Summary
在这里, 我们描述了一种基于细胞的检测方法, 以定量评估小胶质细胞对 tau 的吸收, 目的是创建一个研究工具, 以更好地描述抗 tau 抗体的作用机制。
Abstract
阿尔茨海默病 (ad) 是一种进行性神经退行性疾病, 在这种情况下, 聚集的 tau 和淀粉样蛋白在大脑中积累, 导致神经元功能障碍, 最终导致认知能力下降。神经元中的高磷酸化 tau 集合体被认为是导致大多数与 ad 相关的病理原因。这些聚集物被假定被释放到细胞外的隔间, 并采取相邻的健康神经元, 在那里他们诱导进一步的 tau 聚集。这种 "prion 样" 的传播可以被能够结合和 "中和" 细胞外 tau 集合体的抗体打断, 如 ad 的临床前小鼠模型所示。治疗抗体减少病理的机制之一是抗体介导的接受和清除病理聚集形式的 tau 的微胶质细胞。在这里, 我们描述了一种基于细胞的定量检测方法, 以评估小胶质细胞对 tau 的吸收。该方法采用小鼠微胶质细胞系 bv-2, 具有高特异性、低变异性和中等吞吐量的特点。使用此检测生成的数据可有助于更好地表征抗陶抗体效应功能。
Introduction
阿尔茨海默病 (ad) 是一种进行性神经退行性疾病, 其特征是淀粉样β肽和 tau 蛋白的构象改变和自组装成病理聚集体。正常可溶性淀粉样β肽转化为低聚和纤维淀粉样β, 而异常磷酸化 tau 积累为低聚物和神经纤维缠结 1,2。这些蛋白质聚集物导致神经元死亡, 导致记忆力丧失和随后的逐渐认知能力下降。其他因素, 包括非生产性神经炎症和清除错误蛋白质的能力下降, 可能会加剧和加速疾病。目前, 针对 ad 的干预策略在很大程度上提供了症状缓解, 但没有疾病改变治疗或预防。
越来越多的证据表明, 高磷酸化 tau 聚集体在 ad 的病理中起着关键作用。在非病理状态下, tau 是一种原生展开的蛋白质, 它与微管结合, 并促进它们组装成神经元细胞骨架。当 tau 变得高磷酸化时, 它从细胞骨架分离, 并在神经元中聚集成 tau 聚集体, 这被认为会导致与 ad3相关的大多数病理。聚集的 tau 开始首先在体内积累, 但随着疾病的进展, 它被认为是从受影响的神经元释放到细胞外空间, 它可以被相邻或突触连接的健康神经元在 "像 prion-like 的方式 "。一旦内化, tau 聚合通过模板化构象变化 4诱导进一步的 tau 聚合。
根据这一假设, 能够阻断 tau 种子的疗法可能会减缓或逆转陶氏介导的神经退行性疾病的进程。为了支持这一点, 因基因突变而容易受到肺病影响并被动注射抗 tau 抗体的小鼠表现出降低的 tau 病理和认知功能的改善 5, 6,7,8 ,9。然而, 治疗抗体减少病理的机制仍然难以捉摸。
其中一个建议的机制是抗体介导的吸收和清除病理聚集形式的 tau 的微胶质细胞, 大脑的常驻免疫细胞。最近的出版物表明, 微胶质细胞可以有效地内化和降解病理 tau 物种,这种能力通过 fc 依赖机制, 涉及 fc 受体在表面表达的增强, 抗 tau 抗体微胶质细胞和受体介导的吞噬作用 10,11。这些数据确定微胶质细胞是治疗抗体的潜在重要作用。
本文介绍了一种基于细胞的检测方法, 用于定量评估微胶质细胞对 tau 的吸收。这种检测产生的数据有助于阐明抗陶氏抗体的作用机制, 从而成为推进抗陶抗体作为潜在 ad 治疗的进一步发展步骤的有用工具。
Protocol
1. bv-2 细胞培养
注: 在生物安全第2级遏制下处理 bv-2 细胞。bv-2 细胞系产生包覆的重组共沸逆转录病毒 (只能感染小鼠细胞)12;这类病毒以其体外转化能力和体内致瘤潜力而闻名。
- 在高糖 dulbecco 的修饰鹰培养基 (dmem) 中培养 bovine 细胞, 辅以10% 的胎牛血清 (fbs), 100 umml 青霉素、100μgml 链霉素和 2mm l-谷氨酰胺 (从现在起称为培养介质), 通过 4 x 104 的播种细胞塞勒斯梅尔
- 在37°c 的加湿气氛中保持培养,在5% 的二氧化碳环境中。
注: 细胞生长松散连接和悬浮。
2. 含 ph 敏感荧光染料的标签重组头骨料
注: tau 集料的制备情况见 apetri等人.13与不同的是, 没有硫黄素 t (t) 添加到反应缓冲液。在1.5 毫升离心管中采集了汇总样品。最后荧光信号通过将池样品的118μl 与 50μm tht 溶液的12μl 混合进行检测。在4°c 下, 将聚合反应混合物以 20, 000 x g的速度离心 1小时, 将聚合反应混合物分离。用 sec-mals 对上清液进行了分析, 以确定所有的单体 tau 都被转化为聚集体。颗粒 (tau 集料) 被夹住冷冻并储存在-80°c 的冰柜中。
- 在 ph 值8.5 至 1 mg/ml (~ 20μm) 的 0.1 m 碳酸氢钠缓冲液 (nahco3) 中的再聚合体。
注: tau 集料的浓度是根据最初的单体浓度计算的, 该浓度是根据 tau 单体在280纳米的吸收情况下使用 0.31 mlmg-1厘米-1 厘米-1的系数进行评估的。 - 使用探头声纳对重新悬浮的集料进行扫描, 同时保持在冰上, 以避免过热。
- 使用65% 的振幅 (与功率 250 w 的声纳)。
- 在脉冲之间执行 8个3秒的脉冲, 间隔 15秒, 以避免过热。
- 按照制造商的指示, 在二甲基亚硫酸 (dmso) 中制备 ph 敏感染料 (下称 ph 染料) 的 8.9 mm 库存溶液。
注意: 始终准备一个新的解决方案, 并使用它只在它准备的那一天。 - 在最终染料浓度为 0.2 mm 的情况下, 每摩尔添加10摩尔染料。
- 通过上下轻轻移液混合。
- 在室温下将反应混合物加氢 45-60分钟, 防止光线照射。
- 同时, 按照制造商的指示组装交联的糊精凝胶脱盐柱。
- 平衡含有 3% dmso 的 25 ml 0.1 m nhaco3缓冲液 ph 值8.5 的色谱柱。丢弃流经。
- 将 tau 整体标记反应的产物添加到总体积为 2.5 ml 的色谱柱上。如果样品小于 2.5 ml, 请添加缓冲区, 直到达到 2.5 ml 的总体积。
- 让样品完全进入包装凝胶, 丢弃流动。
- 具有 3.5 ml 0.1 m nahco3缓冲液 ph 8.5 的洗脱液, 含有 3% dmso, 并在 2 ml 管中收集4个等效组分的洗脱液。
- 用双氯酸 (bca) 法测定4组分的蛋白质浓度。
- 将标记的蛋白质存放在-20°c 的冰柜中。
3. 荧光激活细胞分选 (流式细胞仪) 读数的吸收检测
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第1天–细胞种子
- 通过去除培养培养基并加入1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 清洗烧瓶中的 bv-2 细胞。
注: 清洗量将根据所使用的电池瓶的大小而有所不同。例如, 对于 t175 烧瓶, 请使用 1x pbs 的10毫升进行清洗。 - 在37°c 和 5% co 2 下, 用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 (edta) 孵育 0.05%, 从烧瓶中取出 pbs 并分离细胞, 直到细胞从烧瓶中分离 (约 5分钟)。
注: 胰蛋白酶-edta 的体积0.05% 取决于所使用的电池瓶的大小。例如, 对于 t175 烧瓶, 使用2毫升的胰蛋白酶 edta 0.05%。 - 通过向上和向下三次移液, 在培养基中重新移植细胞。
注: 培养介质的体积因使用的电池瓶的大小以及烧瓶中的细胞总数而异。例如, 对于 t175 烧瓶, 使用8毫升的培养介质。 - 在含有200μgml 肝素的培养基中计数细胞并产生最终浓度为 1 x 10 5 细胞的细胞悬浮液。
- 在96孔组织培养平底板中, 每口井板250μl 细胞悬浮液 (2.5 x10 4个细胞)。
- 在37°c 和 5% co2下隔夜孵化板。
- 通过去除培养培养基并加入1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 清洗烧瓶中的 bv-2 细胞。
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第1天–制备免疫复合物
- 在冰上解冻 ph 值染料。
- 在无血清介质 (sfm) 中, 每个 ph 值度染料-tau 集合体的 500 nm 溶液的每个条件准备 65μl (高葡萄糖 dmem 补充 100 uml 青霉素、100μml 链霉素和200μgml 肝素)。
- 在 65μl sfm 中制备抗体稀释剂, 浓度为最后一次的两倍。将 ph 染料和抗体混合在96孔的 u 型底板中。现在每个条件的最终体积为 130μl, ph 染料-tau 聚集体浓度为 250 nm。密封稀释板, 在37°c 下孵育夜间。
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第2天–免疫复合物吸收
- 从 bv-2 细胞中去除培养介质。用100μl 室温 1x pbs 清洗细胞一次。
- 使用多通道移液器将125μl 免疫复合物转移到细胞中。在37°c 和 5% co2 条件下, 用免疫复合物对细胞进行培养 2小时.
- 从细胞中取出培养培养基并将其丢弃。用100μl 室温 1x pbs 清洗细胞一次。
- 取出 1个 pbs, 用50μl 胰蛋白酶 edta 0.25% 在37°c 和 5% co 2 下进行 20分钟的处理。
- 加入200μl 培养培养基, 通过上下移液分离细胞, 很好地重新悬浮。将细胞转移到96孔 u 型底板。在4°c 条件下, 以 400 x g离心板5分钟。
- 将盘子放在冰上, 去除培养基, 并通过将细胞颗粒重新悬浮在150μl 冰冷 1x pbs 中, 将细胞颗粒洗两次。在4°c 条件下, 以 400 x g离心板5分钟。
- 将细胞放在冰上, 取出添加的 1x pbs, 并通过将细胞颗粒重新悬浮在150μl 冷流式细胞仪缓冲液 (1x pbs, 0.5% 牛血清白蛋白 (bsa), 2mm edta) 中进行清洗。在4°c 条件下, 以 400 x g离心板5分钟。
- 将细胞放在冰上, 取出添加的流式细胞仪缓冲液, 并在200μl 冷流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞。
- 通过流式细胞仪在活细胞门中获取 2 x10 4个事件立即分析样品 (请参见步骤 4.1)。
4. 外地资产管制系统分析
注: 有关门控策略, 请参阅图 1 。
- 使用正向散射区域 (fsc-a) 与侧散射区域 (ssc-a) 密度图, 通过排除具有较低的正向散射水平 (即碎片和死细胞) 的事件, 在活细胞上打开门。
- 在活细胞群中, 使用 fsc-a 与正向散射高度 (fsc-h) 来排除细胞双关和聚集物。这是单打门。
- 利用单门中的事件, 生成 ph 染料单参数直方图。
- 确定平均荧光强度。通过排除使用 bv-2 仅对照确定的负细胞来确定 ph 值-dye-tau 阳性细胞的百分比。
5. 免疫复合物吸收与显微镜读数
-
第1天–细胞种子
- 准备 bv-2 细胞, 如步骤3.1.1、3.1.2 和3.1.3 中所述。
- 计数细胞, 并在培养基中重新悬浮它们, 最终浓度为 104 细胞。
- 在多 d-赖氨酸涂层96孔黑色板上, 每个孔板150μl 的细胞悬浮液 (1.5 x103), 并具有清晰的平底。
- 在37°c 和 5% co2 下孵化板 48小时.
-
第3天–准备免疫复合物
注: 在与抗体孵育之前, 对标记的 tau 集料进行了温和的超声检查, 以改善显微镜结果。- 在冰上解冻 ph 值, 并在冰上使用探针声纳进行声纳处理。使用15% 的振幅 (声纳功率为 250 w)。执行30个脉冲 2 s, 并在脉冲之间等待20秒。
- 在 sfm 中, 根据 ph 度染料-tau 聚集体的 500 nm 溶液的每个条件准备65μl。
- 在65μl 的 sfm 中稀释抗体, 使浓度增加最后一种浓度一倍。将 ph 染料和抗体混合在96孔的 u 型底板中。现在每个条件的最终体积为 130μl, ph 染料-tau 聚集体浓度为 250 nm。密封稀释板, 在37°c 下孵育夜间。
- 从电池板上取出培养基, 用150μl 的培养基代替, 辅以200μgl 肝素。在37°c 和 5% co2下隔夜孵化板。
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第4天–免疫复合物吸收
- 从 bv-2 细胞中去除培养介质。使用多通道移液器将125μl 免疫复合物转移到细胞中。
- 用 5% co2 在37°c 下用免疫复合物将细胞培养 1小时 45分钟.
染色细胞核与 dna 特定染料和酸性细胞器与探针选择性地染色低 ph 细胞隔间。用5% 的 co2 在37°c 下将细胞培养 15分钟.
注: 在 sfm 中稀释染料。 - 使用高含量筛选共聚焦系统进行活细胞成像。将温度设置为37°c 和 5% co 2。对于高质量的图像, 请使用63x 水浸目标, 并获得每个成像场0.5μm 平面 (每个 z 堆栈 20个)。
Representative Results
聚合重组陶被共价标记与 ph 敏感的绿色染料。这种染料在酸性细胞器中的内化时, 会显著增加其荧光, 从而允许细胞内定量。用抗陶单克隆抗体培养标记的陶粒集料。特别是, 我们使用了 cbtau-28.1 的嵌合版本 (鼠标 igg1 fc 区域)。这种人体抗体与 tau 的 n 端插入区域结合, 能够结合体外产生的tau 纤维 13.在本试验中, 我们还测试了 cbtau-281–dmcbbtau-28.1 的亲和力改进版本。以亲本和高亲和力突变体形式的 cbtau-28.1 的 fab 片段和小鼠 igg1 等型对照作为对照。
bv-2 细胞在肝素存在的情况下, 用预先形成的免疫复合物或单独聚集的 tau 孵育两个小时, 以阻断抗体与抗体无关的 tau 的吸收。培养后, 细胞进行胰蛋白酶化, 去除与细胞外膜结合的 tau, 并通过流式细胞术进行 tau 吸收分析。正如我们最近描述的 13, 我们观察到, cbtau-28.1 变种促进了 tau 在 bv-2 细胞中的吸收在剂量依赖的方式。由于 cbtau-28.1 法布碎片的吸收没有增加基础 tau 的吸收, 因此 fc 是介导的 (图 2)。此外, 高亲和力的 dmCBTAU-抗体介导的 tau 吸收到 bv-2 细胞中的程度高于野生类型抗体 (图 2)。
用共聚焦显微镜 (图 3) 证实了抗体介导的 tau 在内皮溶酶体室中的吸收和定位, 在这种显微镜下, 酸性细胞室被选择性的低 ph 细胞器探针染色。在 cbtau-28.1 培养的细胞内观察到绿色 ph 染料标记 tau 集合体的细胞内点。此外, 细胞内的 tau 集料通常与低 ph 隔间选择性红色染料同相化, 从而表明在酸性细胞器中存在 tau 集料。cbtau-28.1 法布碎片没有再次增加 tau 的吸收, 表明 fc 受体介导的内化机制 (图 3)。
图 1: 流式细胞术分析中用于检测 bv-2 细胞内化的门学策略.显示了仅 bv-2 对照 (a-c)、同型对照 (d-f) 和 dmCBTAU-(g-i) 的样本数据。bv-2 细胞群在 fsc-a 与 ssc-a 密度图上被控制, 不包括碎片和死细胞 (a、d、g)。然后, bv-2 细胞在 fsc-a 与 fsc-h 密度图上进一步打开, 以排除细胞双关和聚集体 (b、e、h)。单细胞门用于生成 ph 染料 (fitc 在这些代表性结果中) 单参数直方图 (c, f, i), 并确定几何平均荧光强度。或者, 计算 ph 度染料-tau 阳性细胞的百分比, 不包括使用 bv-2 对照确定的阴性细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: cbtau-28.1 介导 tau 集合体的吸收进入微胶质 bv-2 细胞.聚合重组 tau 共用绿色荧光 ph 敏感染料共价标记, 并用小鼠嵌合体版的人抗 tau 抗体 cbtau-28.1 孵育, 其亲和力改善格式, dmcbtau-28.1, 相应的 fab 片段, a小鼠 igg1 异型对照抗体或无抗体 (仅 tau 集合体)。免疫复合物随后在肝素存在的情况下用 bv-2 细胞孵育两个小时, 以阻断抗体与抗体无关的 tau 吸收。采用流式细胞术对免疫复合物的吸收进行了评估, 并以荧光强度 (a) 的几何平均值(gm) 或 tau 阳性 (tau +) 细胞 (b) 的百分比表示。(a) 中的误差柱表示两个独立实验的标准偏差, 而 (b) 表示单个实验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: tau 集料由 bv-2 细胞内化, 并在细胞酸性细胞器中定位.在肝素存在的情况下, 用 bv-2 细胞孵育了两个小时的预制陶氏抗体免疫复合物, 以阻断抗体的独立吸收。孵育后, 细胞核被 dna 特异性蓝色染料染色, 酸性细胞室用低 ph 隔间选择性红色染料染色。活细胞成像显示细胞内标记的 tau 集料 (绿色) 在细胞内的点点, 这些标记的 tau 集料 (绿色) 是在 cbtau-28.1 和 dmcbtau-28.1 培养的细胞内, 但不是同型对照。此外, 细胞内的 tau 聚集体通常与红色染料 (黄色) 同相化, 从而表明在酸性细胞隔间中存在 tau 集料。cbtau-28.1 法布碎片没有增加 tau 吸收, 表明 fc 受体介导的内化机制。图像表示使用63x 水浸目标获得的 20个 z-堆栈 (0.5μm 平面) 的最大强度投影。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
小胶质细胞, 常驻大脑的免疫细胞, 最近被确定为重要的参与者抗体介导的治疗方法的 tau象 10,11。微胶质细胞抗体介导的 tau 清除, 以及神经元吸收9的阻断、纤维形成13、14的抑制或不稳定以及通过溶酶体对反病毒纤维的清除路径15, 可能有助于在小鼠模型中观察到的抗陶氏抗体的有效性5,6,7, 8,9.
我们在这里描述了一种基于细胞的检测方法, 用于定量评估微胶质细胞对 tau 的吸收, 目的是创建一个研究工具, 以更好地描述抗 tau 抗体的作用机制。
本试验, 改编自 funk等人.11、采用 bv-2 细胞, 为永垂小鼠微胶质细胞。虽然它们不能与初级微胶质细胞完全相比, 但它们具有初级微胶质细胞的许多特征, 包括体内的吞噬细胞以及β和 tau 纤维11、16、17 的能力,18,19。此外, 他们在体外表现出可重复的行为, 这使得他们非常适合于分析开发和定量研究, 这需要最小的实验变异性。除此之外, 与使用初级微胶质细胞相比, 不朽的细胞系可以获得更高的检测吞吐量, 并消除对动物牺牲的需求。
我们在本试验中使用的 tau 集料是利用我们最近描述的高度可重复的体外聚集过程获得的, 并显示出与从 ad 大脑中分离出的配对螺旋丝 (phf) 相似的形态患者。虽然我们没有观察到任何意想不到的结果, 可能已导致的 tau 聚集体粘附到塑料或玻璃表面, 使用稳定和良好的特征 tau 聚集体发挥了关键的作用, 在这种检测的重现性。
对检测重现性有显著贡献的另一个方面是细胞密度。协议中描述的每口井的细胞数量代表了所描述条件下的最佳细胞密度。
比芬克等人还多.11描述, 我们用 ph 敏感染料标记 tau 集料, 该染料在酸性细胞器中的内化时显著增加其荧光, 从而允许细胞内定量。这一点, 再加上表面结合免疫复合物和或 tau 的胰蛋白酶消化, 保证了流式细胞仪测量的荧光信号是 tau 吸收而不是与细胞表面结合的结果。此外, 使用 ph 敏感染料可以在显微镜实验中检测到内化的陶族, 而无需消化表面结合免疫复合物, 而需要重新电镀和回收细胞。
与前面描述的11相比, 我们还进一步优化了我们的检测的显微镜读出, 在我们的显微镜实验中使用了一种高度选择性的染料用于酸性细胞器, 这不仅使我们能够确认抗体介导在内溶酶体隔间中, 也有 tau 集料的定位。
我们开发的检测方法具有最佳的特异性, 从而形成了一个良好的实验窗口, 使阳性样本和阴性样品之间有了很强的分离。有趣的是, 该检测间接检测抗体亲和力的差异, 从而代表了研究抗陶抗体效应功能的有力工具。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢阿尔贝托·卡平泰罗·苏亚雷斯提供的宝贵技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
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