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Immunology and Infection

नैदानिक परीक्षण के लिए एक शर्त के रूप में ट्यूमर स्लाइस Explants की स्थापना और विश्लेषण

Published: November 29, 2018 doi: 10.3791/58569
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM), HiLIFE, University of Helsinki

Summary

हम murine फेफड़ों के ट्यूमर से व्युत्पंन organotypic स्लाइस की पीढ़ी, खेती और व्यवस्थित विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । हम यह भी वर्णन कैसे टुकड़ा मोटाई के लिए अनुकूलित करने के लिए, और कैसे दवा सांद्रता का चयन करने के लिए ट्यूमर स्लाइस का इलाज ।

Abstract

Organotypic प्राथमिक ऊतक explant संस्कृतियों, जो परिशुद्धता कटौती स्लाइस शामिल हैं, तीन आयामी (3-डी) ऊतक वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से देशी ऊतक के कोशिकीय बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं । ऊतक स्लाइसें तुरंत हौसले से संप्रदाय ट्यूमर से कटौती intratumor विविधता के स्थानिक पहलुओं को बनाए रखने, इस प्रकार उंहें vivo जीव विज्ञान में के उपयोगी किराए बना । ऊतक टुकड़ा तैयारी और खेती की स्थिति के सावधान अनुकूलन ट्यूमर टुकड़ा explants के पूर्वानुमान नैदानिक क्षमता के लिए मौलिक है । इस संबंध में, murine मॉडल मूल्यवान हैं, के रूप में इन ट्यूमर सामग्री के एक सुसंगत प्रवाह प्रदान करने के लिए दोहराने और reproducible प्रयोगों प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल murine फेफड़ों के ट्यूमर के संवर्धन-व्युत्पंन ऊतक एक घूर्णन मशीन इकाई, एक प्रणाली है कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के लिए ऊतकों के आंतरायिक जोखिम को सक्षम बनाता है का उपयोग कर स्लाइस का वर्णन । हमारे पिछले काम से पता चला है कि मशीन घूर्णन के उपयोग के अंय संस्कृति के तरीकों की तुलना में ऊतक की व्यवहार्यता में सुधार, विशेष रूप से फ्लोटिंग स्लाइस और स्थिर फिल्टर का समर्थन करता है । यहां, हम आगे दिखाने के लिए कि स्लाइस मोटाई के कल्चरल स्लाइस की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, सुझाव है कि टुकड़ा मोटाई के अनुकूलन अलग ऊतक प्रकार के लिए किया जाना चाहिए । इस तरह के संकेत गतिविधियों, stromal सेल घुसपैठ या भेदभाव मार्करों की अभिव्यक्ति, दवा उपचार द्वारा बदल मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए आसंन ऊतक स्लाइस का आवश्यक मूल्यांकन के रूप में प्रासंगिक oncogenic कार्यों में स्पष्ट इथ, या खेती ही है. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल murine फेफड़ों के ट्यूमर स्लाइस और एक घूर्णन मशीन इकाई पर उनकी संस्कृति की पीढ़ी का वर्णन करता है और दर्शाता है कि कैसे स्लाइस व्यवस्थित विषम ऊतक मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए, के रूप में एक शर्त दवा की प्रतिक्रिया अध्ययन करने से पहले.

Introduction

ठोस ट्यूमर ऊतक, फेफड़ों के कैंसर सहित, प्रदर्शन आनुवंशिक और phenotypic विविधता, और बंदरगाह परिसर microenvironments1,2. ट्यूमर कोशिकाओं और दवा संवेदनशीलता और प्रतिरोध तंत्र3पर उनके आसपास के microenvironment प्रभाव के बीच एक साथ खेलना । यह सही ढंग से जैविक जटिलताओं और मूल ट्यूमर में अभिनय कार्यों मॉडल कर सकते हैं कि नैदानिक मॉडल के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला गया. सटीक-कट स्लाइस तुरंत ताजा ट्यूमर से व्युत्पंन एक अद्वितीय संसाधन प्रदान करते हैं, के रूप में वे vivo जीवविज्ञान में प्रतिनिधित्व करने के लिए एक प्रमुख क्षमता है, phenotypes स्थानिक एक व्यक्ति के ट्यूमर में वितरित सहित कम समय की एक छोटी खिड़की के लिए । संप्रदाय नैदानिक ट्यूमर कुछ व्यक्तिगत नमूनों में से एक है कि एक कैंसर रोगी से प्राप्त किया जा सकता है, और उनके नैदानिक उपयोग जांच के हकदार हैं ।

organotypic संस्कृतियों के इतिहास के जल्दी 19वीं सदी के लिए वापस तिथियां, जब मानव intracranial ट्यूमर हाथ ऊतक टुकड़ों में काट रहे थे और तथाकथित फांसी छोड़ विधि का उपयोग कर संस्कृति । ऊतक टुकड़े एक coverslip से जुड़े थे और heparinized मानव प्लाज्मा में डुबकी की अनुमति दी, जिसके बाद coverslips उल्टे थे, सील और कई हफ्तों के लिए संस्कृति4। मैंयुअल रूप से काट ट्यूमर टुकड़ों के बाद से अंय तरीकों की एक किस्म का उपयोग कर रहा है, जैसे प्लाज्मा थक्के5पर, तरल मीडिया6में, या ०.४५ µm ताकना आकार6फिल्टर पर । शब्द "organotypic" पहले १९५४ में इस्तेमाल किया गया था, चिकी भ्रूण नेत्र7के रेटिना भेदभाव पर एक अध्ययन में । इस अध्ययन के बाद किया गया है कि फेफड़े और दिल के ऊतकों explants लड़की भ्रूण8से व्युत्पंन, और मस्तिष्क explants से वयस्क चूहों9।

विभिन्न टुकड़ा करने की क्रिया पद्धतियों वर्णित किया गया है, अर्थात् मैनुअल हेलिकॉप्टरों10,11, Krumdieck ऊतक स्लाइसर12,13, और vibratomes11,14,15, 16. Krumdieck ऊतक स्लाइसर बेलनाकार ऊतक कोर है, जो फिर एक microtome का उपयोग कर परिपत्र ऊतक स्लाइस में कटा हुआ उत्पन्न करता है । एक vibratome, दूसरी ओर, एक हिल ब्लेड microtome का उपयोग करता है । जिगर स्लाइस पर एक अध्ययन में, यह दिखाया गया है कि Leica vibratome Krumdieck स्लाइसर के साथ तुलना में अधिक reproducible और संगत स्लाइस उत्पन्न करता है15. स्लाइस २५० से ५०० µm को लेकर मोटाई का इस्तेमाल किया गया है, और अध्ययन व्यवहार्यता और रूपात्मक सुविधाओं के रखरखाव की रिपोर्ट भी 16 दिनों तक14,10,17,18। हालांकि, ट्यूमर चर चयापचय प्रोफाइल है कि पोषक तत्वों की आवश्यकताओं को प्रभावित कर सकते हैं, और इस तरह के ऊतकों कठोरता और मैट्रिक्स संरचना के रूप में मापदंडों वातन और पोषक तत्व प्रवाह पर प्रभाव कर सकते हैं । इसलिए यह संभावना है कि प्रत्येक ऊतक प्रकार टुकड़ा करने की क्रिया और संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन की आवश्यकता है ।

विभिंन खेती के तरीकों को टुकड़ा संस्कृतियों का समर्थन किया गया है: i) स्टेशनरी दौर संस्कृति भी स्थिर समर्थन संस्कृति, जिसमें स्लाइसें एक अर्द्ध छिद्रित झिल्ली डालने के शीर्ष पर रखा जाता है संस्कृति माध्यम में डूबे । इस में, स्लाइस के शीर्ष हवा के संपर्क में है, जबकि नीचे छिद्रित सम्मिलित14,19के माध्यम से पोषक तत्वों के साथ पूरक है; ii) Trowel विधि, मूल रूप से संस्कृति पूरे अंगों या भ्रूण ऊतक स्लाइस करने के लिए विकसित की है । इस में, स्लाइस एक कॉटन शीट या एक मेटल ग्रिड द्वारा समर्थित फिल्टर के शीर्ष पर रखा जाता है, और फिल्टर संस्कृति माध्यम में भिगोया जाता है । ऊतकों को नम रखने के लिए, मध्यम की एक पतली परत20,21,22स्लाइस के शीर्ष पर जोड़ा जाता है । ये पहले दो तथाकथित हवा तरल दौर संस्कृतियों रहे हैं; iii) रोलर ट्यूब संस्कृतियों, जिसमें स्लाइसें मध्यम से युक्त एक प्लास्टिक ट्यूब के सपाट पक्ष के अंदर रखा जाता है, और धीमी गति से ट्यूब रोटेशन ऊतक एक चक्र के पहले भाग के दौरान मध्यम के साथ कवर किया जाता है कि यह सुनिश्चित करता है, या वातित दूसरे23के दौरान; iv) घूर्णन मशीन इकाइयों, जिसमें स्लाइसें आवर्तक रूप से पोषक तत्वों और वातन के साथ मध्यम को उजागर कर रहे हैं । रोलर ट्यूबों से अलग, इस विधि स्लाइस में छिद्रित टाइटेनियम ग्रिड के शीर्ष पर रखा जाता है 6 में रखा अच्छी तरह से प्लेट्स के माध्यम से मध्यम24।

ऊतक के टुकड़े से व्युत्पंन ठोस ट्यूमर तार्किक एक आकर्षक पूर्व vivo मॉडल जिसमें विरोधी कैंसर एजेंटों के उपचार प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए मौजूद है, के रूप में वे व्यवहार्यता के मूल्यांकन की अनुमति है, लक्षित मार्ग गतिविधि, और आणविक प्रोफाइल अपने मूल ट्यूमर microenvironment की उपस्थिति में एक विशिष्ट ट्यूमर की । हालांकि, मूल्यांकन करने के लिए कि क्या दवा प्रतिक्रियाओं में मापा ट्यूमर स्लाइसें सीटू प्रतिक्रियाओं में की भविष्यवाणी कर रहे हैं, यह किस हद तक ऊतक स्लाइसें कोशिका प्रसार जैसे ट्यूमर विशिष्ट जैविक कार्यों को बनाए रखने के लिए मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है, histopathology-विशिष्ट कोशिका विभेद या oncogenic संकेतात्मक गतिविधियाँ. यांत्रिक तनाव के प्रभाव के दौरान टुकड़ा तैयार करने, टुकड़ा हैंडलिंग, या संस्कृति दोनों ऊतक स्लाइस की गुणवत्ता और जैविक कार्यों पर प्रेरित रूपांतरों मौलिक सवाल कर रहे हैं, कसकर ट्यूमर को लागू करने की क्षमता से जुड़े-व्युत्पंन कार्यात्मक निदान के लिए स्लाइस ।

हमारे IMI वित्त पोषित संघ परियोजना PREDECT (http://www.predect.eu) बाहर सेट को व्यवस्थित इन मूलभूत प्रश्नों का पता, स्रोतों की एक किस्म से स्लाइस explants का अध्ययन करके । स्तन, प्रोस्टेट और फेफड़ों के कैंसर के मॉडल से व्युत्पंन स्लाइस का प्रयोग, इस संयुक्त प्रयास गुणात्मक पठन-बहिष्कार के साथ ही मात्रात्मक hematoxylin और eosin के रूप में अच्छी तरह से उपयोग (एच एंड ई)-readouts आधारित वायुमंडलीय ऑक्सीजन और स्थिर फिल्टर के लिए एक आवश्यकता को प्रदर्शित करने के लिए ७२ घंटे तक के लिए संस्कृतिपूर्ण स्लाइस की व्यवहार्यता को बनाए रखने का समर्थन करता है । इसके अलावा, immunohistochemistry (आइएचसी) ने सुसंस्कृत स्लाइस पर विश्लेषणों से पता चला कि अंतर-स्लाइस व्यवहार्यता ग्रैडिएंट, murine गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC), एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर), HIF1α और γH2AX से व्युत्पंन स्लाइस में परिगलन ढाल के रूप में सबूत स्तन कैंसर स्लाइस में ढाल, या एण्ड्रोजन रिसेप्टर (AR) अभिव्यक्ति ग्रेडिएंट में प्रोस्टेट कैंसर स्लाइस25. दिलचस्प है, murine NSCLC की 24 ज संस्कृतियों में अंतर-स्लाइस व्यवहार्यता ढाल एक घूर्णन मशीन इकाई में खेती द्वारा बचाया गया, और हमारे हाल के अध्ययन से पता चला कि व्यवहार्यता ७२ ज26के लिए बढ़ाया गया था । विशेष रूप से ऊपर की ओर सबसे व्यवहार्य26बनी हुई है, कि दवा प्रतिक्रिया विश्लेषण की पुष्टि के स्लाइस पर सबसे अच्छा ऊतक के इस तरफ से किया जाता है ।

हालांकि यह कैसे अब तक ऊतक स्लाइसें सीटू ट्यूमर कार्यों में दोहराऊंगा कर सकते है के रूप में एक सवाल बना हुआ है, वे बड़े पैमाने पर किया गया है विरोधी के लिए प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल कैंसर एजेंटों, लक्षित दवाओं सहित, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और कीमोथेरेपी एजेंटों 10,11,13,14,18,27। हम हाल ही में पता चला है कि murine NSCLC स्लाइसें प्रसार में गतिशील परिवर्तन दिखाने के लिए और खेती के बाद संकेतात्मक गतिविधियों oncogenic जब हौसले से कटौती 0 एच स्लाइस26की तुलना में । यह इंगित करता है कि यह जांचना महत्वपूर्ण है कि क्या सीटू जैविक कार्यों में लक्षित खेती के दौरान उचित रूप से संरक्षित है, गड़बड़ी अध्ययन करने से पहले । इन निष्कर्षों के बावजूद, हमें पता चला कि ट्यूमर स्लाइस लक्षित चिकित्सा के लिए स्थानिक प्रतिक्रिया मॉडल कर सकते हैं, बीच दवा उपचार संक्षिप्त रह (24 एच) और26संवर्धन की शुरुआत में शुरू कर रहे हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण मांयता की स्थापना और ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक पहलुओं का वर्णन, औषधीय दवा परीक्षण में अपने आवेदन करने से पहले ।

Protocol

इस अध्ययन में वर्णित सभी माउस प्रयोगों फिनिश राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड से दिशा निर्देशों का पालन करके प्रदर्शन किया गया था, और हेलसिंकी विश्वविद्यालय के प्रायोगिक पशु समिति और राज्य प्रांतीय द्वारा अनुमोदित किया गया दक्षिणी फिनलैंड के कार्यालय (license number ESAVI/9752/04.10.07/2015) ।

1. तैयारी टुकड़ा करने की क्रिया से पहले

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार रखें: vibratome नमूना धारक, vibratome बफर ट्रे, 10 सेमी कल्चरल प्लेट, 24-वेल प्लेट, 10 एमएल पिपेट, पिपेट बॉय, अपशिष्ट बैग, ७०% ेतोः एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में उपकरणों को संक्रमित करने के लिए, और ऊतक गोंद ।
  2. vibratome तैयार: ७०% ेतोः के साथ ब्लेड धारक पोंछ, एक नया ब्लेड देते हैं, और मैनुअल (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) में दिए गए निर्देशों के अनुसार एक vibrocheck प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: यह vibrocheck कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह ब्लेड के ऊर्ध्वाधर विक्षेपन को कम करता है और अच्छी गुणवत्ता स्लाइसें सुनिश्चित ।
  3. हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/ml streptomycin (HBSS + P/S) के साथ पूरक के साथ 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं भरें; बर्फ पर प्लेट रखें ।
  4. तैयार F12 संस्कृति मध्यम १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/एमएल streptomycin, 2 मिमी glutamax, 22 मिमी ग्लूकोज, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक ।
    नोट: ट्यूमर स्लाइस संस्कृति मध्यम और विकास कारक की खुराक25ट्यूमर ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  5. दवा उपचार के लिए F12 माध्यम की आवश्यक मात्रा तैयार करें, चरण १.४ में वर्णित समान संरचना का उपयोग करते हुए, लेकिन FBS का लोप करें ।
    नोट: के बाद से सीरम में वृद्धि कारकों oncogenic को प्रभावित कर सकते हैं, प्रसंस्कृत स्लाइस में संकेतन, सीरम मुक्त माध्यम अल्पकालिक दवा गड़बड़ी अध्ययन ट्यूमर स्लाइस पर के लिए सिफारिश की है. यदि दीर्घकालिक स्लाइस संस्कृतियों का विश्लेषण कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है पहले सीरम के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए ऊतक व्यवहार्यता और ट्यूमर पर अनुपचारित टुकड़ा संस्कृतियों में विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति मुक्त मध्यम ।

2. ट्यूमर का संग्रह-फेफड़ों असर

  1. Euthanize एक ट्यूमर-ग्रीवा अव्यवस्था से असर माउस जब यह परिश्रम सांस लेने और शरीर के वजन के नुकसान के लक्षण से पता चलता है ।
    नोट: CO2-मध्यस्थता इच्छामृत्यु फेफड़ों में hypoxic शर्तों को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, जो एक hypoxic प्रतिक्रिया को बटोरने के माध्यम से स्लाइस व्यवहार्यता या oncogenic गतिविधियों पर एक प्रभाव हो सकता है ।
  2. सभी चार पंजे में 30 ग्राम सुई डालने के द्वारा एक स्टायरोफोम ढक्कन पर euthanized माउस खिंचाव, ताकि छाती उजागर होता है ।
  3. छाती की ओर पेट से त्वचा को खोलें, और गर्दन क्षेत्र तक काटें । कट रिब पिंजरे खुला है, और फिर डायाफ्राम फेफड़ों और दिल को बेनकाब करने के लिए । टिशू की क्षति से बचने के लिए कैंची को angled पोजीशन में रखें ।
  4. काटना ट्यूमर-असर फेफड़ों को दिल से एक साथ और उन्हें ५० मिलीलीटर ट्यूब में रखते हैं जिसमें 30 मिलीलीटर बर्फ-शीत HBSS + P/ ट्यूब आइस-ठंडा रखें और जितनी जल्दी हो सके अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: फेफड़े के ट्यूमर के प्रसंस्करण में देरी oncogenic कार्यों को बदल सकते हैं, उदाहरण के मार्ग गतिविधियों संकेत के लिए ।

3. परिशुद्धता की पीढ़ी-कट फेफड़ों के ट्यूमर स्लाइस

  1. एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट में एक लामिना हूड के अंदर रखा HBSS + पी में ट्यूमर-असर फेफड़ों हस्तांतरण । बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग कर फेफड़ों पालियों अलग, और टुकड़ा करने की क्रिया के लिए सतह पर ट्यूमर के साथ पालियों का चयन करें ।
    नोट: ट्यूमर > आकार में 3 मिमी टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उपयुक्त हैं । के बाद से सामांय फेफड़ों के बड़े ट्यूमर चारों ओर ऊतक कठोरता में अंतर के कारण टुकड़ा करने की क्रिया समझौता, ट्यूमर ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के दौर से गुजर सामांय ऊतक से अलग किया जाना चाहिए, ऐसी है कि एक को मंजूरी दे दी ट्यूमर क्षेत्र vibratome ब्लेड चेहरे ।
  2. एक बाँझ स्केलपेल के साथ दूर ट्यूमर के चारों ओर है कि सामान्य फेफड़ों के ऊतकों के हिस्से को काटने के द्वारा एक फ्लैट ऊतक टुकड़ा सतह उत्पन्न, और cyanoacrylate चिपकने वाला की एक बूंद में फ्लैट स्लाइड डुबकी । vibratome के नमूना धारक पर इस ओर माउंट इतना है कि ट्यूमर एक ईमानदार स्थिति में ब्लेड चेहरे । 2-3 मिनट के लिए गोंद सूखी चलो ।
    नोट: सामांय फेफड़ों के नमूने धारक को चिपके ट्यूमर ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, और टुकड़ा करने की क्रिया से पहले सामांय ऊतक तक पहुंच जाता है बंद कर दिया है । ट्यूमर के ऊतकों को कई बार सामान्य फेफड़े के ऊतकों की चिमड़ा बनावट के कारण झुकता है, जो नमूना धारक से चिपक जाता है, अपनी ईमानदार स्थिति से समझौता कर लेता है । यदि ऐसा होता है, गोंद अतिरिक्त सामांय फेफड़ों का समर्थन पूर्व के बगल में ऊतक के एक टुकड़े को एक ईमानदार स्थिति में ट्यूमर को बनाए रखने के लिए सामांय फेफड़े के ऊतकों घुड़सवार (आंकड़ा 1a iii) ।
  3. धातु बफर ट्रे में नमूना धारक प्लेस और यह ठंडा HBSS + पी के साथ भरने के लिए जब तक ऊतक बफर में डूब गया है । सफेद बर्फ स्नान पर धातु बफर ट्रे प्लेस और बर्फ इतना जोड़ें ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया करते हुए शांत रखने के लिए ।
  4. vibratome के लिए सफेद बर्फ स्नान देते हैं । चुनें उपयुक्त टुकड़ा करने की क्रिया सेटिंग्स: आयाम 2.5 के बीच-2.8 के बीच लेकर, 0.10-0.14 एमएस के बीच टुकड़ा करने की क्रिया की गति, और एक काटने की मोटाई के बीच 160-250 µm लेकर ।
    नोट: टुकड़ा करने की क्रिया सेटिंग्स ऊतक की कठोरता के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है । मुश्किल ऊतक नरम ऊतक की तुलना में टुकड़ा करने के लिए आसान है, और नरम ऊतकों कम गति के साथ टुकड़ा करने की आवश्यकता है (0.1-0.12 ms) और उच्च आयाम (2.6-2.8). एक 4 – 5 मिमी बड़े ट्यूमर आम तौर पर प्रदान करता है 15 – २०० µ मीटर मोटाई के 20 स्लाइस. अल्पकालिक खेती के लिए, murine ट्यूमर लामिना हूड के बाहर अर्द्ध बाँझ शर्तों के तहत कटा हुआ जा सकता है । हालांकि, नैदानिक ट्यूमर हमेशा मानव ऊतक में संभव संक्रामक एजेंटों के लिए जोखिम से बचने के लिए एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा लामिना हूड के अंदर कटा हुआ होना चाहिए.
  5. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक 24-अच्छी तरह से बर्फ पर आयोजित की थाली के अलग कुओं में HBSS के 1 मिलीलीटर में स्लाइसें इकट्ठा, बारीकी से क्रम में स्लाइसें कटा रहे है का ट्रैक रखने । प्रायोगिक योजना के अनुसार 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं को चिन्हित करें । उदाहरण के लिए, संस्कृति समय अंक के रूप में या 0 एच, वाहन नियंत्रण (सी), दवा इलाज (टी) (आंकड़ा 1b द्वितीय) के रूप में एक 24 अच्छी थाली के अनुक्रमिक कुओं मार्क ।
    नोट: परेशान या ट्यूमर ऊतक खींच जबकि एक स्लाइस का संग्रह नहीं है, के रूप में यह ब्लेड के कोण के संबंध में ट्यूमर के उंमुखीकरण बदल जाएगा, बाद में स्लाइस की मोटाई में विसंगतियों के लिए अग्रणी ।
  6. सभी स्लाइसें एकत्र कर रहे हैं, तो उन्हें अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम की २.५ मिलीलीटर युक्त 6-अच्छी तरह से थाली में रखा टाइटेनियम ग्रिड (प्रति ग्रिड 2-3 स्लाइस) पर स्थानांतरण । सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले टाइटेनियम ग्रिड और मध्यम के बीच बना रहे हैं ।
    1. ग्रिड पर एक स्लाइस लोड करने के लिए, 6-well प्लेट को एक angled स्थिति में रखें जिससे कि मध् यम का एक हिस् सा ग्रिड को कवर कर सके और स्लाइस को ग्रिड पर मध् यम में रखे; संदंश का उपयोग करने के लिए टुकड़ा फैल अगर यह कर्ल । एक humidified मशीन के अंदर रखा घूर्णन मशीन पर 6-अच्छी तरह से प्लेटें लोड ९५% हवा और 5% CO2के साथ ३७ ° c पर रखा है, और रोटेशन चक्र शुरू (चित्रा 1C मैं-ii) ।
      नोट: धातुई ग्रिड और 6-अच्छी तरह से प्लेट घूर्णन इकाई पर मोड़ से पहले सही वजन संतुलित होने की जरूरत है । यह ग्रिड के बीच में स्लाइस की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण है ताकि वे पूरी तरह से रोटेशन चक्र के दौरान हवा और तरल चरणों के बीच वैकल्पिक । स्लाइस है कि बहुत कम या उच्च रखा जाता है उचित ऑक्सीजन या पोषक तत्वों को उजागर नहीं कर रहे है (चित्रा 1C मैं), जो ऊतक व्यवहार्यता समझौता कर सकते हैं । यह खेती के दौरान ग्रिड पर टुकड़ा की स्थिति का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में टुकड़ा कभी भी नीचे स्लाइड कर सकते हैं । यदि यह 1 के भीतर होता है, संस्कृति शुरुआत के 2 ज, अपनी स्थिति को सही और नीचे ध्यान दें कि इस नमूने क्षतिग्रस्त हो सकता है । स्लाइस है कि समय की एक विस्तारित अवधि के लिए गलत है खारिज कर दिया जाना चाहिए, के रूप में ऊतक व्यवहार्यता काफी अनुचित ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति से प्रभावित है ।
  7. एक 0 ज, अनकल्चरल, संदर्भ के रूप में एक ऊतक स्लाइस के सन्निकट ले लीजिए । कटा हुआ जा रहा है ऊतक के शीर्ष, मध्य और केंद्र का प्रतिनिधित्व करने के लिए कम से कम तीन संदर्भ स्लाइस लीजिए. ठीक 0 एच स्लाइसें तुरंत और प्रक्रिया के रूप में ५.१ में वर्णित है ।
    नोट: स्लाइस की संख्या सीमित है, उदाहरणके लिए, यदि एकाधिक यौगिक उपचार या तकनीकी प्रतिकृति किया जाता है, अपने पड़ोसी 0 एच नमूना के साथ प्रत्येक इलाज नमूना की तुलना मुश्किल हो सकता है. ऐसे मामलों में, निकटतम 0 एच स्लाइस का उपयोग करें (कम-से-600 µm के अलावा) संबंधित ऊतक व्यवहार्यता या संस्कृति शुरुआत में प्रासंगिक मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए ।
  8. लंबी अवधि की खेती के लिए प्रतिदिन संस्कृति माध्यम की भरपाई करें । ऊतकों को बाँझ संदंश का उपयोग स्लाइस युक्त ग्रिड लिफ्ट, और यह 6 अच्छी तरह से प्लेट की एक खाली कुआं में जगह; ताजा संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम के ७०% की जगह है, और ग्रिड मध्यम में वापस जगह है । चरण ३.६ में बताया गया के रूप में रोटेशन चक्र जारी रखें ।

4. छोटे अणु अवरोधकों के साथ ट्यूमर स्लाइस का उपचार

  1. उपचार माध्यम में यौगिकों की आवश्यक सांद्रता तैयार करें । आमतौर पर, सेल संस्कृतियों में मापा IC50s की तुलना में एक 10 गुना उच्च दवा एकाग्रता ऊतक स्लाइस में लक्ष्य अवरोध को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. विशिष्ट cytotoxicity से बचने के लिए, प्रत्येक यौगिक के लिए न्यूनतम प्रभावी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण करें । यहां, हम परीक्षण 0.1 – 1 µ m के PI3K/mTOR अवरोध करनेवाला dactolisib और 0.05 – 0.5 µ खल्क के selumetinib murine स्लाइस पर NSCLC अवरोधक ।
  2. 6-well प्लेट में पतला दवा या DMSO या अन्य वाहन नियंत्रण के साथ २.५ मिलीलीटर मीडिया जोड़ें । टाइटेनियम ग्रिड कुओं में रखें ।
  3. ३.६ कदम में वर्णित के रूप में ग्रिड पर ऊतक स्लाइस प्लेस ।
  4. धारा 5 में वर्णित के रूप में आयल ब्लॉक में ऊतक निर्धारण और स्लाइस के प्रसंस्करण के साथ आगे बढ़ना 24 एच. के लिए वाहन या नशीली दवाओं के उपचार करते हैं ।
    ध्यान दें: दवा उपचार की अवधि के प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, ध्यान में ऊतक स्लाइस की क्षमता के लिए सीटू ऊतक संस्कृति अवधि के दौरान विश्लेषण कार्यों में बनाए रखने के लिए ले ।

5. निर्धारण और ऊतक स्लाइस के प्रसंस्करण

  1. ध्यान से एक फिल्टर पंजाब में लथपथ कागज पर अनकल्चरल 0 एच संदर्भ या प्रसंस्कृत टुकड़ा उठा ।
    1. ऐसा करने के लिए, एक 10 सेमी की थाली में पंजाब के 2-3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, ' पंजाबियों में स्लाइस फ्लोट और ' मछली यह संदंश की एक जोड़ी के साथ फिल्टर कागज पर टुकड़ा उठाने से बाहर ।
    2. फ़िल्टर पेपर को एक histocassette में स्थानांतरित करें और बाद में संसाधित होने वाले चरणों (चित्र 1 d) के दौरान स्लाइस की स्थिति को चिह्नित करने के लिए ऊतक स्लाईस के ऊपर पतला hematoxylin (1:1 के पानी में) की एक बूंद डालें ।
    3. कैसेट बंद करें, और यह 4% तटस्थ बफर formalin समाधान में स्थानांतरण । 4 ° c पर रात भर ऊतकों को ठीक करें ।
      नोट: स्लाइस को फ़िल्टर काग़ज़ के शीर्ष पर रखने के दौरान, सुनिश्चित करें कि स्लाइस का शीर्ष अनुभाग ऊपर की ओर हो रहा है; यह चरण ६.३ में वर्णित के रूप में अनुभागीकरण और विश्लेषण के दौरान एक स्लाइस के ऊपर, मध्य, और नीचे अनुभाग का पालन करने के लिए आवश्यक है ।
  2. अगले दिन, ७०% ेतोः में कैसेट स्थानांतरण, और तुरंत आयल-embedding ऊतक प्रसंस्करण कदम के साथ आगे बढ़ना ।
  3. ऊतक प्रसंस्करण से पहले, 10 मिनट प्रत्येक के लिए १००% ेतोः 2x में histocasettes धो लो । इस मामले में, ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक माइक्रोवेव स्टेशन का उपयोग करें । 1 मिमी ऊतक मोटाई के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम का चयन करें और मैनुअल (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) में दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
    नोट: अन्य ऊतक प्रसंस्करण मशीनों का उपयोग करते समय, पतले ऊतक नमूनों के लिए उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग करें.
  4. आयल-embedding के लिए, एक histocassette खोलें और फ़िल्टर काग़ज़ से स्लाइस को सावधानीपूर्वक उठाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें । फ़िल्टर कागज त्यागें, और एक तरल तेल युक्त मोल्ड में टुकड़ा हस्तांतरण ।
    1. एंबेडिंग मोल्ड के नीचे के खिलाफ ऊतक प्रेस, उदाहरण के लिए एक फ्लैट वजन के साथ, यहां तक कि अनुभाग सुनिश्चित करने के लिए । मोल्ड के शीर्ष पर histocasette के नीचे भाग प्लेस, मोल्ड 30 मिनट के लिए एक ठंडी खोपड़ी पर ठंडा है, और तेल ब्लॉक से मोल्ड अलग ।
      नोट: क्षैतिज embedding के लिए एक विकल्प के रूप में, यह एक ईमानदार स्थिति में टुकड़ा स्थिति से खड़ी ट्यूमर टुकड़ा एंबेड करने के लिए संभव है । अनुलंब अनुभाग आसानी से किसी एकल अनुभाग 25पर व्यवहार्यता या कार्यात्मक मार्कर व्यंजक में ग्रेडिएंट का विश्लेषण करने की अनुमति देते हैं. क्षैतिज-एंबेडेड स्लाइस के साथ ग्रेडिएंट विश्लेषण को आयल सेक्शनिंग की आवश्यकता है जैसा कि चरण ६.२ में वर्णित है ।

6. प्रसंस्करण और Formalin-फिक्स्ड और आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों का विश्लेषण

  1. एक microtome का उपयोग FFPE ऊतक टुकड़ा ब्लॉक के 4 µm पतले वर्गों को तैयार करें । जब अनुभाग, ब्लॉक की सतह क्षैतिज ब्लेड के संबंध में उन्मुख है कि ब्लॉक के कोण को समायोजित करें; यह ऊतक भर में भी वर्गों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
  2. एक संभावित संस्कृति-प्रेरित व्यवहार्यता ग्रेडिएंट, कक्ष माइग्रेशन को स्लाइस में, या सभी कल्चर्ड स्लाइसेस में, या तो, शीर्ष, केंद्र और नीचे की परतों से ऊतक स्लाइस में प्रत्येक ऑब्जेक्ट स्लाइड पर अनुभागों को एकत्रित करें पर कैप्चर सक्षम करने के लिए के रूप में नीचे बताया ।
  3. कांच स्लाइड के ऊपरी भाग पर सबसे पहले आयल-एंबेडेड ऊतक स्लाइस के अनुक्रमिक ऊतक वर्गों लीजिए । कांच स्लाइड के नीचे भाग के बाद बीच में गहरी ऊतक परतों के वर्गों का संग्रह जारी (चित्रा 1E) ।
    नोट: एक गिलास स्लाइड पर तीन वर्गों को समायोजित करने के लिए, दूर तेल के अतिरिक्त ट्रिम कर दीजिए एंबेडेड ऊतक टुकड़ा आसपास के ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सूखे के लिए वर्गों की अनुमति दें, और एच एंड ई धुंधला या immunohistochemistry के रूप में नीचे वर्णित के साथ आगे बढ़ें ।
    नोट: FFPE अनुभागों उच्च तापमान पर या समय की विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत किए जाते हैं, जब antigenicity की हानि हो सकती है । आयल सेक्शन को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करने की सिफारिश की जाती है, और आइएचसी विश्लेषण अनुभाग के बाद 6 महीने के भीतर किया जाना चाहिए ।
    1. एच एंड ई के लिए धुंधला, deparaffinize और इस प्रकार के रूप में आयल के वर्गों rehydrat: 5 मिनट के लिए xylene 3x, 1 मिनट के लिए १००% ेतोः 3x, 1 मिनट के लिए ९६% ेतोः 2x, ७०% ेतोः 1x 1min, और 1 मिनट के लिए पानी 2x ।
    2. 10 मिनट के लिए ताजा फ़िल्टर्ड hematoxylin समाधान में वर्गों की मशीन, और 5 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के नीचे धो लो । एसिड अल्कोहल में वर्गों डुबकी (1% ७०% ेतोः में एचसीएल) 2 बार के लिए, और 2 मीटर के लिए ०.५% eosin के साथ मशीन द्वारा पीछा किया 5 मिनट के लिए चल रहे नल के नीचे पानी के नीचे धोने अंदर.
    3. eosin कदम के बाद, शराब और xylene समाधान में स्लाइड विसर्जित द्वारा वर्गों निर्जलीकरण, इस प्रकार है: ९६% ेतोः 2x के लिए 15 एस, १००% ेतोः 3x के लिए 30 एस, xylene 1 मिनट के लिए 3x । अंत में, एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम में वर्गों एंबेड ।

7. ऊतक व्यवहार्यता और अगोचर अभिव्यक्ति का विश्लेषण

  1. स्कैनर का उपयोग करके एच एंड ई-सना स्लाइड की पूरी स्लाइड स्कैन जेनरेट करके उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां प्राप्त करना । ऊतक व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, शीर्ष, मध्य और निचले वर्गों के स्लाइस का प्रतिनिधित्व ऊतक स्कैन से स्नैपशॉट ले ।
    1. फोटो जोड़तोड़ सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, मैन्युअल रूप से ऊतकों के गल क्षेत्रों पर मास्क आकर्षित, MATLAB का उपयोग कर गल क्षेत्रों के ठहराव द्वारा पीछा किया ।
    2. हमारे पिछले अध्ययन (Närhi एट अल., चित्रा S2B और सी)26में किया के रूप में निकटतम 0 एच टुकड़ा की तुलना में अलग समय अंक के लिए खेती स्लाइस के सापेक्ष व्यवहार्यता की गणना । इसी प्रकार, एक कल्चरल स्लाइस के शीर्ष, मध्य और निचले भाग में व्यवहार्यता को बढ़ाता है और प्रत्येक अनुभाग की सापेक्ष व्यवहार्यता की गणना अपने निकटतम 0 h स्लाइस करने के लिए संभावित अंतर-स्लाइस व्यवहार्यता ग्रेडिएंट का आकलन करें ।
      नोट: जबकि murine NSCLC स्लाइस की मात्र खेती गल कोशिका मृत्यु लाती है, पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं ट्यूमर ऊतक के आधार पर बदलती हैं । उदाहरण के लिए, HIF1α, ER, और मैक्रोफेज के रूप में चिह्नित F4/80 फ़िल्टर-समर्थित स्लाइस संस्कृतियों में एक स्तन कैंसर मॉडल25से व्युत्पंन पाया गया । इसलिए, एच एंड ई के रूप में अच्छी तरह के रूप में आइएचसी-आधारित विश्लेषण के लिए एक ऊतक के प्रकार के लिए विचार किया जाना चाहिए ।
  2. तेल वर्गों पर आइएचसी प्रदर्शन करते हैं । निंनलिखित आइएचसी प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक बिंदु है, और अंय एंटीबॉडी के लिए और अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है । संक्षेप में, deparaffinize और के रूप में आयल वर्गों rehydrat इस प्रकार है: 5 मिनट के लिए xylene 3x, 1 मिनट के लिए १००% ेतोः 3x, 1 मिनट के लिए ९६% ेतोः 2x, 1 मिनट के लिए ७०% ेतोः 1x, और 1 मिनट के लिए पानी 2x ।
    1. प्रतिजनी epitopes को बेनकाब करने के लिए, एक पीटी मॉड्यूल में पीएच 6 में 10 मिमी साइट्रिक एसिड का उपयोग कर गर्मी मध्यस्थता प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ अवरुद्ध और 10% सामांय बकरी सीरम (NGS) 1x पंजाब में परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए (21-23 डिग्री सेल्सियस) के बाद ।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी 1% BSA और 1x पंजाब में 5% NGS में पतला गर्मी, या तो 1 के लिए-परिवेश के तापमान पर 2 ज । विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन, परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए, 3, 3 '-Diaminobenzidine (ढाब) का उपयोग कर पता लगाने के बाद ।
    3. वर्गों hematoxylin के साथ counterstained है (जल में 1:10 को पतला) 30 एस के लिए, और 5 मिनट के लिए नल का पानी के नीचे धोने, शराब और xylene समाधान में स्लाइड विसर्जित करके निर्जलीकरण द्वारा पीछा किया, इस प्रकार है: ७०% ेतोः 1x, ९६% ेतोः 2x, १००% ेतोः 3x, xylene 3x ( 1 मिनट प्रत्येक चरण) । अंत में, एक xylene आधारित बढ़ते माध्यम में वर्गों एंबेड ।
  3. आइएचसी-सना हुआ स्लाइड की पूरी स्लाइड स्कैन प्राप्त करें, उन्हें एक छवि व्यूअर का उपयोग कर का उपयोग कर 1:4 के आवर्धन अनुपात पर TIFF छवियों के रूप में निर्यात करें, और ImageJ का उपयोग कर quantifications प्रदर्शन ।
    नोट: स्कैनर के लिए एक विकल्प के रूप में, 20X या 40X आवर्धन पर सूक्ष्म छवियों quantifications के लिए प्राप्त किया जा सकता है । छवि आवर्धन quantified होने के लिए मार्कर के आधार पर चुना जा सकता है; cytoplasmic या झिल्ली मार्करों 20X छवियों का उपयोग quantified किया जा सकता है, जबकि उच्च इज़ाफ़ा छवियों, परमाणु धुंधला के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।
    1. परमाणु मार्कर के ठहराव के लिए, इस मामले NKX2-1 अभिव्यक्ति में, फिजी-ImageJ का उपयोग कर 16-bit छवियों के लिए प्रत्येक छवि कंवर्ट, और छवि विश्लेषण के लिए छवियों को अपलोड करें ।
    2. विश्लेषण के आधार पर छवि विश्लेषण पाइपलाइन को अनुकूलित करें । इस प्रोटोकॉल में NKX2-1 के ठहराव के लिए निंन पाइपलाइन का उपयोग करें धनात्मक नाभिक: प्राथमिक ऑब्जेक्ट्स की पहचान । मापने वस्तु तीव्रता । फ़िल्टर ऑब्जेक्ट्स (ंयूनतम मान = 0.0025) । गणित की गणना । परिणाम नाभिक की कुल संख्या के ढाब दाग नाभिक के प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

Representative Results

चित्रा 1 पीढ़ी, खेती और सटीक कटौती ऊतक murine NSCLC ट्यूमर से व्युत्पंन स्लाइस के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रदर्शन के लिए, हम एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से ट्यूमर का उपयोग (GEMM) Lkb1 के नुकसान के साथ एक साथ KrasG12D के सशर्त सक्रियण बंदरगाह (भी Serine/Threonine कळेनासे 11 के रूप में जाना), इसके बाद बुलाया केरल. माउस प्रजनन और फेफड़ों के ट्यूमर दीक्षा26,28में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया था । चित्रा 2a के लिए एक घूर्णन मशीन इकाई का उपयोग कर 24 एच के लिए संस्कृतिया स्लाइस की व्यवहार्यता पर ऊतक टुकड़ा मोटाई के प्रभाव को दर्शाता है । परिणामों से पता चलता है कि १६० µm पतले स्लाइस टुकड़ा भर में बड़े गल क्षेत्रों होते हैं । इसके अलावा, २५० µm पतले स्लाइसें २०० µm पतले स्लाइस की तुलना में स्लाइस में एक परिगलन ढाल दिखाते हैं । यह संभावना है कि सबसे पतले १६० µm की समग्र व्यवहार्यता ग्रिड के शीर्ष पर स्लाइस की स्थिति के दौरान तकनीकी हैंडलिंग के कारण होता है, के रूप में इन नाजुक है और कर्ल करते हैं । दूसरी ओर, जब स्लाइसें बहुत मोटी हैं, वे स्लाइस में ऑक्सीजन या पोषक तत्व प्रसार में कमी करने के लिए प्रवण हो सकता है, जो murine NSCLC explants में गल मौत ढाल25के रूप में सबूत है । तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चर मोटाई के साथ स्लाइसें एक ट्यूमर से उत्पंन किया जा सकता है, समान vibratome सेटिंग्स के उपयोग के बावजूद । इसलिए यह विभिन्न ट्यूमर के नमूनों से कई दोहराने का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है. महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक ऊतक प्रकार टुकड़ा मोटाई अनुकूलन की आवश्यकता है अधिकतम व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए, के रूप में ऊतक बनावट और कठोरता ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रवाह को प्रभावित कर सकते हैं । चित्र b -2c NKX2-1 अभिव्यक्ति की मात्रात्मक आइएचसी विश्लेषण दिखाता है, नमूनों में अच्छी तरह से विभेदित फेफड़े ग्रंथिकर्कटता (एसी) का एक मार्कर ७२ एच तक की खेती की और 0 एच स्लाइस का मिलान किया. परिणाम बताते है कि NKX2-1 अभिव्यक्ति के रूप में 0 ज के लिए कल्चरल स्लाइसें में काफी बदल नहीं है, यह सुझाव है कि खेती की प्रक्रिया खुलकर एसी ट्यूमर ऊतक के भेदभाव की स्थिति को प्रभावित नहीं करता है । चित्रा 2d लक्षित दवाओं की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए ट्यूमर ऊतक स्लाइस की उपयोगिता को दर्शाता है । हम हाल ही में दिखाया गया है कि Kras उत्परिवर्ती murine ACs प्रदर्शन उच्च अभिव्यक्ति की phosphorylated ERK1/2 (बढ़ा MAPK मार्ग गतिविधि अंकन) जब adenosquamous (ए एस सी) ट्यूमर की तुलना में, phosphorylated 4EBP1 की अभिव्यक्ति (अंकन mTOR गतिविधि ) इसी तरह एसी और ए एस सी ट्यूमर दोनों में व्यक्त की है । परीक्षण करने के लिए अगर इन रास्ते को प्रभावी ढंग से ऊतक के स्लाइस पर निशाना बनाया जा सकता है, एल. ए. एसी ऊतक स्लाइस यौगिकों की DMSO या titrated मात्रा के साथ इलाज किया गया, अर्थात् 0.1 – 1 µ m dactolisib mTOR मार्ग या 0.05 – 0.5 µ m selumetinib लक्ष्य MAPK मार्ग को लक्षित करने के लिए. परिणाम बताते है कि 1 µ m dactolisib या ०.५ selumetinib के µ मीटर फास्फारिलीकरण या 4EBP1 के ERK1 में बाधा में प्रभावी रहे है/ इसके अलावा, लक्षित phosphoproteins की खुराक पर निर्भर अवरोध इंगित करता है कि ऊतक स्लाइस भी फास्फारिलीकरण-विशिष्ट एंटीबॉडी मान्य करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1: स्थापना और murine NSCLC ट्यूमर-व्युत्पंन स्लाइस explants के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (अ) योजनाबद्ध संग्रह और ट्यूमर-टुकड़ा करने की क्रिया के लिए फेफड़ों असर की तैयारी का वर्णन । फेफड़ों पालियों एक माउस से काटा जाता है और ट्यूमर ऊतक सामांय ऊतक से दूर विच्छेदित है । काले arrowhead और तारे लगभग 4 मिमी और 1 मिमी ट्यूमर, क्रमशः संकेत मिलता है । सफेद arrowhead नमूना धारक की सतह से चिपके फेफड़े के ऊतकों को इंगित करता है । सामान्य फेफड़ों का समर्थन ऊतक के एक अतिरिक्त टुकड़ा पर लाल तीर अंक एक ईमानदार स्थिति में ट्यूमर को बनाए रखने के लिए. (ख) Vibratome टुकड़ा करने की क्रिया और ऊतक स्लाइस का संग्रह । सफेद तीर टुकड़ा करने की दिशा को इंगित करता है । अनुक्रमिक स्लाइस का संग्रह 24-well प्लेट युक्त कोल्ड HBSS + P/ स्लाइसें या तो अलग समय अंक (यहां, 24-72 एच) के लिए संस्कृति की खेती के दौरान ट्यूमर विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है (शीर्ष पंक्ति), या दवा उपचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । C: वाहन नियंत्रण, टी: दवा उपचार । (ग) घूर्णन मशीन इकाइयों का उपयोग कर खेती के लिए ऊतक टुकड़ा रखकर । 6-अच्छी तरह से थाली झुकाव है कि कुछ मध्यम ग्रिड के शीर्ष को शामिल किया गया, मध्यम के शीर्ष पर ग्रिड के बीच में ऊतक टुकड़ा जगह है, और संदंश का उपयोग टुकड़ा फैल गया । सुनिश्चित करें कि 6 अच्छी तरह से प्लेटें वजन एक चिकनी रोटेशन चक्र के लिए संतुलित कर रहे हैं । X: गलत इंगित करता है, Equation और: स्लाइस की सही स्थिति इंगित करता है । (घ) एक ट्यूमर टुकड़ा के FFPE ब्लॉक के फोटोग्राफ । तेल में काला तीर अंक-एंबेडेड ऊतक hematoxylin के साथ दाग टुकड़ा । (ङ) FFPE ब्लॉकों में स्लाइसों के अनुभागात्मक क्रम को दर्शाने वाली योजनाबद्ध; इन वर्गों के लिए ऊतक व्यवहार्यता और ट्यूमर-विशिष्ट की अभिव्यक्ति की उपयोगिता का आकलन संसाधित किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: व्यवहार्यता और histotype-विशिष्ट मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन, और NSCLC ऊतक स्लाइस पर लक्षित दवा उपचार । (क) प्रतिनिधि एच एंड ई छवियों का संकेत मोटाई के एसी NSCLC स्लाइस की 24 H. २०० µm पतले स्लाइस १६० µm या २५० µm पतले स्लाइस की तुलना में बेहतर व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए संस्कृति । डार्क ब्लू एच एंड ई सना हुआ व्यवहार्य ऊतक का प्रतिनिधित्व करता है, और गुलाबी pseudocoloredी क्षेत्रों को इंगित करता है । हल्के नीले या तो गरीब ऊतक गुणवत्ता या रेशेदार स्ट्रोमा की उपस्थिति के कारण विश्लेषण से बाहर रखा क्षेत्रों को इंगित करता है । T1 और टी 2 जैविक दो अलग ट्यूमर से व्युत्पंन प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = ५०० µm. (B) प्रतिनिधि आइएचसी छवियां NKX2-1 अभिव्यक्ति के एसी स्लाइस में इंगित समय बिंदुओं के लिए कल्चरित । तीर उच्च आवर्धन में दिखाए गए क्षेत्र को इंगित करता है । परिणाम दिखाते है कि NKX2-1 अभिव्यक्ति 0 h स्लाइस की तुलना में cultureed स्लाइस में परिवर्तित नहीं है । स्केल बार = ५०० µm और ५० µm क्रमशः कम और उच्च आवर्धन के लिए । (C) (B) में दर्शाए गए डेटा का ठहराव. (घ) 0 ज स्लाइस में phosphorylated 4EBP1 या pERK1/2 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि आइएचसी छवियों, या DMSO या titrated की dactolisib मात्रा के साथ व्यवहार स्लाइस (dact, शीर्ष पंक्ति) या phosphorylated pERK1/2 अभिव्यक्ति में 0 एच स्लाइस, या स्लाइस DMSO के साथ इलाज या selumetinib (चयन, निचली पंक्ति) । काले वर्ग बक्से उच्च आवर्धन में दिखाया क्षेत्रों का संकेत है । स्केल बार = 1 मिमी या ५० µm कम या उच्च आवर्धन के लिए, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इन विट्रो में विभिन्न जटिल 3d संस्कृतियों और organoids सहित ट्यूमर मॉडल, वास्तुकला और oncogenic कार्यों के दोहराऊंगा के लिए विकसित किया गया है vivo ट्यूमर ऊतक में29,30. हालांकि, 3 डी संस्कृतियों या organoids की स्थापना ऊतक पृथक्करण और एक एकल सेल प्रकार या सह एक कृत्रिम वातावरण में कुछ सेल प्रकार का चयन की संस्कृति के चयनात्मक वृद्धि शामिल है । एक परिणाम के रूप में, इस तरह के मॉडल पूरी तरह से ट्यूमर विविधता और ट्यूमर-स्ट्रोमा बातचीत की जटिलताओं पर कब्जा । Organotypic ट्यूमर स्लाइस, दूसरी ओर, ऊतक वास्तुकला और सीटू ट्यूमर में की जैविक जटिलताओं को बनाए रखने, व्यापक हेरफेर के बिना. ऊतक स्लाइस की यह क्षमता उनके पैतृक microenvironment में मॉडल ट्यूमर कोशिकाओं के लिए उन्हें विशेष रूप से नैदानिक अध्ययन के लिए आकर्षक प्रदान करता है. हम पहले स्थापना और परिशुद्धता के विश्लेषण में कटौती ट्यूमर स्लाइस के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह की रिपोर्ट, और पता चला है कि, फिल्टर का समर्थन करता है की तुलना में, एक घूर्णन गर्मी इकाई अल्पकालिक murine NSCLC टुकड़ा संस्कृतियों25 की व्यवहार्यता में सुधार , 31. हालांकि, घूर्णन इकाइयों पर खेती तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और निरंतर निगरानी की आवश्यकता है । हम यहाँ ट्यूमर ऊतक के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान स्लाइस पीढ़ी और उन्हें संस्कृति के लिए एक घूर्णन मशीन इकाई के व्यावहारिक उपयोग, साथ ही साथ तरीकों को सीटू ट्यूमर जीव विज्ञान में कब्जा करने के लिए स्लाइस की क्षमता पर नजर रखने के लिए, एक शर्त दवा से पहले प्रतिक्रिया परीक्षण ।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम ऊतक अखंडता और ट्यूमर स्लाइस की व्यवहार्यता सुनिश्चित करते हैं । यदि सामान्य फेफड़ों के ऊतकों ट्यूमर के चारों ओर, vibratome असंगत मोटाई के साथ स्लाइसें उत्पन्न कर सकते हैं या स्लाइस को नुकसान, सामान्य और ट्यूमर ऊतकों के बीच बनावट और जकड़न में अंतर के कारण. यह इस प्रकार ट्यूमर टुकड़ा करने की क्रिया से पहले आसपास के सामांय फेफड़े के ऊतकों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक और महत्वपूर्ण कदम टुकड़ा करने की क्रिया मोटाई है, जो ध्यान से प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए है । इसके अलावा, एक बार कटा हुआ, यह टुकड़ा लगभग ग्रिड के बीच में रखा जाता है कि महत्वपूर्ण है, तो संस्कृति मध्यम और ऑक्सीजन जोखिम में सूई सटीक आंतरायिक सुनिश्चित करने के लिए । अंत में, यह अपने रोटेशन अवधि के दौरान एक स्लाइस की स्थिति का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में एक टुकड़ा नीचे में मध्यम करने के लिए ड्रॉप कर सकते हैं; यदि ऐसा होता है, तो आगे कार्रवाई प्रोटोकॉल के चरण ३.६ में समझाया गया के रूप में लिया जा सकता है ।

अखंडता को आश्वस्त करने के लिए ऊतक हैंडलिंग के अलावा, वहाँ भी आइएचसी विश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम की व्याख्या कैसे टुकड़ा देशी ऊतक जैसा दिखता है । हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि murine NSCLC ट्यूमर प्रदर्शित oncogenic संकेतन26गतिविधियों में अंतर-ट्यूमर स्थानिक विविधता स्पष्ट । इसका मतलब यह है कि नियंत्रण या दवा के इलाज के नमूनों के लिए विशेष रूप से अलग ऊतक स्लाइस का उपयोग विश्वसनीय प्रयोगात्मक डेटा व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं, और इसलिए बारीकी से आसंन स्लाइस नियंत्रण और परीक्षण नमूनों के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हम आगे दिखाया गया है कि जब प्रसार या oncogenic phosphoprotein अभिव्यक्ति हौसले में कटौती 0 एच स्लाइसें सीटू ट्यूमर में समान थे, प्रसंस्कृत स्लाइसें बदल oncogenic phosphoprotein अभिव्यक्ति दिखाया, विशेष रूप से बदल p4EBP1 और pSRC, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बदल Ki67 आइएचसी द्वारा विश्लेषण प्रसार । बदल p4EBP1 अभिव्यक्ति इसी तरह 24 एच मानव NSCLC और प्रोस्टेट कैंसर स्लाइस संस्कृतियों (नरही एट अल., अनुपूरक चित्रा S3B-S3C, S5 और S7)26में पाया गया । इन निष्कर्षों का समर्थन है कि उनके निकटतम 0 ज के साथ संस्कृतिपूर्ण स्लाइस की तुलना संस्कृतिपूर्ण स्लाइस में सीटू ट्यूमर कार्यों के संरक्षण का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

organotypic स्लाइस25की व्यवहार्यता में सुधार के बावजूद, तकनीकी के मामले में रोटेटर प्रणाली के साथ सीमाएं हैं । टाइटेनियम ग्रिड पर ऊतक स्लाइस रखने फिल्टर आवेषण की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है, और एक घूर्णन मशीन इकाई उपलब्ध नहीं हो सकता है । एक विकल्प के रूप में, स्थिर फिल्टर का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन उस मामले में केवल हवा से उजागर की ओर स्लाइस का विश्लेषण किया जाना चाहिए, के रूप में हवा में फिल्टर ढाल व्यवहार्यता और हाइपोक्सिया HIF1α अभिव्यक्ति द्वारा मापा में तेजी से गठन कर रहे हैं फ़िल्टर समर्थित स्लाइस संस्कृतियों (Davies एट अल., चित्रा 5 और चित्रा 7A-7B)25। हम आगे दिखाया है कि ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों बदल प्रसार और oncogenic अपने मूल ट्यूमर26की तुलना में संकेतात्मक गतिविधियों का प्रदर्शन कर सकते हैं, संभवतः क्योंकि घाव भरने प्रतिक्रियाओं या स्लाइस के चयापचय अनुकूलन के पूर्व vivo संस्कृति३२. हालांकि murine NSCLC ट्यूमर की सकल रूपात्मक सुविधाओं ७२ एच खेती के दौरान बनाए रखा गया था, संस्कृति प्रेरित प्रफलन परिवर्तन खेती के स्लाइस की सटीक ग्रेडिंग को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, ऊतक स्लाइस केवल अल्पकालिक कार्यात्मक अध्ययन के लिए उपयोग किया जाना चाहिए ।

एक घूर्णन मशीन इकाई का प्रयोग कम से आंशिक रूप से, विशेष रूप से संस्कृति के पहले 24 घंटे के दौरान अंतर-स्लाइस व्यवहार्यता या अगोचर अभिव्यक्ति ढाल, बचाता है । एक बार अखंडता और समारोह के लिए मांय, इस तरह के दवा उपचार के अध्ययन के रूप में कार्यात्मक अध्ययन के लिए ऊतक सामग्री प्रदान करता है । दवा की प्रतिक्रिया की रूपरेखा के अलावा, बदल लक्ष्य की अभिव्यक्ति निंनलिखित दवा उपचार भी एंटीबॉडी सत्यापन लाभ उठा सकते हैं । यह माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ murine epitopes का पता लगाने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, के रूप में इन उच्च धुंधला पृष्ठभूमि दे देते हैं । इसके अलावा, अच्छी तरह से मान्य एंटीबॉडी नैदानिक और नैदानिक सेटिंग्स में विश्वसनीय और reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. इस प्रकार, बहुतायत या फास्फारिलीकरण के ऊतकों स्लाइस में दवा उपचार के बाद प्रासंगिक epitopes के मॉडुलन एंटीबॉडी सत्यापन में एक आसान व्यावहारिक अनुप्रयोग प्रदान करता है । ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों का एक प्रमुख लाभ स्थानिकी-oncogenic संकेतन गतिविधियों या ट्यूमर या stromal कोशिकाओं में दवा की प्रतिक्रिया, जो उन्हें एक आकर्षक पूर्व vivo मॉडल बनाता है सहित वितरित कार्यों, मॉडल करने की क्षमता है. हालांकि, स्लाइसें खेती के दौरान घुमाएं, और खेती की प्रक्रिया को आगे ऊतक विशेष रूप से किनारों पर नुकसान पहुंचा सकते हैं । इसलिए यह ठीक करने के लिए चुनौती दे रहा है आइएचसी-0 एच स्लाइस का दाग के साथ धुंधला हो गया है, जो संस्कृतिपूर्ण स्लाइस में पाया गया है, जो करने के लिए ठीक से स्थानिक विरोधी गतिविधियों को कड़ी करने की क्षमता समझौता । इसके अलावा, ट्यूमर-आंतरिक, संस्कृति प्रेरित और दवा प्रेरित-गल प्रतिक्रियाओं murine NSCLC ऊतक स्लाइस में, स्थानिक दवा प्रतिक्रियाओं का सही quantitation समझौता कम से अलग कर रहे हैं । अंत में, ट्यूमर टुकड़ा संस्कृतियों का उपयोग एक शोधकर्ता एक ही ट्यूमर पर परीक्षण एकाधिक यौगिकों के लिए अनुमति देता है, पशुओं के इलाज की जरूरत के बिना, इस प्रकार परिष्कृत, को कम करने, और प्रयोगशाला पशुओं पर प्रयोगों की जगह ।

एक भविष्य के आवेदन के रूप में, वर्णित प्रोटोकॉल नैदानिक ठोस ट्यूमर के नमूनों को अपनाया जा सकता है । इसके अलावा ऊतक प्रकार निर्भर संशोधनों या अनुकूलन की संभावना है, टुकड़ा मोटाई और कंपन गति सहित vibratome सेटिंग्स को समायोजन के साथ शुरू करने के लिए ट्यूमर बनावट या जकड़न के लिए इन का अनुकूलन की आवश्यकता है । इसके अलावा, पोषक तत्व और विकास कारक आवश्यकता अलग ट्यूमर ऊतकों के लिए भिंन हो सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, स्तन कैंसर के स्लाइस मध्यम13,18में पूरक इंसुलिन के साथ प्रसंस्कृत किया गया है । यह देखते हुए कि सीमित ऊतक सामग्री सर्जरी या बायोप्सी के दौरान प्राप्त की है, रोगी के अनुकूलन-व्युत्पन्न ट्यूमर स्लाइस संस्कृतियों के नमूने दोहराने की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने में कठिनाइयों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसके अलावा, डेटा reproducibility भी स्पष्ट रोगी-रोगी नमूना विविधता द्वारा चुनौती दी है, विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं बनाम fibrotic क्षेत्रों या stromal घुसपैठ के प्रतिशत में, के रूप में अच्छी तरह से गल ऊतक घटकों । अंत में, नैदानिक सेटिंग्स में ट्यूमर स्लाइस के आवेदन की जांच की आवश्यकता होगी किस हद तक दवा प्रतिक्रियाओं के स्लाइस explants में पूर्व उपचार बायोप्सी के बाद इलाज के लिए मैच vivo प्रतिक्रियाओं में ।

Disclosures

लेखकों के हितों के टकराव नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

इस शोध कार्य में नवीन दवाओं की पहल से वित्तीय सहायता प्राप्त संयुक्त उपक्रम अनुदान समझौता एनओ ११५१८८, हेलसिंकी चिकित्सा छात्रवृत्ति (A.S.N.) में विश्वविद्यालय के डॉक्टरी कार्यक्रम, और Sigrid Juselius और ओरियन-Farmos मूलाधार (E.W.V.) । हम ईमानदारी से हमारे PREDECT ऊतक टुकड़ा मंच संघ के सदस्यों (Taija वायुसेना Hällström और Siv Knaappila अप रोटेटर प्रणाली की स्थापना में समर्थन के लिए धंयवाद, और Riku विश्लेषण के साथ समर्थन के लिए Turkki MATLAB । Jouko Siro चित्र 1 तस्वीरें कैप्चरिंग के लिए धंयवाद दिया है । हम ऊतकवैज्ञानिक स्लाइड स्कैनिंग के लिए FIMM WebMicroscope टीम का शुक्र है, और पशुपालन सहायता के लिए प्रयोगशाला पशु केंद्र ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced salt solution (HBSS) Sigma H6648
Penicillin Streptomycin solution Thermo Fischer Scientific 15140-122
Ham's F-12 medium Thermo Fischer Scientific 21765-037
Glucose VWR 101174Y
FBS Thermo Fischer Scientific 10270-106
Glutamine 200mM Thermo Fischer Scientific 25030-024
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) Abbott 32046-90-1
Leica VT1200 S vibrating blade microtome Leica Biosystems 14048142066
Slicing blade VWR PERS60-0138
Titanium grids Albamma Research and Development MA0036
Slice incubation unit Albamma Research and Development MD2500
10 cm tissue culture plate Sarstedt 83.1802
24-well plate Sarstedt 83.1836
6-well plate Sarstedt 83.1839
Neolus Hypodermic Needles Terumo Neolus NN2525R
50 mL falcon tube Greiner  227261
PBS Lonza BE17-517Q
Formaldehyde Fisher F/1501/PB08
Trifold histo cassette paper Cancer Diagnostics DX26280
Histo cassettes VWR 720-2199 
KOS The microwave multifunctional tissue processor Milestone SRL CAT307EN-003
Microtome Thermo Fischer Scientific HM355S
Superfrost Ultra plus slides VWR 631-0099
BSA Sigma A2153
NGS Thermo Fischer Scientific 16210-064
Citric acid Sigma C1909
PT-Module Thermo Fischer Scientific A80400012
Hematoxylin for H&E staining Merck 1.09249.0500
Hematoxylin for counter staining Dako S3309
Eosin Sigma E4382
NKX2-1 antibody Abcam ab133638 Lot Number: GR98031-12
pERK 1/2 antibody Cell Signaling Technologies CST 4370 Lot Number: 17
p4EBP1 antibody Cell Signaling Technologies CST 2855 Lot Number: 20
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody ImmunoLogic VWRKDPVR-110HRP
Mounting medicum pertex VWR MEDT41-4021-00
DAB  ImmunoLogic VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235) Selleckchem S1009
Selumetinib (AZD2644) Selleckchem S1008
Pannoramic 250 slide scaner 3DHISTECH
MATLAB MathWorks https://se.mathworks.com/products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER  3DHISTECH https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6 Adobe https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ ImageJ https://imagej.net/Fiji
CellProfiler CellProfiler cell image analysis software http://cellprofiler.org/

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ Organotypic explants ऊतक स्लाइस निदान नैदानिक मॉडल गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर घूर्णन मशीन इकाई औषध उपचार vibratome KRAS ग्रंथिकर्कटता
नैदानिक परीक्षण के लिए एक शर्त के रूप में ट्यूमर स्लाइस Explants की स्थापना और विश्लेषण
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Nagaraj, A. S., Bao, J., Hemmes, A., … More

Nagaraj, A. S., Bao, J., Hemmes, A., Machado, M., Närhi, K., Verschuren, E. W. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (141), e58569, doi:10.3791/58569 (2018).

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