV-atividade para análise da concentração e o estabelecimento de curvas de calibração para cálculo de logP impedem o progresso de pesquisa neste campo. Em particular, este é o caso dos compostos alifáticos não-UV-ativas. Fluorados alifáticos metades tornaram-se cada vez mais atraentes para o design de drogas nos últimos anos, e sua influência na Lipofilicidade total do composto é um tópico de pesquisa em nosso grupo21. Além disso, 19F é um núcleo ativo de NMR altamente sensível, fazendo 19F NMR uma ferramenta útil para a análise de compostos fluorados. Ele também tem uma gama maior de shift química comparada com a de 1H. Portanto, vale a pena desenvolver um método simples para logP determinação de compostos fluorados UV-inativos por espectroscopia de RMN de F 19. Portanto, o objetivo geral deste método é conseguir a determinação Lipofilicidade conveniente de compostos fluorados.

O princípio-chave da nossa 19método baseado em F NMR é adicionar uma referência de fluorados composta na partição experimento (Figura 1)21. Compostos X e composto de referência (ref) são divididos entre água e n- octanol. Após desenroscada, uma alíquota de cada fase é levada em um tubo de NMR e 19F NMR experimentos são executados em ambas as amostras de NMR. A intensidade dos picos do flúor é proporcional aos compostos concentração (C) e o número de átomos de flúor (n) dos compostos. Entre compostos X e ref, rácios integrais podem ser obtidos por ambas as fases. A relação em n- octanol camada é definida como ρocte ρaq para a camada de água (EQ. 1). A relação dos valores ρ é igual a proporção dos coeficientes de partição (P) dos compostos X e ref (EQ. 2). Isto conduz à equação final (EQ. 4) para logP medição do composto X. Portanto, a fim de determinar o valor deP de um desconhecido X composto, rácios de integração somente (ρoct e ρaq) de log em ambas as camadas são necessárias para ser medido por 19F NMR.

Protocol

1. particionamento

  1. Adicionar 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X, ca. 6,0 mg) e 2, 2,2-trifluoroethanol (referência composto, ca. 3,0 mg) para um balão em forma de pera com 10 mL, dissolver em n- octanol (grau HPLC, ca. 2 mL) e adicionar água (grau HPLC, ca. 2 mL).
    Nota: Este experimento é executado em triplicado. Composto solubilidade em água e n- octanol deve ser verificada. A quantidade do composto usado para partição deve ser considerada com cuidado para evitar supersaturação do composto em qualquer camada. A proporção de massa entre compostos X e referência ref composto também deve ser considerado para evitar que os rácios integrantes de uma determinada amostra NMR são fora um intervalo de 10/1 a 1/10. Por exemplo, se há uma diferença de < 2 unidades logarítmicasP entre compostos X e ref, óptima relação massa posso assegurar que os rácios de integração em amostras de água e 1-octanol NMR são dentro de um intervalo de 10/1 a 1/10. Em contrapartida, se uma relação de integração de 50/1 em uma camada é obtida, haverá mais prováveis relativamente maiores erros na integração para o pico com concentração mais baixa. A equação abaixo pode ser usada para prever a óptima relação massa composta:
    mX / mref = {(cP X/Pref)-0,5 * (MX/ Mref) * [(1 + cPX) / (1 + Pref)]} / (NX / Nref)
    m, em massa; M, massa molecular; N, o número de átomos de F; P, coeficientes de partição; cP, coeficientes de partição calculado.
  2. Coloque os frascos dentro de um recipiente de temperatura controlada, acima de um stirplate e se conectar a um chiller de recirculação. Agite a mistura bifásica a 25 ° C, durante 2 h, com agitando a velocidade de 600 rpm.
  3. Equilibrar a mistura a 25 ° C durante a noite (ca. 16 h), para permitir a separação completa fase.
    Nota: Em alguns casos, a formação de uma espuma entre a n- octanol e água limite pode ser observada. Neste caso, a mistura foi transferida para um frasco de vidro de 4 mL e centrifugada até o desaparecimento da espuma. A mistura bifásica foi então esquerda para equilibrar novamente a 25 ° C durante a noite.

2. preparação da amostra NMR

  1. Corrigi o frasco a um carrinho de retorta com uma pinça.
  2. Tirar uma alíquota de ca. 0,70-0,85 mL da água e n- octanol camadas, usando seringas de plástico descartáveis de 1ml com agulhas longas.
    1. Para tomar a água alíquota, desenhe ca. 0,02 mL de ar para a seringa antes de colocar a agulha na mistura. Ao mover a agulha através da superior n- octanol camada camada de água, empurre suavemente para fora o ar para impedir a entrada da agulha de n- octanol solução.
    2. Retire a agulha longa da mistura. Descarte uma pequena quantidade de amostra de água, deixando ca. 0,6 mL de amostra de esquerda na seringa. Cuidadosamente Limpe a agulha com pano seco e injetar ca. 0,5 mL de amostra de água em um tubo limpo de NMR. Feche rapidamente o tubo NMR com um boné.
    3. Para a amostra de n- octanol, retire a agulha longa da camada n- octanol. Descarte uma pequena quantidade de amostra de n- octanol, deixando ca. 0,6 mL de amostra de esquerda na seringa. Cuidadosamente Limpe a agulha com o tecido seco e injetar ca. 0,5 mL de n- octanol amostra em um tubo limpo de NMR. Feche rapidamente o tubo NMR com um boné.
  3. Inspecione visualmente as duas amostras de n- octanol e água para qualquer contaminação (EG., pequenas gotas de n- octanol em amostra de água ou pequenas gotas de água na amostra de n- octanol).
    Nota: Se houver qualquer contaminação, a alíquota amostra precisa ser re-preparado a mistura bifásica. Como a medição é feita em triplicado, obtêm-se seis tubos NMR.
  4. A cada tubo NMR, adicionar 0,1 mL de solvente deuterado NMR é miscível com água e n- octanol (EG., acetona-d6) para habilitar o bloqueio de sinal durante a aquisição de NMR.
  5. Para compostos com pontos de ebulição baixos (EG., < 120 ° C), selar os tubos NMR usando um maçarico e, após resfriamento, inverta o tubo para verificar se há fugas. Cuidadosamente, invertido que o NMR selada ou não seladas tubos 20 vezes para obter uma solução homogénea para 19F NMR experiências.

3. NMR experimentos

  1. Executar, usando as configurações padrão do parâmetro NMR (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), experiências de NMR F {1H} 19para identificar mudanças químicas de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X) e 2, 2,2-trifluoroethanol (composto de referência) em ambos os n amostras de NMR - octanol e água.
  2. Medir o tempo de relaxação spin-lattice (T1) para núcleos de flúor diagnóstico usando uma sequência de inversão-recuperação22. Medir o nível de tempo de atraso de pulso apropriada (D1, definido como ≥ 5 * T1) dos valores obtidos de T1 para integração de NMR quantitativo preciso.
    Nota: Isto é muito demorado, mas uma D1 de 60 s para a amostra de fase da água e de 30 s para a amostra de fase octanol, são configurações conservadoras que cumprirá com segurança o D1 ≥ 5 * T1 criterium.
  3. Executar 19experiências NMR F {1H} novamente com ajustado as configurações de parâmetros como segue: um) uso D1 ≥ 5 * T1; b) a frequência de centro deslocamento ponto (O1P) entre os dois sinais de diagnóstico flúor, então ambos os núcleos podem ser igualmente animados; c) definir a largura espectral (SW) como 300 ppm, mas reduzir-se uma melhor relação SNR se necessário; d) definir o número de transientes (NS) como 64 mas aumentar se SNR superior é exigido.
    Nota: Não-dissociado 19F NMR experimentos podem ser usados também para aquisição de dados NMR. No entanto, dissociados de próton 19F NMR experimentos são preferidos aqui como simplifica os sinais de flúor através da remoção de acoplamentos de próton-flúor, que também aumenta a relação sinal-ruído. Nós usamos o inverso-bloqueadas dissociação para obter um espectro dissociado sem nOe (nuclear Overhauser efeito) melhorias23. Para integração quantitativa, uma relação sinal-ruído (≥300) é desejada. 24

4. processamento de dados

  1. Processe os dados obtidos usando ACD/NMR processador Academic Edition ou outro software de processamento personalizado NMR.
    1. Abra o arquivo de dados NMR e, em seguida, abra a pasta pdata , seguida de pasta 1. Exclua o arquivo 1r .
    2. Retornar ao arquivo de dados NMR e arraste o arquivo fid para a janela ACD/NMR processador.
    3. Clique no botão WFunctions , selecione exponencial, defina o valor LB como 2e clique no botão OK .
    4. Clique no botão Preenchimento Zero , aumentar a Contagem de pontos para 4 vezes de sua Contagem de pontos Original clicando em um pequeno botão ao lado do número e clique o Okey botão.
    5. Clique no botão de Fourier TR.. .
    6. Clique no botão de fase , então clique no botão do Mouse PhD , clique e mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse, mova o mouse para a frente ou para trás até os maiores picos do espectro é corretamente em fases.
      1. Clique e mantenha pressionado o botão direito do mouse, mova o mouse para a frente ou para trás até que a outra técnica do espectro é corretamente em fases. Em seguida, desmarque o botão do Mouse PhD , ampliar a área espectral com os picos de flúor, clique em Sintonia fina, realizar a correção de fase, se necessário, conforme descrito anteriormente, até que todos os picos estão corretamente em fases e, em seguida, clique o carrapato botão.
    7. Clique no botão de linha de base , em seguida, o botão Opções . Selecione Uma média de espectro para modelos automáticos, ajuste o número de pontos para a caixa a metade da largura, se necessário (em especial para o espectro com baixa relação S/R), clique em Okey | Autoe, em seguida, clique no botão de carrapato .
    8. Clique em integração, integrar os picos de diagnóstico flúor e clique no botão de carrapato .
      Nota: Se a curva integral não é paralela à linha de base, clique no botão de Corr. de Bias e ajustar a inclinação e a inclinação até a curva é paralela à linha de base.
  2. Obter as relações de integração de n- octanol e água NMR amostras e usar a equação de cálculo logP (Figura 1, EQ. 4) para obter o valor de logP de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X).

Representative Results

Dois conjuntos de dados, como controle de experimentos são mostrados na Figura 2,21. Usando 2, 2,2-trifluoroethanol como composto de referência, valores logP foram obtidos por 2-fluoroethanol e 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0,75 e +1.20, respectivamente (Figura 2A). Posteriormente, a lipofilicidade da 2-fluoroethanol determinou-se novamente, mas com 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol como a referência (usando seu log experimentalmente medido anterior valorP +1.20). O log medido valorP foi-0.76, que só tinha uma diferença de 0,01 unidades logarítmicasP quando comparado com o valor medido usando 2, 2,2-trifluoroethanol como referência.

Da mesma forma, para cis-2,3-diflúor-1,4-butanodiol, a diferença de logP valores medidos usando 2-fluoroethanol e seu isômero trans também é muito pequeno (0,01 logP unidades, Figura 2B). Isto demonstrou que a seleção de referência composto não tem impacto sobre a medição de logP . Além disso, um pequeno desvio-padrão (< 0,01) indicado boa reprodutibilidade do nosso método.

Usando nosso método, uma série de compostos com valores de registro conhecidoP foi medida conforme mostrado na tabela 1. A diferença entre dados da literatura e os valores medidos usando nosso método é mostrada na última coluna da tabela. No geral, os valores obtidos experimentalmente logP (a 25 ° C) tenham boa a excelente conformidade com os valores da literatura, que ainda mais o nosso método validado.

Exemplos adicionais selecionados21 foram mostrados na Figura 3. Todos estes compostos alifáticos não-UV-ativo (a partir de carboidratos fluorado para fluorohydrins) podem ser facilmente medidos com nosso método.

Figure 1
Figura 1: Princípio do método de determinação deP log. Esta figura foi reproduzida com permissão da Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 21. este método de agitar-balão baseia-se em espectroscopia NMR F de 19. Um composto de referência é usado para o experimento de partição. Alíquotas para n- octanol e fase de água foram levadas para a experiência NMR. Rácios de integração entre referência composto e o composto a ser medido são obtidos para a determinação do log valor deP . Detalhada dedução matemática de equações, que conduz à equação final para a medida, também são dadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplos de validação interna 21. realizaram-se dois conjuntos de experimentos de controle, usando dois compostos diferentes de referência para medir o valor de logP de um composto,. O logP diferença entre essas experiências é insignificante. Desvio padrão (< 0,01) de experimentos executar em triplicado mostra boa reprodutibilidade do método. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Selecionado mais exemplos de logP medição usando nosso método. Aplicar este método, foram obtidos valores de logP para 8 compostos fluorados (como carboidratos fluorados, acíclicos alkanols e fluorohydrins conformationally restrito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Comparação entre os dados da literatura e os valores de registo experimentalP usando nosso método21. logP valores para 14 compostos fluorados (com log conhecido dadosP ) foram medidos usando este novo método. Os compostos de referência utilizados para cada medição também foram tabulados. Comparação (logP) entre valores de literatura e resultados do logP do nosso método demonstrou boa precisão deste método. um2, 2,2-Trifluoroethanol (TFE), 2-Fluoroethanol (FE); b Log de médiaP valor pelo menos três experimentos; c Medido experimentalmente logP valor pelo nosso método (-0,75) foi usado como referência. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo descrito no documento é um método simples para logP medição de compostos fluorados. Este método é aplicável a compostos fluorados com um logP valor de -3 a 3. Para obter mais hidrófila (logP < -3) ou compostos lipofílicos (logP > 3), este método pode ainda ser usado, mas vai exigir muito mais tempo de experiência NMR como número alargado de transientes é necessárias para obter uma boa relação sinal-ruído. Portanto, esta é uma limitação do método. Não há nenhuma exigência para a frequência do espectrômetro NMR, enquanto são satisfeitas as condições (configurações de parâmetro de NMR e SNR suficiente) para integração quantitativa. Quanto qualquer método do frasco de agitação, é fundamental para evitar a contaminação durante a amostragem de camada e supersaturação.

Comparado com o método anterior de agitar-balão e suas variações, existem várias vantagens em nosso método no que diz respeito a métodos existentes. 1) medições de massa de soluto, volume de solventes de partição e alíquotas de amostra NMR não são necessários. 2) o composto para a medição pode ser impuro, desde que as mudanças químicas de flúor das impurezas são diferentes do composto medido. 3) por causa do efeito de compensação intrínseca ao trabalhar com a relação de uma relação, erros sistemáticos são eliminados. 4) este método é aplicável a compostos fluorados UV-inativos. 5) este método é fácil de usar, com instalações de NMR de acesso aberto como nenhuma configuração especial de NMR é necessários (tais como a supressão de solvente, aplicando um ângulo pequeno da excitação, etc.).

Atualmente, nós estamos usando este método para medir as lipophilicities de carboidratos fluorados, fluorohydrins e fluorados amidas, a fim de investigar a influência da fluoretação na Lipofilicidade e identificar partes de gases fluorados com baixar o Lipofilicidade efeito. Desenvolvimento de método para logP medição de mais compostos lipofílicos (logP > 3) e para gases fluorados aminas está em curso no nosso grupo.

Pode-se salientar que 19F NMR também pode ser usado para micelle crítico de determinação de concentração (CMC)30.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa é financiada como parte do EPSRC concede EP/K016938/1 e EP/P019943/1 (ZW, HRF) e de um prêmio de conversão caso EPSRC/AstraZeneca (BFJ). Universidade de Southampton é agradeceu apoio adicional. O EPSRC é agradeceu ainda mais para uma concessão de capacidade de núcleo EP/K039466/1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe Bruker n/a AVIIIHD400
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe Bruker n/a
DrySyn Snowstorm reactor Asynt ADS13-S
recirculating chiller Asynt n/a model:Grant-LTC2
magnetic stirplate Asynt ADS-HP-NT
ACD/NMR processor software ACD/Labs n/a ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015

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Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (log<em>P</em>) usando <sup>19</sup>espectroscopia RMN de F
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Wang, Z., Jeffries, B. F., Felstead, H. R., Wells, N. J., Chiarparin, E., Linclau, B. A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (143), e58567, doi:10.3791/58567 (2019).More

Wang, Z., Jeffries, B. F., Felstead, H. R., Wells, N. J., Chiarparin, E., Linclau, B. A New Straightforward Method for Lipophilicity (logP) Measurement using 19F NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (143), e58567, doi:10.3791/58567 (2019).

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