Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

생체 외에서 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58570

Summary

이 원고에 설명 된 타우 집계 분석 결과 vivo에서 타우 misfolding 및 집계의 예상된 기능을 모방 합니다.

Abstract

타우 단백질의 집계와 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 형성은 Alzheimer의 질병 그리고 다른 tauopathies의 특징. 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 다른 단백질에 비해, 타우 단백질에 대 한 보고 체 외에서 집계 속도 덜 일관 된 상대적으로 높은 가변성을 제시. 여기는 생체 외에서 집계 분석 결과 타우 misfolding 및 집계 비보와 관련 된 예상된 단계 개발에 설명 합니다. 분석 결과 N 맨끝 산 성 삽입 뿐만 아니라 4 개의 microtubule 바인딩 도메인 (MBD)는 긴 타우 isoform (huTau441)를 사용 합니다. 생체 외에서 집계는 덤플링의 추가 의해 트리거되는 96 잘 microplate 형식에서 thioflavin T 형광 지속적으로 선행 하 고. 타우 집계 분석 결과 매우 다른 우물, 실험 실행 및 단백질의 일괄 처리 사이 재현 이다. 집계 리드 타우 PHF 같은 형태학 시드 드 노 보 원 구조의 형성에 매우 효율적입니다. 타우 misfolding 및 집계의 기계 장치를 공부 하 고 응용 프로그램 뿐만 아니라 현재 분석 결과 심사 약물의 병 인을 방해할 수 있는 강력한 도구입니다.

Introduction

Alzheimer의 질병은 histopathologically 집계 된 아 밀 로이드 베타1 의 세포 외 치 플 라크의 축적에 의해 정의 된 치명적인 신경 퇴행 성 장애 및 포함 하는 세포내 neurofibrillary tangles 집계 hyperphosphorylated 타우 단백질2. 생리 타우 단위체 이며 6 독특한 isoforms를 포함 하는 0-2로 제시 N 터미널 삽입 및 3 또는 4 microtubule 바인딩 도메인3,4 평균 2-3 phosphorylations의 양자 택일 접합에서 발생. Hyperphosphorylation, misfolding 및 fibrillary 구조로 자체 집계 미친된 개인5,6병 적 평가로 타우 pathogenesis의 핵심 요소를 구성 하는 믿 었 다.

광고 뿐만 아니라 frontotemporal lobar 변성 (FTLD), 선택의 질병, 진보적인 supranuclear 마비 (PSP), fronto 일시적인 치 매 (FTD) 및 주를 포함 하 여 다른 tauopathies 집계 neurofibrillary 타우 tangles 특징은 나이 관련 된 tauopathy (부)2. 생 화 확 적인 관점에서 광고와 관련 된 병 적인 과정에 빛을 발산 수 타우 misfolding 및 집계의 메커니즘을 이해 하 고 다른 tauopathies. 과학적 측면 뿐만 아니라 강력한 생체 외에서 집계 분석 실험 약물 후보7,8,,910의 심사에 대 한 귀중 한 도구입니다. 타우의 aggregation nucleation 의존 중 합 프로세스 (NDP)11,12,,1314다음 믿어진다. 신 민 당 활동 자형 이며 빠른 정력적으로 내리막 집계 과정 뒤에 정력적으로 형편이 나쁜 nucleation 단계 시작.

다른 amyloidogenic 단백질, 프리온 단백질, 녹말 체 beta와 α-synuclein를 포함 하 여 달리 타우 자발적으로 생리 적인 조건 하에서 집계 되지 않습니다 그리고 심지어 극단적인 pHs 또는 높은 온도 비 집계15에 대 한 대조. 이것은 대부분의 아마 타우 집계 인터페이스에 hydrophylic 상호 작용입니다. 그러나, 타우 집계 효율적으로 생리 적인 농도에서 헤 파 린16 등 다른 polyanions17,18 inducers를 사용 하는 경우.

타우 집계 분석 생체 외에서 설정 하는 이전 노력 타우 misfolding 및 집계, 세부 사항에 도움이 되 거 있다 하지만 그들은 무슨 vivo에서 타우 집계 활동 여겨진다 흉내 낸의 짧은. 대부분의 경우, 타우 집계 활동 타우 nucleation와 관련 된 초기 지연 위상을 부족 했다. 이 결과 매우 높은 타우 단백질 농도 사용 하 여 집계 시작 타우 단백질 준비에서의 존재 및/또는 더 많은 생리 적 전체 길이 타우 보다 훨씬 더 높은 집계 성향으로 타우 조각의 사용 되었을 수 있습니다. 단백질19,20,21,,2223. 또한, 이전 연구는 재현성 및 타우 집계 활동의 견고성 측면을 해결 하지 않았다.

여기, 우리는 강력한 생체 외에서 타우 집계 분석 결과 해당 하는 지 수 성장 단계 다음 타우 nucleation 초기 지연 위상 nucleation 종속 합의 주요 특성을 모방을 설명 합니다. 또한, 생성 된 재조합 타우 집계 자연에서 원 고 매우 높은 시드 힘. 분석 결과 또한 타우 배치 사이 높은 재현성 이며 집계 억제제에 대 한 화면에 유용한 도구를 나타냅니다.

Protocol

1. 시 약 준비

  1. 반응 버퍼
    1. 반응 버퍼 준비: 0.5 m m PBS, pH 6.7 TCEP 건조 분말을 용 해 하 여에 한 TCEP (MW = 286.65 g/mol) PBSstock 솔루션, pH 7.4에에서.
      참고: TCEP의 존재 때문에 집계 연구 시스테인을 포함 하는 야생 타입 타우 단백질을 사용 하 여 브리지 이다. 현재 프로토콜에서 TCEP 6.7 7.4에서 PBS의 pH 조정에 사용 되 고 어떤 산화 환 원 반응 조절에 역할을 재생 합니다.
    2. 철저 하 게 혼합 하 고 메 마른 0.22 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
    3. 약 수 그리고-80 ˚C에 게입니다.
    4. 벤치에 thaw 하 고 사용 하기 전에 RT에서 안정.
  2. huTau441
    1. (자세한 단백질 표정과 정화 참조 Apetri 그 외 여러분 huTau441 제거 24)-80 ˚C 냉장고에서.
    2. 벤치에 thaw 하 고 실내 온도 (RT) equilibrate.
    3. 12000 x g 20-25 ˚C 공기 방울을 제거에 5 분의 단백질 재고와 튜브를 회전 합니다.
    4. 280에서 huTau441by 흡수의 농도 측정 nm 0.31 mL mg-1c m-1 의 소 광 계수를 사용 하 여
  3. Thioflavin T
    1. 10mg ThT 건조 분말을 용 해 하 여 500 μ M thioflavin T (ThT) 재고 솔루션을 준비 (MW = 318.86 g/mol) 35 mL 반응 버퍼에.
    2. 철저 하 게, 소용돌이 3 번 최대 속도에서 20 초 동안 혼합 하 고 메 마른 0.22 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터를 통해 솔루션을 필터링.
    3. 411에서 흡수 측정 하 여 농도 결정 nm 22000 M-1 c m-1 의 소 광 계수를 사용 하 여 500 μ M ThT 농도 조정 하 고. 빛에서 보호 하는 RT에 저장 합니다. 2 개월 마다 준비 신선한.
  4. 헤 파 린
    1. HMW 덤플링 건조 분말의 1 mg를 용 해 하 여 신선한 55 μ M 덤플링을 솔루션 준비 (MW = 17-19 kDa) 1 mL 반응 buffer 실시간
    2. 적극적으로 악수 하 고 소용돌이 2 5 초 동안 시간.
    3. 살 균 0.20 μ m 기 공 크기 PES 멤브레인 필터 (주사기)를 통해 솔루션을 필터링 합니다.

2. 연속 모드 ThT 집계 분석 결과 다중 모드 Microplate 리더

참고: ThT 염료 연속 모드 (자동 측정) huTau441 집계 활동 모니터링에 대 한 반응에 추가 됩니다. 비록 반응 일반 fluorometer에 의해 지켜질 수 있다 기존의 cuvette을 사용 하 여 작업의 수동 자연 제한 측정 주파수 및 기록 된 운동 곡선의 정확도 손상. 이러한 이유로 자동 멀티 모드 microplate 리더 사용 됩니다.

  1. 악기 설정
    1. 컴퓨터와 다중 모드 microplate 리더를 켭니다. 10 분 동안 안정화 장비 하자.
    2. 소프트웨어를 시작 하 고 준비 하는 프로토콜.
      1. 프로토콜 종류 선택: 표준 프로토콜 (데이터 축소 수행 하지 독립적으로 각 접시).
      2. 37 ˚C에서 온도 설정 하 고 프로토콜을 계속 하기 전에 preheatment를 선택 합니다.
      3. 운동 실행 설정: 실행 시간 50 h / 측정 간격: 15 분.
      4. 연속 모드에서 425 cpm (3mm)에 떨고 궤도 설정 합니다.
      5. 읽기 방법 선택: 형광 강도 끝점/운동-Monochromators 파장: 여기 440 nm (20 nm 대역폭) / 방출 485 nm (20 nm 대역폭)-광학 위치: 탑-정상 읽기 속도-읽기 높이: 4.50 m m
      6. 만든된 프로토콜을 사용 하 여 실행을 시작 합니다. 실험의 이름을 새로 만든된 파일의 대상을 선택 하 고 원하는 온도를 사전 equilibrate 악기를 허용.
  2. 자발적인 huTau441 변환
    1. 1.5 mL 튜브에 반응 샘플을 준비 합니다. 반응 및 4 복제 사용 200 μ 믹스 (4에 대 한 반응 볼륨 복제 800 μ =).
    2. 800 μ 반응 샘플 (4 복제)의 경우 15 μ M huTau441, 8 μ M 헤 파 린 및 50 μ M 준비 ThT. 단백질 반응 버퍼와 혼합 하 여 시작 덤플링을 ThT을 추가 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 혼합. 시 추가 대 한 표시 순서를 존중 합니다.
    3. 12000 x g, 공기 방울을 제거 하기 위해 5 분 동안 25 ˚C에서 샘플을 회전 합니다.
    4. 200 μ 당 96 잘 microplates에 잘 반응 샘플의 분배 (96-잘 블랙 솔리드 microplate, 잘-볼륨 360 μ, 편평한 바닥). 기포의 형성을 하지 마십시오.
    5. 증발을 피하기 위해 microplate 인감.
    6. 멀티 모드 microplate 리더에 미 판 놓고 측정을 시작 합니다.
    7. 실험의 완료 후 장비에서 플레이트를 제거 하 고 데이터 처리 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.
  3. 변환, 씨앗 수집 및 저장의 품질 확인 합니다.
    1. 접시에서는 마감재를 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 다른 복제 수영장. 그것을 수집 하기 전에 2 번 아래로 pipetting으로 우물에서 집계 샘플 혼합 잘. 집계 우물의 바닥에 예금 해 경향이 있다.
    2. 믹스 철저 하 게에 1.5 mL 튜브 5 번 위아래로 pipetting으로 분배 (대 한 자세한 내용은 참조 Apetri 외. AFM에 의해 집계를 분석 하기 위한 운 모 표면에 10-20 μ 24)입니다.
    3. 1 시간 동안에 x g와 4 ˚C 20000 1.5 mL 튜브를 회전 하 여 집계를 수확. 집계는 펠 릿을 형성합니다.
    4. 분리 하 고 상쾌한 S-MALS 성공적인 변환 (자세한 내용은 참조 Apetri 그 외 여러분 에 대 한 집계를 나타내는 샘플에서 단위체의 부재를 확인 하 여 분석 24)입니다.
    5. 레이블을 나타내는 초기 huTau441 단백질 농도 및 샘플 볼륨 나머지 집계 (펠 릿)를 포함 하는 1.5 mL 튜브. 스냅 집계를 동결 하 고-80 ˚C에 저장 합니다.
  4. 시드 반응
    1. HuTau441 집계-80 ˚C 냉동 고에서 제거 합니다. 반응 버퍼의 볼륨 레이블 (초기 샘플 볼륨)에 표시 된 고 8 번 5 위아래로 pipetting으로 집계 실시간 Resuspend을 안정화 하는 튜브를 추가 합니다.
    2. 집계 샘플 sonicate 200 μ 샘플 (15 μ M huTau441), 1/8"microtip을 사용 하 여 얼음에 sonicate (100 μ에서 최대 10 mL) 15의 전체 기간에 대 한 s 1의 펄스와 2의 일시 중지를 사용 하 여 s 30% 진폭 (sonicator 250 와트)에서. 다시 실시간 샘플 equilibrate
      참고: 고용된 쥡니다 조건 20-50 nm24의 길이와 타우 소의 균질 인구 이어질.
    3. 1.5 mL 튜브에 반응 샘플을 준비 합니다. 반응 및 4 복제 사용 200 μ 믹스 (4에 대 한 반응 볼륨 복제 800 μ =).
    4. 15 μ M huTau441, 8 μ M 헤 파 린 및 50 μ M를 포함 800 μ 반응 샘플 준비 ThT. 단백질 반응 버퍼와 혼합 하 여 시작 덤플링을 ThT을 추가 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 잘 혼합. 시 추가 대 한 표시 순서를 존중 합니다.
    5. 12000 x g, 공기 방울을 제거 하기 위해 5 분 동안 25 ˚C에서 샘플을 회전 합니다.
    6. 200 μ 당 96 잘 (96-잘 블랙 솔리드 microplate, 잘-볼륨 360 μ, 편평한 바닥)에 잘 반응 샘플의 분배. 기포의 형성을 하지 마십시오.
    7. 균질 철저 하 게 미리 형성한 fibril 샘플 반복 의해 위아래로 pipetting (5 회) 고 각 잘 금액 씨앗의 원하는 비율에 추가 합니다. 200 μ 잘 총 볼륨에 대 한 미리 형성한 씨앗 추가의 2 μ 1% (v/v)입니다. 믹스를 위아래로 pipetting으로 3 우물에 추가할 때 시간 및 기포의 형성을 방지.
    8. 증발을 피하기 위해 microplate 인감.
    9. 멀티 모드 microplate 리더에 미 판 놓고 측정을 시작 합니다.
    10. 장비에서 플레이트를 제거 하 고 데이터를 스프레드시트로 내보내기.

Representative Results

재조합 huTau44124설명 포함 하는 C291A 및 C322A 돌연변이 그의 C-터미널 C-태그 표현 되었고 이전 정화의 N 맨끝. HuTau441 배치는 SDS 페이지와 거의 100 %S-MALS (그림 1)에 의해 평가 단위체에 시각으로 매우 순수. 15 µ M huTau441의 집계 8 µ M HMW 덤플링의 추가 의해 유도 되었다 고 반응 계속 ThT 형광 다중 모드 microplate 리더를 사용 하 여 뒤를 이었다. 여기 파장은 440 nm (대역폭 20 nm) 방출 485에서 측정 했다 반면 nm (대역폭 20 nm). 분석 결과 거의 구별할 (그림 2A) 되 고 10 개인 우물에서 결과 함께 매우 재현. ThT 긍정적인 huTau441 집계의 형태학은 50 시간 후 AFM에 의해 평가 됐다. 집계 hutau441 보고 비보 전 형태학 (그림 2B)와 비슷한 다른 길이의 원 구조의 균질 혼합물 이다. 또한, 최종 반응 혼합물 S MALS 측정 (그림 2C)에서 같이 집계에 전체 변환을 제안 하는 모노 머를 포함 하지 않습니다. HuTau441 집계에서 독립적인 실험 실행의 활동 유사한 자형 커브와 분간 지연 및 성장 단계 (그림 3)에 의해 강조 매우 비슷합니다. 단백질의 다른 배치를 사용 하는 경우 재현성의 높은 수준 유지 됩니다 (그림 4). 또한, 미리 형성한 huTau441 집계는 타우 단위체를 보충 하 고 유도 하는 데 노 보 타우의 형성에 매우 효율적. 미리 형성한 타우 집계 0.0025% (v/v)의 낮은 양의 nucleation 및 트리거 드 노 보 소 (그림 5)의 생성을 무시할 수 있다.

Figure 1
그림 1: 재조합 huTau441는 단위체와 매우 순수. 분자량 표준 단백질 사다리 (kDA)를 포함 하 여 4-12 %SDS 페이지 젤에 조건을 변성 시키기 아래 A) 순수성 평가 (레인 1); 마지막 C 태그 선호도 정화 단계 (레인 2);에서 통과 열 세척 분수 (3 차선), huTau441 단백질 피크 (4 차선) 전에 eluted 고 버퍼 후 교환 (5 레인), 각각). B) S-MALS는 huTau441의 분석. 단백질 > 99.9% 단위체 51 kDa의 분자량으로 표시 하 고 집계 또는 조각을 포함 하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 재조합 huTau441의 높은 재현성 이며 원 구조를 양적 리드. A) 헤 파 린의 활동 유도 huTau441 집계 ThT 형광에 의해 96 잘 microplate 형태로 지속적으로 모니터링 한다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 10 개별 곡선 같은 microplate의 10 우물에서 동일한 단백질 배치의 변환에 해당 하며 14.2의 평균 (SD)와 지연 단계를 특징으로하는 ± 0.38 h와 t50 18.8 ± 0.40 h. 운동 데이터의 5 매개 변수 logisti를 장착 했다 위 점근 선형 감소와 c 곡선입니다. 지연 위상 및 t50 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이 보간을 계산 했다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. 커브 피팅 및 요약 통계 IBM SPSS 통계 버전 20.0.0.2 사용 하 여 얻을 수 있습니다. B). 타우 집계 표시 PHF 같은 형태학 50 h;에서 AFM 이미지에 표시 된 대로 C). 단위체 huTau441의 S MALS 분석 (t = 0 h)과 반응의 완료에서 반응 혼합물의 상쾌한 (t = 50 h). 50 h 시간 지점에서 반응 혼합물 1 h g와 4 ˚C와 S MALS에 주입 결과 상쾌한 X 20000에 대 한 centrifuged 이었다. 모노 머의 실종의 완전 한 집합을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 타우 집계 분석 결과 독립 실험 실행 사이 높은 재현성을 보여줍니다. 두 개의 패널 huTau441 단백질의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 두 개의 독립적인 실험에서 수집 하는 자발적인 huTau441 집계에 대 한 4 개의 개별 활동 추적을 표시 합니다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 속도 론 12.2 ± 0.18 h와 17.8 ± 0.8 h (실행 1)와 11.6 ± 0,52 h t50 의 (SD)와 평균 지연 위상과 t50 17.8 ± 0.23 h (실행 2)의 각각 특징입니다. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. T50 은 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이의 보간에 의해 계산 되었다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 타우 집계 분석 결과 huTau441 단백질의 다른 배치 사이 높은 재현성을 보여줍니다. 각 패널 4에 해당 하는 특정 huTau441 일괄 복제 보여줍니다. 각 일괄 처리의 집계는 독립적인 실험에 선행 되었다. HuTau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 일괄 처리 15.3 ± 0.38 h (SD)와 평균 지연 위상과 t50 21.1 ± 0.46 h (배치 1);의 특징은 4 개의 개별 타우 해당 집계 속도 론 래그 단계 12.5 ± 0.07 h와 t50 19.8 ± 0.34 h (배치 2); 15.1 ± 0.34 h의 단계와 t50 21.9 ± 0.86 h (일괄 3)의 지연 및 지연 11.5 ± 0.29 h의 단계와 t50 17.8 ± 0.29 h (일괄 4)의 각각. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. 지연 위상 및 t50 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이 보간을 계산 했다. 지연 위상 ThT 형광 신호 3% 증가에 따라 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 미리 형성한 hutau441 집계는 높은 활동 시드. 뿌리기 시작, sonicated 타우 집계 단위체 hutau441에 추가 되었습니다. 빨강에서 파랑, 다른 운동 곡선의 각 색상 추가 된 씨앗의 다른 금액을 나타냅니다: 1.25%, 0.63%, 0.31%, 0.16%, 0.08%, 0.04%, 0.02%, 0.01%, 0.005%와 0.0025% (v/v), 각각. Hutau441의 자발적인 변환 검정으로 표시 됩니다. 모든 조건 quadruplicate에서 테스트 되었습니다. 씨앗의 특정 농도와 관련 된 4 개의 운동 복제 높은 재현성 및 대부분 구별할 수 있습니다. Hutau441 및 헤 파 린 농도 각각 8 µ M 및 15 µ M입니다. 미리 형성 된 sonicated 원 구조의 작은 금액의 추가 초기 지연 위상 자발적인 변환에서 관찰 하 고 효과 씨앗의 양에 비례 합니다. 빨강에서 파랑, t50 관찰 (t50 spont.conv-t50 시드) 점은 18.9, 18.40, 17.8, 17.3, 16.6, 16.1, 15.4, 14.7, 14.2 13.7 시간, 각각. Hutau441의 자발적인 변환은 평균 t50 (SD) 19.85의 특징은 ± 0.54 h. 운동 데이터 위 우리에 선형 감소 5-매개 변수 로지스틱 곡선을 장착 했다. t50 은 선형 회귀에 의해 예측 된 값 사이의 보간에 의해 계산 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

수많은 노력에도 불구 하 고 타우 집계 활동 날짜 부족 재현성의 원하는 수준 및/또는 nucleation 종속 합19,,2021 의 기능 중 일부를 문학에서 보고 , 22 , 23 , 25. 이것은 종종 지연 위상, 비효율적인 시드 및 타우의 원 비 자연의 부족에 의해 강조. 이러한 단점에 대 한 이유 다를 수 있습니다 고 최적의 타우 단백질 품질 (조각화, 집계, 낮은 순도, 등등의 존재.), 단백질 및 시 약 및 실험 조건 또는 유도 포함 한다. 또 다른 있느냐는 2 시스테인 잔류물 타우 집계 인터페이스 주위에 형성 내부-수 있는 인테르-산화 환 원 환경 및 영향 타우 집계의 효율성에 따라 분자 이황화 다리. 대부분의 방식에서 DTT 또는 TCEP 시스테인 잔류물 감소 형태로 유지 하 고 따라서 증가 재현성25레벨에 사용 된 시 약을 줄이고. 또한, 타우의 소멸 계수는 매우 낮은 단백질 농도의 정확한 측정에 어려움에 이르게.

우리는 몇 가지 매개 변수 및 타우 단백질에 대 한 강력 하 고, 재현 고 대표 집계 프로필에 대 한 중요 한 고려 하는 품질 특성에 특히 집중: 내부-의 가능성을 제거 하 고 간-분자 이황화 형성, 매우 순수한 타우 모노 머를 생성 하 고 농도 결정의 정확도 향상. 이러한 모든 시이 약 관련 된 질문은 최적의 분석 결과 개발에 대 한 중요 한 고려 하는 잠재적인 관심 포인트. 이러한 문제를 해결 하려면 두 개의 돌연변이, C291A 및 C322A, 그리고 N-C 터미널 태그 전체 길이 huTau441 표현 했다. 시스테인 잔류물의 돌연변이 달리 매우 통제 하기 어려운 이황화 다리 제거 하는 동안 타우 단백질에 최소한의 영향을 있다. 상대적으로 짧은 N와 C 맨끝 태그와 단백질을 표현 하 여 매우 높은 순도, 무결성 및 단위체 콘텐츠 주도 단계 선호도 정화 프로토콜을 추구 수 있었습니다. 또한, 우리는 단백질의 소멸 계수를 증가 하 고 훨씬 더 정확한 농도 측정24를 허용 하는 F8W 돌연변이 소개 했다.

높은-품질 단백질 시 약을 사용 하 여 다른 분석 결과 매개 변수 또한 최적화 했다. 최적의 타우: 헤 파 린 비율 이전 출판된 연구26은 0.5 (M/M) 주위에 확인 되었다. 또한, 기계 및 광학 경 음악 설정은 재현성 및 최적의 매개 변수를 제조 업체에 따라 어느 정도 달라질 수 있습니다 위해 중요 합니다.

이 분석 결과에서 설명의 집계 타우 pathogenesis 연관 광고에 및 tauopathies 관련 특성을 보여 줍니다. 프로세스는 해당 고 에너지 핵의 형성 하는 초기 지연 위상 시작 하 고에 해당 하는 급속 한 성장 단계 fibril 성장. 지연 시간은 충분히 긴 시드 프로세스 씨앗 농도 (그림 5) 동안 여전히 너무 오래 그래서 단백질 저하 및 일반적인 집계를 피할 수의 광범위 한 범위 (그림 자세히 공부 넓은 창을 열려면 2). 이러한 2 차 이벤트 huTau441 등 본질적으로 무질서 단백질 생리 적 조건에 시간의 오랜 기간 동안 노출 되 면 일이 특히 수. PHFs의 형태 광고 환자의 두뇌에서 격리 되며 모집 단위체 타우를 드 노 보 에서 매우 효율적인 획득된 타우 집계 표시 집계, 시드 라고 하는 프로세스를 생성. 분석 결과 사실상 우물, 실험 실행 및 단백질 일괄 처리 사이 구별 되 고 운동 곡선 높은 재현성. 현재 분석 결과 긴 타우 isoform, huTau441에 초점을 맞추고 있지만 응용 프로그램을 적용할 수 있습니다 또한, 다른 형태의 타우 (Ameijde 그 외 여러분, Acta Neuropathologica 통신, 언론에서)의 변환 연구 그것은 수 기계 연구 tau isoforms의 상호 작용에 초점을 맞춘 고 가능성이 있는 3R, 4R isoforms는 PHFs 및 선택의 질병 또는 치 매 Frontotemporal에 타우 병리학 주로 포함 되어 있는 광고에 타우 pathogenesis의 차이점에 빛을 발산 3R, 4R tau isoforms, 각각27.

분석 결과의 매우 높은 재현성 상대적으로 쉽게 그들의 특정 랩 설정에서 그것을 구현 하는 독자를 허용 해야 합니다. 분석 결과 믿어지는 무슨이 vivo에서 misfolding과 타우의 모방, 타우 pathogenesis 및 그것에 빛을 발산 하게된다 기계 연구 약물 후보를 심사 하기 위한 유용한 도구를 구성 및 그들의 간섭 평가 와 병 인 과정의 다른 단계.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 한 나 Inganäs 및 우수한 기술 지원에 대 한 마 반 빈 센 마틴 Koldijk 데이터 분석에 대 한 표현과 huTau441의 정화에 대 한 헥 터 Quirante를 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

신경 과학 문제로 141 타우 집계 시드 아 밀 로이드 마약 검사 치 매 tauopathies 단백질 misfolding
<em>생체 외에서</em> 타우 단백질 및 마약 검사의 집계를 공부에 대 한 분석 결과
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri,More

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter