I denne artikkelen beskrive vi protokoller av protein uttrykk, rensing, krystallisering og struktur fastsettelse av N-terminal domenet ryanodine reseptoren fra diamondback møll (Plutella xylostella).
Utvikling av potente og effektive insektmidler målretting insekt ryanodine reseptorer (RyRs) har vært av stor interesse innen landbruk skadedyrbekjempelse. Hittil har flere diamide insektmidler målretting pest RyRs har blitt kommersialisert, som genererer årlig omsetning på 2 milliarder amerikanske dollar. Men forståelse av modusen for handling av RyR målretting insektmidler er begrenset av mangel på strukturelle informasjon om insekt RyR. Dette begrenser igjen forståelse av utviklingen av insektmiddel motstand i skadedyr. Diamondback møll (DBM) er en ødeleggende pest ødelegge cruciferous avlinger over hele verden, som har også blitt rapportert å vise motstand mot diamide insektmidler. Derfor er det av stor praktisk betydning å utvikle romanen insektmidler målretting DBM RyR, spesielt rettet mot en region forskjellig fra det tradisjonelle diamide binding området. Her presenterer vi en protokoll strukturelt betegner N-terminal domenet RyR fra DBM. Krystallstruktur x-ray ble løst av molekylære erstatning oppløsning av 2.84 Å, som viser en beta-trefoil folding motiv og en flankemanøveren alpha helix. Denne protokollen kan tilpasses for uttrykket, rensing og strukturelle karakteristikk av andre domener eller proteiner generelt.
Ryanodine reseptorer (RyRs) er bestemt ionekanaler, som megle gjennomtrengning av Ca2 + ioner over sarcoplasmic retikulum (SR) membraner i muskelceller. Derfor spille de en viktig rolle i magnetisering sammentrekning kopling prosessen. I sin funksjonelle form, RyR samler som en homo-tetramer med en molekylær masse > 2 MDa, med hver delenhet bestående av ~ 5000 aminosyre rester. I pattedyr, finnes det tre isoformene: RyR1 – Skjelettmuskel type, Hjertemuskel type RyR2- og RyR3-overalt uttrykt i forskjellige vev1.
I insekter er det bare én type RyR, som er uttrykt i muskel- og nervøs vev2. Insekt RyR er mer lik pattedyr RyR2 med en sekvens identitet på ca 47%3. Diamide insektmidler målretting RyR av sommerfugler og Coleoptera er utviklet og markedsført av store selskaper som Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) og Syngenta (cyantraniliprole). Siden lanseringen relativt nylig har diamide insektmidler blitt en av de raskest voksende klassen av insektmidler. Foreløpig har salget av disse tre insektmidler årlig krysset 2 milliarder amerikanske dollar med en vekst på mer enn 50% siden 2009 (Agranova).
Nyere studier har rapportert utviklingen av motstand i insekter etter et par generasjoner av bruken av insektmidler4,5,6,7,8. Den motstand mutasjoner i transmembrane domenet av RyRs fra diamondback møll (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) og de tilsvarende stillingene i tomat leafminer, Tuta reservatet (G4903E, I4746M) viser at regionen kan være involvert i diamide insektmiddel binding som denne regionen er kjent for å være kritisk for gating av channel4,8,9. Til tross for omfattende forskning på dette området forblir nøyaktig molekylære mekanismer av diamide insektmidler unnvikende. Videre er det uklart om motstand mutasjoner påvirker interaksjonene med diamides direkte eller allosterically.
Tidligere studier har rapportert strukturen i flere RyR domener pattedyrarter og strukturen i full lengde pattedyr RyR1 og RyR2 av Røntgenkrystallografi og cryo-elektronmikroskop, henholdsvis10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Men så langt ingen struktur av insekt RyR er rapportert, som forbyr oss fra å forstå molekylær vanskelighetene med funksjonen reseptor og molekylære mekanismer insektmiddel handling og utvikling av insektmiddel motstand.
I dette manuskriptet presenterer vi en generalisert protokoll for strukturelle karakterisering av N-terminal β-trefoil domene ryanodine reseptoren fra diamondback møll, en ødeleggende pest infisere cruciferous avlinger verdensomspennende22. Konstruer ble utviklet etter publiserte kanin RyR1 NTD krystall strukturer23,24og cryo-EM strukturelle modeller16,17,18,19, 20 , 21. Dette er første høyoppløselig strukturen rapportert insekt RyR, som avslører mekanismen for kanal gating og gir en viktig mal for utviklingen av artsspesifikke insektmidler ved hjelp av strukturen-basert stoff design. For strukturen forklaring ansatt vi Røntgenkrystallografi, som regnes som “gull standard’ for protein proteinstrukturer på nær Atom løsning. Selv om krystallisering prosessen er uforutsigbare og arbeidsintensiv, vil denne trinnvise protokollen hjelpe forskere til å uttrykke, rense og karakterisere andre domener av insekter RyR eller noen andre proteiner generelt.
I dette papiret beskriver vi fremgangsmåten for å recombinantly express, rense, utkrystallisere og bestemme strukturen i DBM RyR NTD. For krystallisering er et viktig krav å skaffe proteiner med høy løselighet, renhet og homogenitet. I vår protokollen valgte vi å bruke pET-28a-HMT vektor som inneholder en hexahistidine kode og MBP tag, begge kan utnyttes for rensing å få en høyere fold renhet. I tillegg MBP tag aids i Løseligheten av målet protein. Vi renset protein av fem sammenhengende trinn som hadde prote…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering av denne forskningen ble levert av: nasjonale nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National natur Science Foundation i Kina (31320103922, 31230061) og prosjekt av nasjonal grunnforskning (973) Program Kina (2015CB856500, 2015CB856504). Vi er takknemlige for ansatte på beamline BL17U1 i Shanghai Synchrotron stråling anlegg (SSRF).
pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
IPTG | Genview | 367931 | |
HEPES | Genview | 7365459 | |
β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
Sonnicator | Scientz | II-D | |
Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |