Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vitro Analysen for å studere aggregering av Tau Protein og narkotikarelaterte Screening

Published: November 20, 2018 doi: 10.3791/58570
Automatic Translation
1, 1, 1
1Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Companies of Johnson and Johnson

Summary

Tau aggregering analysen beskrevet i dette manuskriptet etterligner etterlengtede funksjonene i vivo tau misfolding og aggregering.

Abstract

Samling av tau protein og dannelse av sammenkoblede spiralformede filamenter er et kjennetegn på Alzheimers sykdom og andre tauopathies. Sammenlignet med andre proteiner tilknyttet nevrodegenerative sykdommer, aggregering rapportert i vitro kinetics for tau protein er mindre konsekvente presenterer en relativt høy variasjon. Her beskrive vi utviklingen av i vitro aggregering analysen som etterligner forventet trinnene knyttet tau misfolding og aggregering i vivo. Analysen bruker de lengste tau isoformen (huTau441) som inneholder både N-terminal surt setter samt fire microtubule binding domener (MBD). I vitro aggregasjonen er utløst av tillegg av heparin og kontinuerlig etterfulgt av thioflavin T fluorescens i 96 godt microplate format. Tau aggregering analysen er svært reproduserbar mellom forskjellige brønner, eksperimentelle kjører og grupper av protein. Aggregering fører til tau PHF-lignende morfologi som er svært effektiv i seeding dannelsen av de novo fibrillar strukturer. I tillegg til sin søknad i å studere mekanismen av tau misfolding og aggregering, er gjeldende analysen et kraftig verktøy for screening legemidler som kan forstyrre patogenesen av tau.

Introduction

Alzheimers sykdom er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse histopathologically definert av akkumulering av ekstracellulære senil plaketter av aggregert Amyloid beta1 og intracellulær neurofibrillary ledninger som inneholder samlet hyperphosphorylated tau protein2. Fysiologiske tau er monomerisk og presentert som seks unike isoformene som inneholder 0-2 N terminal INSERT og 3 eller 4 microtubule binding domener3,4 som følge av alternativ skjøting og et gjennomsnitt på 2-3 phosphorylations. Det antas at hyperphosphorylation, misfolding og selv samling i fibrillary strukturer utgjør de viktigste elementene i tau patogenesen, som pathologically vurdert i demente enkeltpersoner5,6.

De aggregerte neurofibrillary tau floker er et kjennetegn ikke bare for Annonsen, men også for andre tauopathies, inkludert frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD), Pick sykdom, progressiv supranuclear parese (PSP), fronto-temporal demens (FTD) og primær Age-relaterte tauopathy (del)2. Fra en biokjemiske synspunkt, forstå mekanismen av tau misfolding og aggregering kunne kaste lys over patologisk prosesser knyttet til Annonsen og andre tauopathies. Det vitenskapelige aspektet er robust i vitro aggregering analyser verdifulle verktøy for screening av narkotika kandidater7,8,9,10. Det antas at aggregering av tau følger en nucleation avhengige polymerisasjon prosessen (NDP)11,12,13,14. NDP kinetics er sigmoidal og starter med en energisk ugunstige nucleation trinn etterfulgt av en rask energisk nedoverbakke aggregering prosess.

I motsetning til andre amyloidogenic proteiner, inkludert prion protein, amyloid beta og α-synuclein, tau spontant samlet ikke under fysiologiske forhold og selv ekstreme pHs eller høye temperaturer er ikke-bidro samling15. Dette skyldes sannsynligvis hydrophylic vekselsvirkningene i tau aggregering grensesnittet. Imidlertid samler tau effektivt i fysiologiske konsentrasjoner Når indusere som heparin16 eller17,18 andre polyanions brukes.

Tidligere innsats å sette opp i vitro tau aggregering analyser har kaste lys på detaljene i tau misfolding og aggregering, men de kom kort av etterligne hva antas å være i vivo tau aggregering kinetics. I de fleste tilfeller manglet tau aggregering kinetics den første lag fasen knyttet tau nucleation. Dette kan ha vært konsekvensen av å bruke svært høy tau protein konsentrasjoner, tilstedeværelse av aggregater i Start tau protein forberedelsene og/eller bruk av tau med mye høyere aggregering tilbøyelighet enn den mer fysiologiske full lengde tau protein19,20,21,22,23. Videre opp tidligere studier ikke reproduserbarhet og robusthet del av tau aggregering kinetics.

Her beskriver vi en robust i vitro tau aggregering analysen som etterligner hovedegenskapene for en nucleation avhengige polymerisasjon med en første lag fase tilsvarer tau nucleation etterfulgt av en eksponentiell vekstfase. Videre genererte rekombinant tau aggregater er fibrillar i naturen og har en ekstremt høy seeding styrke. Analysen er svært reproduserbar mellom tau grupper og representerer et verdifullt verktøy til skjermen for aggregering hemmere.

Protocol

1. forberedelse av reagenser

  1. Reaksjon buffer
    1. Forberede reaksjon buffer: 0,5 mM TCEP i PBS, pH 6,7 av oppløsning TCEP pulver (MW = 286.65 g/mol) i PBSstock-løsningen pH 7.4.
      Merk: Det skyldes tilstedeværelse av TCEP under bygge bro aggregering studier med wild type tau protein som inneholder cysteinene. I den gjeldende protokollen, TCEP brukes bare til å justere pH i PBS fra 7,4 til 6,7 og spiller ingen annen rolle i å regulere alle redoksreaksjoner.
    2. Bland godt og filtrere løsningen gjennom et sterilt 0.22 μm pore størrelse PES membran filter.
    3. Aliquot og butikk på-80 grader.
    4. Tine på benken og stabilisere seg på RT før bruk.
  2. huTau441
    1. Fjern huTau441 (for protein uttrykk og rensing se Apetri et al. 24) fra-80 grader fryseren.
    2. Tine på benken og equilibrate til romtemperatur (RT).
    3. Spinne rør med protein lager for 5 min på 12.000 x g ved 20-25 grader å fjerne luftbobler.
    4. Måle konsentrasjonen av huTau441by absorpsjon på 280 nm bruker en utryddelse koeffisient av 0.31 mL mg-1cm-1
  3. Thioflavin T
    1. Klargjør 500 μM thioflavin T (ThT) lagerløsning ved oppløsning 10 mg av ThT pulver (MW = 318.86 g/mol) i 35 mL reaksjon buffer.
    2. Bland godt, vortex 3 ganger på 20 sekunder med maksimal hastighet og filtrere løsningen gjennom et sterilt 0.22 μm pore størrelse PES membran filter.
    3. Bestemme konsentrasjonen av absorpsjon målinger på 411 nm bruker en utryddelse koeffisient 22.000 M-1 cm-1 og justere ThT konsentrasjon til 500 μM. Lagre på RT beskyttet mot lyset. Forberede fersk hver 2 måneder.
  4. Heparin
    1. Forberede frisk 55 μM heparin-oppløsningen av oppløsende 1 mg av HMW heparin pulver (MW = 17-19 kDa) i 1 mL reaksjon buffer på RT.
    2. Rist kraftig og vortex 2 ganger i 5 sekunder.
    3. Filtrere løsning gjennom et sterilt 0,20 μm pore størrelse PES membran filter (sprøyte).

2. kontinuerlig ThT aggregering analysen på en multi-modus Microplate leser

Merk: ThT fargestoff legges til reaksjonen å overvåke huTau441 aggregering kinetics i en kontinuerlig (automatisk mål). Selv om reaksjonen kan bli etterfulgt av en vanlig fluorometer ved hjelp av konvensjonelle søppel, operasjonenes manuelle natur operasjonen begrenser frekvensen av målinger og kompromisser nøyaktigheten av innspilte kinetic kurvene. Derfor brukes en automatisk Multi-mode microplate leser.

  1. Instrumentet satt opp
    1. Slå på datamaskinen og multi-modus microplate leseren. La utstyret stabilisere i 10 minutter.
    2. Start programvaren og forberede en protokoll.
      1. Velg protokollen: standard-protokollen (Data reduksjon utføres uavhengig for hver plate).
      2. Still inn temperaturen på 37 grader, og velg preheatment før du fortsetter protokollen.
      3. Angi kinetic Kjør: kjøretid 50 h / måling intervall: 15 min.
      4. Angi orbital rister på 425 cpm (3 mm) i kontinuerlig modus.
      5. Velg metoden Les: fluorescens intensitet endepunktet/Kinetic - Monochromators bølgelengder: eksitasjon 440 nm (20 nm båndbredde) / utslipp 485 nm (20 nm båndbredde) - optikk plasser: topp - Normal lese hastighet - lese høyde: 4.50 mm
      6. Start Kjør bruker opprettet protokollen. Navnet eksperimentet, Velg målet for den nyopprettede filen og at maskinen skal pre equilibrate til ønsket temperatur.
  2. Spontan huTau441 konvertering
    1. Forberede reaksjon eksemplet i en 1,5 mL tube. Bruk 200 μL blanding per reaksjon og minst 4 replikat (reaksjon volumet for 4 replikerer = 800 μL).
    2. Forberede 800 μL reaksjon utvalg (ved 4 gjentak) som inneholder 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved å blande protein med reaksjon bufferen, Legg heparin og ThT og bland godt pipettering opp og ned 5 ganger. Respekter den angitte rekkefølgen for reagens tillegg.
    3. Spinne eksempler på 12.000 x g og 25 grader i 5 min å fjerne luftbobler.
    4. Dispensere 200 μL av reaksjon vareprøve per brønn i 96-brønnen microplates (96-brønns svart heldekkende microplate, godt volum 360 μL, flat bunn). Unngå luftbobler.
    5. Forsegle microplate å unngå fordampning.
    6. Plasser microplate i Multi-mode microplate leser og starte målinger.
    7. Etter ferdigstillelse av eksperimentet, Fjern plate fra utstyr og eksportere data til en databehandlingen programvare.
  3. Kvalitetskontroll av konvertering, frø innsamling og lagring.
    1. Fjern sealer fra platen og basseng i forskjellige replikat i 1,5 mL rør. Bland godt aggregert prøven i brønnene av pipettering opp og ned 2 ganger før å samle. Aggregater tendens til å sette på bunnen av brønnen.
    2. Mix grundig i 1,5 mL tube av pipettering opp og ned 5 ganger og dispensere 10-20 μL på glimmer underlag for å analysere aggregater av AFM (for mer informasjon se Apetri et al. 24).
    3. Høste aggregatene ved å spinne 1,5 mL røret i 20.000 x g og 4 grader i 1 time. Aggregater danner pellets.
    4. Separate og analysere nedbryting av S-MALS å bekrefte fravær av monomerisk tau i utvalget som indikerer en vellykket konvertering i aggregat (for ytterligere detaljer se Apetri et al. 24).
    5. Etiketten 1,5 mL røret som inneholder de resterende aggregatene (pellet) første huTau441 protein konsentrasjon og prøve volum. Fest fryse Aggregatene og lagre på-80 grader.
  4. Seeded reaksjon
    1. Fjern huTau441 aggregater fra-80 grader fryser. Legg volumet av reaksjon buffer angitt på etiketten (første eksempel volum) og la røret stabilisere til RT. Resuspend aggregatene av pipettering opp og ned 5 til 8 ganger.
    2. Sonicate samlede utvalget. For en 200 μL prøve (15 μM huTau441), sonicate på isen ved hjelp av en 1/8†microtip (fra 100 μL opptil 10 mL) for en perioden 15 s med pulser av 1 s og pauser av 2 s på 30% amplituden (sonicator 250 watt). Nytt equilibrate prøve å RT.
      Merk: De næringsdrivende sonication forholdene føre til en homogen befolkning på tau fibrils med lengder av 20-50 nm24.
    3. Forberede reaksjon prøven i 1,5 mL rør. Bruk 200 μL blanding per reaksjon og minst 4 replikat (reaksjon volumet for 4 replikerer = 800 μL).
    4. Forberede 800 μL reaksjon utvalg som inneholder 15 μM huTau441, 8 μM heparin og 50 μM ThT. Start ved å blande protein med reaksjon bufferen, Legg heparin og ThT og bland godt pipettering opp og ned 5 ganger. Respekter den angitte rekkefølgen for reagens tillegg.
    5. Spinne eksempler på 12.000 x g og 25 grader i 5 min å fjerne luftbobler.
    6. Dispensere 200 μL av reaksjon vareprøve per brønn i 96-brønnen (96-brønns svart heldekkende microplate, godt volum 360 μL, flat bunn). Unngå luftbobler.
    7. Homogenize grundig preformed fibril prøven ved repeterende opp og ned pipettering (5 ganger) og legge til hvert godt beløpet tilsvarer ønsket prosentverdi av frø. For en 200 μL godt totalt volum er 2 μL preformed frø tillegg en 1% (v/v). Blanding av pipettering opp og ned 3 ganger når du legger til brønnen og unngå luftbobler.
    8. Forsegle microplate å unngå fordampning.
    9. Plasser microplate i Multi-mode microplate leser og starte målinger.
    10. Fjern plate fra utstyr og eksportere data til et regneark.

Representative Results

Rekombinant huTau441 som inneholder C291A og C322A mutasjoner og N-terminal hans og C-terminalen C-koder ble uttrykt og renset som tidligere beskrevet24. Kladdene som huTau441 er svært ren som visualisert på SDS-side og nesten 100% monomerisk som vurdert av S-MALS (figur 1). Aggregering av 15 µM huTau441 ble indusert ved tilsetning av 8 µM HMW heparin og reaksjonen var kontinuerlig etterfulgt i ThT fluorescens likner en multimode microplate. Eksitasjon bølgelengden var 440 nm (båndbredden 20 nm) mens utslipp ble målt på 485 nm (båndbredden 20 nm). Analysen er svært reproduserbare, med resultater fra 10 individuelle brønner er nesten utvisket (figur 2A). Morphologies av ThT positiv huTau441 aggregater ble vurdert etter 50 h av AFM. Aggregert hutau441 er en homogen blanding av fibrillar strukturer i ulike lengder ligner rapporterte ex vivo morphologies (figur 2B). Videre inneholder ikke endelige reaksjonsblandingen monomer, foreslå en full konvertering i aggregat som vist av S-MALS målinger (figur 2C). The kinetics av huTau441 samling i uavhengige eksperimentelle kjører er svært lik som understreket av lignende sigmoidal kurver og skille lag og vekst faser (Figur 3). Høy reproduserbarhet opprettholdes når forskjellige bunker protein brukes (Figur 4). Videre er preformed huTau441 aggregater svært effektiv i å rekruttere tau monomer og indusere dannelsen av de novo tau aggregat. Beløpene så lavt som 0.0025% (v/v) av preformed tau aggregater er i stand til å omkjøringsvei nucleation og utløser generasjon av de novo fibrils (figur 5).

Figure 1
Figur 1: rekombinant huTau441 er monomerisk og svært ren. A) renhet vurdering under denaturing betingelser på en 4-12% SDS side gel inkludert molekylvekt standard protein stigen (i kDA) (Lane 1); strømme gjennom fra siste C-tag affinitet rensing trinn (Lane 2); kolonnen vask brøkdel (Lane 3), elut huTau441 protein topp, før (Lane 4), og etter buffer utveksling (Lane 5), henholdsvis). B) S-MALS analyse av huTau441. Protein viser til > 99,9% monomerisk med molar masse 51 kDa og inneholder ikke mengder eller fragmenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: samling av rekombinant huTau441 svært reproduserbare og fører kvantitativt fibrillar strukturer. A) kinetics av heparin indusert huTau441 aggregering overvåkes kontinuerlig i 96 godt microplate format av ThT fluorescens. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. 10 personlige kurvene tilsvarer konvertering av samme protein batch i ti brønner i den samme microplate og er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase av 14.2 ± 0.38 h og t50 18.8 ± 0.40 h. Kinetic data var utstyrt med en 5-parameteren logisti c kurven med lineær nedgang i den øvre asymptoten. Lag fase og t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. Kurven passer og Sammendrag er oppnådd ved hjelp av IBM SPSS statistikk versjon 20.0.0.2. B). Tau aggregater Vis PHF-lignende morphologies som angitt av AFM bildebehandling på 50 h; C). S-MALS analyse av monomerisk huTau441 (t = 0 h) og nedbryting reaksjonsblandingen reaksjonen er ferdig (t = 50 h). På 50 h tidspunktet var reaksjonsblandingen sentrifugeres 1t på 20.000 X g og 4 grader og resulterte nedbryting injisert på S-MALS. Forsvinningen av monomer toppen bekrefter komplett aggregering av tau. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: tau aggregering analysen viser høy reproduserbarhet mellom uavhengige eksperimentelle kjøres. De to panelene viser fire individuelle kinetics spor på spontan huTau441 aggregering samlet i to uavhengige eksperimenter ved hjelp av samme gruppe av huTau441 protein. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Kinetics er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase 12.2 ± 0,18 h og t50 gjennomsnitt 17,8 ± 0,8 h (kjøre 1) og 11,6 ± 0,52 h og t50 i gjennomsnitt 17,8 ± 0,23 h (kjøre 2), henholdsvis. Kinetisk data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. T50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tau aggregering analysen viser høy reproduserbarhet mellom forskjellige bunker huTau441 protein. Hvert panel viser fire replikerer tilsvarer en bestemt huTau441 gruppe. Aggregering av hver gruppe ble etterfulgt i uavhengige eksperimenter. Konsentrasjoner av huTau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Aggregering kinetics tilsvarer de fire individuelle tau grupper er preget av en gjennomsnittlig (med SD) lag fase av 15.3 ± 0.38 h og t50 21,1 + 0,46 h (Batch 1); Lag fase av 12.5 ± 0,07 h og t50 av 19,8 ± 0.34 h (Batch 2); Lag fase av 15,1 ± 0.34 h og t50 21.9 + 0,86 h (Batch 3) og lag phase 11,5 + 0.29 h og t50 i gjennomsnitt 17,8 ± 0.29 h (Batch 4), henholdsvis. Kinetisk data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. Lag fase og t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Lag fase beregnes basert på 3% økning av ThT fluorescens signal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Preformed hutau441 aggregater har høy seeding aktivitet. For å starte frø, ble sonicated tau aggregater lagt til monomer hutau441. Fra rød til blå, hver farge av ulike kinetic kurver representerer ulike mengden ekstra frø: 1,25%, 0,63%, 0.31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0.02%, 0,01%, 0.005% og 0.0025% (v/v), henholdsvis. Spontan konvertering av hutau441 er representert i svart. Alle ble testet i quadruplicate. De fire kinetic gjentak forbundet med en viss konsentrasjon av frø er svært reproduserbare og i de fleste tilfeller utvisket. Konsentrasjoner av hutau441 og heparin er 15 µM og 8 µM, henholdsvis. Tillegg av små mengder av pre-formet sonicated fibrillar strukturer eliminerer den første lag fasen i spontan konvertering og effekten er proporsjonal med antall frø. Fra rød til blå, er forskjellen i t50 observert (t50 spont.conv-t50 såing) 18,9, 18.40, gjennomsnitt 17,8, 17.3, 16,6, 16,1, 15,4, 14,7, 14,2 og 13,7 timer, henholdsvis. Spontan konvertering av hutau441 er preget av en gjennomsnittlig t-50 (med SD) av 19.85 ± 0.54 h. Kinetic data var utstyrt med en 5-parameteren logistikk kurve med lineær nedgang i den øvre asymptoten. t50 ble beregnet av interpolering mellom normalverdiene av lineær regresjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Til tross for utallige forsøk, tau aggregering kinetics rapportert i litteraturen dato mangel ønsket nivået av reproduserbarhet og/eller noen av funksjonene i nucleation avhengige polymerisasjon19,20,21 , 22 , 23 , 25. Dette er ofte understreket av mangel på et lag fase, ineffektiv såing og ikke-fibrillar natur tau aggregat. Årsaken til disse manglene kan variere og inkluderer sub-optimal tau protein kvalitet (fragmentering, tilstedeværelse av aggregater, lav renhet, osv.), valg av protein og inducing reagenser og eksperimentelle forhold. En kompliserende faktor er to cystein rester ligger rundt tau aggregering grensesnittet som kan danne intra - eller inter - molekylær disulfide broer avhengig av redoks miljø og påvirke effektiviteten av tau aggregering. I de fleste tilnærminger redusere reagenser som DTT eller TCEP har blitt brukt til å opprettholde cystein rester i redusert former og dermed øke nivåer av reproduserbarhet25. Videre er utryddelse koeffisient tau svært lav som fører til problemer i nøyaktige målinger av protein konsentrasjon.

Vi fokuserer spesielt på noen parametere og kvalitet attributter som vi anses avgjørende for en robust, reproduserbare og representant aggregering profil for tau protein: eliminerer muligheten for intra - og inter-molekylær disulfide formasjon, generere en svært ren tau monomer og forbedre nøyaktigheten av konsentrasjon besluttsomhet. Alle disse reagens knyttet spørsmål oppmerksomhet steder som vi som kritisk for optimal analysen utvikling. For å løse disse problemene, ble full lengde huTau441 uttrykt med to mutasjoner, C291A og C322A, og med N - og C-terminalen koder. Mutasjon av cystein rester har minimal innvirkning på tau protein mens de eliminerer den ellers veldig vanskelig å kontrollere disulfide broer. Uttrykke protein med relativt kort N - og C-terminalen koder tillot oss å forfølge en totrinns affinitet rensing protokoll som førte til høy renhet, integritet og monomer innhold. Videre har innført vi en F8W mutasjon som økt utryddelse koeffisient av protein og tillot mye mer nøyaktig konsentrasjon målinger24.

I tillegg til høy-kvalitet protein reagenser, var uteffekt analysen også optimalisert. Den optimale tau: heparin forholdet ble identifisert for å være rundt 0,5 (M/M) som er i tråd med tidligere publiserte undersøkelser26. Videre er mekanisk og optisk instrumental innstillinger avgjørende å sikre reproduserbarhet og optimale parametere avvike i noen grad avhengig av produsenten.

Aggregering av tau beskrevet i denne analysen viser egenskapene som er knyttet til tau patogenesen i AD og relaterte tauopathies. Prosessen starter med en første lag fase tilsvarer dannelsen av høy energi kjerner og etterfølges av en rask vekstfase som svarer til fibril vekst. Forsinkelse er tilstrekkelig lang til å åpne en bred vindu for å studere i detalj seeding prosessen som dekker et bredt spekter av frø konsentrasjoner (figur 5) mens fortsatt ikke for lenge så protein fornedrelse og/eller ikke-spesifikk aggregering unngås (figur 2). Disse sekundære hendelsene kan spesielt skje når en bunn uordnede protein som huTau441 blir utsatt for lange perioder fysiologiske forhold. Innhentet tau aggregater skjermen morfologi av PHFs isolert fra hjernen til AD pasienter og er svært effektiv i å rekruttere monomerisk tau og konvertere den til de novo generert aggregat, en prosess som frø. Analysen er svært reproduserbare, kinetisk kurvene blir nesten utvisket mellom brønner, eksperimentelle kjører og protein bunker. Selv om gjeldende analysen fokuserer bare på den lengste tau isoformen, huTau441, programmet kan tilpasses for å studere konvertering av andre former for tau (Ameijde et al., Acta Neuropathologica kommunikasjon, i trykk) videre kan mekanistisk studier fokuserte på samspillet mellom tau isoformene og muligens kaste lys over forskjellene mellom tau patogenesen i AD hvor både 3R og 4R isoformene er i PHFs og PICK sykdom eller Frontotemporal demens der tau patologi inneholder hovedsakelig 3r og 4R tau isoformene, henholdsvis27.

Den svært høy reproduserbarhet til analysen bør tillate leserne å iverksette den med relativ letthet i bestemte lab innstillingene. Analysen etterligner det som antas å være i vivo misfolding og aggregering av tau, aktivere mekanistisk studier som vil kaste lys over tau patogenesen og det er et verdifullt verktøy for screening narkotika kandidater og vurdere deres forstyrrelser med de ulike trinnene i patogenesen prosessen.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Hector Quirante for uttrykk og rensing av huTau441, Hanna Inganäs og Margot van Winsen utmerket kundestøtte og Martin Koldijk for dataanalyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).
  3. Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).
  4. Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).
  5. Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease. Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).
  6. Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau. Science. 251 (4994), 675-678 (1991).
  7. Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease. Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).
  8. Pickhardt, M., et al. Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies. Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).
  9. Paranjape, S. R., et al. Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro. ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).
  10. Seidler, P. M., et al. Structure-based inhibitors of tau aggregation. Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).
  11. Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231. Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).
  12. Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).
  13. Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).
  14. Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro. Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).
  15. Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).
  16. Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
  17. Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).
  18. Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).
  19. Barghorn, S., Mandelkow, E. Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).
  20. Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution. Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).
  21. Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein. Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).
  22. Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies. Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).
  23. Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. Journal of Visualized Experiments. (95), e51537 (2015).
  24. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43 (2018).
  25. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
  26. Zhu, H. L., et al. Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation. Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).
  27. Buee, L., Delacourte, A. Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease. Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).

Tags

Nevrovitenskap problemet 141 Tau aggregering såing amyloid narkotikarelaterte screening Alzheimers tauopathies protein misfolding
<em>In Vitro</em> Analysen for å studere aggregering av Tau Protein og narkotikarelaterte Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri,… More

Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter