Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Celle-baserede analyse at studere antistof-medieret Tau Clearance af mikroglia

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58576
Automatic Translation
1, 2,3, 3, 3, 4, 3
1Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Belgium, 2Department of Hematopoiesis, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, The Netherlands, 3Janssen Prevention Center, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, The Netherlands, 4Neuroscience Discovery, Janssen Pharmaceutical Company of Johnson & Johnson, Pennsylvania

Summary

Her beskriver vi en celle-baseret analyse for at vurdere kvantitativt tau optagelse af mikroglia med formålet at skabe et testpræparat værktøj til bedre karakterisere virkningsmekanisme af anti-tau antistoffer.

Abstract

Alzheimers sygdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ tilstand hvor aggregerede tau og amyloid protein ophobes i hjernen forårsager neuronal dysfunktion, hvilket i sidste ende fører til kognitiv tilbagegang. Hyperphosphorylated tau aggregater i neuron menes at forårsage de fleste af patologi tilknyttet annonce. Disse aggregater er antaget at blive frigivet i det ekstracellulære rum og taget af tilstødende sund neuroner hvor de fremkalde yderligere tau sammenlægning. Denne "prion-lignende" spredning kan afbrydes af antistoffer kan bindende og "neutralisere" ekstracellulære tau aggregater som vist i prækliniske musemodeller af annonce. En af de foreslåede mekanismer som terapeutisk antistoffer reducere patologi er antistof-medieret optagelse og clearance af patologiske aggregerede former for tau af mikroglia. Her beskriver vi en kvantitativ celle-baseret analyse for at vurdere tau optagelse af mikroglia. Denne analyse bruger musen microglial cellelinje BV-2, giver mulighed for høj specificitet, lav variabilitet og medium gennemløb. Data genereret med dette assay kan bidrage til en bedre Karakteristik af anti-tau antistof effektor funktion.

Introduction

Alzheimers sygdom (AD) er en progressiv neurodegenerativ tilstand karakteriseret ved en konformationel ændring og samlesæt af amyloid β peptid og tau protein i patologisk aggregater. Den normale opløselige amyloid β peptid omdannes til oligomere og fibrillar amyloid β, mens unormalt fosforyleres tau ophobes som oligomerer og neurofibrillary tangles1,2. Disse protein aggregater medføre neuronal død fører til hukommelsestab og efterfølgende progressive kognitiv tilbagegang. Andre faktorer, herunder ikke-produktive neuroinflammation og en nedsat evne til at klare fejlfoldede proteiner, kan forværre og fremskynde sygdom. I øjeblikket interventionsstrategier mod annonce giver i høj grad symptomlindring, men der er ingen sygdomsmodificerende helbredelse eller forebyggelse.

Stadig flere beviser antyder en nøglerolle af hyperphosphorylated tau aggregater i patologi af annonce. I sin ikke-patologiske tilstand er tau en indbygget udfoldet protein, der binder sig til mikrotubuli og fremmer deres forsamling i de neuronale cytoskelet. Når tau bliver hyperphosphorylated, det frigøres fra cytoskelettet og klynger i tau aggregater i neuron, som menes at forårsage de fleste af patologi tilknyttet AD3. Aggregerede tau starter akkumulere først intracellulært, men efterhånden som sygdommen skrider frem, antages det at blive frigivet fra berørte neuroner i det ekstracellulære rum, hvorfra det kan tages af tilstødende eller synaptically tilsluttede sund neuroner i en " prion-lignende måde". Når internaliseret, inducerer aggregeringen tau yderligere tau aggregering via skabelonbaserede konformationel ændring4.

Ifølge denne hypotese kan behandlinger i stand til at afbryde tau såning bremse eller vende løbet af tau-medieret neurodegenerativ sygdom. Til støtte for dette Vis mus lavet modtagelige for tauopathy af genetisk mutation og passivt injiceres med anti-tau antistoffer reduceret tau patologi og forbedret kognitive funktion5,6,7,8 ,9. Men de mekanismer, hvorved terapeutiske antistoffer reducere patologi stadig undvigende.

En af de foreslåede mekanismer er antistof-medieret optagelse og clearance af patologiske aggregerede former for tau af mikroglia, hjernens bosiddende immunceller. De seneste publikationer foreslå at mikroglia kan effektivt internalisere og forringe patologiske tau arter og denne evne er forstærket af anti-tau antistoffer via en Fc-afhængige mekanisme der involverer Fc receptorer udtrykkes på overfladen af mikroglia og receptor medieret fagocytose10,11. Disse oplysninger identificerer mikroglia som potentielt vigtige effektorer af terapeutiske antistoffer.

Heri beskrives en celle-baseret analyse for at vurdere kvantitativt tau optagelse af mikroglia. Data genereret med dette assay kan hjælpe med at belyse virkningsmekanismer af anti-tau antistoffer således udgør et nyttigt redskab til at fremme anti-tau antistoffer til yderligere trin i deres udvikling som potentielle AD behandling.

Protocol

1. BV-2 celler kultur

Bemærk: Håndtag BV-2 celler under biosikkerhedsniveau 2 indeslutning. BV-2 cellelinie producerer et kappebærende rekombinante ecotropic retrovirus (i stand til at inficere murine celler kun)12; sådanne vira er kendt for deres i vitro omdanne evne og i vivo tumorfremkaldende potentiale.

  1. Kultur BV-2 celler i høje glukose Dulbecco ændret eagle medium (DMEM) med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 2 mM L-glutamin (refereret til som dyrkningsbaserede middel fra nu af) suppleret med såning celler på 4 x 104 celler/mL.
  2. Vedligeholde kulturer i en fugtig atmosfære i 5% CO2 ved 37 ° C.
    Bemærk: cellerne vokse løst tilknyttede og suspension.

2. etiketten rekombinant Tau aggregater med pH-følsom fluorescerende farvestof

Bemærk: Tau aggregater blev forberedt som beskrevet i Apetri et al. 13 med den forskel, at ingen Thioflavin T (ThT) blev føjet til reaktion buffer. Aggregerede prøver blev indsamlet i 1,5 mL centrifugeglas. Endelige fluorescens signal blev kontrolleret ved at blande 118 µL af eksemplet pool med 12 µL af en 50 µM ThT løsning. Aggregater blev adskilt ved centrifugering sammenlægning reaktionsblanding ved 20.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Supernatanten blev analyseret af SEK-MALS at bekræfte, at alle de monomere tau blev omdannet til aggregater. Pellets (tau aggregater) var snap nedfryses og opbevares i en fryser ved-80 ° C.

  1. Resuspend tau aggregater i 0,1 M natriumbikarbonat buffer (NaHCO3) ved pH 8,5 til en koncentration på 1 mg/mL (~ 20 µM).
    Bemærk: Koncentrationen af tau aggregater er baseret på den oprindelige monomerer koncentration som vurderet af absorptionen af tau monomerer på 280 nm med en udslettelse koefficient af 0.31 mLmg-1cm-1.
  2. Der sonikeres resuspenderet aggregater ved hjælp af en sonde sonikator samtidigt med at holder på is for at undgå overophedning.
    1. Bruge en amplitude på 65% (med sonikator magtens 250 W).
    2. Udføre 8 pulser af 3 s med pauser 15 s mellem pulser at undgå overophedning.
  3. Forberede en 8.9 mM stamopløsning af pH-følsom farvestof (fremover reference til som pH farvestof) i dimethylsulfoxid (DMSO) efter fabrikantens anvisninger.
    Bemærk: Altid forberede en frisk løsning og bruger det kun på dagen det er forberedt.
  4. Tilføje 10 mol af farvestof per mol af protein til en afsluttende farvestof koncentration af 0,2 mM.
  5. Bland forsigtigt når der afpipetteres op og ned.
  6. Inkuber reaktionsblandingen til 45-60 min. ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
  7. I mellemtiden, samle en krydsbundet dextran gel afsaltning kolonne efter fabrikantens anvisninger.
  8. Blandingen henstår kolonnen med 25 mL af 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 der indeholder 3% DMSO. Kassér flow gennem.
  9. Tilføje et produkt af aggregeringen tau mærkning reaktion på kolonnen i en samlet maengde paa 2,5 mL. Hvis prøven er mindre end 2,5 mL, tilsættes buffer, indtil en samlede volumen af 2,5 mL er opnået.
  10. Lad prøven Indtast pakket gelen helt, kassere gennemstrømnings.
  11. Elueres med 3,5 mL af 0,1 M NaHCO3 buffer pH 8,5 der indeholder 3% DMSO og Eluatet opsamles i 4 tilsvarende fraktioner i 2 mL rør.
  12. Bestemme protein koncentrationer af de 4 fraktioner af bicinchoninic syre (BCA) assay.
  13. Gemme den mærket protein i en-20 ° C fryser.

3. optagelse Assay med fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) læse-out

  1. Dag 1 – frø cellerne
    1. Vask BV-2 celler i kolben ved at fjerne dyrkning medium og tilføje 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
      Bemærk: Vask volumen vil variere baseret på størrelsen af den celle kolbe brugt. For eksempel, for en T175 kolbe, vask med 10 mL 1 x PBS.
    2. Fjern PBS fra kolben og frigør celler ved inkubering med trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA) 0,05% ved 37 ° C og 5% CO2 , indtil cellerne løsnes fra kolben (ca. 5 min.).
      Bemærk: Volumen af trypsin-EDTA 0,05% afhænger af størrelsen på den celle kolbe brugt. For en T175 kolbe, skal du bruge 2 mL trypsin-EDTA 0,05%.
    3. Resuspend celler i dyrkning medium af pipettering op og ned tre til fem gange.
      Bemærk: Lydstyrken af dyrkning medium varierer baseret på størrelsen af den celle kolbe brugt og dermed antallet af celler i kolben. For en T175 kolbe, skal du bruge 8 mL dyrkning medium.
    4. Tælle celler og oprette en cellesuspension med en endelig koncentration på 1 x 105 celler/mL i dyrkningsmediet indeholdende 200 μg/mL heparin.
    5. Plade 250 µL af cellesuspension (2,5 x 104 celler) pr. brønd i en 96-brønd vævskultur flad bundplade.
    6. Inkuber plade natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Dag 1 – Forbered Immunocomplexes
    1. Tø pH dye-tau på is.
    2. Forberede 65 µl pr. betingelse af en 500 nM opløsning med pH dye-tau aggregater i serumfrit medium (SFM) (høje glukose DMEM suppleret med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 200 µg/mL af heparin).
    3. Forberede antistof fortyndinger i 65 µl af SFM og ved en koncentration dobbelt som et endeligt mål. Bland pH dye-tau aggregater og antistoffer i en 96-brønd u-bundplade. Endelige volumen pr. betingelse er nu 130 µl og pH dye-tau aggregater koncentration er 250 nM. Forsegle fortynding plade og Ruger over natten ved 37 ° C.
  3. Dag 2-Immunocomplexes udbredelse
    1. Fjerne dyrkningsbaserede middel fra BV-2 celler. Vaske cellerne en gang med 100 µL stuetemperatur 1 x PBS.
    2. Overføre 125 µL immunocomplexes celler ved hjælp af en multikanalpipette. Inkuber celler med immunocomplexes i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Fjern inkubation medium fra cellerne og kassér den. Vaske cellerne en gang med 100 µL stuetemperatur 1 x PBS.
    4. Fjerne 1 x PBS og behandler celler med 50 µL trypsin-EDTA 0,25% i 20 min. ved 37 ° C og 5% CO2.
    5. Tilføje 200 µL af dyrkningsbaserede middel og resuspend godt af pipettering op og ned for at frigøre cellerne. Overfør celler til en 96-brønd U-nederste plade. Centrifuge plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    6. Sætte pladen på is, fjerne dyrkning medium og vask celler to gange af resuspending celle pellets i 150 µL is koldt 1 x PBS. Centrifuge plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    7. Sætte celler på is, fjerne tilsat 1 x PBS og vask dem af resuspending celler pellets i 150 µL koldt FACS buffer (1 x PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 2 mM EDTA). Centrifuge plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    8. Sætte celler på is, fjerne ekstra FACS buffer og resuspend celler i 200 µL koldt FACS buffer.
    9. Analysere prøver straks af FACS erhverve 2 x 104 begivenheder i levende celler gate (Se trin 4.1).

4. FACS analyse

Bemærk: Se figur 1 for den gating strategi.

  1. Ved hjælp af området forward scatter (FSC-A) versus side scatter område (SSC-A) tæthed plot, gate på levende celler ved at udelukke begivenheder med lavere forward scatter niveauer (dvs., snavs og døde celler).
  2. Inden for befolkningens levende celle, bruge FSC-A versus forward scatter højde (FSC-H) at udelukke celle dubletter og aggregater. Dette er singlet gate.
  3. Ved hjælp af begivenhederne i singlet gate, generere en pH farvestof enkelt parameter histogram.
  4. Bestemme gennemsnitlige fluorescens intensitet. Bestemme procentdelen af pH dye-tau positive celler ved at udelukke negative celler som bestemmes ved hjælp af BV-2 kun kontrol.

5. Immunocomplexes optagelse med mikroskopi udlæsning

  1. Dag 1 – frø cellerne
    1. Forberede BV-2-celler, som beskrevet i trin 3.1.1, 3.1.2 og 3.1.3.
    2. Tælle celler og resuspend dem i dyrkning medium til en slutkoncentration på 104 celler/mL.
    3. Plade 150 µL af cellesuspension (1.5 x 103) pr. brønd i en poly-D-lysin belagt 96-brønd sort plade med klare flad bund.
    4. Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO2 for 48 h.
  2. Dag 3 – Forbered Immunocomplexes
    Bemærk: Mild sonikering af mærket tau aggregater før inkubation med antistof, blev udført for at forbedre mikroskopi resultater.
    1. Tø pH dye-tau på is og Læg instrumenterne i ultralydsbad ved hjælp af en sonde sonikator samtidigt med at holder på is. Bruge en amplitude på 15% (250 W sonikator magt). Udføre 30 pulser af 2 s og vent 20 s mellem pulser.
    2. Forberede 65 µl pr. betingelse af en 500 nM opløsning med pH dye-tau aggregater i bæredygtig skovforvaltning.
    3. Fortynd antistoffer i 65 µl af SFM til en koncentration dobbelt som et endeligt mål. Bland pH dye-tau aggregater og antistoffer i en 96-brønd u-bundplade. Endelige volumen pr. betingelse er nu 130 µl og pH dye-tau aggregater koncentration er 250 nM. Forsegle fortynding plade og Ruger over natten ved 37 ° C.
    4. Fjerne medium fra celle plade og erstatte med 150 µL af dyrkningsbaserede middel suppleret med 200 µg/mL heparin. Inkuber plade natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Dag 4-Immunocomplexes udbredelse
    1. Fjerne dyrkningsbaserede middel fra BV-2-celler. Overføre 125 µL immunocomplexes celler ved hjælp af en multikanalpipette.
    2. Inkuber celler med immunocomplexes for 1 timer og 45 min ved 37 ° C med 5% CO2.
      Pletten cellekerner med DNA bestemt farvestof og sure organeller med en sonde, som selektivt pletter lav pH cellulære rum. Inkuber celler 15 min ved 37 ° C med 5% CO2.
      Bemærk: Fortynd farvestoffer i bæredygtig skovforvaltning.
    3. Udføre live-celle billeddannelse ved hjælp af et højt indhold af screening Konfokal system. Sæt temperaturen til 37 ° C og 5% CO2. For høj kvalitetsbilleder, bruge en 63 X vand fordybelse mål og erhverve 0,5 µm fly (20 pr. Z-stak) pr. afbildet felt.

Representative Results

Aggregerede rekombinant tau var kovalent mærket med en pH-følsom grønne farvestof. Dette farvestof øger dramatisk sin fluorescens efter sin internalisering i sure organeller, hvorved for intracellulære kvantificering. Mærket tau aggregater blev inkuberet med anti-tau monoklonale antistoffer. Navnlig, brugte vi en kimære version (mus IgG1 Fc region) af CBTAU-28.1. Denne humant antistof binder sig til den N-terminale Indsæt region tau og er i stand til at binde in vitro- genereret tau fibriller13. I denne analyse testet vi også en affinitet-forbedret version af CBTAU-28,1 – dmCBTAU-28.1. Fab fragmenter af CBTAU-28.1, i forældre- og høj-affinitet mutant format, og en mus IgG1 isotype kontrol blev brugt som styrer.

BV-2-celler blev inkuberet med de præ-dannet immunocomplexes eller aggregerede tau alene i to timer i nærværelse af heparin at blokere antistof-uafhængig tau optagelse. Efter inkubationen celler blev trypsinized for at fjerne tau bundet til den ekstracellulære membran og blev analyseret for tau optagelse ved flowcytometri. Som vi beskrev for nylig13, konstaterede vi, at CBTAU-28,1 varianter fremmet udbredelsen af tau i BV-2 celler i en dosisafhængig måde. Optagelsen blev Fc medieret da CBTAU-28,1 Fab fragmenter ikke steg basal tau optagelse (figur 2). Desuden medieret høj affinitet dmCBTAU-28,1 antistof tau optagelse i BV-2 celler i højere grad end wild-type antistof (figur 2).

Antistof-medieret tau optagelse og lokalisering af tau aggregater i endolysosomal rum blev bekræftet af Konfokal mikroskopi (figur 3) hvor den sure cellulære rum var plettet ved hjælp af en sonde selektivt til lav pH organeller. Intracellulære puncta grønne pH farvestof mærket tau aggregater blev observeret inde i cellerne, der blev inkuberet med CBTAU-28.1. Derudover intracellulære tau aggregater ofte colocalized med den lave pH rum selektiv røde farvestof hvilket tyder på tilstedeværelse af tau aggregater i de sure organeller. CBTAU-28,1 Fab fragmenter steget ikke tau optagelsen igen med angivelse af en Fc-receptor medieret internalisering mekanisme (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Gating strategi, der anvendes i analysen af handelsstrømmen flowcytometri for at opdage tau internalisering af BV-2 celler. Demodata fra BV-2 kun kontrol (A-C), isotype kontrol (D-F) og dmCBTAU-28.1 (G-jeg) vises. BV-2 celle befolkning var gated på en FSC-A vs SSC-A tæthed plot eksklusive snavs og døde hudceller (A, D, G). BV-2-celler blev derefter yderligere låge på en FSC-A vs FSC-H tæthed plot at udelukke celle dubletter og aggregater (B, E, H). Enkelt celle gate blev brugt til at generere en pH farvestof (FITC i disse repræsentative resultater) enkelt parameter histogram (C, F, jeg) og bestemme geometriske middelværdi fluorescens intensitet. Alternativt, procentdel af pH dye-tau positive celler blev beregnet ekskl negative celler som bestemt ved hjælp af BV-2 kun kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: CBTAU-28,1 medierer optagelsen af tau aggregater i microglial BV-2 celler. Aggregerede rekombinant tau var kovalent mærket med grønne fluorescens pH-følsom farvestof og inkuberes med en mus kimære version af den menneskelige anti-tau antistof CBTAU-28.1, sin affinitet forbedret format, dmCBTAU-28.1, den tilsvarende Fab fragmenter, en musen IgG1 isotype kontrol antistof eller ingen antistof (tau aggregater alene). Immunocomplexes blev efterfølgende inkuberes med BV-2 celler i to timer i nærværelse af heparin at blokere antistof-uafhængig tau optagelse. Udbredelse af immunocomplexes blev vurderet ved flowcytometri og udtrykt som den geometriske middelværdi (GM) af fluorescens intensitet (A) eller procentdel af tau positive (tau +) celler (B). Fejllinjer i (A) angiver standardafvigelsen af to uafhængige eksperimenter, mens (B) viser en enkelt eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Tau aggregater er internaliseret af BV-2-celler og lokalisere i cellulære sure organeller. Præfabrikerede tau-antistof immunocomplexes var inkuberes med BV-2 celler i to timer i nærværelse af heparin at blokere antistof-uafhængig optagelse. Efter inkubationen farves kerner med et DNA specifikke blå farvestof og den sure cellulære rum med en lav pH rum selektiv røde farvestof. Live-celle imaging afslørede intracellulære puncta af mærket tau aggregater (grøn) inde i cellerne, der blev inkuberet med CBTAU-28,1 og dmCBTAU-28.1, men ikke med kontrolelementet isotype. Derudover farve intracellulære tau aggregater ofte colocalized med røde (gul) hvilket tyder på tilstedeværelse af tau aggregater i sure cellulære rum. CBTAU-28,1 Fab fragmenter steget ikke tau optagelse med angivelse af en Fc-receptor medieret internalisering mekanisme. Billeder repræsenterer maksimal intensitet fremskrivninger af en 20 fly Z-stak (0,5 µm fly) erhvervet med en 63 X vand fordybelse mål. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mikroglia, bosiddende hjernen immunceller, har for nylig identificeret som vigtige spillere i antistof-medieret terapeutiske tilgange til tauopathies10,11. Antistof-medieret tau clearance af mikroglia, sammen med blokering af neuronal optagelse9, hæmning eller destabilisering af fibril formation13,14 , og clearance af intraneuronal fibriller via den lysosomale vej15, kan alle bidrage til anti-tau antistof effektivitet iagttaget hos musemodel af tauopathy5,6,7,8,9.

Vi beskrevet her en celle-baseret analyse for at vurdere kvantitativt tau optagelse af mikroglia med formålet at skabe et testpræparat værktøj til bedre karakterisere virkningsmekanisme af anti-tau antistoffer.

Denne analyse, tilpasset fra Funk et al. 11, bruger BV-2 celler, som er udødeliggjort murine microglial celler. Mens de ikke kan fuldt ud i forhold til primære microglial celler, de har mange af kendetegnene ved primære mikroglia, herunder muligheden for håndfast phagocytosis både Aβ og tau fibriller11,16,17 ,18,19. Derudover viste de en reproducerbar adfærd i vitro der gjorde dem meget velegnet til udvikling af analyse og kvantitative undersøgelser, som kræver minimal eksperimentel variation. Udover dette, udødeliggjort cellelinjer tillade højere assay overførselshastighed og fjerne behovet for animalske offer i forhold til brug af primære mikroglia.

Tau aggregater vi brugte i denne analyse blev opnået ved hjælp af den yderst reproducerbare in vitro- sammenlægning procedure at vi for nylig beskrevet13, og Vis lignende morfologi til parret spiralformet filamenter (PHFs) isoleret fra hjerner af AD patienter. Mens vi ikke har overholdt alle uventede resultater, der kan have været forårsaget af tau aggregater overholdelse af plast eller glas overflader, spillede brug af stabil og godt karakteriseret tau aggregater en afgørende rolle i dette assay reproducerbarhed.

Et andet aspekt, der bidraget væsentligt til assay reproducerbarhed var celle tæthed. Antallet af celler pr. brønd beskrevet i protokollen repræsenterer den optimale celle tæthed i de beskrevne betingelser.

Anderledes end hvad Funk et al. 11 beskrevet, vi mærket tau aggregater med en pH følsomme farvestof, som øger sin fluorescens ved internalisering i sure organeller, således at for intracellulære kvantificering. Dette, sammen med trypsin fordøjelsen af overfladen bundet immunocomplexes og/eller tau, garantier, fluorescens signal målt ved flowcytometri er resultatet af tau optagelse i stedet for binding til den cellulære overflade. Desuden kræver brug af et pH følsomme farvestof letter påvisning af internaliseret tau aggregater i mikroskopi eksperimenter uden at fordøje overflade bundet immunocomplexes/tau aggregater, som ville derefter celle igen plating og nyttiggørelse.

Vi også yderligere optimeret mikroskopi udlæsning af vores analyse, i forhold til hvad der tidligere er blevet beskrevet11, ved hjælp af en yderst selektiv farve for sure organeller i vores mikroskopi eksperimenter, som ikke tillod os kun at bekræfte antistof-medieret Tau optagelse, men også lokalisering af tau aggregater i endolysosomal rum.

Analysen vi udviklet, har optimale specificitet, hvilket resulterer i en god eksperimentelle vindue giver en stærk adskillelse mellem positive og negative prøver. Interessant, registrerer analysen indirekte forskelle i antistof affinitet således udgør et effektivt redskab til at studere anti-tau antistof effektor funktion.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Alberto Carpinteiro Soares for hans værdifulde tekniske bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BV-2 cells ICLC Interlab Cell Line Collection ATL03001
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) Gibco 10010-015
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300-054
DMEM 4.5 g/dL glucose Gibco 41966-029
Fetal Bovine Serum Gibco 10091-148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605E
EasYFlask Nunc 156499 / 159910
pHrodo Green STP ester Life Technologies P35369 
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM
DMSO Sigma D2650-100ml
PD10 columns GE Healthcare 17-0851-01
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Greiner 665180
Falcon 96-Well Assay Plates Falcon 353910
Heparin Sigma  H3393-50KU
Trypsin-EDTA 0.25% Sigma T4049-100ml
BSA Sigma A7030-100G
EDTA 0.5 M, pH8
FACS Canto II BD
Hoechst 33342 Solution (20 mM) Thermo Fisher Scientific 62249
LysoTracker Deep Red Thermo Fisher Scientific L12492
Opera Phenix Perkin Helmer HH14000000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
  2. Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
  3. Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
  4. Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
  5. Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
  6. Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
  7. Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
  8. Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
  9. Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
  10. Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
  11. Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
  12. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
  13. Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
  14. Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
  15. Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
  16. Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
  17. Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
  18. Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
  19. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).

Tags

Neurovidenskab sag 141 Alzheimers tauopathy tau sammenlægning mikroglia BV-2 optagelse clearance.
Celle-baserede analyse at studere antistof-medieret Tau Clearance af mikroglia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Marco, D., Taggenbrock, R.,… More

De Marco, D., Taggenbrock, R., Crespo, R., Koudstaal, W., Ramsburg, E., Apetri, A. Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia. J. Vis. Exp. (141), e58576, doi:10.3791/58576 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter