Summary
Wij bieden een methode voor de generatie, de teelt en de systematische analyse van organotypic plakjes afgeleid van lymfkliertest Long tumoren. Ook beschrijven we hoe u kunt optimaliseren voor segment dikte en drug concentraties te behandelen tumor segmenten te selecteren.
Abstract
Organotypic primaire explant weefselcultures, waaronder precisie-cut segmenten, vertegenwoordigen de drie-dimensionale (3-D) weefsel architectuur evenals de meercellige interacties van inheemse weefsel. Weefsel segmenten onmiddellijk gesneden uit vers gereseceerd tumoren behouden ruimtelijke aspecten van de heterogeniteit van de intratumor, waardoor ze nuttig surrogaten van in vivo biologie. Zorgvuldige optimalisatie van weefsel segment voorbereiding en teelt voorwaarden is van fundamenteel belang voor de voorspellende diagnostische mogelijkheden van tumor segment explants. In dit verband zijn lymfkliertest modellen waardevol, zoals deze bieden een consistente stroom van tumor materiaal repliceren en reproduceerbare experimenten uit te voeren. Dit protocol beschrijft het kweken van lymfkliertest Long weefsel tumor afkomstige segmenten met behulp van een roterende incubatie-eenheid, een systeem waarmee intermitterende blootstelling van weefsels aan zuurstof en voedingsstoffen. Onze vorige werk is gebleken dat het gebruik van de roterende incubatie eenheden de levensvatbaarheid van weefsel ten opzichte van andere methoden om cultuur verbetert, met name drijvende segmenten en stagnerende filter ondersteunt. Hier, laten we verder dat segment dikte de levensvatbaarheid beïnvloedt van gekweekte segmenten, suggereren dat optimalisatie met de dikte van het segment gedaan moet worden voor verschillende weefseltypes (HLA). Uitgesproken ITH in relevante oncogene functies, zoals activiteiten, stromale cellen infiltratie of expressie van differentiatie markers, signalering vereist evaluatie van aangrenzende weefsel segmenten voor de expressie van markers gewijzigd door medicamenteuze behandeling of teelt zelf. Kortom, dit protocol beschrijft de generatie van lymfkliertest Long tumor segmenten en hun cultuur op een roterende incubatie-eenheid en toont hoe segmenten moeten systematisch worden geanalyseerd voor de expressie van heterogene weefsel markers, als een voorwaarde voorafgaand aan de drug reactie studies.
Introduction
Solide tumor weefsel, met inbegrip van longkanker, genetische en fenotypische heterogeniteit vertonen, en haven van complexe microenvironments1,2. Het samenspel tussen de tumorcellen en hun omliggende communicatie invloed op drug gevoeligheid en resistentie mechanismen3. Dit wijst op de noodzaak voor preklinische modellen die kan nauwkeurig model van biologische complexiteit en functies handelen in native tumoren. Precisie-cut segmenten direct afgeleid van verse tumoren bieden een unieke bron, zoals ze een belangrijkste capaciteit om te vertegenwoordigen in vivo biologie, ten minste voor een korte venster van tijd hebben, met inbegrip van fenotypen ruimtelijk verspreid in een individuele tumor. Gereseceerd klinische tumoren zijn een van de paar gepersonaliseerde specimens die kunnen worden verkregen bij een kankerpatiënt, en hun diagnostisch gebruik verdient toetsing.
De geschiedenis van organotypic culturen dateert uit het begin 19e eeuw, toen de menselijke intracraniële tumoren waren hand-cut in weefsel stukjes en gekweekte met behulp van de zogenaamde opknoping drop, methode. Weefsel fragmenten werden gekoppeld aan een dekglaasje aan en kunnen duik in EDTA menselijk plasma, waarna de coverslips werden omgekeerd, verzegeld en gekweekte voor verscheidene weken4. Handmatig snijden tumor stukken hebben sinds gekweekt met behulp van een verscheidenheid van andere methoden, zoals op plasma stolsels5, in vloeibare media6, of op 0,45 µm porie grootte filters6. De term "organotypic" werd voor het eerst gebruikt in 1954, in een studie over retinale differentiatie van de chick embryo oog7. Dit werd gevolgd door studies die longen en hart weefsel explantaten afgeleid van chick embryo's8en hersenen explantaten van volwassen ratten9gebruikt.
Verschillende segmenteringshulplijnen methoden zijn beschreven, namelijk handmatig choppers10,11, Krumdieck weefsel slicer12,13en vibratomes11,14,15, 16. De Krumdieck weefsel slicer genereert cilindrische weefsel kernen, die vervolgens worden gesneden in plakjes van de circulaire weefsel gebruikend microtome. Een vibratome, aan de andere kant, maakt gebruik van een vibrerende microtoom blade. In een studie over de lever segmenten, werd aangetoond dat de Leica-vibratome meer reproduceerbare en consistente segmenten in vergelijking met de Krumdieck snijmachine15 genereert. Segment diktes variërend van 250 tot 500 µm zijn opgebruikt, en studies rapporteren onderhoud van uitvoerbaarheid en morfologische kenmerken zelfs tot 16 dagen14,10,17,18. Echter tumoren variabele metabolische profielen die voedingsstof eisen kunnen beïnvloeden, en parameters zoals weefsel stijfheid en matrix samenstelling kunnen invloed hebben op beluchting en nutriënten stroom. Het is daarom waarschijnlijk dat elk weefseltype optimalisatie van snijden en cultuur voorwaarden vereist.
Verschillende cultivatiemethoden zijn gebruikt ter ondersteuning van segment culturen: ik) stationaire interfase cultuur, een afkorting voor stagnerende ondersteuning cultuur, waarin segmenten worden geplaatst op de top van een semi-poreuze membraan invoegen ondergedompeld in het kweekmedium. In deze, wordt de top van de segmenten blootgesteld aan de lucht, terwijl de onderkant wordt aangevuld met voedingsstoffen via de poreuze invoegen14,19; II) de methode Troffel, oorspronkelijk ontwikkeld om cultuur hele organen of embryonaal weefsel segmenten. In deze segmenten worden geplaatst op de top van een blad van katoen of filter ondersteund door een metalen rooster en het filter is gedrenkt in het kweekmedium. Om het weefsel vochtig, wordt een dunne laag van medium toegevoegd op de top van de segmenten20,21,22. Deze eerste twee zijn zogenaamde lucht-liquid interfase culturen; III) roller buis culturen, waarin segmenten worden geplaatst binnen de platte kant van een plastic buis met middellange en langzame buis rotatie zorgt ervoor dat het weefsel is bedekt met middellange tijdens het eerste deel van de cyclus of tijdens de tweede23 belucht; IV) roterende incubatie eenheden, die segmenten met tussenpozen worden blootgesteld aan medium met voedingsstoffen en beluchting. Anders dan roller buizen, in deze methode segmenten worden geplaatst op de top van poreuze titanium rasters in 6-Wells-platen met voedingsbodem24geplaatst.
Weefsel segmenten afgeleid van gereseceerd stevige tumors logisch aanwezig een aantrekkelijke ex vivo model waarin voor het testen van de reactie van de behandeling van anti-kanker agenten, zoals zij toestaan dat de evaluatie van levensvatbaarheid, gerichte traject activiteit, en Moleculaire profielen van een specifieke tumor in aanwezigheid van de oorspronkelijke tumor communicatie. Om te beoordelen of de reacties van de drug gemeten in tumor segmenten voorspellende van in situ reacties zijn, is het echter belangrijk om te beoordelen in welke mate weefsel segmenten tumor-specifieke biologische functies zoals celproliferatie behouden, histopathologisch onderzoek-specifieke celdifferentiatie of oncogene signalering activiteiten. De gevolgen van mechanische stress ontlokte tijdens segment voorbereiding, segment behandeling of cultuur-geïnduceerde aanpassingen voor zowel de kwaliteit en de biologische functies van weefsel segmenten zijn fundamentele vragen, strak gekoppeld aan de mogelijkheid om de tumor afkomstige segmenten voor functionele diagnostiek.
Onze consortium IMI-gefinancierd project PREDECT (http://www.predect.eu) wordt systematisch adres deze fundamentele vragen, door het bestuderen van segment explantaten uit een verscheidenheid van bronnen. Segmenten die zijn afgeleid van borst-, prostaat- en longkanker-kanker-modellen te gebruiken, deze gezamenlijke inspanning gebruikt kwalitatieve read-outs evenals kwantitatieve haematoxyline en eosine (H & E) - gebaseerd uitlezingen om aan te tonen van een vereiste voor atmosferische zuurstof en stagnerende filter steunt om te houden van de levensvatbaarheid van gekweekte segmenten tot 72 uur. Bovendien, immunohistochemistry (IHC) analyses op gekweekte segmenten geopenbaard intra-delige levensvatbaarheid verlopen, blijkt als necrose verlopen in plakjes afgeleid van lymfkliertest niet-kleincellige longkanker (NKCLK), oestrogeen receptor (ER), HIF1α en γH2AX kleurovergangen in borst kanker plakjes of androgeen receptor (AR) expressie verlopen in prostaatkanker segmenten25. Interessant, intra-delige levensvatbaarheid verlopen in 24 h culturen van lymfkliertest NKCLK werden gered door de teelt in een roterende incubatie-eenheid, en onze recente studie toonde aan dat de levensvatbaarheid werd uitgebreid tot 72 h26. Met name de bovenzijde bleef meest haalbare26, onderschrijven dat drug reactie op segmenten zijn beste analyses uitvoeren aan deze kant van het weefsel.
Ook al blijft het een vraag hoe ver weefsel segmenten in situ tumor functies kunnen recapituleren, zij zijn uitgebreid gebruikt voor het testen van de reacties op de anti-kanker agenten, met inbegrip van gerichte drugs, monoklonale antilichamen en chemotherapie agenten 10,11,13,14,18,27. We toonden onlangs dat lymfkliertest NKCLK segmenten dynamische veranderingen in proliferatie tonen en oncogene signalering activiteiten na teelt in vergelijking met vers gesneden 0 h plakjes26. Dit geeft aan dat het belangrijk is te onderzoeken of de biologische functies gericht in situ op de juiste wijze worden bewaard tijdens de teelt, vóór perturbation studies. Ondanks deze bevindingen, we toonden dat tumor segmenten model kunnen maken ruimtelijke reactie op gerichte therapieën, Midden drug behandelingen blijven korte (24u) en worden gestart bij het begin van het kweken van26. Het volgende protocol beschrijft belangrijke validatie aspecten die relevant zijn voor de totstandbrenging en de analyse van tumor segment culturen, voorafgaand aan hun toepassing in farmacologische drug testen.
Protocol
Alle muis experimenten beschreven in deze studie werden uitgevoerd door de richtlijnen van de Finse nationale bestuur van dier experimenten, en werden goedgekeurd door de experimentele dier-Comité van de Universiteit van Helsinki en de Braziliaanse provinciale Kantoor van Zuid-Finland (licentie nummer ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. de voorbereidingen voor het snijden
- De volgende materialen klaar houden: vibratome monsterhouder, vibratome buffer lade, 10 cm cultuur plaat, 24-well-plate, 10 mL Pipet, Pipetteer jongen, afval zak, 70% EtOH in een tube van 50 mL desinfecteren van de instrumenten, en weefsel lijm.
- De vibratome bereiden: veeg de Meshouder met 70% EtOH, hechten een nieuw mes, en het uitvoeren van een vibrocheck volgens de instructies in de handleiding (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
Opmerking: Het is belangrijk voor het uitvoeren van de vibrocheck stap, aangezien het minimaliseert de verticale uitwijking van het blad en zorgt voor een goede kwaliteit segmenten. - Vul elk goed van de 24-well plaat met 1 mL van Hanks evenwichtig zout oplossing (HBSS) aangevuld met 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine (HBSS + P/S); Houd de plaat op ijs.
- F12 kweekmedium aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 2 mM glutamax, 22 mM glucose en 10% foetale runderserum (FBS) voor te bereiden.
Opmerking: Tumor segment kweekmedium en groeifactor supplementen kunnen variëren naargelang de tumor weefsel25. - Het normbedrag van F12 medium voorbereiden medicamenteuze behandeling, gebruik van dezelfde samenstelling, zoals beschreven in stap 1.4, maar de FBS weglaten.
Opmerking: Aangezien groeifactoren in het serum oncogene signalering in gekweekte plakjes beïnvloeden kunnen, serumvrij medium wordt aangeraden voor korte termijn drug perturbation studies op segmenten van de tumor. Als langerlopende segment culturen worden geanalyseerd, is het belangrijk eerst het effect te beoordelen van serumvrij medium op weefsel levensvatbaarheid en tumor-specifieke marker expressie in onbehandelde segment culturen.
2. verzameling van Tumor-dragende longen
- Euthanaseren een tumor-dragende muis door cervicale dislocatie als het toont symptomen van moeizame ademhaling en verlies van lichaamsgewicht.
Opmerking: CO2-gemedieerde euthanasie is bekend voor het opwekken van hypoxische voorwaarden in de longen, die een effect op segment levensvatbaarheid of oncogene activiteiten hebben kunnen via een hypoxische reactie opwekken. - Strek de euthanized muis op een piepschuim-deksel door het invoegen van 30 G naalden in alle vier poten, zodat de borst wordt blootgesteld.
- Opengesneden de huid van de buik richting de borst, en tot de nek regio. Opengesneden de ribbenkast, waarna het middenrif, de longen en het hart bloot te stellen. Houd de schaar in een hoekpositie om weefselschade te voorkomen.
- De longen van de tumor-dragende samen met het hart te ontleden en plaats ze in een tube van 50 mL met 30 mL ijskoud HBSS + P/S; Houd de buis ijskoud en gaat u verder met de volgende stap zo snel mogelijk.
Opmerking: Vertragingen in de verwerking van longkanker tumoren kunnen wijzigen oncogene functies, bijvoorbeeld signalering traject activiteiten.
3. productie van precisie-cut Lung Tumor segmenten
- Breng de tumor-dragende longen in HBSS + P/S in een 10 cm weefselkweek plaat binnen een laminaire kap gehouden. De lobben van de longen met behulp van steriele schaar en pincet te scheiden en selecteer lobben met tumoren op het oppervlak voor het snijden.
Opmerking: Tumoren > 3 mm in grootte zijn geschikt voor het snijden. Sinds normaal longweefsel rondom de grote tumor compromissen de snijden als gevolg van verschillen in stijfheid van het weefsel, moet tumor weefsel ondergaan moten worden gescheiden uit de buurt van het normale weefsel, zodanig dat een gewiste tumor regio geconfronteerd met het blad van de vibratome. - Genereren van een platte weefsel stuk oppervlak door te snijden deel van de normale longweefsel rondom de tumor weg met een steriel scalpel en dompel de platte dia in een druppel Cyanoacrylaat lijm. Deze kant op de vibratome de monsterhouder zo monteren dat de tumor wordt geconfronteerd met het mes in een verticale positie. Laat de lijm droog is voor 2-3 min.
Opmerking: De normale longweefsel vastgelijmd aan de monsterhouder interfereert niet met tumor weefsel snijden en snijden wordt gestopt voordat het normale weefsel wordt bereikt. De tumor weefsel bochten soms als gevolg van de sponsachtige textuur van de normale longweefsel vastgelijmd aan de monsterhouder, afbreuk te doen aan haar rechtop. Als dit gebeurt, lijmt een stuk extra normale ondersteuning longweefsel naast de voorgemonteerde normaal longweefsel te behouden van de tumor in een verticale positie (figuur 1A iii). - Plaats van de monsterhouder in de metalen buffer lade en vul deze met koud HBSS + P/S totdat het weefsel wordt ondergedompeld in de buffer. Plaats van de metalen buffer-lade op de witte ijsbad en voeg ijs om het weefsel koel te houden tijdens het snijden.
- De witte ijsbad hechten aan de vibratome. Selecteer geschikte segmenteringshulplijnen instellingen: amplitude variërend tussen 2.5-2.8, snijden snelheid tussen 0.10-0.14 ms en een snijdikte variërend tussen de 160-250 µm.
Opmerking: Segmenteringshulplijnen instellingen moeten worden aangepast volgens de hardheid van het weefsel. Harde weefsel is gemakkelijker aan het segment dan zachtere weefsel en zachtere weefsels vereist snijden met lagere snelheid (0.1-0.12 ms) en hogere amplitude (2.6-2.8). Een 4-5 mm grote tumor biedt doorgaans 15 tot 20 segmenten van 200 µM dikte. Voor korte teelt, kunnen lymfkliertest tumoren worden gesneden onder semi-steriele omstandigheden buiten de laminaire kap. Klinische tumoren moeten echter altijd worden gesneden binnen een klasse II bioveiligheid laminaire kap om te voorkomen dat blootstelling aan mogelijke besmettelijke agentia in het menselijke weefsel. - Met behulp van steriele pincet, verzamelen de plakjes in 1 mL HBSS in aparte putjes van de plaat van een 24-well gehouden op ijs, nauw het bijhouden van de volgorde waarin segmenten worden gesneden. Mark van elk van de 24-well plaat volgens de proefopzet. Bijvoorbeeld, drug mark sequentiële putjes van de plaat van een 24-well als cultuur tijdstippen of 0 h, voertuig controle (C), behandelde (T) (figuur 1B ii).
Opmerking: Niet storen of de tumor weefsel te trekken terwijl het verzamelen van een segment, zoals dit van de tumor oriëntatie met betrekking tot de hoek van het blad veranderen zal, leiden tot inconsistenties in de diktes van de latere segmenten. - Wanneer alle segmenten worden verzameld, kunt u deze overbrengen naar titanium rasters (2-3 plakjes per raster) in een 6-well plaat met 2,5 mL gestolde voedingsbodem per putje geplaatst. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het raster van het titanium en het medium worden gevormd.
- Laden van een segment op het raster, de 6-well-plaat in een hoekpositie houden zodat een gedeelte van het medium heeft betrekking op de grid en plaatst u het segment in het medium op de grid; pincet gebruiken om het segment als het krullen. Laden van de 6-Wells-platen op de roterende incubatie eenheid binnen een bevochtigde incubator onderhouden bij 37 ° C met 95% lucht en 5% CO2geplaatst en begint de cyclus van de rotatie (Figuur 1 c i-ii).
Opmerking: Metallic rasters en de 6-Wells-platen moeten nauwkeurig gewicht evenwichtig voordat ik overga op de roterende eenheid. Het is belangrijk om de positie van de segmenten in het midden van het raster zodat ze volledig afwisselend de lucht en vloeibare fasen tijdens de rotatie cycli. Segmenten die zijn geplaatst te laag of hoog zijn niet op de juiste wijze blootgesteld aan zuurstof of voedingsstoffen (Figuur 1 c ik), die kunnen levensvatbaarheid van weefsel. Het is belangrijk dat u de positie van het segment op de grid tijdens de teelt, zoals het segment kan af en toe naar beneden schuiven. Als dit binnen 1-2 uur voor aanvang van de cultuur gebeurt, corrigeren van haar positie en noteer dat dit voorbeeld kan worden beschadigd. Segmenten die zijn mispositioned voor een langere periode moeten worden afgevoerd, zoals weefsel levensvatbaarheid wordt sterk beïnvloed door onjuiste oxygenatie en voedingsstoffen levering.
- Laden van een segment op het raster, de 6-well-plaat in een hoekpositie houden zodat een gedeelte van het medium heeft betrekking op de grid en plaatst u het segment in het medium op de grid; pincet gebruiken om het segment als het krullen. Laden van de 6-Wells-platen op de roterende incubatie eenheid binnen een bevochtigde incubator onderhouden bij 37 ° C met 95% lucht en 5% CO2geplaatst en begint de cyclus van de rotatie (Figuur 1 c i-ii).
- Het verzamelen van een weefsel segment grenzend aan de gekweekte segmenten als een 0 h, onbeschaafd, verwijzing. Het verzamelen van ten minste drie referentie segmenten te vertegenwoordigen de boven-, Midden- en centrum van het weefsel wordt gesneden. Monteren de 0 h segmenten onmiddellijk en proces zoals beschreven in punt 5.1.
Opmerking: Als het aantal segmenten beperkt is, bijvoorbeeldals meerdere samengestelde behandelingen of technische replicatieonderzoeken worden gedaan, vergelijkingen van elk behandelde monster met de naburige 0 h-monster moeilijk kunnen zijn. Gebruik in dergelijke gevallen de dichtstbijzijnde 0 h-segment (minimaal 400-600 µm uit elkaar) te beoordelen van de levensvatbaarheid van de relatieve weefsel of expressie van relevante markers bij aanvang van de cultuur. - Voor langdurige teelt, vullen het kweekmedium elke dag. Opheffing van het raster met de weefsel segmenten met behulp van steriele pincet, en breng dit in een leeg putje van de plaat 6-well; 70% van het medium vervangen door verse kweekmedium, en plaats het rooster terug in het medium. De rotatie-cyclus blijven zoals beschreven in stap 3.6.
4. behandeling van Tumor segmenten met klein molecuul remmers
- De vereiste concentraties van stoffen in het behandelingsmedium voor te bereiden. Meestal is een 10-fold hogere drug concentratie ten opzichte van de IC50s gemeten in celculturen vereist te bereiken doel remming in weefsel plakjes. Test om te voorkomen van aspecifieke cytotoxiciteit, een aantal uiteenlopende concentraties te verkrijgen van de minimaal effectieve concentratie voor elke verbinding. Hier, we getest 0.1 – 1 µM van de PI3K/mTOR remmer dactolisib en 0,05-0,5 µM van de MEK-remmer selumetinib op lymfkliertest NKCLK segmenten.
- Voeg 2,5 mL van media met de verdunde drug of DMSO of ander voertuig besturingselement in de 6-well-plaat. Plaats de rasters van titanium in de putjes.
- Plaats de plakjes weefsel op de rasters als beschreven in stap 3.6.
- Voertuig of drug behandelingen voor 24 h. doorgaan met weefsel fixatie en verwerking van de segmenten in paraffineblokken zoals beschreven in sectie 5 uitvoeren.
Opmerking: De duur van de medicamenteuze behandeling kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van de doelstelling van het experiment, rekening houdend met de mogelijkheid van weefsel segmenten te behouden in situ weefsel functies geanalyseerd tijdens de periode van de cultuur.
5. vastlegging en verwerking van de plakjes weefsel
- Trek voorzichtig de onbeschaafd 0 h verwijzing of gekweekte segment op een filtreerpapier gedrenkt in PBS.
- Om dit te doen, voeg 2-3 mL PBS in een bord van 10 cm, laat de segment-float in PBS en 'vis' het uit door het opheffen van het segment op het filtreerpapier met een paar pincet.
- Breng het filtreerpapier in een histocassette en voeg een druppel verdunde Haematoxyline (1:1 in gedeïoniseerd water) op de top van het weefsel segment naar de positie van het segment zichtbaar te markeren tijdens de verdere verwerking stappen (Figuur 1 d).
- Sluit de cassette, en breng dit in 4% neutraal gebufferde formaline-oplossing. Repareren de weefsels 's nachts bij 4 ° C.
Nota: Terwijl de plaatsing van het segment op de top van het koffiefilter, zorg ervoor dat het bovenste gedeelte van het segment naar boven zijn gericht; Dit is nodig om het volgen van de boven-, Midden- en onderste gedeelte van een segment tijdens segmenteren en analyse zoals beschreven in stap 6.3.
- De volgende dag, breng de cassettes in 70% EtOH, en meteen doorgaan met de stap weefsel paraffine-insluiting.
- Wassen vóór verwerking van weefsel, de histocasettes in 100% EtOH 2 x voor elke 10 min. In dit geval, gebruik een magnetron-station voor verwerking van het weefsel. Selecteer het programma gebruikt voor 1 mmdikte weefsel en volg de instructies in de handleiding (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
Opmerking: Bij gebruik van ander weefsel verwerking van machines, geschikt voor dun weefselsteekproeven programma gebruiken. - Voor het insluiten van paraffine, open een histocassette en met een scalpel Trek voorzichtig het segment van het koffiefilter. Negeren het koffiefilter, en breng het segment in een mal met vloeibare paraffine.
- Druk op het weefsel tegen de onderkant van de insluiten schimmel, bijvoorbeeld met een platte gewicht, om ervoor te zorgen zelfs segmenteren. Plaats het onderste gedeelte van de histocasette op de top van de schimmel, laat het afkoelen van de schimmel op een koude pate voor 30 min en scheiden van de mal van het blok paraffine.
Opmerking: Als alternatief voor het insluiten van horizontale, men kan insluiten van het segment van de tumor verticaal door de positionering van het segment in een verticale positie. Verticale delen toestaan gemakkelijk analyse van verlopen levensvatbaarheid of functionele marker expressie op een enkele sectie 25. Kleurovergang analyse met horizontaal-ingebedde segmenten vereist paraffine afdelen zoals beschreven in stap 6.2.
- Druk op het weefsel tegen de onderkant van de insluiten schimmel, bijvoorbeeld met een platte gewicht, om ervoor te zorgen zelfs segmenteren. Plaats het onderste gedeelte van de histocasette op de top van de schimmel, laat het afkoelen van de schimmel op een koude pate voor 30 min en scheiden van de mal van het blok paraffine.
6. verwerking en analyse van formaline-vaste en paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels
- 4 µm dunne secties van het FFPE weefsel segment blokken gebruikend microtome voor te bereiden. Bij het segmenteren, de hoek van het blok zodanig aanpassen dat het oppervlak van het blok horizontaal georiënteerd met betrekking tot het blad is; Dit is nodig om het verkrijgen van zelfs secties in het weefsel.
- Opdat vangst van een potentiële cultuur-geïnduceerde levensvatbaarheid verloop, cel migratie over de segmenten, of verlopen in biomerker expressie in gekweekte segmenten, verzamelen secties uit de boven-, Midden en lagen van elk van het weefsel segment op object dia 's zoals hierna wordt uiteengezet.
- Sequentiële weefselsecties van het segment van paraffine-ingebedde weefsel eerst verzamelen op het bovenste gedeelte van de dia's van glas. Blijven het verzamelen van de secties van de diepere lagen van weefsel in het midden, gevolgd door de onderste gedeelte van het glas dia's (figuur 1E).
Opmerking: Om drie secties op een glasplaatje, trim weg het overschot van paraffine rondom het ingesloten weefsel segment. - Toestaan de secties te droge overnachting bij 37 ° C, en ga verder met H & E kleuring of immunohistochemistry, zoals hieronder beschreven.
Opmerking: Verlies van antigenicity kan optreden wanneer FFPE secties zijn opgeslagen bij hoge temperaturen of voor langere tijd. Paraffine secties worden aanbevolen bij 4 ° C worden opgeslagen en IHC analyses moeten worden verricht binnen 6 maanden na het segmenteren.- Voor de H & E kleuring, deparaffinize en hydrateren de paraffine secties als volgt: xyleen 3 x voor 5 min, 100% EtOH 3 x voor 1 min, 96% EtOH 2 x voor 1 min, 70% EtOH 1 x 1min en gedeïoniseerd water 2 x voor 1 min.
- Incubeer de secties in vers gefilterde Haematoxyline oplossing voor 10 min en wassen onder stromend leidingwater voor 5 min. Dip de secties in zure alcohol (1% HCl in 70% EtOH) voor 2 keer, en wassen onder stromend leidingwater voor 5 min gevolgd door incubatie met 0,5% eosine 2 m in.
- Na de eosine stap, de secties uitdrogen door de dia's in alcohol en xyleen oplossingen, als volgt onder te dompelen: 96% EtOH 2 x voor 15 s, 100% EtOH 3 x voor 30 s, xyleen 3 x voor 1 min. Tot slot, de secties in een medium xyleen gebaseerde montage insluiten.
7. analyse van weefsel levensvatbaarheid en Biomarker expressie
- Hoge resolutiebeelden te verwerven door het genereren van de hele dia scans van H & E gebeitste dia's met behulp van een scanner. Om te beoordelen weefsel levensvatbaarheid, momentopnamen van de scans van de weefsel vertegenwoordigen de secties van het boven-, Midden- en onderkant van de segmenten.
- Met behulp van manipulator fotosoftware, handmatig tekenen maskers op de necrotische gebieden van de weefsels, gevolgd door kwantificering van necrotisch regio's met behulp van MATLAB.
- Bereken de relatieve levensvatbaarheid van de segmenten gekweekt voor verschillende tijdstippen, ten opzichte van de dichtstbijzijnde 0 h-segment zoals gedaan in onze eerdere studie (Närhi et al., Figuur S2B en C)26. Op dezelfde manier beoordelen potentiële intra-delige levensvatbaarheid verlopen door het kwantificeren van de levensvatbaarheid in de sectie van het boven-, Midden- en onderkant van een gekweekte segment en de relatieve levensvatbaarheid van elke sectie aan het bijbehorende segment 0 h dichtst te berekenen.
Opmerking: Hoewel de zuivere teelt van lymfkliertest NKCLK segmenten necrotische celdood induceert, biologische reacties op ex vivo kweekomstandigheden variëren, afhankelijk van de tumor weefsel. Bijvoorbeeld, werden verlopen in macrofagen gekenmerkt door F4/80, HIF1α en ER ontdekt in de filter-ondersteunde segment culturen afgeleid van een borst kanker model25. H & E - evenals IHC gebaseerde analyses van gekweekte segmenten moeten worden overwogen voor elk weefseltype.
- IHC op de paraffine secties uitvoeren. Het volgende IHC-protocol is een uitgangspunt, en vereist verdere optimalisatie voor andere antilichamen. Kort, deparaffinize en hydrateren de paraffine secties als volgt: xyleen 3 x voor 5 min, 100% EtOH 3 x voor 1 min, 96% EtOH 2 x voor 1 min, 70% EtoH 1 x voor 1 min en gedeïoniseerd water 2 x voor 1 min.
- Blootstellen van de antigene epitopes, warmte-gemedieerde antigeen ophalen met behulp van 10 mM citroenzuur met een pH van 6 in een module van PT, uit te voeren gevolgd door blokkeren met 1% boviene serumalbumine (BSA) en 10% normale geit Serum (NGS) in 1 x PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (21-23 ° C).
- Incubeer het primaire antilichaam in 1% BSA en 5% verdunde NGS in 1 x PBS, hetzij gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur. Incubeer met anti-konijn secundair antilichaam, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door detectie met behulp van 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB).
- Secties zijn counterstained met haematoxyline (verdund tot 1:10 in gedeïoniseerd water) voor 30 s, en wassen onder de kraan water gedurende 5 minuten, gevolgd door uitdroging door het onderdompelen van de dia's in alcohol en xyleen oplossingen, als volgt: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, xyleen 3 x ( 1 min elke stap). Tot slot, de secties in een medium xyleen gebaseerde montage insluiten.
- Verwerven van de hele dia scans van IHC gebeitste dia's exporteren als TIFF-afbeeldingen op een vergroting verhouding van 1:4 met behulp van de met behulp van een afbeeldingsviewer en de ondermeer met behulp van ImageJ uitvoeren.
Opmerking: als een alternatief voor de scanner, microscopische beelden op 20 X of 40 X vergroting kunnen worden verworven voor ondermeer. Vergroting van de afbeelding kan worden gekozen afhankelijk van de markering moeten worden gekwantificeerd; hoge vergroting beelden worden aanbevolen voor nucleaire kleuring, terwijl cytoplasmatische of membraan markeringen kunnen worden gekwantificeerd aan de hand van 20 X beelden.- Voor de kwantificering van nucleaire markers, in dit geval NKX2-1 expressie, elke afbeelding converteren naar 16-bits afbeeldingen met behulp van Fiji-ImageJ en uploaden van afbeeldingen voor beeldanalyse.
- Aanpassen van de afbeelding analyse pijpleiding afhankelijk van de analyse. In dit protocol, gebruiken de volgende pijpleiding voor de kwantificering van de positieve kernen NKX2-1: identificeren primaire objecten | Meten van de intensiteit van het Object | Objecten filteren (minimale waarde = 0.0025) | Berekenen van Math De resultaten worden weergegeven als percentages van DAB gebeitste kernen van het totale aantal kernen.
Representative Results
Figuur 1 geeft de workflow voor de generatie, de teelt en de analyse van precisie-cut weefsel segmenten afgeleid van lymfkliertest NKCLK tumoren. Voor deze demonstratie vormt en we ingenomen zijn tumoren uit een genetisch gemanipuleerde muismodel (GEMM) herbergen voorwaardelijke activering van KrasG12D samen met het verlies van Lkb1 (ook bekend als Serine/Threonine Kinase 11), hierna te noemen KL. Muis fok- en longkanker tumor inleiding werd uitgevoerd zoals beschreven in26,28. Figuur 2A toont het effect van weefsel segment dikte op de levensvatbaarheid van segmenten gekweekte gedurende 24 uur met behulp van een roterende incubatie-eenheid. Uit de resultaten blijkt dat 160 µm dunne plakjes grote necrotische gebieden in het segment bevatten. Bovendien, tonen 250 µm dunne plakjes een necrose gradiënt over het segment ten opzichte van 200 µm dunne plakjes. Het is waarschijnlijk dat de slechte algehele levensvatbaarheid van de dunste 160 µm wordt veroorzaakt door technische behandeling tijdens de positionering van de segmenten op de top van de rasters, zoals deze kwetsbaar zijn en hebben de neiging te krullen. Aan de andere kant, wanneer segmenten te dik zijn zijn, dat kunnen ze naar voren gebogen aan tekortkomingen in zuurstof of voedingsstoffen verspreiding over de segmenten, die in lymfkliertest NKCLK explants blijkt als necrotic dood kleurovergang25. Echter moet worden opgemerkt dat segmenten met variabele dikte kunnen worden gegenereerd vanuit één tumor, ondanks gebruik van identieke vibratome instellingen. Het wordt daarom aanbevolen om meerdere replicatieonderzoeken uit verschillende tumor monsters analyseren. Bovenal vereist elke weefseltype segment dikte optimalisatie te bereiken maximale levensvatbaarheid, zoals de textuur van het weefsel en de hardheid oxygenatie en nutriënten stroom beïnvloeden kunnen. Figuur 2B -2C illustreert kwantitatieve analyses van de IHC van NKX2-1 expressie, een marker van Long goed gedifferentieerd adenocarcinoom (AC) in monsters verbouwd tot 72 h en gematched 0 h segmenten. Resultaten tonen aan dat NKX2-1 expressie niet aanzienlijk wordt gewijzigd in gekweekte plakjes in vergelijking tot 0 h onbeschaafd segmenten, suggereren dat het proces van de teelt niet openlijk de status van de differentiatie van AC tumor weefsel aantast. Figuur 2D toont het nut van tumor weefsel segmenten voor de beoordeling van de doeltreffendheid van gerichte drugs. We onlangs bleek dat Kras mutant lymfkliertest ACs tentoonstelling hoge uitdrukking van gefosforyleerd ERK1/2 (markering verhoogde MAPK traject activiteit) in vergelijking met adenosquamous (ASC) tumoren, terwijl uitdrukking van gefosforyleerd 4EBP1 (markering mTOR activiteit ) wordt eveneens uitgedrukt in zowel AC en ASC tumoren. Om te testen of deze trajecten kunnen effectief worden gericht op weefsel segmenten, KL AC weefsel segmenten werden behandeld met DMSO of getitreerd bedragen van verbindingen, namelijk 0.1 – 1 µM dactolisib richten op het mTOR traject of 0,05-0,5 µM selumetinib te richten op de MAPK-pathway. Resultaten tonen aan dat 1 µM dactolisib of 0,5 µM van selumetinib zijn effectief in het remmen van de fosforylatie van 4EBP1 of ERK1/2, respectievelijk. Dosis-afhankelijke remming van de gerichte phosphoproteins geeft bovendien aan dat weefsel segmenten ook kunnen worden gebruikt voor het valideren van fosforylering-specifieke antilichamen.
Figuur 1: schematische weergave van de workflow voor de vaststelling en analyse van lymfkliertest NKCLK tumor verkregen slice explantaten. (A) schematische beschrijving van de collectie en de voorbereiding van tumor-dragende longen voor het snijden. Long lobben zijn geoogst van een muis en tumor weefsel is ontleed weg van normale weefsel. De zwarte pijlpunt en asterisk geven aan ongeveer 4 mm en 1 mm tumoren, respectievelijk. De witte pijlpunt geeft longweefsel vastgelijmd aan het oppervlak van de monsterhouder. De rode pijl wijst op een extra stuk van normaal longweefsel steun te behouden van de tumor in een verticale positie. (B) Vibratome snijden en verzameling van weefsel segmenten. Witte pijl geeft de richting van het snijden. Verzameling van opeenvolgende segmenten in een 24-well plaat met koude HBSS + P/S. De segmenten kunnen ofwel worden gekweekt voor verschillende tijdstippen (hier, 24-72 uur) te beoordelen van tumor-specifieke marker meningsuiting tijdens de teelt (bovenste rij), of kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van de drug behandelingen. C: voertuig controle, T: medicamenteuze behandeling. (C) het weefsel segment voor teelt met behulp van roterende incubatie eenheden plaatsen. Kantelen van de 6-well plaat, zodanig dat de bovenkant van het raster wordt bedekt door een medium, plaats het weefsel segment in het midden van het raster op de top van het medium en verspreid het segment met pincet. Ervoor zorgen dat de 6-Wells-platen gewicht uitgebalanceerd voor een soepele rotatie-cyclus. X: geeft onjuiste, en 
: geeft aan juiste positionering van het segment. (D) foto van het blok van de FFPE van een segment van de tumor. Zwarte pijl wijst op paraffine-ingebedde weefsel segment gekleurd met haematoxyline. (E) schema toont de vectorafbeeldingsbestanden volgorde van de plakjes in FFPE blokken; deze secties kunnen worden verwerkt om weefsel levensvatbaarheid en tumor-specifieke biomerker expressie te beoordelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beoordeling van de levensvatbaarheid en histotype-specifieke marker expressie en gerichte medicamenteuze behandeling op NKCLK weefsel segmenten. (A) vertegenwoordiger H & E beelden van AC NKCLK segmenten van de aangegeven diktes gekweekt voor 24 h. 200 µm dunne plakjes handhaven beter levensvatbaarheid in vergelijking met 160 µm of 250 µm dunne plakjes. Donkerblauw geeft H & E levensvatbare weefsel gekleurd en roze geeft pseudocolored necrotische regio's. Licht blauwe geeft aan regio's die zijn uitgesloten van de analyse, hetzij als gevolg van slechte weefsel kwaliteit of aanwezigheid van vezelig stroma. T1 en T2 vertegenwoordigen biologische replicatieonderzoeken afgeleid van twee verschillende tumoren. Schaal bar = 500 µm. (B) vertegenwoordiger IHC beelden van NKX2-1 expressie in AC plakjes gekweekt voor de aangegeven tijdstippen. Pijl geeft aan dat de ruimte die zijn genoemd in hogere vergroting. Resultaten tonen aan dat NKX2-1 expressie wordt niet gewijzigd in de gekweekte plakjes t.o.v. 0 h segmenten. Schaal bar = 500 µm en 50 µm voor lage en hoge vergrotingen, respectievelijk. (C) kwantificering van de gegevens in (B) worden weergegeven. (D) vertegenwoordiger IHC beelden van gefosforyleerd 4EBP1 of pERK1/2 expressie in 0 h segmenten, of segmenten behandeld met DMSO getitreerd bedragen van dactolisib (dact, bovenste rij) of pERK1/2 expressie in 0 h, of segmenten die zijn behandeld met DMSO phosphorylated of selumetinib (sel, onderste rij). Zwarte vierkante vakken geven aan gebieden in hogere vergroting weergegeven. Schaal bar = 1 mm of 50 µm voor lage of hoge vergroting, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Verschillende complexe in vitro tumor modellen, waaronder 3D culturen en organoids, zijn ontwikkeld om te recapituleren, de architectuur en oncogene functies van in vivo tumor weefsel29,30. Echter, de totstandbrenging van 3D culturen of organoids inhoudt weefsel dissociatie en selectieve groei van een eencellige type of co cultuur van een select aantal celtypes in een kunstmatige omgeving. Dientengevolge, vangen dergelijke modellen onvolledig de fijne kneepjes van tumor heterogeniteit en tumor-stroma interacties. Organotypic tumor segmenten, aan de andere kant, handhaven de weefsel architectuur en biologische complexiteit van de in situ tumor, zonder uitgebreide manipulatie. Dit vermogen van weefsel segmenten model tumorcellen in hun eigen communicatie maakt hen bijzonder aantrekkelijk voor preklinische studies. We eerder gemeld een geoptimaliseerde workflow voor de vaststelling en analyse van precisie-cut tumor segmenten, en toonde aan dat, in vergelijking met filter ondersteunt, een roterende incubatie-eenheid verbetering van de levensvatbaarheid van korte termijn lymfkliertest NKCLK segment culturen25 , 31. echter, teelt op roterende eenheden is technisch uitdagende en vereist een voortdurende controle. Wij presenteren hier een protocol voor tumor weefsel segment generatie en praktische gebruik van een roterende incubatie eenheid tot cultuur hen, evenals begeleidende methoden voor het controleren van de mogelijkheid van segmenten te vangen in situ tumor biologie, een voorwaarde voorafgaand aan drugs reactie testen.
Verschillende kritische stappen in het protocol garanderen van weefsel integriteit en levensvatbaarheid van de segmenten van de tumor. Als normale longweefsel de tumor omringt, kan de vibratome genereren segmenten met inconsistente dikte of schade van de segmenten, als gevolg van verschillen in textuur en stijfheid tussen normaal en tumor weefsels. Het is dus belangrijk om te verwijderen van het omliggende normale longweefsel vóór de tumor snijden. Een andere belangrijke stap is het snijden dikte, en die zorgvuldig moet worden geoptimaliseerd voor elk weefseltype. Bovendien, zodra gesneden, is het essentieel dat het segment ongeveer in het midden van het raster ligt, om zo ervoor te zorgen nauwkeurige intermitterende dompelen in cultuurmedium en zuurstof blootstelling. Tenslotte is het belangrijk dat u de positie van een segment volgt tijdens de geldigheidsduur van de rotatie, als een segment kan drop down in aan het medium; Als dit gebeurt, kunnen verdere acties worden ondernomen zoals beschreven in stap 3.6 van het protocol.
Naast weefsel die verwerken te verzekeren van de integriteit, zijn er ook kritische stappen in de analyse van de IHC te interpreteren hoe het segment lijkt op het oorspronkelijke weefsel. Onze vorige studie toonde aan dat lymfkliertest NKCLK tumoren tot ruimtelijke heterogeniteit uitgesproken intra-tumor in oncogene signalering activiteiten26 vertonen. Dit betekent dat het gebruik van ruimtelijk gescheiden weefsel voor besturingselementen segmenten of drug-behandelde monsters kunnen invloed hebben op betrouwbare experimentele data interpretatie, en vandaar nauw aangrenzende segmenten moeten worden gebruikt als besturingselementen en proefmonsters. We toonden dat verder terwijl proliferatie of oncogene phosphoprotein expressie in vers gesneden onbeschaafd 0 h plakjes waren vergelijkbaar met in situ tumoren, gekweekte segmenten toonde veranderde oncogene phosphoprotein expressie, specifiek veranderde p4EBP1 en pSRC, evenals gewijzigde proliferatie geanalyseerd door Ki67 IHC. Gewijzigde p4EBP1 expressie is ook aangetroffen in 24 h menselijke NKCLK en prostaatkanker slice culturen (Narhi et al.., aanvullende figuur S3B-S3C, S5 en S7)26. Deze bevindingen onderschrijven dat vergelijking van gekweekte segmenten met hun dichtstbijzijnde 0 h onbeschaafd segment cruciaal is voor het behoud van in situ tumor functies in gekweekte plakjes beoordelen.
Ondanks de verbetering van de levensvatbaarheid van organotypic plakjes25, zijn er beperkingen met de rotator-systeem in termen van technische details. Plaatsen van de plakjes weefsel op titanium rasters is moeilijker in vergelijking met filteren inzetstukken en een roterende incubatie-eenheid mogelijk niet beschikbaar. Als alternatief, stagnerende filter ondersteunt kunnen worden gebruikt, maar in dat geval alleen de lucht-blootgesteld kant van de segmenten moet worden geanalyseerd, zoals lucht-naar-filter verlopen in de levensvatbaarheid en hypoxie gemeten door HIF1α expressie worden snel gevormd in filter-ondersteunde segment culturen (Davies et al.., figuur 5 en figuur 7A-7B)25. We hebben verder aangetoond dat de tumor segment culturen vertonen kunnen veranderde proliferatie en oncogene signalering activiteiten ten opzichte van hun inheemse tumoren26, mogelijk vanwege de wondgenezing reacties of metabole aanpassing van de segmenten ex vivo 32cultuur. Hoewel bruto morfologische kenmerken van de lymfkliertest NKCLK tumoren werden onderhouden tijdens 72 h teelt, kan cultuur-geïnduceerde proliferatieve wijzigingen nauwkeurige sortering van de gecultiveerde segmenten. Dus, weefsel segmenten moeten alleen worden gebruikt voor korte termijn functionele studies.
Gebruik van een roterende incubatie-eenheid redt op zijn minst gedeeltelijk intra-delige levensvatbaarheid of biomerker expressie verlopen, met name tijdens de eerste 24 h van cultuur. Eenmaal gevalideerd voor integriteit en functie, biedt dit weefsel materiaal voor functionele studies, zoals drug behandeling studies. Naast de reactie drugsprofielen, kan gewijzigde doelwit expressie na medicamenteuze behandeling ook profiteren van antilichaam validatie. Dit is vooral relevant voor de detectie van lymfkliertest epitopen met muis monoklonale antilichamen, omdat deze de neiging om hoge kleuring achtergrond geven. Bovendien, zijn goed gevalideerde antilichamen noodzakelijk om betrouwbare en reproduceerbare gegevens in diagnostische en klinische instellingen. Modulatie van de overvloed of fosforylatie van relevante epitopes na medicamenteuze behandeling in weefsels plakjes biedt dus een handige praktische toepassing in antilichaam validatie. Een groot voordeel van tumor segment culturen is de mogelijkheid om model ruimtelijk-verdeelde functies, met inbegrip van oncogene signalering activiteiten of drug reactie in de tumor of stromale cellen, waardoor ze een aantrekkelijke ex vivo -model. Echter segmenten draaien tijdens de teelt, en het proces van de teelt kan verdere schade aan het weefsel met name aan de randen. Het is daarom uitdagend op juist overlay de biomerker gebeitste IHC beelden van 0 h segmenten met de necrotische regio's ontdekt in gekweekte plakjes, die de mogelijkheid maken juist ruimtelijke biomerker activiteiten naar een reactie van de drug in het gedrang brengt. Daarnaast, zijn tumor-intrinsieke-, cultuur-geïnduceerde en drug-geïnduceerde necrotische reacties niet te onderscheiden ten minste in lymfkliertest NKCLK weefsel segmenten, nauwkeurige kwantificatie van ruimtelijke drug reacties in gevaar te brengen. Tot slot, het gebruik van tumor segment culturen toelaat een onderzoeker aan de test meerdere verbindingen op de dezelfde tumor, zonder de noodzaak voor de behandeling van dieren, dus verfijnen, verminderen en experimenten met proefdieren vervangen.
Als een toekomstige toepassing, kan het protocol beschreven klinische solide tumor monsters worden vastgesteld. Verder zijn leveringsoptimalisatie of weefsel type-afhankelijke wijzigingen waarschijnlijk nodig, beginnend met de aanpassingen aan de instellingen van de vibratome met inbegrip van segment dikte en trillingen snelheid optimaliseren deze voor tumor textuur of stijfheid. Daarnaast kan nutriënt en groeifactor eis variëren voor verschillende tumor weefsels. Als voorbeeld hebben borst kanker segmenten zijn gekweekt met insuline aangevuld in de middelgrote13,-18. Gezien het feit dat beperkte weefsel materiaal wordt verkregen tijdens chirurgie of biopsie, kan optimalisatie van patiënt-afgeleide tumor segment culturen lastig zijn als gevolg van moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende aantallen monsters. Bovendien, reproduceerbaarheid van de gegevens is ook uitgedaagd door uitgesproken patiënt-te-patiënt voorbeeld heterogeniteit, met name in het percentage van tumorcellen versus fibrotische regio's of stromale infiltreert, alsmede onderdelen van necrotisch weefsel. Ten slotte zou de toepassing van tumor segmenten in Diagnostische instellingen onderzoek van de omvang aan welke drug reacties in segment explantaten voor de voorbehandeling biopsieën wedstrijden aan nabehandeling in vivo reacties vereisen.
Disclosures
Auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit onderzoek werk ontvangen financiële steun van innovatieve geneesmiddelen gemeenschappelijke onderneming voor het initiatief verlenen overeenkomst no 115188, de Universiteit van Helsinki Doctoral programma biogeneeskunde beurzen (A.S.N.) en de Sigrid Juselius en Orion-Farmos stichtingen (E.W.V.). Wij bedanken onze PREDECT weefsel segment platform Consortiumleden (Taija af Hällström en Siv Knaappila voor steun bij het opzetten van de rotator-systeem en Riku Turkki voor ondersteuning bij de MATLAB-analyse. Jouko Siro is bedankte voor het vastleggen van de foto's van figuur 1. Wij danken het team FIMM WebMicroscope voor het scannen van de histologische dia's, en ondersteuning van het laboratorium dier centrum voor veeteelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
| Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
| Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
| Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
| Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
| Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
| 10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
| Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
| 50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
| PBS | Lonza | BE17-517Q | |
| Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
| Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
| Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
| KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
| Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
| Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
| Citric acid | Sigma | C1909 | |
| PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
| Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
| Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
| Eosin | Sigma | E4382 | |
| NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
| pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
| p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
| BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
| Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
| DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
| Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
| Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
| Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
| MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
| Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
| Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
| CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |
References
- Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution. Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).
- Travis, W. D., et al. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).
- Wright, J. C., et al. Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer. Cancer. 15, 284-293 (1962).
- Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. Studies on the organ culture of human tumors. Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).
- Reinbold, R. [Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).
- Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. [Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects]. Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).
- Bousquet, J., Meunier, J. M. [Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Estes, J. M., et al. Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model. Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).
- Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).
- Jaamaa, S., et al. DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue. Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).
- Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue. Current protocols in neuroscience. , Chapter 6 Unit 6.11 (2001).
- Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture. Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells International. , 959807 (2015).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement. Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).
- Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices. Scientific Reports. 5, 17187 (2015).
- Narhi, K., et al. Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours. The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Nagaraj, A. S., et al. Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1. Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).
- Hoogt, R., et al. Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project. Scientific Data. 4, 170170 (2017).
- Davidson, S. M., et al. Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer. Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).
