Summary
Una novedosa y sencilla variación del método de frasco de agitación se desarrolló para la medida de la lipofilia precisa de compuestos fluorados por espectroscopia de RMN F 19.
Abstract
Fluoración se ha convertido en una herramienta eficaz para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los compuestos bioactivos. Una de las aplicaciones de la introducción del flúor es modular la lipofilicidad del compuesto. En nuestro grupo estamos interesados en el estudio del impacto de la fluoración en la lipofilia de fluorohydrins alifáticos y carbohidratos fluorados. Estos no son UV-activa, dando por resultado una difícil determinación de lipofilia. Aquí, presentamos un método sencillo para la medida de la lipofilia de compuestos fluorados por espectroscopia de RMN F 19. Este método no requiere ninguna actividad UV. Precisa masa soluto, solvente y alícuota de volumen también no están obligados a medirse. Usando este método, mide las lipophilicities de un gran número de alkanols fluorados y carbohidratos.
Introduction
Lipofilia es un parámetro clave fisicoquímico de las moléculas de droga que influye en las propiedades de los fármacos candidatos en muchos aspectos, incluyendo la solubilidad de la droga, biodisponibilidad y toxicidad1. Lipofilia se mide como el logaritmo (logP) del cociente de las concentraciones de compuestos después de la partición entre n-octanol y agua. Rangos óptimos lipofilia se han propuesto en base a datos estadísticos de fármacos administrados por vía oral, de la cual la "regla de Lipinski de 5'' es el más famoso ejemplo2,3. De hecho, controlar lipofilia ha demostrado para ser esencial para la mejora de la perspectiva de los candidatos de la droga. Aumentar la afinidad del fármaco por elevada lipofilia se ha identificado como uno de los principales problemas en los proyectos de descubrimiento de drogas durante las últimas décadas, llevando a mayor desgaste tarifas3. Por lo tanto, se ha sugerido que desarrollo de drogas exitosa está asociada con mantener la lipofilia molecular de los fármacos candidatos dentro de los límites óptimos durante la afinidad optimización proceso3,4. En ese sentido, nuevos conceptos (tales como índices de eficiencia lipofílico) han sido introducidos5,6.
Por lo tanto es de gran importancia para medir con precisión la lipofilia durante el proceso de desarrollo de fármacos. Además, la disponibilidad de métodos sencillos para la medida de la lipofilia es en la demanda como investigación fundamental tiene como objetivo identificar soluciones para logP modulación. En la actualidad, numerosos métodos establecidos son accesibles para lipofilicidad determinación1. El estándar 'frasco de agitación (SF)' método7y sus variantes se emplean comúnmente para medir valores de logP directamente, que en la mayoría de los casos dependen de espectroscopía UV-Vis para la cuantificación. La principal desventaja de este método clásico de SF es su carácter intensivo. Además, puede ocurrir la formación de emulsiones, especialmente para compuestos altamente lipofílicos8,9. Varios métodos fueron desarrollados para evitar tales problemas, como por medio de análisis por inyección en flujo, tubo de diálisis, etcetera. 9,10. Sin embargo, ninguno de estos métodos son directa o fácilmente aplicables en laboratorios no especializados.
Existen también muchos métodos indirectos para el uso, tales como valoración potenciométrica11métodos electroforéticos12,13, RP HPLC-métodos basados en cromatografía, método basado en la espectrometría de masa14, etcetera. Éstos son métodos indirectos, como los valores de logP se obtienen de las curvas de calibración. Entre estos métodos, el método de RP-HPLC ha sido ampliamente utilizado porque es fácil de usar y ahorra tiempo. Sin embargo, su exactitud depende el conjunto de entrenamiento para establecer la curva de calibración, y la lipofilia Estimado depende de la partición sistema13,15.
Hay un número de 1H NMR métodos reportados en la literatura para la determinación de lipofilia. Mo et al desarrolló un método para la medición de logP mediante 1H NMR sin disolventes deuterados. Agua y octanol, como disolventes de la partición, se utilizaron como referencia para la cuantificación de la concentración de soluto en cada fase16. Herth y compañeros de trabajo también informaron de un enfoque, por el que el experimento de partición se produjo directamente en un tubo NMR, donde se recolectaron los datos de NMR de la capa acuosa inferior D2O antes y después de la extracción con 1-octanol, para obtener la distribución coeficiente de17. Además, Soulsby et al. explotados 1H RMN como una herramienta de análisis, determinar la amplitud de las señales mediante el uso de reducción completa a software de tabla de frecuencia de amplitud. La relación de las amplitudes en capas llevados a los coeficiente de partición medido18. Estos métodos son relativamente fáciles de utilizar pero a menudo requieren la calibración de pulsos selectivos y niveles de potencia o el uso de en forma de pulsos de gradiente para asegurar la adecuada supresión solvente y selectividad de la señal.
También pueden obtenerse registro calculadoP (clogP) valores para los compuestos. Hay varios métodos de cálculo y software disponible en el mercado. Estos valores de obstrucciónP se utilizan en la industria farmacéutica al evaluar gran número de moléculas de droga. Sin embargo, grandes errores de estorboP valores no son infrecuente19,20.
Los requisitos de la UV-actividad para el análisis de la concentración y el establecimiento de curvas de calibración para el cálculo de logP impiden el progreso de la investigación en este campo. En particular, éste es el caso de compuestos alifáticos UV-activa. Fracciones alifáticas fluorados se han convertido en cada vez más atractivas para el diseño de fármacos en los últimos años, y su influencia en general lipofilicidad del compuesto es un tema de investigación en nuestro grupo21. Además, 19F es un núcleo de NMR-activos altamente sensible, haciendo 19F RMN una herramienta útil para el análisis de compuestos fluorados. También tiene una gama más grande de la cambio química comparada con la de 1H. Por lo tanto, vale la pena desarrollar un método sencillo para logP determinación de compuestos fluorados de UV-activa por espectroscopia de RMN F 19. Por lo tanto, el objetivo general de este método es lograr determinación conveniente lipofilia de compuestos fluorados.
El principio fundamental de nuestro 19método basado en el F NMR es añadir una referencia fluorados en la partición experimento (figura 1)21. X compuesto y compuesto de referencia (ref) se reparten entre agua y n- octanol. Después de equilibrar, se tomó una alícuota de cada fase en un tubo NMR y 19F RMN experimentos se ejecutan en ambas muestras de NMR. La intensidad de los picos de flúor es proporcional a compuesto concentración (C) y el número de átomos de flúor (n) de los compuestos. Entre compuesto X y ref, pueden obtenerse relaciones integradas para ambas fases. El cociente en n- octanol capa se define como ρocty ρaq para la capa de agua (EQ. 1). La relación de los valores ρ es igual al cociente de los coeficientes de partición (P) del compuesto X y ref (EQ. 2). Esto conduce a la ecuación final (EQ. 4) para registro de medición deP del compuesto X. Por lo tanto, para determinar el valor deP de un compuesto desconocido X, sólo relaciones de integración (oct y ρ de ρaq) de log en ambas capas son necesarias para medirse con 19F NMR.
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Protocol
1. partición
- Añadir 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (compuesto X, ca. 6.0 mg) y 2,2,2 trifluoroethanol (referencia compuesto, ca. 3.0 mg) a un matraz de pera de 10 mL, disolver en n- octanol (grado HPLC, aprox. 2 mL) y agregue agua (grado HPLC, aprox. 2 mL).
Nota: Este experimento se ejecuta por triplicado. Se comprobará el compuesto solubilidad en agua y n- octanol. La cantidad del compuesto utilizado para la partición debe considerarse cuidadosamente para evitar sobresaturación del compuesto en cualquier capa. La relación masa de compuesto X y referencia ref compuesto también debe ser considerado para evitar que la integral de una determinada muestra de NMR son fuera de un rango de 10/1 a 1/10. Por ejemplo, si hay una diferencia de < 2 unidades logP entre compuesto X y ref, óptima relación entre la masa puede asegurar que las relaciones de integración en muestras de agua y 1-octanol NMR son dentro de un rango de 10/1 a 1/10. En cambio, si se obtiene una relación de integración de 50/1 en una capa, habrá más probabilidades de errores relativamente grandes en la integración para el pico con la concentración más baja. La siguiente ecuación puede utilizarse para predecir la relación óptima de masa compuesta:
mX / mref = {(cP X/Pref)-0,5 * (MX/ Mref) * [(1 + cPX) / (1 + Pref)]} / (NX / Nref)
m, masa; M, masa molecular; N, número de átomos de F; P, coeficientes de partición; cP, coeficientes de partición calculada. - Colocar los frascos dentro de un receptáculo de control de temperatura por encima de un stirplate y conectar a un enfriador de recirculación. Revolver la mezcla bifásica a 25 ° C por 2 h, con agitación a velocidad de 600 rpm.
- Equilibrar la mezcla a 25 ° C durante la noche (aprox. 16 h), para permitir para la separación de la fase completa.
Nota: En algunos casos, puede observarse la formación de una espuma entre el n- octanol y agua límite. En este caso, la mezcla se transfirió a un frasco de vidrio de 4 mL y centrifugar hasta la desaparición de la espuma. La mezcla bifásica fue entonces izquierda para equilibrar otra vez a 25 ° C durante la noche.
2. preparación de la muestra RMN
- Fijar el matraz en un soporte de retorta con una abrazadera.
- Tomar una alícuota de aprox. 0.70 0.85 mL de agua y n- octanol capas, usando jeringas de plástico desechables de 1 mL con agujas largas.
- Para tomar el alícuota de agua, drenaje aprox. 0,02 mL de aire en la jeringa antes de poner la aguja en la mezcla. Mientras se mueve la aguja a través de la superior n- octanol capa en la capa de agua, empuje suavemente hacia fuera el aire para impedir la entrada de la aguja de solución de n- octanol.
- Retire la aguja larga de la mezcla. Desechar una pequeña cantidad de muestra de agua, dejando aprox. 0,6 mL de izquierda muestra en la jeringa. Con cuidado Limpie la aguja con tejido seco e inyectar aprox. 0.5 mL de muestra de agua en un tubo limpio de NMR. Cerrar rápidamente el tubo NMR con una tapa.
- Para la muestra de n- octanol, retire la aguja larga de la capa de n- octanol. Desechar una pequeña cantidad de muestra de n- octanol, dejando aprox. 0,6 mL de izquierda muestra en la jeringa. Cuidadosamente Limpie la aguja con tejido seco e inyectar aprox. 0.5 mL de n- octanol muestra en un tubo limpio de NMR. Cerrar rápidamente el tubo NMR con una tapa.
- Visualmente ambas muestras n- octanol y agua para cualquier tipo de contaminación (por ej., pequeñas gotas de n- octanol en muestra de agua o pequeñas gotas de agua en la muestra de n- octanol).
Nota: Si hay cualquier tipo de contaminación, la alícuota debe ser re-preparado de la mezcla bifásica. Como la medición se hace por triplicado, se obtienen seis tubos NMR. - A cada tubo NMR, Añadir 0,1 mL de un solvente NMR deuterado que es miscible con agua y n- octanol (e.g., acetona d6) para activar la cerradura de la señal durante la adquisición de NMR.
- Para compuestos con puntos de ebullición bajos (e.g., < 120 ° C), sellar los tubos NMR utilizando un soplete y, después de enfriar, invertir el tubo para detectar cualquier fuga. Cuidadosamente los experimentos de invertir que 20 veces para obtener una solución homogénea para 19F NMR los tubos NMR sellado o no selladas.
3. RMN experimentos
- Ejecutar, utilizando parámetros NMR estándar (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), experimentos de NMR F {1H} 19para identificar cambios químicas de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (compuesto X) y 2,2,2 trifluoroethanol (compuesto de referencia) en ambos n muestras de NMR - octanol y agua.
- Medir el tiempo de relajación spin-lattice (T1) para núcleos de flúor diagnóstico utilizando una secuencia de inversión-recuperación22. Medir el nivel de retraso de pulso apropiadas (D1, como ≥ 5 * T1) de los valores obtenidos de la T1 para la integración de NMR cuantitativa exacta.
Nota: Este es muy desperdiciador de tiempo, sino un D1 de 60 s para la muestra de fase de agua y de 30 s para la muestra de la fase de octanol, son ajustes conservadores que con seguridad satisfará la D1 ≥ 5 * T1 criterium. - Ejecutar 19experimentos NMR F {1H} ajustado otra vez con ajustes de los parámetros de la siguiente manera: a) uso D1 ≥ 5 * T1; b) centro de la frecuencia de offset punto (O1P) entre las dos señales de diagnóstico flúor por lo que ambos núcleos pueden ser igualmente excitados; c) establecer el ancho espectral (SW) como 300 ppm, pero reducir si una mejor relación SNR si es necesario; d) establecer el número de oscilaciones (NS) 64 pero aumentan si se requiere mayor SNR.
Nota: No disociada 19F RMN experimentos también pueden utilizarse para adquisición de datos NMR. Sin embargo, se prefieren los experimentos de RMN F protón desemparejado 19aquí como simplifica las señales flúor quitando acoplamientos de protón-flúor que también aumenta la relación señal a ruido. Utilizamos la disociación inversa cerrada para obtener un espectro desconectado sin nOe (efecto nuclear de Overhauser) mejoras23. Para la integración cuantitativa, se desea una relación de señal a ruido (≥300). 24
4. procesamiento de datos
- Procesar los datos obtenidos con ACD/NMR procesador Academic Edition u otro software de proceso NMR personalizado.
- El archivo de datos de NMR, y abra la carpeta pdata , carpeta 1. Elimine el archivo de 1r .
- Volver al archivo de datos de NMR y arrastrar el archivo de la fid en la ventana de procesador ACD/NMR.
- Haga clic en el botón de WFunctions , seleccione exponencial, ajuste de LB como 2y haga clic en el botón OK .
- Haga clic en el botón de Cero relleno , aumentar el Conteo de puntos 4 veces de su Cuenta de puntos Original pulsando un pequeño botón al lado del número y haga clic en Aceptar botón.
- Pulse el botón de TR. de Fourier .
- Haga clic en el botón de la fase , luego haga clic en el botón del Ratón pH. , haga clic en y mantenga presionado el botón izquierdo del ratón, mueva el ratón hacia delante o hacia atrás hasta el mayor pico del espectro es bien gradualmente.
- Haga clic en y mantenga presionado el botón derecho del ratón, mueva el ratón hacia delante o hacia atrás hasta que el otro peak(s) del espectro correctamente es gradual. Luego Desmarque el botón del Ratón pH. zoom en la zona espectral con los picos de flúor, haga clic en Puesta a punto, realizar la corrección de fase, si es necesario como se describe anteriormente hasta que todos los picos son fases correctamente y haga clic en la marca botón.
- Haga clic en el botón de línea de base , luego el botón de Opciones . Seleccionar el Espectro promedio para modelos automáticos, ajuste el número de puntos de media anchura de la caja si es necesario (en particular para el espectro con baja relación S/R), haga clic en Aceptar | Autoy haga clic en el botón de señal .
- Haga clic en integraciónintegración de los picos de flúor diagnóstico y haga clic en el botón de señal .
Nota: Si la curva integral no es paralela a la línea de fondo, haga clic el botón Sesgo Corr. y ajustar la inclinación y la pendiente hasta que la curva es paralela a la línea de base.
- Obtener las relaciones de integración de n- octanol y agua NMR muestras y utilizar en la ecuación de cálculo deP de log (figura 1, EC. 4) para obtener el valor de logP de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (compuesto X).
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Representative Results
Dos conjuntos de datos como control de experimentos se muestran en la figura 221. Utilizando 2,2,2 trifluoroethanol como compuesto de referencia, valores de logP se obtuvieron 2-fluoroethanol y 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0.75 y +1.20, respectivamente (figura 2A). Posteriormente, la lipofilia de fluoroethanol 2 se determinó otra vez pero con 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol como referencia (con su anterior registro experimental medidoP valor +1.20). El valor deP de log medido fue de -0,76, que sólo tuvo una diferencia de 0,01 unidades deP de log cuando se compara con el valor medido usando 2,2,2 trifluoroethanol como referencia.
Asimismo, para el cis-2,3-difluoro-1, 4-butanediol, mide la diferencia en valores de logP mediante el uso de 2-fluoroethanol y su isómero trans es también muy pequeña (0,01 logP unidades, figura 2B). Esto demostró que la selección del compuesto de referencia no tiene impacto en la medición de logP . Además, una pequeña desviación de estándar (< 0,01) indica la buena reproducibilidad de nuestro método.
Con nuestro método, una serie de compuestos con valores conocidos de logP se midió como se muestra en la tabla 1. En la última columna de la tabla se muestra la diferencia entre datos de la literatura y los valores medidos utilizando nuestro método. En general, los valores obtenidos experimentalmente logP (a 25 ° C) tienen buena a excelente de acuerdo con los valores de la literatura, que además nuestro método validado.
Ejemplos adicionales de las21 fueron demostrados en la figura 3. Todos estos compuestos alifáticos de la UV-activa (de carbohidratos fluorados a fluorohydrins) se pueden medir fácilmente con nuestro método.
Figura 1: Principio de registro método de determinación deP . Esta figura se ha reproducido con permiso de Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 21. este método de frasco de agitación se basa en la espectroscopia de RMN F 19. Un compuesto de referencia se utiliza para el experimento de partición. Se tomaron alícuotas para la fase de agua y n- octanol para experimento NMR. Se obtienen relaciones de integración entre el compuesto de referencia y el compuesto a medir para la determinación del valor deP de log. Toda deducción matemática de las ecuaciones, que conduce a la ecuación final para la medición, también se dan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ejemplos de validación interna 21. dos conjuntos de experimentos de control, con dos compuestos de referencia diferentes para medir el valor de logP de un compuesto, se llevaron a cabo. El registroP diferencia entre esos experimentos es insignificante. Desviación estándar (< 0,01) de experimentos run por triplicado muestra buena reproducibilidad del método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de registro de medición deP , utilizando nuestro método más seleccionados. Aplicación de este método, se obtuvieron valores de logP para 8 compuestos fluorados (como carbohidratos fluorados, alkanols acíclicos y fluorohydrins conformationally restringido). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Comparación entre los datos de la literatura y los valores de registro experimentalP usando nuestro método21. se midieron valores deP de log de 14 compuestos fluorados (con registro sabidoP datos) utilizando este nuevo método. También se tabularon los compuestos de referencia usados para cada medición. Comparación (logP) entre los valores de la literatura y logP los resultados de nuestro método había demostrado buena exactitud de este método. un2,2,2-Trifluoroethanol (TFE), 2-Fluoroethanol (FE); b Promedio de logP valor de por lo menos tres experimentos; c Registro experimental medido valor deP por el método (-0.75) fue utilizado como referencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo descrito en el libro es un método sencillo para logP medición de compuestos fluorados. Este método es aplicable a compuestos fluorados con un valor deP de log de -3 a 3. Más hidrofílico (RegistroP < -3) o compuestos lipofílicos (logP > 3), este método puede utilizarse pero requerirá mucho más tiempo de experimento NMR como número ampliado de transitorios se necesita para obtener una buena relación señal a ruido. Por lo tanto, ésta es una limitación del método. No hay ningún requisito para la frecuencia del espectrómetro de RMN, siempre y cuando se cumplan las condiciones (parámetros NMR y SNR suficiente) para la integración cuantitativa. En cuanto a cualquier método de frasco de la sacudida, es fundamental para evitar la sobresaturación y la contaminación durante el muestreo de la capa.
Comparado con el anterior método de frasco de agitación y sus variaciones, hay varias ventajas en nuestro método con respecto a los métodos existentes. 1) mediciones de la masa de soluto volumen de partición solventes y alícuotas por muestra de NMR no son necesarios. 2) compuesto para la medición puede ser impuro siempre que los desplazamientos químicos de flúor de las impurezas son diferentes a la del compuesto medido. 3) causa del efecto de compensación intrínseca cuando se trabaja con la relación de una relación, se eliminan los errores sistemáticos. 4) este método es aplicable a compuestos fluorados UV-activa. 5) este método es fácil de utilizar con instalaciones de NMR de libre acceso como ninguna configuración especial de NMR se necesita (como supresión de disolvente, aplicar un ángulo pequeño de la excitación, etc.).
Actualmente, estamos utilizando este método para medir las lipophilicities de hidratos de carbono fluorado, amidas fluorohydrins y fluorados, con el fin de investigar la influencia de fluoración en la lipofilia y para identificar grupos fluorados con efecto reductor de la lipofilia. Desarrollo de métodos para registro de medición deP de más lipófilas (RegistroP > 3) y para fluorados aminas está llevando a cabo en nuestro grupo.
Se puede señalar que 19F NMR puede utilizarse también para la crítica de la micela (CMC) de concentración determinación30.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación es financiada como parte del EPSRC otorga EP/K016938/1 y EP/P019943/1 (ZW, HRF) y de un premio de conversión de EPSRC/AstraZeneca caso (BFJ). La Universidad de Southampton es agradeció apoyo adicional. El EPSRC más dio las gracias por una subvención de la capacidad de base K039466/EP/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe | Bruker | n/a | AVIIIHD400 |
| NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe | Bruker | n/a | |
| DrySyn Snowstorm reactor | Asynt | ADS13-S | |
| recirculating chiller | Asynt | n/a | model:Grant-LTC2 |
| magnetic stirplate | Asynt | ADS-HP-NT | |
| ACD/NMR processor software | ACD/Labs | n/a | ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015 |
References
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