Summary

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Published: November 30, 2018
doi:

Summary

I denne artikkelen beskrive vi protokoller av protein uttrykk, rensing, krystallisering og struktur fastsettelse av N-terminal domenet ryanodine reseptoren fra diamondback møll (Plutella xylostella).

Abstract

Utvikling av potente og effektive insektmidler målretting insekt ryanodine reseptorer (RyRs) har vært av stor interesse innen landbruk skadedyrbekjempelse. Hittil har flere diamide insektmidler målretting pest RyRs har blitt kommersialisert, som genererer årlig omsetning på 2 milliarder amerikanske dollar. Men forståelse av modusen for handling av RyR målretting insektmidler er begrenset av mangel på strukturelle informasjon om insekt RyR. Dette begrenser igjen forståelse av utviklingen av insektmiddel motstand i skadedyr. Diamondback møll (DBM) er en ødeleggende pest ødelegge cruciferous avlinger over hele verden, som har også blitt rapportert å vise motstand mot diamide insektmidler. Derfor er det av stor praktisk betydning å utvikle romanen insektmidler målretting DBM RyR, spesielt rettet mot en region forskjellig fra det tradisjonelle diamide binding området. Her presenterer vi en protokoll strukturelt betegner N-terminal domenet RyR fra DBM. Krystallstruktur x-ray ble løst av molekylære erstatning oppløsning av 2.84 Å, som viser en beta-trefoil folding motiv og en flankemanøveren alpha helix. Denne protokollen kan tilpasses for uttrykket, rensing og strukturelle karakteristikk av andre domener eller proteiner generelt.

Introduction

Ryanodine reseptorer (RyRs) er bestemt ionekanaler, som megle gjennomtrengning av Ca2 + ioner over sarcoplasmic retikulum (SR) membraner i muskelceller. Derfor spille de en viktig rolle i magnetisering sammentrekning kopling prosessen. I sin funksjonelle form, RyR samler som en homo-tetramer med en molekylær masse > 2 MDa, med hver delenhet bestående av ~ 5000 aminosyre rester. I pattedyr, finnes det tre isoformene: RyR1 – Skjelettmuskel type, Hjertemuskel type RyR2- og RyR3-overalt uttrykt i forskjellige vev1.

I insekter er det bare én type RyR, som er uttrykt i muskel- og nervøs vev2. Insekt RyR er mer lik pattedyr RyR2 med en sekvens identitet på ca 47%3. Diamide insektmidler målretting RyR av sommerfugler og Coleoptera er utviklet og markedsført av store selskaper som Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) og Syngenta (cyantraniliprole). Siden lanseringen relativt nylig har diamide insektmidler blitt en av de raskest voksende klassen av insektmidler. Foreløpig har salget av disse tre insektmidler årlig krysset 2 milliarder amerikanske dollar med en vekst på mer enn 50% siden 2009 (Agranova).

Nyere studier har rapportert utviklingen av motstand i insekter etter et par generasjoner av bruken av insektmidler4,5,6,7,8. Den motstand mutasjoner i transmembrane domenet av RyRs fra diamondback møll (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) og de tilsvarende stillingene i tomat leafminer, Tuta reservatet (G4903E, I4746M) viser at regionen kan være involvert i diamide insektmiddel binding som denne regionen er kjent for å være kritisk for gating av channel4,8,9. Til tross for omfattende forskning på dette området forblir nøyaktig molekylære mekanismer av diamide insektmidler unnvikende. Videre er det uklart om motstand mutasjoner påvirker interaksjonene med diamides direkte eller allosterically.

Tidligere studier har rapportert strukturen i flere RyR domener pattedyrarter og strukturen i full lengde pattedyr RyR1 og RyR2 av Røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskop, henholdsvis10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men så langt ingen struktur av insekt RyR er rapportert, som forbyr oss fra å forstå molekylær vanskelighetene med funksjonen reseptor og molekylære mekanismer insektmiddel handling og utvikling av insektmiddel motstand.

I dette manuskriptet presenterer vi en generalisert protokoll for strukturelle karakterisering av N-terminal β-trefoil domene ryanodine reseptoren fra diamondback møll, en ødeleggende pest infisere cruciferous avlinger verdensomspennende22. Konstruer ble utviklet etter publiserte kanin RyR1 NTD krystall strukturer23,24og cryo-EM strukturelle modeller16,17,18,19, 20 , 21. Dette er første høyoppløselig strukturen rapportert insekt RyR, som avslører mekanismen for kanal gating og gir en viktig mal for utviklingen av artsspesifikke insektmidler ved hjelp av strukturen-basert stoff design. For strukturen forklaring ansatt vi Røntgenkrystallografi, som regnes som “gull standard’ for protein proteinstrukturer på nær Atom løsning. Selv om krystallisering prosessen er uforutsigbare og arbeidsintensiv, vil denne trinnvise protokollen hjelpe forskere til å uttrykke, rense og karakterisere andre domener av insekter RyR eller noen andre proteiner generelt.

Protocol

1. gen kloning, Protein uttrykk og rensing PCR forsterke DNA tilsvarer protein av interesse (rester 1-205 av DBM RyR, Genbank iht. no. AFW97408) og klone i pET-28a-HMT vektor av hemorroider-uavhengig kloning (LIC)25. Denne vektoren inneholder en histidin kode, MBP tag og en TEV protease cleavage nettsted på N-terminus15. Design LIC primere for forsterkning av målet genet med LIC-kompatible 5 utvidelser:Videresend LIC primer:5′ …

Representative Results

Rensing N-terminal domenet DBM RyR ble uttrykt som en fusion protein med en hexahistidine kode, MBP koder og et TEV protease cleavage område. Vi fulgte en fem-trinns rensing strategi for å få en svært ren protein, egnet for krystallisering formålet. Først var fusion protein renset fra løselig brøkdel av celle lysate Ni-NTA kolonnen (HisTrap HP). Deretter fusion protein ble utsatt for TEV protease cleavage og hexahistidine-M…

Discussion

I dette papiret beskriver vi fremgangsmåten for å recombinantly express, rense, utkrystallisere og bestemme strukturen i DBM RyR NTD. For krystallisering er et viktig krav å skaffe proteiner med høy løselighet, renhet og homogenitet. I vår protokollen valgte vi å bruke pET-28a-HMT vektor som inneholder en hexahistidine kode og MBP tag, begge kan utnyttes for rensing å få en høyere fold renhet. I tillegg MBP tag aids i Løseligheten av målet protein. Vi renset protein av fem sammenhengende trinn som hadde prote…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansiering av denne forskningen ble levert av: nasjonale nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National natur Science Foundation i Kina (31320103922, 31230061) og prosjekt av nasjonal grunnforskning (973) Program Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi er takknemlige for ansatte på beamline BL17U1 i Shanghai Synchrotron stråling anlegg (SSRF).

Materials

pET-28a-HMT vector This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain Novagen 69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL) GE Healthcare 45-000-325
Amylose resin column New England Biolabs E8021S
Q Sepharose high-performance column  GE Healthcare 17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) Millipore UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column  GE Healthcare 28-9893-36
Automated liquid handling robotic system  Art Robbins Instruments Gryphon
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 82050-494
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601
Mounted CryoLoop – 20 micron Hampton Research HR4-955
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607
Nano drop Thermo Scientific NanoDrop One
Crystal incubator Molecular Dimensions MD5-605
X-Ray diffractor Rigaku FRX
PCR machine Eppendorf Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit Qiagen 27104
Gel extraction kit Qiagen 28704
SspI restriction endonuclease NEB R0132S
T4 DNA polymerase Novagen 2868713
Kanamycin Scientific Chemical 25389940
IPTG Genview 367931
HEPES Genview 7365459
β-mercaptoethanol Genview 60242
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall LYNX 6000 
Sonnicator Scientz II-D
Protein purification system GE Healthcare Akta Pure
Light microscope Nikon SMZ745
IzIt crystal dye Hampton Research HR4-710
Electrophoresis unit Bio-Rad 1658005EDU
Shaker Incubator Zhicheng ZWYR-D2401
Index crystal screen Hampton Research HR2-144
Structure crystal screen Molecular Dimensions MD1-01
ProPlex crystal screen Molecular Dimensions MD1-38
PACT premier crystal screen Molecular Dimensions MD1-29
JCSG-plus crystal screen Molecular Dimensions MD1-37

References

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
  3. Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
  4. Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
  5. Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
  6. Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
  7. Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
  8. Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
  9. Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
  10. Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
  11. Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
  12. Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
  13. Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
  14. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  15. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  16. des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
  17. Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
  18. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
  19. Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
  20. Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
  21. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  22. Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
  23. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
  24. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
  25. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  26. Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
  27. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  30. Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
  31. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  32. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
  33. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  35. Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
  36. Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).

Play Video

Cite This Article
Nayak, B. C., Wang, J., Lin, L., He, W., You, M., Yuchi, Z. Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella. J. Vis. Exp. (141), e58568, doi:10.3791/58568 (2018).

View Video