Summary
Her beskriver vi en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia med sikte på å skape en eksperimentell verktøy å bedre karakterisere virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer.
Abstract
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv nevrodegenerative tilstand som samlet tau og amyloid proteiner akkumuleres i hjernen forårsaker neuronal dysfunksjon som til slutt fører til kognitiv svikt. Hyperphosphorylated tau mengdefunksjoner i Nevron antas å føre til de fleste av patologi forbundet med Annonsen. Disse aggregater er antok å bli utgitt i det ekstracellulære rommet og tatt opp av tilstøtende sunn neurons der de induserer ytterligere tau aggregering. Denne "prion-like" spre kan bli avbrutt av antistoffer bindende og «nøytralisere» ekstracellulære tau aggregater som vist i preklinisk musen modeller av Annonsen. En av de foreslåtte mekanismene som terapeutiske antistoffer redusere patologi er antistoff-mediert opptak og klarering av patologisk aggregert tau av microglia. Her beskriver vi en kvantitativ cellebasert analysen for å vurdere tau opptak av microglia. Denne analysen bruker musen microglial celle linje BV-2, gir høy spesifisitet, lav variasjon og medium gjennomstrømming. Data generert med denne analysen kan bidra til bedre karakteristikk av anti-tau antistoff funksjoner effektor.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD) er en progressiv nevrodegenerative tilstand preget av conformational endringen og selvstendig montering av amyloid β peptid og tau protein i patologisk aggregat. Normal løselig amyloid β peptid omdannes til oligomeric og fibrillar amyloid β, mens unormalt fosforylert tau akkumuleres som oligomers og neurofibrillary ledninger1,2. Disse protein aggregater føre til nevronale døden til hukommelsestap og etterfølgende progressive kognitiv svikt. Andre faktorer, inkludert ikke-produktive neuroinflammation og redusert evne til å fjerne misfolded proteiner, kan forverre og akselerere sykdom. Foreløpig intervensjon strategier mot annonse gir i hovedsak symptomatisk lettelse, men det er ingen sykdom-modifisere kur eller forebygging.
Økende bevis antyder en nøkkelrolle i hyperphosphorylated tau mengdefunksjoner i patologi av Annonsen. I ikke-patologisk tilstand er tau en innfødt ufalsede protein som binder seg til piskehale som henger og fremmer deres forsamlingen neuronal cytoskeleton. Når tau blir hyperphosphorylated, det løsner fra cytoskeleton og klynger i tau mengdefunksjoner i Nevron, som forårsaker de fleste av patologi forbundet med Annonsen3. Samlet tau starter samler først intracellulært, men som sykdommen utvikler seg, det antas å bli befridd fra berørte nerveceller i ekstracellulære plass, som det kan bli tatt opp av tilstøtende eller synaptically tilkoblet sunn nerveceller i en " Prion-lignende måte". En gang internalisert, induserer tau samlet ytterligere tau aggregering via mal conformational endre4.
Ifølge denne hypotesen, kan terapi kan avbryte tau seeding bremse eller reversere løpet av tau-mediert nevrodegenerative sykdommer. Dette viser mus laget utsatt for tauopathy av genetisk mutasjon og passivt injisert med anti-tau antistoffer redusert tau patologi og bedre kognitiv funksjon5,6,7,8 ,9. Men fortsatt mekanismer som terapeutiske antistoffer redusere patologi unnvikende.
En av de foreslåtte mekanismene er antistoff-mediert opptak og klarering av patologisk aggregert tau av microglia, hjernens bosatt immunceller. Siste publikasjoner foreslår at microglia kan effektivt internalisere og svekke patologisk tau arter og dette forsterkes av anti-tau antistoffer via en Fc-avhengig mekanisme som involverer Fc reseptorer uttrykt på overflaten av Microglia og reseptor mediert fagocytose10,11. Disse dataene identifiserer microglia som potensielt viktig effektor av terapeutiske antistoffer.
Her beskriver vi en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia. Data generert med denne analysen kan hjelpe Klargjørende virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer dermed representerer en nyttig verktøyet å avansere anti-tau antistoffer til ytterligere skritt av deres utvikling som potensielle AD behandling.
Protocol
1. BV-2 celler kultur
Merk: Håndtaket BV-2 celler under grad 2 forvaring. BV-2 celle linjen produserer en innhyllet rekombinant ecotropic retrovirus (dugelig av infeksjon bare murine celler)12; slike virus er kjent for sine i vitro transformere evne og i vivo tumorigenic potensial.
- Kultur BV-2-celler i høy glukose Dulbecco endret eagle medium (DMEM) supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 2 mM L-glutamin (referert til som dyrking medium nå) av seeding cellene på 4 x 104 celler/mL.
- Opprettholde kulturer i et fuktet 5% CO2 på 37 ° C.
Merk: cellene vokse løst knyttet og i suspensjon.
2. label rekombinant Tau aggregater med pH-sensitive fluorescerende farge
Merk: Tau aggregater var forberedt som beskrevet i Apetri et al. 13 med forskjellen at ingen Thioflavin T (ThT) ble lagt til bufferen som reaksjon. Aggregert prøvene ble samlet i 1,5 mL sentrifuge rør. Siste fluorescens signalet ble sjekket ved å blande 118 µL av bassenget utvalget med 12 µL av en 50 µM ThT løsning. Aggregater var atskilt med sentrifugering aggregering reaksjonsblandingen 20.000 x g 1t på 4 ° C. Nedbryting ble analysert av SEC-MALS å bekrefte at alle monomerisk tau ble omgjort til aggregatene. Pellets (tau aggregater) var snapin frosset og lagret i en fryser på-80 ° C.
- Resuspend tau aggregater inne 0.1 M natriumbikarbonat buffer (NaHCO3) ved pH 8.5 til en konsentrasjon av 1 mg/mL (~ 20 µM).
Merk: Konsentrasjon av tau aggregater er basert på den opprinnelige monomerer konsentrasjonen som vurdert av absorpsjon av tau monomerer på 280 nm bruker en utryddelse koeffisient av 0.31 mLmg-1cm-1. - Sonicate de resuspended aggregatene bruker en sonde sonicator samtidig på is for å unngå over-oppvarming.
- Bruk en amplituden til 65% (med sonicator av 250 W).
- Utføre 8 pulser av 3 s med pauser 15 s mellom pulser for å unngå overoppheting.
- Forberede en 8,9 mM lager løsning av pH-sensitive fargestoff (heretter referanse til som pH fargestoff) i dimethyl sulfoxide (DMSO) følger produsentens instruksjoner.
Merk: Alltid forberede en frisk løsning og bruk den bare på klar. - Legge 10 føflekker fargestoff per mol protein til en siste fargestoff konsentrasjon av 0.2 mM.
- Bland ved pipettering forsiktig opp og ned.
- Inkuber reaksjonsblandingen i 45-60 min i romtemperatur, beskyttet mot lyset.
- I mellomtiden, samle en krysskoblet dekstran gel avsalte kolonnen produsentens instruksjoner.
- Equilibrate kolonnen med 25 mL 0.1 M NaHCO3 buffer pH 8.5 inneholder 3% DMSO. Kast flyten gjennom.
- Legg produktet av tau samlet merking reaksjonen til en kolonne i et totalvolum på 2,5 mL. Hvis prøven er mindre enn 2,5 mL, legge buffer til et totalvolum på 2,5 mL er oppnådd.
- La prøven inn pakket gel helt, forkaste gjennomflytsenhet.
- Elute med 3,5 mL 0.1 M NaHCO3 buffer pH 8.5 inneholder 3% DMSO og samle eluate i 4 tilsvarende fraksjoner i 2 mL rør.
- Bestemme protein konsentrasjoner av 4 fraksjoner ved bicinchoninic syre (BCA) analysen.
- Lagre merket protein i 20 ° C fryser.
3. opptaksanalyse med fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) lese-out
-
Dag 1-frø cellene
- Vask BV-2 celler i flasken ved å fjerne dyrking middels og legge til 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
Merk: Vask volum vil variere avhengig av størrelsen på cellen kolbe brukes. For eksempel for en T175 kolbe, vask med 10 mL 1 x PBS. - Fjern PBS fra flasken og koble celler av rugende trypsin-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) 0,05% på 37 ° C og 5% CO2 inntil cellene løsner fra flasken (ca 5 min).
Merk: Antall trypsin-EDTA 0,05%, avhengig av størrelsen på cellen kolbe brukes. For eksempel en T175 kolbe, bruke 2 mL trypsin-EDTA 0,05%. - Resuspend celler i dyrking medium av pipettering opp og ned tre til fem ganger.
Merk: Antall dyrking medium varierer basert på størrelsen på cellen kolbe brukes og dermed antall celler i flasken. For eksempel en T175 kolbe, bruke 8 mL dyrking medium. - Telle celler og opprette en celle suspensjon med en siste konsentrasjon av 1 x 105 celler/mL i kultur medium som inneholder 200 μg/mL heparin.
- Plate 250 µL av cellen suspensjon (2,5 x 104 celler) per brønn i en 96-brønns vev kultur flat bunn plate.
- Inkuber plate overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
- Vask BV-2 celler i flasken ved å fjerne dyrking middels og legge til 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
-
Dag 1-forberede Immunocomplexes
- Tine pH dye-tau på is.
- Forberede 65 μl per betingelse i en 500 nM løsning av pH dye-tau aggregater i serum-free medium (SFM) (høy glukose DMEM med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 200 µg/mL av heparin).
- Forberede antistoff fortynninger i 65 µl SFM og en konsentrasjon dobbel endelig en. Bland pH dye-tau aggregater og antistoffer i en 96-brønns u-bunnplaten. Siste volum per betingelse er nå 130 µl og pH dye-tau aggregater konsentrasjonen er 250 nM. Seal fortynning platen og ruge over natten på 37 ° C.
-
Dag 2-Immunocomplexes opptak
- Fjerne dyrking medium fra BV-2 celler. Vask celler én gang med 100 µL romtemperatur 1 x PBS.
- Overføre 125 µL av immunocomplexes til celler ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber cellene med immunocomplexes 2 h 37 ° C og 5% CO2.
- Fjerne inkubasjon mediet fra cellene og kaste den. Vask celler én gang med 100 µL romtemperatur 1 x PBS.
- Fjerne 1 x PBS og behandle celler med 50 µL trypsin-EDTA 0,25% etter 20 min på 37 ° C og 5% CO2.
- Legg til 200 µL av dyrking medium og resuspend godt av pipettering opp og ned for å koble cellene. Overføre cellene til en 96-brønns U-Bunn platen. Sentrifuger plate på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
- Sette platen på isen, fjerne dyrking medium og vask celler to ganger av resuspending celle pellets i 150 µL isen kalde 1 x PBS. Sentrifuger plate på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
- Lagt celler på is, fjerne ekstra 1 x PBS og vask dem ved resuspending celler pellets 150 µL kaldt FACS buffer (1 x PBS, 0,5% bovin serum albumin (BSA), 2 mM EDTA). Sentrifuger plate på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
- Lagt celler på is, fjerne legges FACS buffer og resuspend celler i 200 µL kaldt FACS buffer.
- Analysere prøver etter FACS anskaffe 2 x 104 hendelser i lever celler porten (se trinn 4.1).
4. FACS analyse
Merk: Se figur-1 for gating strategien.
- Bruke frem scatter området (FSC-A) mot siden området (SSC-A) tetthet spredningsdiagram, gate på lever celler ved å ekskludere hendelser med lavere fremover scatter nivåer (dvs. rusk og døde celler).
- I levende celle befolkningen, bruke FSC-A versus frem scatter høyde (FSC-H) å utelate cellen doublets og aggregat. Dette er singlet porten.
- Bruke hendelsene i singlet porten, histogrammer pH fargestoff enkelt parameter.
- Bestemme mener fluorescens intensitet. Angi prosentandelen av pH dye-tau positiv celler ved å ekskludere negativ celler som bestemmes ved hjelp av BV-2 bare kontroll.
5. Immunocomplexes opptak med mikroskopi lese-out
-
Dag 1-frø cellene
- Forberede BV-2 celler som beskrevet i trinn 3.1.1, 3.1.2 og 3.1.3.
- Telle celler og resuspend dem i dyrking middels til en siste konsentrasjon av 104 celler/mL.
- Plate 150 µL av cellen suspensjon (1,5 x 103) per brønn i en poly-D-Lysine belagt 96-brønns svart plate med klart flat bunn.
- Inkuber plate på 37 ° C og 5% CO2 48 h.
-
Dag 3-forberede Immunocomplexes
Merk: Mild sonication av merket tau aggregater før inkubasjon med antistoff, ble utført for å forbedre mikroskopi resultater.- Tine pH dye-tau på is og sonicate bruker en sonde sonicator samtidig på is. Bruk en amplituden til 15% (sonicator makt på 250 W). Utføre 30 pulser 2 s og vente 20 s mellom pulser.
- Forberede 65 μl per betingelse i en 500 nM løsning av pH dye-tau mengdefunksjoner i SFM.
- Fortynne antistoffer i 65 µl av SFM til en konsentrasjon doble endelig en. Bland pH dye-tau aggregater og antistoffer i en 96-brønns u-bunnplaten. Siste volum per betingelse er nå 130 µl og pH dye-tau aggregater konsentrasjonen er 250 nM. Seal fortynning platen og ruge over natten på 37 ° C.
- Fjerne mediet fra cellen plate og erstatte med 150 µL av dyrking medium med 200 µg/mL heparin. Inkuber plate overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
-
Dag 4-Immunocomplexes opptak
- Fjerne dyrking medium fra BV-2 celler. Overføre 125 µL av immunocomplexes til celler ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Inkuber cellene med immunocomplexes for 1 h og 45 min ved 37 ° C med 5% CO2.
Flekken celle kjerner med DNA bestemt fargestoff og sure organeller med en sonde som selektivt flekker lav pH mobilnettet avdelinger. Inkuber cellene 15 min på 37 ° C med 5% CO2.
Merk: Fortynne fargestoffer i SFM. - Utføre live-celle tenkelig benytter et høyt innhold screening AC confocal systemet. Angi temperatur 37 ° C og 5% CO2. For høy kvalitet bilder, bruke en 63 X vann nedsenking målsetting og få 0,5 µm fly (20 per Z-stabel) per fotografert felt.
Representative Results
Aggregert rekombinant tau ble covalently merket med en pH-sensitive grønt fargebad. Dette fargestoffet øker dramatisk sin fluorescens på sin internalisering i surt organeller, og dermed muliggjør intracellulær kvantifisering. Merket tau aggregater ble inkubert med anti-tau monoklonale antistoffer. Spesielt brukte vi en chimeric versjon (mus IgG1 Fc region) av CBTAU-28,1. Denne menneskelige antistoff binder til N-terminal sett inn regionen tau og er i stand til å binde i vitro generert tau fibrils13. I denne analysen testet vi en affinitet-forbedret versjon av CBTAU-28,1-dmCBTAU-28,1. Fab fragmenter av CBTAU-28,1, i foreldre og høy affinitet mutant formater, og mus IgG1 isotype kontroll ble brukt som styrer.
BV-2 ble inkubert med den pre-formet immunocomplexes eller samlet tau alene timer i nærvær av heparin blokkere antistoff-uavhengig tau opptak. Etter inkubasjon celler var trypsinized for å fjerne tau bundet til ekstracellulære membranen og ble analysert for tau opptak av flowcytometri. Som vi nylig beskrevet13, observerte vi at CBTAU-28,1 varianter forfremmet opptak av tau i BV-2-celler i en doseavhengig måte. Opptaket var Fc mediert siden CBTAU-28,1 Fab fragmenter ikke økte basale tau opptak (figur 2). Videre mediert høy affinitet dmCBTAU-28,1 antistoffer tau opptak i BV-2 celler i høyere grad enn vill-type antistoff (figur 2).
Antistoff-mediert tau opptak og lokalisering av tau aggregater i endolysosomal rommet ble bekreftet av AC confocal mikroskopi (Figur 3) der surt mobilnettet rommet var farget med en sonde selektiv for lav pH organeller. Intracellulær puncta grønne pH fargestoff merket tau aggregater ble observert i cellene som ble inkubert med CBTAU-28,1. Videre intracellulær tau aggregater ofte colocalized med lav pH kupé selektiv røde fargestoff dermed antyder tilstedeværelsen av tau mengdefunksjoner i surt organeller. CBTAU-28,1 Fab fragmenter økte ikke tau opptak igjen indikerer en Fc-reseptor-mediert internalisering mekanisme (Figur 3).
Figur 1: Gating strategien som brukes i flyt cytometri analyse for å merker tau internalisering av BV-2 celler. Eksempeldata fra BV-2 bare kontroll (Vekselstrøm), isotype kontroll (D-F) og dmCBTAU-28,1 (G-jeg) vises. BV-2 celle befolkningen var gated på FSC-A vs SSC-en tetthet tomten unntatt rusk og døde celler (A, D, G). BV-2 celler ble deretter videre gated på FSC-A vs FSC-H tetthet tomten ekskludere cellen doublets og aggregat (B, E, H). Enkelt celle gate ble brukt histogrammer pH fargestoff (FITC i disse representant resultatene) enkelt parameter (C, F, jeg) og geometriske gjennomsnittet fluorescens intensitet. Alternativt, prosentandel av pH dye-tau positiv celler beregnet unntatt negativ celler som bestemmes ved hjelp av BV-2 bare kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CBTAU-28,1 formidler opptak av tau aggregater i microglial BV-2 celler. Aggregert rekombinant tau var covalently merket med grønne fluorescens pH-sensitive fargestoff og inkubert med en musen chimeric versjon av menneskelig anti-tau antistoffer CBTAU-28,1, sin affinitet forbedret format, dmCBTAU-28,1, det tilsvarende Fab fragmenter, en mus IgG1 isotype kontroll antistoff eller ingen antistoff (tau aggregater alene). Immunocomplexes ble senere inkubert med BV-2 celler i to timer i nærvær av heparin blokkere antistoff-uavhengig tau opptak. Opptak av immunocomplexes ble vurdert av flowcytometri og uttrykt som det geometriske gjennomsnittet (GM) til fluorescens intensitet (A) eller prosentandel av tau positiv (tau +) celler (B). Feilfelt i (A) angir standardavviket for to uavhengige eksperimenter, mens (B) viser en enkelt eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tau aggregater er internalisert BV-2 celler og lokalisere i mobilnettet surt organeller. Preformed tau-antistoff immunocomplexes ble inkubert med BV-2 celler i to timer i nærvær av heparin blokkere antistoff-uavhengig opptak. Etter inkubasjon var kjerner farget med en DNA bestemt blå farge og sure mobilnettet rommet med en lav pH kupé selektiv rød farge. Live-celle imaging avslørte intracellulær puncta av merket tau aggregater (grønn) i cellene som ble inkubert med CBTAU-28,1 og dmCBTAU-28,1, men ikke med kontrollen isotype. Videre farge intracellulær tau aggregater ofte colocalized med røde (gul) dermed antyder tilstedeværelsen av tau mengdefunksjoner i surt mobilnettet batterirommet. CBTAU-28,1 Fab fragmenter økte ikke tau opptak som indikerer en Fc-reseptor-mediert internalisering mekanisme. Bildene representerer maksimale intensitet anslag av en 20 fly Z-stack (0,5 µm plan) kjøpt med en 63 X vann nedsenking målsetting. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Microglia, bosatt hjernens immunceller, har nylig identifisert som viktige spillere i antistoff-mediert terapeutiske metoder for tauopathies10,11. Antistoff-mediert tau godkjennes av microglia, sammen med blokkering av neuronal opptak9, hemming eller destabilisering av fibril formasjon13,14 og rydding av intraneuronal fibrils via den lysosomale Pathway15, kan alle bidra til anti-tau antistoff effekten i musemodell av tauopathy,5,,6,,7,,8,,9.
Vi beskrevet her en cellebasert analysen for å vurdere kvantitativt tau opptak av microglia med sikte på å skape en eksperimentell verktøy å bedre karakterisere virkningsmekanismer av anti-tau antistoffer.
Denne analysen, tilpasset fra Funk et al. 11, bruker BV-2 celler, som er udødeliggjort murine microglial celler. Mens de ikke fullt sammenlignes primære microglial celler, de har mange av egenskapene til primære microglia, inkludert muligheten for robust phagocytose både Aβ og tau fibrils11,16,17 ,18,19. Videre, de viste en reproduserbar atferd i vitro som gjorde dem velegnet for analysen utvikling og kvantitative studier som krever minimal eksperimentell variasjoner. Foruten dette, udødeliggjort cellelinjer tillate høyere analysen gjennomstrømming og eliminere behovet for dyr offer sammenlignet med bruk av primære microglia.
Tau aggregater vi brukte i denne analysen var får svært reproduserbar i vitro aggregering prosedyren at vi nylig beskrevet13, og Vis lignende morfologi til sammen spiralformede filamenter (PHFs) isolert fra hjernen annonse pasienter. Mens vi ikke observerer noen uventede resultater som kan ha blitt forårsaket av tau aggregater overholdelse av plast eller glass overflater, spilte bruk av stabile og godt preget tau aggregater en avgjørende rolle i reproduserbarhet av denne analysen.
Et annet aspekt som bidro til analysen reproduserbarhet var celle tetthet. Antall celler per brønn beskrevet i protokollen representerer optimal celle tettheten i beskrevet forhold.
Annerledes enn hva Funk et al. 11 beskrevet, vi merket tau aggregat med en pH følsom fargestoff som øker sin fluorescens på internalisering i surt organeller, dermed gir for intracellulær kvantifisering. Dette, sammen med trypsin fordøyelsen av overflaten bundet immunocomplexes og/eller tau, garanterer fluorescens signalet målt ved flowcytometri er et resultat av tau opptak i stedet for binding til mobilnettet overflaten. Videre krever bruk av en pH følsom fargestoff Letter oppdagelsen av internalisert tau aggregater mikroskopi eksperimenter uten behovet av fordøye overflaten bundet immunocomplexes/tau aggregater som ville deretter cellen re plating og gjenoppretting.
Vi har også optimalisert mikroskopi avlesing av våre analysen, sammenlignet med hva har tidligere blitt beskrevet11, ved hjelp av en svært selektiv farge for surt organeller våre mikroskopi eksperimenter som ikke tillot oss bare å bekrefte antistoff-mediert tau opptak, men også lokalisering av tau aggregater i endolysosomal rommet.
Analysen vi utviklet, har optimal spesifisitet som resulterer i god eksperimentelle vindu slik at en sterk separasjon mellom positive og negative prøvene. Interessant, oppdager analysen indirekte forskjeller i antistoff affinitet dermed representerer et kraftig verktøy for å studere anti-tau antistoff funksjoner effektor.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Alberto Carpinteiro Soares for hans verdifulle kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
- Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
- Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
- Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
- Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
- Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
- Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
- Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
- Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
- Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
- Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
- Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
- Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
- Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
- Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).
