Summary
אנו מספקים שיטה הדור, ניתוח שיטתי של פרוסות organotypic נגזר גידולים ריאות מאתר וטיפוח. אנו מתארים גם מיטוב עבור עובי הפרוסה, וכיצד לבחור ריכוזי התרופה לטיפול הגידול פרוסות.
Abstract
Organotypic ראשי explant בתרביות, הכוללים דיוק-לחתוך פרוסות, מייצגים הארכיטקטורה רקמות תלת-ממדי (3-D), כמו גם את האינטראקציות multicellular של רקמה מקורית. פרוסות רקמות לחתוך מיד מ גידולים resected טרי לשמר היבטים מרחביים של הטרוגניות intratumor, ובכך הופך אותם שימושי המחליפים של הביולוגיה ויוו . זהירות אופטימיזציה של הכנה פרוסה רקמות ותנאי הטיפוח-תרגול הוא היסוד עבור אבחון הפוטנציאל חזוי של הגידול פרוסה explants. בהקשר זה, מודלים מאתר הם בעלי ערך, כמו אלה לספק זרם עקבי של הגידול חומר כדי לבצע שכפול וניסויים לשחזור. פרוטוקול זה מתאר את culturing הפרוסות נגזר הגידול רקמת הריאה מאתר באמצעות יחידת הדגירה מסתובב, מערכת המאפשרת חשיפה לסירוגין של רקמות חמצן וחומרים מזינים. העבודות הקודמות שלנו הראו כי השימוש של סיבוב הדגירה יחידות משפר את הכדאיות של רקמות לעומת שיטות אחרות תרבות, במיוחד צף פרוסות ותומך מסנן קיפאון. . הנה, אנחנו עוד יותר מראים עובי הפרוסה משפיע על הכדאיות של פרוסות בתרבית, רומז שאופטימיזציה של עובי הפרוסה צריך להיעשות עבור סוגי רקמות שונות. מבוטא ITH בפונקציות oncogenic הרלוונטיים, כגון איתות פעילויות, תאי סטרומה חדירה או ביטוי של בידול סמנים, מחייבת הערכה של רקמות סמוך פרוסות עבור הביטוי של סמני ששונו כתוצאה הטיפול בתרופה או טיפוח עצמה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את הדור של הריאה מאתר הגידול פרוסות ותרבותם על יחידת הדגירה מסתובב ומדגים כמה פרוסות צריך להיות באופן שיטתי מנותח עבור הביטוי של סמנים רקמות הטרוגנית, כתנאי לפני הסמים התגובה מחקרים.
Introduction
רקמות גידולים מוצקים, כולל סרטן ריאות, התערוכה הטרוגניות גנטית ו פנוטיפי, הנמל מורכבים microenvironments1,2. יחסי הגומלין בין תאים סרטניים והשפעתם microenvironment שמסביב על סמים רגישות והתנגדות מנגנונים3. זה מדגיש את הצורך במודלים פרה זה יכול באופן מדויק המורכבות הביולוגית ופונקציות מתנהג גידולים מקומיים. דיוק-לחתוך פרוסות מיד נגזר גידולים טריים לספק משאב ייחודי, כפי שיש להם קיבולת העיקרי כדי לייצג ויוו ביולוגיה, לפחות עבור חלון קצרה של זמן, כולל פנוטיפים במרחב מופץ בגידול בודדים. גידולים קלינית resected הן אחת מהדוגמאות אישית כמה זה ניתן להשיג חולת סרטן, שימושם אבחון ראוי לביקורת.
ההיסטוריה של organotypic תרבויות שתחילתה במאהה 19 מוקדם, כאשר גידולים תוך-גולגולתי האנושי היו יד-לחתוך לחתיכות רקמות, בתרבית באמצעות מה שמכונה תלוי בשיטה טיפה. שברי רקמת המצורפת coverslip, מותר לטבול לתוך heparinized לפלסמה אנושית, לאחר מכן coverslips היו הפוכים, אטום ותרבותית במשך שבועות מספר4. חותכים ידנית גידול חלקים מאז היו בתרבית תוך שימוש במגוון שיטות אחרות, כגון פלזמה קרישי5, נוזל מדיית6, או ב- 0.45 מיקרומטר הנקבוביות מסננים גודל6. המונח "organotypic" שימש לראשונה בשנת 1954, במסגרת מחקר על בידול ברשתית של העין העובר7צ'יק. זאת בעקבות מחקרים שהשתמשו explants רקמת הריאה והלב נגזר צ'יק עוברי8ו explants במוח חולדות למבוגרים9.
שיטות שונות עם פרוסות היו מסוקי המתואר, כלומר ידני10,11,12,מבצעה רקמת Krumdieck13ו14,11,vibratomes15, 16. בפורס רקמת Krumdieck מייצר גלילי רקמה ליבות, אשר הם מכן חתוכים לפרוסות רקמות מעגלית באמצעות מיקרוטום. Vibratome, מצד שני, משתמשת מיקרוטום רוטטת של להב. במחקר על פרוסות כבד, זה הוצג vibratome לייקה מפיקה פרוסות לשחזור ועקבית יותר לעומת ה מבצעה Krumdieck15. עוביים פרוסה ועד 250 מיקרומטר 500 שימשו ולאחר מחקרים דווח תחזוקה של הכדאיות ותכונות מורפולוגיות אפילו עד 16 ימים14,10,17,18. עם זאת, גידולים יש פרופילים מטבולית משתנים אשר יכולים להשפיע על דרישות מזין, פרמטרים כגון רקמות קשיחות ומטריקס הרכב יכול להשפיע על לערבב ואת זרימת החומרים המזינים. לכן סביר כי כל סוג הרקמה דורש אופטימיזציה של תנאים ולגזירה של תרבות.
הטיפוח-תרגול שיטות השתמשו כדי לתמוך פרוסה תרבויות: אני) תרבות לאטמוספרה נייח, הנקרא גם תרבות תמיכה קיפאון, שבו מונחים פרוסות הוספה למחצה נקבובי ממברנה שקוע בתוך המדיום תרבות. בחודש זה, העליון של הפרוסות חשוף לאוויר, בעוד החלק התחתון הוא בתוספת עם חומרים מזינים באמצעות14,הוספה נקבובי19; ii. שיטת) כפות סיידים, שפותחה במקור איברים כל תרבות או פרוסות מתחלקים. בחודש זה, פרוסות ממוקמים על גבי סדין כותנה או מסנן נתמך על ידי רשת מתכת, המסנן טבולים המדיום תרבות. כדי לשמור על הרקמות לח, שכבה דקה של מדיום נוסף על גבי פרוסות20,21,22. אלה שני הראשונים נקראים כך אוויר נוזלי לאטמוספרה תרבויות; iii) רולר צינור תרבויות, בו פרוסות ממוקמים בתוך הצד השטוח של צינור פלסטיק המכיל בינוני, וכל סיבוב איטי צינור מבטיחה כי הרקמה הוא מכוסה בינוני במהלך החלק הראשון של מחזור, או מוגזים במהלך השנייה23; iv) סיבוב יחידות דגירה, שבו פרוסות נחשפים לסירוגין בינוני עם חומרים מזינים, לערבב. שונה צינורות רולר, בשיטה זו פרוסות מונחים רשתות טיטניום נקבובי ממוקמת ב 6-ובכן צלחות עם תרבות בינוני24.
רקמות פרוסות נגזר resected גידולים מוצקים לוגית נוכח מודל אטרקטיבי לשעבר vivo בו לבדוק את התגובה לטיפול של סוכנים אנטי סרטניים, כפי שהם מאפשרים הערכת הכדאיות, ממוקד מסלול פעילות ופרופילים מולקולרית של גידול ספציפי בנוכחות microenvironment הגידול הטבעית שלה. עם זאת, כדי להעריך אם יש לתגובות סמים נמדד פרוסות גידול חזוי של תגובות ב באתרו , חשוב להעריך לשמר פרוסות רקמות מה היקף הגידול הספציפי תפקודים ביולוגיים התפשטות תאים, התמיינות תאים ספציפיים histopathology או oncogenic פעילויות איתות. השפעת מכאניים elicited במהלך ההכנה פרוסה, טיפול פרוסה או תרבות-induced adaptions על איכות והן תפקודים ביולוגיים של רקמות פרוסות הן שאלות יסוד, קשורה באופן הדוק היכולת ליישם נגזר הגידול פרוסות עבור לאיבחון פונקציונלי.
הפרויקט שלנו במימון תעש קונסורציום PREDECT (http://www.predect.eu) יוצא לכתובת באופן שיטתי שאלות יסוד אלה, על ידי לימוד פרוסה explants ממגוון רחב של מקורות. שימוש בפרוסות נגזר מודלים סרטן השד, הערמונית, ריאות, במאמץ משותף זה מנוצל הקריאות איכותי וכן hematoxylin כמותית של eosin (H & E) - לפי המפרט להפגין דרישה עבור חמצן אטמוספרי ומסנן קפואה תומך כדי לקיים את הכדאיות של פרוסות בתרבית עד 72 h. יתר על כן, ניתוחים אימונוהיסטוכימיה (IHC) על פרוסות בתרבית חשף אינטרה-פרוסה הכדאיות מעברי צבע, עדות כמעברי נמק פרוסות הנגזר מאתר שאינם קטנים התא סרטן ריאות (NSCLC), קולטן אסטרוגן (ER), HIF1α, γH2AX מעברי צבע בפרוסות סרטן השד, או אנדרוגן קולטן (AR) ביטוי מעברי צבע סרטן הערמונית פרוסות25. מעניין, מעברי צבע הכדאיות אינטרה-פרוסה בתרבויות 24 שעות של NSCLC מאתר חולצו על ידי טיפוח ביחידה אינקובציה מסתובב, שלנו במחקר עדכני הראה כי הכדאיות הוארך עד 72 h26. במיוחד את הצד העליון נשאר המעשי ביותר26, המאשרת כי סמים ניתוחים בתגובה על פרוסות הטוב מתבצעות בצד הזה של הרקמה.
למרות נשארת השאלה כיצד רחוק רקמות פרוסות יכול לסכם בחיי עיר הגידול פונקציות, הם שימשו באופן נרחב כדי לבדוק את התגובות סוכנים אנטי סרטניים, לרבות תרופות יישוב, נוגדנים חד-שבטיים, כימותרפיה סוכני 10,11,13,14,18,27. לאחרונה הראינו כי מאתר NSCLC פרוסות הצג שינויים דינמיים בהתפשטות, פעילויות איתות oncogenic בעקבות טיפוח בהשוואה טרי חתוך או פרוסות26. אפשרות זו מציינת כי חשוב לחקור אם יישוב בחיי עיר תפקודים ביולוגיים נשמרים כראוי במהלך הטיפוח, לפני לימודי ההפרעות. למרות ממצאים אלה, הראנו פרוסות הגידול יכול מודל מרחבי בתגובה טיפולים ממוקדים, בעיצומו סמים נשארים טיפולים קצרים (24 שעות), מבוצעים מיד עם תחילת culturing26. הפרוטוקול הבא מתאר אימות חשוב בהיבטים הרלוונטיים הממסד וניתוח של תרבויות פרוסה הגידול, לפני היישום שלהם בבדיקת סמים תרופתי.
Protocol
כל עכבר ניסויים המתוארים במחקר זה בוצעו על ידי ביצוע ההנחיות של המנהלים הלאומית הפינית של חיה הניסויים, ואושרו על-ידי הוועדה חיה ניסיוני של אוניברסיטת הלסינקי, המחוז את המדינה משרד בדרום פינלנד (רישיון מספר ESAVI/9752/04.10.07/2015).
1. ההכנות לפני לחתוך
- לשמור את החומרים הבאים מוכן: vibratome הדגימה למחזיק, vibratome מאגר מגש, 10 ס מ תרבות צלחת, צלחת 24-ובכן, פיפטה של 10 מ"ל, פיפטה הילד, שקית אשפה, 70% EtOH 50 מ ל צינור לחטא. את הכלים, ודבק רקמות.
- מכינים את vibratome: נגב בעל להב עם 70% EtOH, לצרף להב חדש, ולבצע את vibrocheck על פי ההוראות במדריך (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
הערה: חשוב לבצע את הצעד vibrocheck, כמו זה ממזער את הסטה אנכית של הלהב ומבטיח פרוסות באיכות טובה. - למלא כל אחד טוב של צלחת 24-ובכן עם 1 מ"ל של הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) בתוספת 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין µg/mL 100 (HBSS + P/S); לקחת את הצלחת על קרח.
- להכין F12 תרבות בינוני בתוספת 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 2 מ מ glutamax, גלוקוז 22 מ"מ ו- 10% סרום שור עוברית (FBS).
הערה: גידול פרוסה בינונית תרבות, גורם הגדילה תוספי מזון יכול להשתנות בהתאם רקמת הגידול25. - להכין את הכמות הנדרשת של F12 בינוני הטיפול בתרופה, באמצעות הרכב אותו כפי שמתואר בשלב 1.4, אבל משמיט את FBS.
הערה: מאז גורמי גדילה של הסרום עשוי להשפיע על איתות oncogenic בפרוסות בתרבית, בינונית ללא סרום מומלצת לטווח קצר מחקרים ההפרעות סמים על הגידול פרוסות. אם תרבויות פרוסה וקהילותיהם מנותחים, חשוב להעריך השפעת בינונית ללא סרום על רקמות הכדאיות וביטוי סמן הגידול הספציפי בתרבויות פרוסה שלא טופלו קודם.
2. אוסף של הריאות נושאות
- המתת חסד עכבר נושאות על ידי נקע בצוואר הרחם כאשר זה מראה תסמינים של הנשימה המאומצת ואובדן משקל הגוף.
הערה: CO2-המתת חסד בתיווך מוכרת תנאים חמצן בריאות, אשר עלולה להיות השפעה על הכדאיות פרוסה או פעילויות oncogenic דרך הצליחו יותר במשיכת תגובה ובשפתיים. - למתוח את העכבר לאללה על גבי מכסה קלקר על ידי החדרת מחטים 30 G ארבע רגליים, כך בחזה חשוף.
- לחתוך את העור מן הבטן לכיוון החזה, ועד אזור הצוואר. לחתוך את כלוב הצלעות, ולאחר מכן את הסרעפת לחשוף את הריאות והלב. שמור את המספריים במצב בזווית כדי למנוע נזק לרקמות.
- לנתח את הריאות נושאות יחד עם הלב, למקם אותם לתוך שפופרת 50 מ ל המכיל 30 מ של קרח HBSS + P/S; לשמור את הצינור כקרח והמשך לשלב הבא מהר ככל האפשר.
הערה: עיכוב בעיבוד של גידולים ריאות עשוי לשנות פונקציות oncogenic, לדוגמה איתות לשביל פעילויות.
3. הדור של דיוק-קאט ריאות הגידול פרוסות
- להעביר את הריאות נושאות HBSS + P/S לתוך צלחת תרביות רקמה 10 ס מ כל הזמן בתוך ברדס למינריות. להפריד את אונות הריאה באמצעות מלקחיים ומספריים סטרילי, ובחר אונות עם גידולים על פני השטח שמגיע.
הערה: גידולים > 3 מ מ גודל מתאימים עם פרוסות. מאז רקמת הריאה נורמלי סביב הפשרות גידול ענק עם פרוסות עקב הבדלים רקמות קשיחות, רקמת הגידול שעברו חיתוך להפרידם מן הרקמה רגילה, כך אזור הגידול שנוקה פונה הלהב vibratome. - יצירת משטח פיסת רקמה שטוח על-ידי חיתוך חלק של רקמת הריאה נורמלי המקיף את הגידול משם עם איזמל סטרילי, לטבול השקופית שטוח טיפה של דבק מגע דבק. לטעון את הצד הזה אל בעל הדגימה של vibratome כך הגידול פונה הלהב בתנוחה זקופה. תן דבק יבש למשך 2-3 דקות.
הערה: רקמת הריאה רגילים מודבקים על בעל הדגימה אינה מפריעה גידול רקמות לחתוך, חותך נעצר לפני הרקמות מתמלאת. רקמת הגידול לפעמים מתכופף עקב מרקם ספוגי של רקמת הריאה רגילים מודבקים על בעל הדגימה, להתפשר על ליישר. אם זה קורה, הדבק חתיכה של רקמת הריאה נורמלי נוספים תמיכה ליד רקמת הריאה נורמלי שנטענו מראש כדי לשמר את הגידול בתנוחה זקופה (איור 1A השלישי). - המקום בעל הדגימה במגש מאגר מתכת ולמלא אותה עם קר HBSS + P/S עד הרקמה שקועה בתוך המאגר. מניחים את המגש מאגר מתכת על גבי האמבטיה לבן קרח ולהוסיף קרח כדי לשמור על הרקמה מגניב בזמן החיתוך.
- לצרף את אמבטיית קרח לבן vibratome. בחר הגדרות חיתוך מתאימים: משרעת הנעים בין 2.5-2.8, חותך מהירות בין 0.10-0.14 ms, עובי חיתוך הנעים בין 160-250 מיקרומטר.
הערה: ההגדרות עם פרוסות צריך להיות מותאם על פי הקשיות של הרקמה. רקמה קשה קל לחתוך יותר רקמה רכה יותר, ודורש רקמות רך עם פרוסות עם מהירות נמוכה יותר (0.1 – 0.12 ms) ו משרעת גבוהה יותר (2.6-2.8). גידול גדול 4-5 מ מ מספקת בדרך כלל 15 – 20 פרוסות של 200 עובי מיקרומטר. לטיפוח לטווח קצר, מאתר גידולים יכולים נפרס בתנאים סטריליים למחצה מחוץ למכסה למינריות. עם זאת, גידולים קליני צריך נפרס תמיד בתוך class II אבטחה למינריות ברדס כדי למנוע את החשיפה לגורמי אפשרי בתוך הרקמה האנושית. - בעזרת מלקחיים סטרילי, לאסוף את הפרוסות ב 1 מ"ל של HBSS בבארות נפרדים של צלחת 24-ובכן שנערך על הקרח מקרוב שמירה על מסלול של הסדר שבו פרוס לפרוסות. לסמן כל טוב של צלחת 24-ובכן לפי התוכנית הניסיונית. לדוגמה, מארק רציפים בארות של צלחת 24-טוב כמו נקודות זמן תרבות או הו, בקרת הרכב (ג), סמים שטופלו (T) (איור 1B ii)
הערה: אין להפריע או למשוך את רקמת הגידול תוך איסוף פרוסה, כמו זה תשנה את הכיוון של הגידול ביחס הזווית של הלהב, המוביל אל חוסר עקביות בעוביים הפרוסות עוקבות. - כאשר כל הפרוסות נאספים, להעביר אותם על גבי רשתות טיטניום (2-3 פרוסות לכל רשת) בצלחת 6-ובכן המכילה 2.5 מ של תרבות בינוני לכל טוב. ודא כי אין בועות אוויר נוצרים בין הרשת טיטניום המדיום.
- כדי לטעון פרוסה על הרשת, לקחת את הצלחת 6-ובכן בתנוחה בזווית כך חלק של המדיום מכסה את הרשת, ולמקם את הפרוסה המדיום על הרשת; להשתמש מלקחיים כדי להפיץ את הפרוסה אם זה תלתלים. לטעון את הצלחות 6-ובכן ביחידה אינקובציה מסתובב בתוך חממה humidified ומתוחזק על 37 ° C עם אוויר 95% ו- 5% CO2, ולהתחיל מחזור הסיבוב (איור 1C i-ii).
הערה: רשתות מתכתי עם הלוחיות 6-ובכן צריך להיות מדויק משקל מאוזנת לפני הפעלת יחידת מסתובב. חשוב למקם את הפרוסות באמצע הרשת כך הם חלופי מלא בין האוויר לבין נוזלי שלבים במהלך מחזורי הסיבוב. פרוסות הממוקמות נמוך מדי או גבוה לא כראוי נחשפים חמצן או חומרים מזינים (איור 1C אני), אשר יכולה לסכן את הכדאיות רקמות. חשוב לעקוב אחר המיקום של הפרוסה על הרשת במהלך הטיפוח, כפי הפרוסה מפעם לפעם יכול להחליק. אם זה קורה בתוך 1-2 h תחילת תרבות, לתקן את מיקומו, רשמו דוגמה זו עלולים להינזק. צריכים להיות מושלך הפרוסות הן mispositioned לתקופה ממושכת של זמן, כמו רקמות הכדאיות מושפע באופן משמעותי חמצון לקוי של אספקת מזונם.
- כדי לטעון פרוסה על הרשת, לקחת את הצלחת 6-ובכן בתנוחה בזווית כך חלק של המדיום מכסה את הרשת, ולמקם את הפרוסה המדיום על הרשת; להשתמש מלקחיים כדי להפיץ את הפרוסה אם זה תלתלים. לטעון את הצלחות 6-ובכן ביחידה אינקובציה מסתובב בתוך חממה humidified ומתוחזק על 37 ° C עם אוויר 95% ו- 5% CO2, ולהתחיל מחזור הסיבוב (איור 1C i-ii).
- לאסוף פרוסה רקמות סמוכים לפרוסות בתרבית ככל ה 0, תרבותית הפניה. לאסוף את התייחסות לפחות שלוש פרוסות לייצג את העליון, התיכון ומרכז של הרקמה להיות פעור. לתקן את 0 h פרוסות מיד ואת תהליך כמתואר ב- 5.1.
הערה: אם מספר הפרוסות מוגבל, למשל, אם מספר טיפולים מורכבים או משכפל טכני נעשים, השוואות של כל מדגם שטופלו עם מדגם 0 h השכנה שלה יכול להיות קשה. במקרים כאלה, השתמש הפרוסה הו הקרוב (מיקרומטר לפחות 400 – 600 בנפרד) להערכת הכדאיות רקמות היחסי או ביטוי של סמנים רלוונטיות תחילת תרבות. - לטיפוח לטווח ארוך, לחדש את המדיום תרבות בכל יום. הרם את רשת המכיל את הפרוסות רקמות באמצעות מלקחיים סטרילי, ולמקם אותו ובכן ריק של צלחת 6-טוב; להחליף 70% של המדיום בינונית טרייה-תרבות, ולמקם את הרשת בחזרה המדיום. המשך מחזור הסיבוב כמוסבר בשלב 3.6.
4. טיפול של הגידול פרוסות עם מעכבי מולקולה קטנה
- הכינו את ריכוזי תרכובות במדיום הטיפול הנדרש. בדרך כלל, ריכוז סמים 10-fold גבוה יותר בהשוואה את IC50s נמדד תרביות תאים נדרש כדי להשיג את המטרה עיכוב בפרוסות רקמות. כדי להימנע cytotoxicity לא ספציפי, לבדוק את טווח ריכוזים כדי להשיג ריכוז מינימלית יעיל עבור כל המתחם. . הנה, בדקנו 0.1 – 1 מיקרומטר את dactolisib מעכב PI3K/mTOR ו 0.05-0.5 מיקרומטר של selumetinib מעכב MEK על פרוסות NSCLC מאתר.
- להוסיף 2.5 מ של מדיה עם הסם מדולל או דימתיל סולפוקסיד או פקד אחר הרכב המשקולת 6-. טוב. למקם את רשתות טיטניום הבארות.
- מניחים את פרוסות רקמות על גבי הרשתות כפי שמתואר בשלב 3.6.
- לבצע טיפול ברכב או סמים עבור ה 24 להמשיך עם קיבוע הרקמה ועיבוד הפרוסות לגושי פרפין כמתואר בסעיף 5.
הערה: משך הטיפול בסמים ניתן למטב בהתאם מטרת הניסוי, אם לוקחים בחשבון את היכולת של רקמות פרוסות לשמור בחיי עיר פונקציות רקמות נותחו במהלך תקופת תרבות.
5. קיבוע ועיבוד של הפרוסות רקמות
- בזהירות הרימו הו מחציתה ההפניה או בתרבית פרוסה על גבי נייר סינון טבולים PBS.
- כדי לעשות זאת, מוסיפים 2-3 מ"ל של PBS צלחת 10 ס מ, לתת את הבמה פרוסה ב- PBS, 'לדוג' אותו על ידי הרמת הפרוסה על גבי נייר הסינון עם זוג מלקחיים.
- להעביר נייר הסינון histocassette, וכן להוסיף טיפת hematoxylin מדולל (1:1 במים יונים) על הפרוסה רקמות בעליל לסמן את המיקום של הפרוסה במהלך השלבים העיבוד הבאים (איור 1D).
- סגור את הקלטת ולאחר להעבירו פתרון ניטרלי פורמלין במאגר 4%. את הרקמות בן לילה ב 4 º C.
הערה: בעת הצבת הפרוסה על גבי נייר הסינון, ודא כי בחלק העליון של הפרוסה פונה כלפי מעלה; הדבר נחוץ לעקוב אחר העליון, האמצעי, בחלק התחתון של פרוסה במהלך חלוקתה וניתוח כפי שמתואר בשלב 6.3.
- למחרת, העברת הקלטות לתוך 70% EtOH, ולהמשיך מיד עם הצעד עיבוד רקמה הטבעה-פרפין.
- לפני עיבוד רקמות, לשטוף את histocasettes 100% EtOH 2 x 10 דקות כל אחד. במקרה זה, השתמש תחנת מיקרוגל ברקמה. בחר את התוכנית המשמש 1 מ"מ עובי רקמת ובצע את ההוראות המופיעות במדריך (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
הערה: בעת שימוש עיבוד מכונות רקמה אחרים, השתמש בתוכנית מתאים דגימות רקמה רזה. - להטבעת פרפין-, פתח את histocassette ולהשתמש אזמל בזהירות להרים את הפרוסה של נייר הסינון. להשליך נייר הסינון, ולהעביר את הפרוסה לתוך תבנית המכילה שמן פראפין.
- הקש את הרקמה בתחתית להטבעה, למשל עם משקל שטוח, כדי להבטיח אפילו חלוקתה. למקם את החלק התחתון של histocasette על גבי כייר, ומצננים את עובש על פייט קר למשך 30 דקות, ולהפריד העובש מהגוש פרפין.
הערה: כחלופה להטבעת אופקי, זה אפשרי להטביע את הפרוסה הגידול אנכית על-ידי הצבת הפרוסה בתנוחה זקופה. מקטעים אנכיים ברצון לאפשר ניתוח של מעברי צבע הכדאיות או סמן פונקציונלי בביטוי על סעיף בודד 25. ניתוח מעבר צבע עם פרוסות אופקית-מוטבע דורש פרפין חלוקתה כפי שמתואר בשלב 6.2.
- הקש את הרקמה בתחתית להטבעה, למשל עם משקל שטוח, כדי להבטיח אפילו חלוקתה. למקם את החלק התחתון של histocasette על גבי כייר, ומצננים את עובש על פייט קר למשך 30 דקות, ולהפריד העובש מהגוש פרפין.
6. עיבוד וניתוח של פורמלין-קבוע ושל מוטבע-פרפין (FFPE) של רקמות
- להכין 4 מיקרומטר סעיפים דקים מאבני FFPE רקמות פרוסה באמצעות מיקרוטום. בעת חלוקתה, להתאים את הזווית של הרחוב כך השטח של גוש מכוון בצורה אופקית ביחס הלהב; הדבר נחוץ להשיג אפילו מקטעים לאורך כל הרקמה.
- כדי לאפשר לכידה של פוטנציאל הכדאיות תרבות-induced הדרגתי, נדידת תאים על-פני פרוסות, או מעברי צבע בביטוי סמן על פני פרוסות בתרבית, לאסוף חלקים מהשכבות, מרכז ובתחתיתו של כל אחד של הפרוסה רקמות בשקופיות אובייקט כמוסבר להלן.
- איסוף מקטעים רציפים רקמות של הפרוסה רקמות פרפין-מוטבע קודם על החלק העליון של השקופיות זכוכית. המשך איסוף את מקטעי רקמת ועליית לאמצע ואחריו בחלק התחתון של השקופיות זכוכית (איור 1E).
הערה: כדי להכיל לשלושה חלקים על משטח זכוכית, לקיטום עודף של פרפין סביב הפרוסה רקמות מוטבעים. - לאפשר את הסעיפים כדי לילה יבש ב 37 מעלות צלזיוס, ולהמשיך עם H & E להכתים או אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן.
הערה: הפסד של antigenicity עשויה להתרחש כאשר FFPE והמקטעים נשמרים בטמפרטורה גבוהה או לתקופות ממושכות של זמן. פרפין מקטעים, מומלץ לאחסן ב 4 ° C, ניתוחים IHC צריכה להתבצע בתוך 6 חודשים לאחר חלוקתה.- עבור צביעת המטוקסילין, deparaffinize, נתרענן הסעיפים פרפין כדלקמן: קסילן 3 x עבור 5 דקות, 100% EtOH 3 x עבור 1 דקות, 96% EtOH 2 x עבור 1 דקות, 70% EtOH 1 x 1 דקות, ומים יונים 2 x עבור 1 דקות.
- דגירה הסעיפים בפתרון hematoxylin מסוננים טריים למשך 10 דקות, לשטוף תחת הברז במים זורמים במשך 5 דק מח ש הסעיפים אלכוהול חומצה (1% HCl ב 70% EtOH) 2 פעמים, לשטוף תחת זורמים מי ברז למשך 5 דקות ולאחריו הדגירה עם 0.5% eosin 2 מ' ב.
- בעקבות הצעד אאוזין, מייבשים את המקטעים במועט השקופיות פתרונות אלכוהול, קסילן, כדלקמן: 96% EtOH 2 x 15 s, 100% EtOH 3 x עבור 30 s, קסילן 3 x עבור 1 דקות. בסופו של דבר, הטבע הסעיפים במדיום קסילן מבוססי הרכבה.
7. ניתוח של רקמות הכדאיות וביטוי סמן
- לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה על ידי יצירת השקופית כל הסריקות של H & E שהוכתמו השקופיות באמצעות סורק. להערכת הכדאיות רקמות, מצלמים מפני הבדיקות רקמות המייצג את המקטעים העליון, האמצעי והתחתון של הפרוסות.
- באופן ידני באמצעות תוכנה מניפולטור צילום, צייר מסכות על אזורי נמק ברקמות, ואחריו כימות של אזורי נמק בתוכנת MATLAB.
- חישוב הכדאיות היחסי של הפרוסות שהונדסו נקודות זמן שונות בהשוואה הפרוסה הו הקרוב כפי שנעשה מחקר (Närhi et al., . איור S2B ו- C) הקודם שלנו26. באופן דומה, להעריך את פוטנציאל אינטרה-פרוסה הכדאיות מעברי צבע על-ידי לכימות הכדאיות בחלק העליון, האמצעי והתחתון של פרוסה בתרבית, לחשב את הכדאיות היחסי של כל אחד מהמקטעים פרוסה הו הקרוב ביותר שלה.
הערה: בזמן הטיפוח גרידא של פרוסות NSCLC מאתר גורם מוות תאי נמק, תגובות ביולוגיות שמחוץ תרבות תנאים משתנים בהתאם רקמת הגידול. לדוגמה, מעברי צבע HIF1α, ER ו מקרופאגים מסומן על ידי F4/80 אותרו בתרבויות פרוסה הנתמכות על-ידי מסנן נגזר של סרטן השד דגם25. לכן, H & E - כמו גם מבוססת-IHC ניתוחים של פרוסות בתרבית צריך להיחשב עבור כל סוג הרקמה.
- מבצע IHC הסעיפים פרפין. פרוטוקול IHC הבאים מהווה נקודת התחלה, דורש נוספים מיטוב עבור נוגדנים אחרים. בקצרה, deparaffinize, נתרענן הסעיפים פרפין כדלקמן: קסילן 3 x עבור 5 דקות, 100% EtOH 3 x עבור 1 דקות, 96% EtOH 2 x עבור 1 דקות, 70% EtoH 1 x 1 דקות, ומים יונים 2 x עבור 1 דקות.
- כדי לחשוף את epitopes antigenic, לבצע אחזור אנטיגן בתיווך חום באמצעות חומצה ציטרית 10 מ מ ב- pH 6 במודול PT, ולאחריה חסימת עם 1% אלבומין שור (BSA) ו-10% סרום עז רגילה (הגדרות) ב 1 x PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (21-23 מעלות צלזיוס).
- דגירה נוגדן ראשוני מדולל BSA 1% ו- 5% הגדרות ב- 1 x הציבורית, גם עבור 1 – 2 שעות בטמפרטורת החדר. דגירה עם נוגדנים משניים אנטי-ארנב, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו זיהוי באמצעות 3, 3′-Diaminobenzidine (DAB).
- סעיפים הם counterstained עם hematoxylin (מדולל במים יונים כדי 1:10) עבור 30 s ו לשטוף תחת מי ברז למשך 5 דקות, ואחריו התייבשות במועט השקופיות פתרונות אלכוהול, קסילן, כדלקמן: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, קסילן 3 x ( 1 דקות בכל שלב). בסופו של דבר, הטבע הסעיפים במדיום קסילן מבוססי הרכבה.
- לרכוש כל השקופית סריקות של שקופיות שהוכתמו IHC, לייצא אותם כתמונות TIFF-יחס הגדלה של 1:4 באמצעות באמצעות מציג תמונה, ולבצע את quantifications באמצעות ImageJ.
הערה: כפי אלטרנטיבה הסורק, תמונות מיקרוסקופיות 20 X או 40 X הגדלה ניתן לרכוש עבור quantifications. הגדלה התמונה יכולה להיבחר בהתאם הסמן כדי ניתן לכמת; תמונות בהגדלה המומלצות עבור צביעת גרעינית, בעוד cytoplasmic או סמני קרום ניתן לכמת באמצעות תמונות X 20.- על כימות של סמנים גרעינית, במקרה זה ביטוי NKX2-1, להמיר כל תמונה תמונות 16 סיביות באמצעות פיג'י-ImageJ, ולהעלות תמונות עבור ניתוח תמונות.
- התאם אישית את הצינור ניתוח התמונה בהתאם הניתוח. פרוטוקול זה, להשתמש הצינור הבא עבור כימות של גרעין חיובי NKX2-1: לזהות אובייקטים ראשוניים | מדידת עוצמת אובייקט | סינון אובייקטים (ערך מינימלי = 0.0025) | לחשב והפ התוצאות מיוצגים כאחוזים שהוכתמו DAB הגרעינים של המספר הכולל של גרעין האטום.
Representative Results
איור 1 מייצג את זרימת העבודה עבור הדור, טיפוח ניתוח של רקמות דיוק-לחתוך פרוסות הנגזר מאתר גידולים NSCLC. לצורך ההדגמה, אנחנו מנוצל גידולים ממודל העכבר מהונדסים גנטית (GEMM) מחסה מותנה הפעלה של קראסG12D יחד עם האובדן של Lkb1 (הידוע גם בשם תראונין/סרין קינאז 11), להלן בשם KL. העכבר רבייה ובריאות הגידול חניכה בוצע כמתואר26,28. איור 2A מדגים את ההשפעה של רקמות עובי הפרוסה על הכדאיות של פרוסות בתרבית במשך 24 שעות ביממה באמצעות ביחידה אינקובציה מסתובב. התוצאות מציגות כי 160 מיקרומטר פרוסות דקיקות מכילים אזורים עם נמק גדולים על פני הפרוסה. בנוסף, פרוסות דקיקות של 250 מיקרומטר מציגים נמק של מעבר צבע לאורך הפרוסה לעומת 200 מיקרומטר פרוסות דקיקות. סביר כי הכדאיות הכוללת המסכן של מיקרומטר 160 הדק נגרמת על ידי טיפול טכני במהלך מיצוב הפרוסות על גבי הרשתות, אלה הם שבירים, נוטים להתכרבל. מצד שני, כאשר פרוסות עבה מדי, שהם יכולים להפוך נוטה ליקויים חמצן או דיפוזיה מזין הפרוסות, אשר ב NSCLC מאתר explants היא עדות כמו נמק מוות הדרגתיות25. עם זאת, יצוין כי ניתן להפיק פרוסות עם עוביים משתנים של גידול אחד, למרות השימוש בהגדרות vibratome זהים. לכן מומלץ לנתח משכפל מרובים מדגימות גידול שונים. חשוב, כל סוג הרקמה דורש אופטימיזציה עובי הפרוסה על מנת להשיג מקסימום הכדאיות, כמו מרקם רקמות או קשיות ולהשפיע על חמצון ואת זרימת החומרים המזינים. איור 2B -2C מדגים ניתוחים כמותיים IHC של הביטוי NKX2-1, סמן של היטב הבדיל ריאות אדנוקרצינומה (AC) בדגימות מעובדות עד 72 שעות ותואמים את 0 h פרוסות. התוצאות מראות כי הביטוי NKX2-1 הוא לא שינו באופן משמעותי בפרוסות בתרבית לעומת 0 פרוסות מחציתה h, רומז כי תהליך הטיפוח בגלוי משפיעה על המצב בידול של רקמת הגידול AC. איור דו-ממדי מדגים את התועלת של פרוסות רקמת הגידול להערכת היעילות של תרופות יישוב. לאחרונה הראינו קראס מוטציה מאתר ACs בנספח גבוהה את הביטוי הזה של phosphorylated ERK1/2 (סימון פעילות מוגברת של מסלול MAPK) בהשוואה adenosquamous (ASC) גידולים, תוך ביטוי של phosphorylated 4EBP1 (סימון פעילות mTOR ) באופן דומה מתבטא בגידולים AC וגם ASC. כדי לבדוק אם המסלולים הללו ניתן לפלח ביעילות על רקמות פרוסות, פרוסות רקמות KL AC שטופלו דימתיל סולפוקסיד או טיטרציה כמויות של תרכובות, כלומר 0.1 – 1 מיקרומטר dactolisib למקד את המעבר mTOR או 0.05-0.5 מיקרומטר selumetinib למקד את המעבר MAPK. התוצאות מראות כי 1 מיקרומטר dactolisib או 0.5 מיקרומטר של selumetinib יעילים בעיכוב זירחון של 4EBP1 או ERK1/2, בהתאמה. יתר על כן, עיכוב למינון של יישוב phosphoproteins מציין כי רקמת פרוסות גם יכול להיות מנוצל כדי לאמת נוגדנים ספציפיים זירחון.
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה עבור הקמת וניתוח של מאתר NSCLC פרוסה נגזר הגידול explants. (א) מפרטים טכניים המתארים את איסוף והכנה של הריאות נושאות שמגיע. אונות הריאה נקצרים מן עכבר, רקמת הגידול הוא גזור מן הרקמות. ראש חץ שחור של כוכבית מצביעים על 4 מ מ 1 מ"מ גידולים, בהתאמה. החץ הלבן מצביע על רקמת הריאה דבוק אל פני השטח של בעל הדגימה. הנקודות חץ אדום כלי נוסף של רקמת הריאות נורמלי תמיכה כדי לשמר את הגידול בתנוחה זקופה. Vibratome (B) אוסף של פרוסות רקמה וגזירה. חץ לבן מציין את הכיוון עם פרוסות. אוסף של פרוסות רציפים לתוך צלחת 24-ובכן המכיל קר HBSS + P/S. הפרוסות יכול להיות בתרבית נקודות זמן שונות (כאן, 24-72 h) כדי להעריך ביטוי סמן הגידול הספציפי בזמן התרגול (שורה עליונה), או יכול לשמש כדי לבצע טיפולים תרופות. C: בקרת הרכב, t: הטיפול בתרופה. (ג) הצבת הפרוסה רקמות לטיפוח באמצעות יחידות הדגירה מסתובב. להטות את הצלחת 6-ובכן כך מסוימים בינונית מכסה את החלק העליון של הרשת, מקום הפרוסה רקמות באמצע הרשת על גבי המדיום, להפיץ את הפרוסה באמצעות מלקחיים. להבטיח כי הלוחות 6-ובכן משקל מאוזנת עבור מחזור הסיבוב חלקה. X: ציון שגויה, ו- 
: מציין מיקום נכון של הפרוסה. (ד) תצלום של הרחוב FFPE על נתח הגידול. חץ שחור בנקודות פרוסה פרפין-מוטבע רקמה צבעונית עם hematoxylin. (E) שרטוט המציג את סדר אופטים הפרוסות בבלוקים FFPE; ניתן לעבד מקטעים אלה כדי להעריך את הכדאיות רקמות וביטוי סמן הגידול הספציפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הערכת הכדאיות והביטוי סמן histotype ספציפית ולאחר הטיפול ממוקד על פרוסות רקמות NSCLC. תמונות (A) נציג H & E AC NSCLC פרוסות עוביים המצוין תרבותי עבור פרוסות דקיקות של מיקרומטר 24 ה 200 לשמור על התפקוד טוב יותר לעומת 160 מיקרומטר או 250 מיקרומטר פרוסות דקיקות. כחול כהה מייצג H & E צבעונית רקמות קיימא, ומציין ורוד pseudocolored אזורי נמק. כחול בהיר מציין אזורים נכללו בניתוח, עקב איכות רקמת עניים או נוכחות של משתית סיבית או. T1 ו T2 מייצגים ביולוגי משכפל נגזר שני גידולים שונים. סרגל קנה מידה = 500 IHC נציג תמונות מיקרומטר. (B) של NKX2-1 ביטוי בפרוסות AC תרבותי על הנקודות הזמן שצוין. החץ מצביע על האזור שמוצג הגדלה גבוהה יותר. התוצאות מראות כי הביטוי NKX2-1 אינה משתנה את פרוסות בתרבית לעומת 0 h פרוסות. סרגל קנה מידה = מיקרומטר 500 ו- 50 מיקרומטר עבור הגדלה נמוך וגבוה, בהתאמה. (ג) כימות הנתונים המוצגים ב (B). (ד) נציג IHC תמונות של phosphorylated 4EBP1 או pERK1/2 ביטוי או פרוסות, או פרוסות שטופלו דימתיל סולפוקסיד טיטרציה כמויות של dactolisib (נערכה, השורה העליונה) או phosphorylated pERK1/2 ביטוי הו פרוסה, או פרוסות שטופלו דימתיל סולפוקסיד או selumetinib (sel, שורה תחתונה). קופסאות ריבוע שחור מציינים אזורים באיור הגדלה גבוהה יותר. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ או 50 מיקרומטר עבור ההגדלה נמוך או גבוה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
מתחם במבחנה הגידול מודלים שונים, כולל תרבויות 3D ו- organoids, פותחו כדי לסכם את אדריכלות והפונקציות oncogenic ויוו 29,רקמת הגידול30. עם זאת, הקמת תרבויות תלת-ממד או organoids כרוך דיסוציאציה רקמת גידול סלקטיבי של סוג תא בודד או תרבות משותפת של בחירת סוגי תאים אחדים סביבה מלאכותית. כתוצאה מכך, מודל שכזה שהיישום ללכוד המורכבות של אינטראקציות הטרוגניות, הגידול-משתית הגידול. Organotypic הגידול פרוסות, מצד שני, לשמור על רקמה ביולוגית ואדריכלות המורכבות של הגידול ב באתרו , ללא מניפולציה נרחב. יכולת זו של הרקמה פרוסות לתאים סרטניים דגם microenvironment מקורי שלהם מעבד אותם אטרקטיביים במיוחד ללימודי פרה. בעבר דיווחנו זרימת עבודה ממוטב עבור הקמת ניתוח של הגידול דיוק-לחתוך פרוסות, וכן הראה כי, לעומת לסנן תומך, ביחידה אינקובציה מסתובב לשפר את הכדאיות של לטווח קצר מאתר NSCLC פרוסה תרבויות25 , 31. עם זאת, טיפוח בסבב יחידות הוא מאתגר מבחינה טכנית, דורש ניטור מתמיד. אנו מציגים כאן פרוטוקול גידול רקמות פרוסה ושימוש מעשי סיבוב ליחידה הדגירה תרבות אותם, כמו גם ליווי שיטות כדי לנטר את היכולת של פרוסות ללכוד בחיי עיר הגידול ביולוגיה, תנאי הכרחי לפני הסמים תגובת בדיקה.
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול להבטיח תקינות רקמת ואת הכדאיות של הפרוסות הגידול. אם רקמת הריאה נורמלי מקיף את הגידול, vibratome יכול ליצור פרוסות בעובי לא עקבי או נזק הפרוסות, בשל ההבדלים מרקם וקשיחות בין רקמות רגיל, הגידול. לכן חשוב להסיר את רקמת הריאה נורמלי שמסביב לפני הגידול חותך. עוד צעד קריטי הוא עובי חיתוך, אשר צריך להיות ממוטבים בקפידה עבור כל סוג הרקמה. יתר על כן, ברגע חתוכים, זה קריטי כי הפרוסה ממוקמת בערך באמצע הרשת, אז כדי להבטיח מדויק לסירוגין טובלים בתוך תרבות בינוני וחשיפה חמצן. לבסוף, חשוב לעקוב אחר המיקום של פרוסה במהלך תקופת הסיבוב שלו, כפי פרוסה יכול ליפול המדיום; במקרה כזה, עוד פעולות ניתן לקחת כמוסבר בשלב 3.6 של הפרוטוקול.
בנוסף רקמות טיפול כדי להבטיח תקינות, יש גם שלבים קריטיים בניתוח IHC לפרש איך הפרוסה דומה הרקמה הטבעית. המחקר הקודם שלנו הראה כי גידולים NSCLC מאתר התערוכה בולטת אינטרה-גידול הטרוגניות המרחבי oncogenic פעילויות איתות26. משמעות הדבר היא כי השימוש של רקמות שונות במרחב פרוסות עבור פקדים או דגימות שטופלו בסמים יכול להשפיע על פרשנות הנתונים ניסיוני אמין, ומכאן מקרוב סמוך פרוסות שאמור לשמש פקדים, הבדיקה דוגמאות. אנחנו עוד יותר הראה כי בעת התפשטות או ביטוי oncogenic phosphoprotein h 0 מחציתה טרי חתוך פרוסות היו דומה בחיי עיר גידולים, פרוסות תרבותי הראה phosphoprotein oncogenic שינו הביטוי, במיוחד שינו p4EBP1 pSRC, וכן התפשטות שינו נותחו על ידי Ki67 IHC. הביטוי p4EBP1 שינו זוהה באופן דומה 24 שעות האדם NSCLC וסרטן הערמונית לחתוך תרבויות (Narhi ואח., איור משלים S3B-S3C, S5, S7)26. ממצאים אלה מאשרת כי השוואה של פרוסות תרבותי עם פרוסה מחציתה הו הקרובה שלהם הוא קריטי כדי להעריך את שימור בחיי עיר פונקציות גידול בתרבית פרוסות.
למרות שיפור הכדאיות של פרוסות organotypic25, קיימות מגבלות עם מערכת מסובב במונחים של כל הפרטים הטכניים. הצבת את הפרוסות רקמות על גבי רשתות טיטניום היא מאתגרת יותר בהשוואה לסנן מוסיף, ביחידה אינקובציה מסתובבת לא יהיו זמינים. כחלופה, תומך מסנן קיפאון יכול לשמש, אבל במקרה הזה רק חשוף אוויר בצד של הפרוסות צריך להיות מנותח, כמו מסנן אוויר מעברי צבע הכדאיות, היפוקסיה נמדדת HIF1α ביטוי נוצרות במהירות בפרוסה הנתמכות על-ידי המסנן תרבויות (דייויס et al., איור 5, איור 7 א-7B)25. אנחנו עוד יותר הראו כי הגידול פרוסה תרבויות בנוסח התפשטות שינו ופעילויות איתות oncogenic לעומת גידולים מקורי שלהם26, ואולי בגלל תגובות ריפוי פצע או הסתגלות מטבולית הפרוסות כדי ex-vivo תרבות32. למרות ברוטו תכוניות מורפולוגיות של גידולים NSCLC מאתר היו מתוחזקים במהלך הטיפוח-תרגול 72 h, תרבות-induced שינויים proliferative עשוי להשפיע על ציון מדויק של הפרוסות מעובדים. לפיכך, רקמות פרוסות צריך רק להיות מנוצל ללימודי תפקודית לטווח קצר.
השימוש ביחידה אינקובציה מסתובב מציל לפחות חלקית אינטרה-פרוסה הכדאיות או סמן ביטוי מעברי צבע, במיוחד במהלך 24 השעות הראשונות של תרבות. לאחר האימות עבור תקינות ותפקוד, זה מספק חומר רקמות ללימודים פונקציונלי, כגון לימודי טיפול סמים. בנוסף התרופה התגובה פרופיל, ביטוי יעד שונה בעקבות הטיפול בתרופה יכולים גם ליהנות נוגדן אימות. זה רלוונטי במיוחד זיהוי מאתר epitopes עם העכבר נוגדנים חד-שבטיים, כמו אלה נוטים לתת רקע מוכתמים. בנוסף, נוגדנים היטב המאומת נדרשים להשיג נתונים אמין לשחזור הגדרות אבחון וקלינית. לפיכך, אפנון של שפע או זירחון של epitopes רלוונטי בעקבות הטיפול בתרופה בפרוסות רקמות מספקת יישום מעשי שימושי באימות נוגדן. היתרון העיקרי של תרבויות פרוסה הגידול הוא היכולת מודל במרחב-מבוזרות פונקציות, כולל פעילויות איתות oncogenic או סמים תגובת הגידול או תאי סטרומה, מה שהופך אותם מודל אטרקטיבי ex-vivo . עם זאת, פרוסות לסובב במהלך הטיפוח-תרגול, תהליך הטיפוח יכול נזק נוסף לרקמת במיוחד בקצוות. זה ולכן מאתגר בדיוק בשכבת-העל של הדימויים IHC שהוכתמו סמן הפרוסות 0 h עם אזורי נמק זוהה פרוסות בתרבית, אשר פוגעת ביכולת לקשר בדיוק המרחבי סמן פעילויות סמים לתגובה. בנוסף, גידול מהותי, בהשפעת תרבות, שיכרון תגובות נמק הם נבדלים לפחות מאתר פרוסות רקמות NSCLC, להתפשר על כימות מדויק של תגובות סמים מרחבית. לבסוף, השימוש של הגידול פרוסה תרבויות היתרי חוקר כדי לבדוק את מספר תרכובות את הגידול זהה, כך שאין צורך לטפל בבעלי חיים, ובכך זיקוק, הפחתת והחלפה של ניסויים בבעלי חיים.
כיישום בעתיד, הפרוטוקול המתואר ניתן לאמץ דגימות קליניות גידולים מוצקים. עוד שינויים תלויי-סוג הרקמה או אופטימיזציות נדרשים סביר, החל מהתאמות בהגדרות vibratome כולל עובי הפרוסה מהירות רטט כדי למטב את אלה הגידול מרקם או נוקשות. בנוסף, הדרישה התזונתי של גורם גדילה עשויים להשתנות בשביל לרקמות גידול שונים. לדוגמה, פרוסות סרטן השד תרבותי עם אינסולין בתוספת של בינוני13,18. בהתחשב בכך רקמות מוגבל חומר מתקבל במהלך הניתוח או ביופסיה, אופטימיזציה של החולה, נגזר הגידול פרוסה תרבויות עשויה להיות מאתגרת עקב קשיים בהשגת מספר מספיק של דגימות שכפל. יתר על כן, הנתונים הפארמצבטית הוא גם תיגר מבטאים את החולה-מטופל מדגם הטרוגניות, במיוחד באחוזים של תאים סרטניים לעומת אזורים שהותירה או תסנין סטרומה, כמו גם רכיבים רקמת נמק. לבסוף, יישום של הגידול פרוסות בהגדרות אבחון ידרוש חקירת היקף כדי איזו תרופה תגובות ב explants פרוסה של ביופסיות טרום טיפול מתאים שלאחר הטיפול אין ויוו תגובות.
Disclosures
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
מחקר זה עבודה קיבל תמיכה כספית של תרופות חדשניות יוזמה Joint Undertaking להעניק הסכם no 115188 את תוכנית דוקטורט אוניברסיטת הלסינקי וההתערבות מלגות (A.S.N.), את Juselius סיגריד, יסודות אוריון-Farmos (E.W.V.). אנו מודים פלטפורמה פרוסה חברי האיחוד שלנו PREDECT רקמות (Taija af Hällström סיב Knaappila על תמיכה בהגדרת המערכת מסובב, ואת Riku Turkki לתמיכה בניתוח MATLAB. Jouko סירו הוא הודה על לכידת התמונות איור 1. אנו מודים לצוות FIMM WebMicroscope עבור סריקת שקופיות היסטולוגית, ותמיכה המרכז חיות מעבדה גידול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s Balanced salt solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Ham's F-12 medium | Thermo Fischer Scientific | 21765-037 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| FBS | Thermo Fischer Scientific | 10270-106 | |
| Glutamine 200mM | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Cyanoacrylate adhesive (GLUture) | Abbott | 32046-90-1 | |
| Leica VT1200 S vibrating blade microtome | Leica Biosystems | 14048142066 | |
| Slicing blade | VWR | PERS60-0138 | |
| Titanium grids | Albamma Research and Development | MA0036 | |
| Slice incubation unit | Albamma Research and Development | MD2500 | |
| 10 cm tissue culture plate | Sarstedt | 83.1802 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.1839 | |
| Neolus Hypodermic Needles | Terumo Neolus | NN2525R | |
| 50 mL falcon tube | Greiner | 227261 | |
| PBS | Lonza | BE17-517Q | |
| Formaldehyde | Fisher | F/1501/PB08 | |
| Trifold histo cassette paper | Cancer Diagnostics | DX26280 | |
| Histo cassettes | VWR | 720-2199 | |
| KOS The microwave multifunctional tissue processor | Milestone SRL | CAT307EN-003 | |
| Microtome | Thermo Fischer Scientific | HM355S | |
| Superfrost Ultra plus slides | VWR | 631-0099 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| NGS | Thermo Fischer Scientific | 16210-064 | |
| Citric acid | Sigma | C1909 | |
| PT-Module | Thermo Fischer Scientific | A80400012 | |
| Hematoxylin for H&E staining | Merck | 1.09249.0500 | |
| Hematoxylin for counter staining | Dako | S3309 | |
| Eosin | Sigma | E4382 | |
| NKX2-1 antibody | Abcam | ab133638 | Lot Number: GR98031-12 |
| pERK 1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 4370 | Lot Number: 17 |
| p4EBP1 antibody | Cell Signaling Technologies | CST 2855 | Lot Number: 20 |
| BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody | ImmunoLogic | VWRKDPVR-110HRP | |
| Mounting medicum pertex | VWR | MEDT41-4021-00 | |
| DAB | ImmunoLogic | VWRKBSO4-110 | |
| Dactolisib (NVP BEZ-235) | Selleckchem | S1009 | |
| Selumetinib (AZD2644) | Selleckchem | S1008 | |
| Pannoramic 250 slide scaner | 3DHISTECH | ||
| MATLAB | MathWorks | https://se.mathworks.com/products/matlab.html | |
| 3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER | 3DHISTECH | https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer | |
| Adobe Photoshop CS6 | Adobe | https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s | |
| Fiji-ImageJ | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | |
| CellProfiler | CellProfiler cell image analysis software | http://cellprofiler.org/ |
References
- Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution. Molecular and Cellular Oncology. 2 (3), e985549 (2015).
- Travis, W. D., et al. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1243-1260 (2004).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. The American Journal of Pathology. 4 (4), 337-340 (1928).
- Wright, J. C., et al. Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer. Cancer. 15, 284-293 (1962).
- Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. Studies on the organ culture of human tumors. Cancer Research. 26 (4), 626-637 (1966).
- Reinbold, R. [Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148 (15-18), 1493-1495 (1954).
- Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. [Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects]. Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32 (7-8), 797-801 (1956).
- Bousquet, J., Meunier, J. M. [Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. The British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Estes, J. M., et al. Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model. Gynecologic Oncology. 105 (2), 291-298 (2007).
- Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308 (9), H1112-H1125 (2015).
- Jaamaa, S., et al. DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue. Cancer Research. 70 (21), 8630-8641 (2010).
- Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).
- Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue. Current protocols in neuroscience. , Chapter 6 Unit 6.11 (2001).
- Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture. Journal of Visualized Experiments. 10 (81), (2013).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells International. , 959807 (2015).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement. Proceedings of the National Academy of Science. 104 (17), 7211-7216 (2007).
- Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices. Scientific Reports. 5, 17187 (2015).
- Narhi, K., et al. Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours. The Journal of Pathology. 245 (1), 101-113 (2018).
- Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
- Nagaraj, A. S., et al. Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1. Cell Reports. 18 (3), 673-684 (2017).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24 (9), 1092-1100 (2017).
- Hoogt, R., et al. Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project. Scientific Data. 4, 170170 (2017).
- Davidson, S. M., et al. Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer. Cell Metabolism. 23 (3), 517-528 (2016).
