Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Analysen til at studere en sammenlægning af Tau Protein og stof Screening

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

Tau sammenlægning analysen beskrives i dette manuskript efterligner de forventede funktioner i vivo tau misfoldning og sammenlægning.

Abstract

Sammenlægning af tau protein og dannelsen af parret spiralformet filamenter er kendetegnende for Alzheimers sygdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner, der er forbundet med neurodegenerative sygdomme, rapporterede i vitro sammenlægning kinetik for tau protein er mindre konsekvent præsenterer en relativt høj variabilitet. Her beskriver vi udviklingen af et in vitro- sammenlægning forsøg, der efterligner den forventede foranstaltninger forbundet med tau misfoldning og sammenlægning in vivo. Analysen benytter den længste tau isoform (huTau441), som indeholder både N-terminale sure skær samt fire mikrotubulus bindende domæner (MBD). In vitro- sammenlægning er udløst af tilsætning af heparin og følges løbende af thioflavin T fluorescens i en 96 godt mikrotiterplade format. Tau sammenlægning assay er yderst reproducerbare mellem forskellige brønde, eksperimentelle løber og partier af proteinet. Sammenlægning fører til tau PHF-lignende morfologi, som er meget effektiv i såning dannelsen af de novo fibrillar strukturer. Ud over dets anvendelse i at studere mekanismen af tau misfoldning og sammenlægning, er den nuværende assay en robust værktøj til screening af lægemidler, der kan forstyrre patogenesen af tau.

Introduction

Alzheimers sygdom er en ødelæggende neurodegenerativ sygdom, der er histopathologically defineret af ophobning af ekstracellulære senile plaques aggregerede Amyloid beta1 og intracellulære neurofibrillary tangles der indeholder aggregerede hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomere og præsenteres som seks unikke isoformer indeholdende 0-2 N terminal skær og 3 eller 4 mikrotubulus bindende domæner3,4 fra alternativ splicing og et gennemsnit på 2-3 phosphorylations. Det menes, at hyperphosphorylation, misfoldning og selvstændig sammenlægning i fibrillære strukturer udgør de centrale elementer i tau patogenese, som patologisk vurderet i demente personer5,6.

De aggregerede neurofibrillary tau tangles er kendetegnende for Annoncen, men også for andre tauopathies, herunder frontotemporal lobar degeneration (FTLD), picks sygdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporale demens (FTD) og primære aldersrelaterede tauopathy (del)2. Fra biokemiske forstå mekanisme af tau misfoldning og sammenlægning kunne kaste lys over de patologiske processer forbundet med annonce og andre tauopathies. Ud over det videnskabelige aspekt er robust in vitro- sammenlægning assays værdifulde værktøjer til screening af drug kandidater7,8,9,10. Det menes, at en sammenlægning af tau følger en Nukleering afhængige polymerisering proces (NUP)11,12,13,14. NDP kinetik er sigmoide og starter med en energisk ugunstige Nukleering skridt efterfulgt af et hurtigt energisk downhill sammenlægning proces.

I modsætning til andre amyloidogenic proteiner, herunder prionprotein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og endda ekstreme pHs eller høje temperaturer er ikke befordrende for sammenlægning15. Dette er sandsynligvis på grund af hydrophylic interaktioner i grænsefladen tau sammenlægning. Men aggregater tau effektivt på fysiologiske koncentrationer ved anvendelsen af induktorer såsom heparin16 eller andre polyanions17,18 .

Tidligere bestræbelser på at oprette in vitro- tau sammenlægning assays har kaste lys ind på detaljerne i tau misfoldning og sammenlægning, men de kom kort af efterligne, hvad der menes at være i vivo tau sammenlægning kinetik. I de fleste tilfælde manglede tau sammenlægning kinetik den indledende forsinkelse fase tilknyttet tau Nukleering. Dette kunne have været en følge af ved hjælp af meget høj tau protein fusioner, tilstedeværelsen af aggregater i udgangspunktet tau protein præparater og/eller brug af tau fragmenter med meget højere sammenlægning tilbøjelighed end de mere fysiologiske fuld længde tau protein19,20,21,22,23. Desuden adresse tidligere undersøgelser ikke reproducerbarhed og robusthed aspekt af tau sammenlægning kinetik.

Her, beskriver vi en robust in vitro- tau sammenlægning assay som efterligner de vigtigste karakteristika ved en Nukleering afhængigt af polymerisering med en indledende forsinkelse fase svarende til tau Nukleering efterfulgt af en eksponentiel vækstfase. Desuden, de genererede rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høj seeding potens. Analysen er yderst reproducerbare også mellem tau partier og repræsenterer et værdifuldt redskab til at screene for sammenlægning hæmmere.

Protocol

1. reagens

  1. Reaktion buffer
    1. Forberede reaktion buffer: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6.7 ved at opløse TCEP tørt pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock løsning, pH 7,4.
      Bemærk: Tilstedeværelsen af TCEP skyldes bridging sammenlægning undersøgelser ved hjælp af vildtype tau protein, som indeholder cysteines. I den nuværende protokol, TCEP bruges kun til at justere pH PBS fra 7,4 til 6,7 og spiller ikke nogen rolle i reguleringen af enhver redox reaktioner.
    2. Bland grundigt og opløsningen filtreres gennem et membranfilter til sterile 0,22 μm pore størrelse PES.
    3. Alikvot og butik på-80 ˚C.
    4. Tø på bænken og stabilisere på RT før brug.
  2. huTau441
    1. Fjern huTau441 (for protein proteinekspression og -oprensning Se Apetri et al. 24) fra-80 ˚C fryser.
    2. Tø på bænken og reagensglasset stuetemperatur (RT).
    3. Spin tube med protein bestand i 5 min på 12.000 x g på 20-25 ˚C at fjerne luftbobler.
    4. Måler koncentrationen af huTau441by absorption på 280 nm med en udslettelse koefficient af 0.31 mL mg-1cm-1
  3. Thioflavin Thomsen
    1. Forberede 500 μM thioflavin T (ThT) stamopløsning ved at opløse 10 mg ThT tørt pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaktion buffer.
    2. Blandes grundigt, vortex 3 gange i 20 sekunder ved maksimal hastighed og opløsningen filtreres gennem et sterilt 0,22 μm pore størrelse PES membranfilter.
    3. Bestemme koncentrationen af absorption målinger på 411 nm med en udslettelse koefficient af 22.000 M-1 cm-1 , og Juster ThT koncentration til 500 μM. Gemme på RT beskyttet mod lys. Forberede frisk hver 2 måned.
  4. Heparin
    1. Forberede frisk 55 μM heparin løsning ved at opløse 1 mg HMW heparin tørt pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaktion buffer på RT.
    2. Ryst kraftigt og vortex 2 gange for 5 sekunder.
    3. Filtrer løsning gennem en steril 0,20 μm pore størrelse PES membranfilter (sprøjte).

2. løbende Mode ThT sammenlægning Assay på en multi-mode mikrotiterplade læser

Bemærk: ThT farvestof føjes til reaktion til at overvåge huTau441 sammenlægning kinetik i en løbende tilstand (automatiske målinger). Selv om reaktionen kan efterfølges af en regelmæssig fluorometer ved hjælp af en konventionel kuvette, manuel arten af operationen begrænser hyppigheden af maalingerne og bringer de optagede kinetic kurvernes nøjagtighed. Af denne grund bruges en automatisk multi-mode mikrotiterplade læser.

  1. Instrument oprettet
    1. Tænd computeren og multi-mode mikrotiterplade læseren. Lad udstyret, stabilisere i 10 minutter.
    2. Start programmet og forberede en protokol.
      1. Marker protokoltypen: standard-protokol (reduktion af Data udføres uafhængigt for hver plade).
      2. Indstil temperaturen på 37 ˚C og marker preheatment før du fortsætter til protokollen.
      3. Sætte den kinetisk run: køre tid 50 h / måling interval: 15 min.
      4. Indstille orbital ryster på 425 cpm (3 mm) i kontinuerlig tilstand.
      5. Vælg den metode, Læs: fluorescens intensitet slutpunkt/Kinetic - Monochromators bølgelængder: Excitation 440 nm (20 nm båndbredde) / Emission 485 nm (20 nm båndbredde) - optik position: Top - Normal læse hastighed - Læs højde: 4.50 mm
      6. Start Kør ved hjælp af oprettede protokollen. Navngive eksperimentet, vælge destinationen for den nyoprettede fil og tillade instrument til pre reagensglasset ønskede temperatur.
  2. Spontan huTau441 konvertering
    1. Forberede reaktion prøven i et 1,5 mL tube. Brug 200 μl mix pr. reaktion og mindst 4 replikater (reaktion bind for 4 replikater = 800 μL).
    2. Forberede 800 μL reaktion prøve (ved 4 replikater) indeholdende 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved at blande proteinet med reaktion buffer, tilføje heparin og ThT og bland godt ved pipettering op og ned 5 gange. Respektere den angivne rækkefølge for reagens tilsætning.
    3. Spin prøver på 12.000 x g og 25 ˚C for 5 min at fjerne luftbobler.
    4. Give afkald på 200 μl af reaktion prøve pr. brønd i 96-brønd mikroplader (96-brønd sort solid mikrotiterplade, godt-volumen 360 μL, flad bund). Undgå dannelsen af luftbobler.
    5. Forsegle mikrotiterplade at undgå fordampning.
    6. Placer mikrotiterplade i multi-mode mikrotiterplade læser og starte målinger.
    7. Efter afslutningen af eksperimentet, fjerne pladen fra udstyr og eksportere data til en edb-software.
  3. Kvalitetstjek af konvertering, frø indsamling og opbevaring.
    1. Fjerne sealer fra pladen og samle de forskellige replikater i 1,5 mL rør. Bland godt aggregerede prøven i brøndene af pipettering op og ned 2 gange før indsamling det. Aggregater har tendens til at deponere i bunden af brønden.
    2. Blandes grundigt i 1,5 mL tube af pipettering op og ned 5 gange og give afkald på 10-20 μL på en glimmer overflade til at analysere aggregater af AFM (for yderligere oplysninger se Apetri et al. 24).
    3. Høste aggregater af spinning 1,5 mL tube på 20.000 x g og 4 ˚C i 1 time. Aggregater danne en pellet.
    4. Adskille og analysere supernatanten ved S-MALS at bekræfte fravær af monomere tau i eksemplet med angivelse af en vellykket konvertering i aggregater (for yderligere oplysninger se Apetri et al. 24).
    5. Etiket 1,5 mL tube indeholder de resterende aggregater (pellet) med angivelse af indledende huTau441 proteinkoncentration og sample volumen. Snap fryse aggregater og opbevar ved-80 ˚C.
  4. Seedede reaktion
    1. Fjerne huTau441 aggregater fra-80 ˚C fryser. Tilføje volumen af reaktion buffer på etiketten (oprindelige stikprøve volumen) og lad røret stabilisere til RT. Resuspend aggregater af pipettering op og ned 5 til 8 gange.
    2. Der sonikeres aggregerede prøven. For en 200 μl prøve (15 μM huTau441), der sonikeres på is ved hjælp af en 1/8" microtip (fra 100 μL op til 10 mL) til en samlet periode på 15 s ved hjælp af pulser af 1 s og pauser af 2 s på 30% amplitude (sonikator 250 watt). Re reagensglasset prøven til RT.
      Bemærk: De erhvervsdrivende sonikering betingelser fører til en homogen population af tau fibriller med længder på 20-50 nm24.
    3. Forberede reaktion prøven i 1,5 mL rør. Brug 200 μl mix pr. reaktion og mindst 4 replikater (reaktion bind for 4 replikater = 800 μL).
    4. Forberede 800 μL reaktion prøve indeholdende 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved at blande proteinet med reaktion buffer, tilføje heparin og ThT og bland godt ved pipettering op og ned 5 gange. Respektere den angivne rækkefølge for reagens tilsætning.
    5. Spin prøver på 12.000 x g og 25 ˚C for 5 min at fjerne luftbobler.
    6. Give afkald på 200 μl af reaktion prøve pr. brønd i 96-brønd (96-brønd sort solid mikrotiterplade, godt-volumen 360 μL, flad bund). Undgå dannelsen af luftbobler.
    7. Omrystes grundigt præfabrikerede fibril prøven ved gentagne op og ned pipettering (5 gange) og tilføje til hver godt et beløb svarende til den ønskede procentdel af frø. For en 200 μl godt samlede volumen er 2 μl af præfabrikerede frø tilføjelse en 1% (v/v). Mix af pipettering op og ned 3 gange når du tilføjer til brønden og undgå dannelsen af luftbobler.
    8. Forsegle mikrotiterplade at undgå fordampning.
    9. Placer mikrotiterplade i multi-mode mikrotiterplade læser og starte målinger.
    10. Fjerne pladen fra udstyr og eksportere data til et regneark.

Representative Results

Rekombinante huTau441 indeholdende C291A og C322A mutationer og N-terminal hans og C-terminal C-tags blev udtrykt og renset som tidligere beskrevet24. HuTau441 partier er meget ren som visualiseret på SDS-PAGE og næsten 100% monomere som vurderet af S-MALS (figur 1). Sammenlægning af 15 µM huTau441 blev fremkaldt ved tilsætning af 8 µM HMW heparin og reaktion blev fulgt løbende af ThT fluorescens ved hjælp af en multimode mikrotiterplade læser. Excitation bølgelængde var 440 nm (båndbredde 20 nm) mens emissionerne blev målt til 485 nm (båndbredde 20 nm). Analysen er yderst reproducerbar, med resultater fra 10 individuelle brønde er stort set umulig at skelne (figur 2A). Morfologier ThT positive huTau441 aggregater blev vurderet efter 50 h af AFM. Aggregerede hutau441 er en homogen blanding af fibrillar strukturer af forskellige længder svarende til rapporterede ex vivo morfologier (figur 2B). Desuden indeholder den endelige reaktionsblandingen ikke monomer, tyder på en fuldstændig omlægning i aggregater, som det fremgår af S-MALS målinger (figur 2 c). Kinetik af huTau441 sammenlægning i uafhængige eksperimentelle løber er meget ens, som understreges af lignende sigmoide kurver og umulig at skelne lag og vækst faser (figur 3). Den høje grad af reproducerbarhed bevares, når forskellige batches af protein anvendes (figur 4). Derudover er præfabrikerede huTau441 aggregater meget effektiv i at rekruttere tau monomere og inducere dannelse af de novo tau aggregater. Beløb, der er så lavt som 0,0025% (v/v) af præfabrikerede tau aggregater er i stand til at omgå Nukleering og udløser generation af de novo fibriller (figur 5).

Figure 1
Figur 1: rekombinante huTau441 er monomere og meget ren. A) renhed vurdering under denatureringen betingelser på en 4-12% SDS-PAGE gel herunder molekylvægt standard protein stigen (i kDA) (Lane 1); gennemstrømning fra den endelige C-tag affinitet rensning trin (Lane 2); kolonne vask fraktion (Lane 3), elueres huTau441 protein peak, før (Lane 4) og efter buffer udveksle (Lane 5), henholdsvis). B) S-MALS analyse af huTau441. Protein viser > 99,9% monomere med en kindtand masse 51 kDa og indeholder ikke aggregater eller fragmenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sammenlægning af rekombinante huTau441 er yderst reproducerbare og fører kvantitativt til fibrillar strukturer. A) kinetik af heparin induceret huTau441 sammenlægning overvåges kontinuerligt i 96 godt mikrotiterplade format af ThT fluorescens. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. 10 individuelle kurverne svarer til konvertering af samme protein parti i 10 brønde af den samme mikrotiterplade og er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase af 14.2 ± 0.38 h og t50 18,8 ± 0.40 h. kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logisti c kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. Mellemliggende fase og t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. Kurven montering og sammenfattende statistikker er opnået ved hjælp af IBM SPSS statistik version 20.0.0.2. B). Tau aggregater Vis PHF-lignende morfologier som angivet af AFM imaging på 50 h; C). S-MALS analyse af monomere huTau441 (t = 0 h) og supernatanten af reaktionsblandingen ved afslutningen af reaktionen (t = 50 h). For 50 h tidspunkt var reaktionsmiljøet centrifugeres i 1 time på 20.000 X g og 4 ˚C og resulterede supernatanten injiceres på S-MALS. Forsvinden af monomere peak bekræfter den fuldstændig sammenlægning af tau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tau sammenlægning analysen viser høj reproducerbarhed mellem uafhængige eksperimentelle kører. De to paneler vise fire individuelle kinetik spor til spontane huTau441 sammenlægning indsamlet i to uafhængige forsøg med den samme batch huTau441 protein. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Kinetik er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase 12,2 ± 0.18 h og t50 17,8 ± 0,8 h (Run 1) og 11,6 ± 0,52 h og t50 på 17,8 ± 0,23 h (køre 2), henholdsvis. Kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. T50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tau sammenlægning analysen viser høj reproducerbarhed mellem forskellige batches af huTau441 protein. Hvert panel viser fire replikater, svarende til en specifik huTau441 parti. Sammenlægning af hvert enkelt parti blev fulgt op i uafhængige forsøg. Koncentrationer af huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Sammenlægning kinetik svarende til de fire individuelle tau partier er karakteriseret ved en gennemsnitlig (med SD) lag fase af 15,3 ± 0.38 h og t50 på 21,1 ± 0.46 h (serie 1); mellemliggende fase 12,5 ± 0,07 h og t50 på 19,8 ± 0,34 h (serie 2); mellemliggende fase af 15,1 ± 0,34 h og t50 21.9 ± 0,86 h (serie 3) og en mellemliggende fase af 11,5 ± 0,29 h og t50 på 17,8 ± 0,29 h (serie 4), henholdsvis. Kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. Mellemliggende fase og t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Mellemliggende fase beregnes baseret på 3% stigning på ThT fluorescens signal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: præfabrikerede hutau441 aggregater har høj såning aktivitet. For at starte såning, blev sonicated tau aggregater føjet til monomere hutau441. Fra rød til blå, hver farve af de forskellige kinetic kurver repræsenterer forskellige mængden af tilsat frø: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% og 0,0025% (v/v), henholdsvis. Spontan omdannelse af hutau441 er repræsenteret i sort. Alle betingelser, der blev testet i fire eksemplarer. De fire kinetic replikater forbundet med en vis koncentration af frø er meget reproducerbare og i de fleste tilfælde ikke kan skelnes. Koncentrationer af hutau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Tilsætning af små mængder af præformerede sonicated fibrillar strukturer eliminerer den indledende forsinkelse fase observeret i spontan omdannelse og effekten er proportional med mængden af frø. Fra rød til blå, er forskellen i t50 observeret (t50 spont.conv-t50 såning) 18,9, 18.40, 17,8, 17.3, 16.6, 16,1, 15,4, 14,7, 14.2 og 13,7 timer, henholdsvis. Spontan omdannelse af hutau441 er kendetegnet ved en gennemsnitlig t50 (med SD) af 19.85 ± 0,54 h. kinetiske data var udstyret med en 5-parameter logistisk kurve med en lineær nedgang i den øvre asymptote. t50 blev beregnet ved interpolation mellem forudsagte værdier af lineær regression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Trods talrige bestræbelser, tau sammenlægning kinetik rapporteret i litteraturen til dato mangler det ønskede niveau af reproducerbarhed og/eller nogle af funktionerne i en Nukleering afhængige polymerisering19,20,21 , 22 , 23 , 25. det understreges ofte af manglen på en mellemliggende fase, ineffektive såning og ikke-fibrillar natur af tau aggregater. Årsagen til disse mangler kan variere og omfatter sub-optimale tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelsen af aggregater, lav renhed, osv.), valg af protein og overtalelse reagenser og eller forsøgsbetingelser. En anden komplicerende faktor er de to cystein restkoncentrationer placeret omkring tau sammenlægning interface, der kan danne intra - eller inter - Molekylær disulfid broer afhængigt af redox miljø og påvirke effektiviteten af tau sammenlægning. I de fleste tilgange reducerer reagenser som DTT eller TCEP har været brugt til at opretholde cystein restkoncentrationer i reducerede former og dermed øge niveauet af reproducerbarhed25. Desuden er extinction koefficient af tau meget lav, som fører til vanskeligheder med nøjagtige målinger af proteinkoncentration.

Vi fokuserede især på et par parametre og kvalitetsegenskaber, som vi anses for afgørende for en robust, reproducerbare og repræsentative sammenlægning profil for tau protein: at eliminere muligheden for intra - og inter-Molekylær disulfid dannelse, generere en meget ren tau monomer og forbedre nøjagtigheden af koncentration bestemmelse. Alle disse reagens-relaterede spørgsmål er potentielle opmærksomhed punkter, som vi anses for afgørende for optimal assay udvikling. For at løse disse problemer, blev fuld længde huTau441 udtrykt med to mutationer, C291A og C322A, og N - og C-terminale tags. Mutation af cystein restprodukter har minimal indvirkning på tau protein samtidig fjerne den ellers meget vanskeligt at kontrollere disulfid broer. Udtrykker proteinet med relativt korte N - og C-terminale tags tillod os at forfølge en to-trins affinitet rensning protokol, hvilket førte til meget høj renhed, integritet og monomer indhold. Desuden indførte vi en F8W mutation, der steg extinction koefficient af protein og tilladt langt mere nøjagtige koncentration målinger24.

Ud over at bruge høj kvalitet protein reagenser, var andre assay parametre også optimeret. Den optimale tau: heparin forholdet var identificeret til at være omkring 0,5 (M/M), som er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte undersøgelser26. Desuden, mekanisk og optisk instrumental indstillinger er afgørende for at sikre, at reproducerbarhed og de optimale parametre kan varierer til en vis grad afhængigt af producenten.

Sammenlægning af tau beskrevet i denne analyse viser karakteristika, der er forbundet med tau patogenese i annonce og relaterede tauopathies. Processen starter med en indledende forsinkelse fase svarende til dannelsen af høj energi kerner og er efterfulgt af en hurtig vækstfase, der svarer til fibril vækst. Den mellemliggende tid er tilstrækkelig lang til at åbne en bred vindue for at studere i detaljer seeding processen, der dækker en bred vifte af frø koncentrationer (figur 5) mens stadig ikke alt for længe så protein nedbrydning og/eller ikke-specifikke sammenlægning undgås (figur 2). disse sekundære begivenheder kan især ske, når et uløseligt uordnede protein som huTau441 er udsat for lange perioder til fysiologiske tilstande. Opnåede tau aggregater display morfologi af PHFs isoleret fra hjernen hos AD patienter og er meget effektiv i at rekruttere monomere tau og konvertere den til de novo genereret aggregater, en proces kaldet såning. Analysen er yderst reproducerbar, kinetic kurver er stort set umulig at skelne mellem brønde, eksperimentelle løber og protein partier. Selv om den aktuelle analyse fokuserer kun på de længste tau isoform, huTau441, anvendelsen kan tilpasses til at studere konvertering af andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikation, i pressen) Desuden, det giver Mekanistiske undersøgelser fokuseret på samspillet mellem tau isoformer og eventuelt kaste lys over forskellene mellem tau patogenese i annonce hvor både 3R og 4R isoformer er til stede i PHFs og picks sygdom eller Frontotemporal demens hvor tau patologi indeholder primært 3R og 4R tau isoformer, henholdsvis27.

Meget høj reproducerbarhed af analysen bør tillade læsere til at gennemføre det med relativ lethed i deres specifikke lab indstillinger. Analysen efterligner Hvad menes at være i vivo misfoldning og sammenlægning af tau, at aktivere Mekanistiske undersøgelser, som vil kaste lys over tau patogenese, og det udgør et værdifuldt redskab til screening af lægemiddelkandidater og evaluere deres indblanding med de forskellige trin i patogenesen proces.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Hector Quirante for den proteinekspression og -oprensning af huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen for fremragende teknisk support og Martin Koldijk til dataanalyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

Neurovidenskab sag 141 Tau sammenlægning såning amyloid stof screening Alzheimers tauopathies protein misfoldning
<em>In Vitro</em> Analysen til at studere en sammenlægning af Tau Protein og stof Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri,… More

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter