Summary
Här beskriver vi en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia med syftet att skapa ett prövningsläkemedel verktyg att bättre karaktärisera verkningsmekanismer av anti tau antikroppar.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ tillstånd där aggregerade tau och amyloid proteinerna ansamlas i hjärnan och orsaka neuronal dysfunktion vilket så småningom leder till försämring av kognitiva funktioner. Hyperphosphorylated tau aggregat i neuron tros orsaka de flesta av patologin associerade med AD. Dessa aggregat är antas släppas ut i det extracellulära utrymmet och tas upp av intilliggande friska nervceller där de kan orsaka ytterligare tau aggregering. Denna ”prion-liknande” sprida kan avbrytas av antikroppar som kan binda och ”neutralisera” extracellulära tau aggregat som visas i prekliniska musmodeller av AD. En av de föreslagna mekanismer genom vilka terapeutiska antikroppar minska patologi är antikroppsmedierad upptag och clearance av patologiska aggregerade former av tau av mikroglia. Här beskriver vi en kvantitativ cell-baserad analys för att bedöma tau upptag av mikroglia. Denna analys använder mus mikrogliala cell linjen BV-2, möjliggör hög specificitet, låg variabilitet och medelstora genomströmning. Data som genereras med denna analys kan bidra till en bättre karakterisering av anti tau antikropp effektor funktioner.
Introduction
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ tillstånd som kännetecknas av en conformationaländring och självmontering av amyloid β peptid och tau protein till patologiska aggregat. Den normala lösliga amyloid β peptiden omvandlas till Oligomera och fibrillar amyloid β, medan onormalt fosforyleras tau ackumuleras som oligomerer och fibrillnystan1,2. Dessa protein aggregat orsakar nervcellernas död leder till minnesförlust och efterföljande progressiv kognitiv försämring. Andra faktorer, inklusive icke-produktiva neuroinflammation och en minskad förmåga att rensa felveckning proteiner, kan förvärra och påskynda sjukdom. För närvarande, åtgärdsstrategier mot AD ger huvudsakligen symtomatisk lindring, men det finns ingen sjukdomsmodifierande bota eller förebygga.
Ökande bevis föreslår en nyckelroll av hyperphosphorylated tau aggregat i patologi AD. I sitt icke-patologiska tillstånd har tau ett inbyggt ovikta protein som binder till mikrotubuli och främjar deras församling i neuronala cytoskelettet. När tau blir hyperphosphorylated, det lossnar från cytoskelettet och kluster i tau aggregat i neuron, som tros orsaka de flesta av patologin associerade med AD3. Aggregerade tau börjar ansamlas intracellulärt först, men eftersom sjukdomen fortskrider, förutsätts det för att släppas från drabbade nervceller i det extracellulära utrymmet, som det kan tas av intilliggande eller synaptically anslutna friska nervceller i en ” Prion-liknande sätt ”. En gång internaliserat, inducerar tau summan ytterligare tau aggregering via mallade conformationaländring4.
Enligt denna hypotes, kan terapier kan avbryta tau sådd bromsa eller vända tau-medierad neurodegenerativa sjukdomsförlopp. Till stöd för detta visar möss mottagliga för tauopathy av genetisk mutation och passivt injiceras med anti tau antikroppar minskad tau patologi och förbättrad kognitiv funktion5,6,7,8 ,9. Dock fortfarande de mekanismer genom vilka terapeutiska antikroppar minska patologi gäckande.
En av de föreslagna mekanismerna är antikroppsmedierad upptag och clearance av patologiska aggregerade former av tau av mikroglia, hjärnans bosatt immunceller. Senaste publikationer föreslår att mikroglia kan effektivt internalisera och försämra patologiskt tau arter och denna förmåga förbättras av anti tau antikroppar via en Fc-beroende mekanism som involverar Fc-receptorer uttrycks på ytan av mikroglia och receptor medierad fagocytos10,11. Dessa uppgifter identifierar mikroglia som potentiellt viktiga effektorer av terapeutiska antikroppar.
Vi beskriver häri en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia. Data som genereras med denna analys kan hjälpa till att belysa verkningsmekanismer av anti tau antikroppar som alltså representerar ett användbart verktyg att avancera mot tau antikroppar till ytterligare steg i sin utveckling som potentiell AD behandling.
Protocol
1. BV-2-celler kultur
Obs: Handtag BV-2-celler under biosäkerhetsnivå 2 inneslutning. BV-2 cell linjen producerar ett höljebärande rekombinant ecotropic retrovirus (kan infektera murina celler endast)12. sådana virus är kända för deras in vitro- omvandla förmåga och i vivo tumörframkallande potential.
- Kultur BV-2-celler i hög glukos Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 2 mM L-glutamin (kallad odling medium från nu på) med sådd celler på 4 x 104 celler/mL.
- Upprätthålla kulturer i en fuktad atmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C.
Obs: cellerna växer löst bifogade och i suspension.
2. etikett rekombinant Tau aggregat med pH-känsliga fluorescerande färgämne
Obs: Tau aggregat utarbetades som beskrivs i Apetri o.a. 13 med den skillnaden att ingen Tioflavin T (ThT) lades till reaktion bufferten. Samlade prover samlades i 1,5 mL centrifugrör. Slutliga fluorescens signal var kontrolleras genom att blanda 118 µL av pool provet med 12 µL av en 50 µM ThT lösning. Aggregat var åtskilda av centrifugering aggregering reaktionsblandningen vid 20 000 x g för 1 h vid 4 ° C. Supernatanten analyserades av SEC-MALS att bekräfta att alla den monomeriska tau omvandlades till aggregat. Pellets (tau aggregat) var snapin fryst och lagrad i en frys vid-80 ° C.
- Återsuspendera tau aggregat i 0,1 M natriumbikarbonat buffert (NaHCO3) vid pH 8,5 till en koncentration av 1 mg/mL (~ 20 µM).
Obs: Koncentration av tau aggregat är baserad på den inledande monomerer koncentrationen enligt bedömning av absorptionen av tau monomerer på 280 nm med en extinktionskoefficient 0,31 mLmg-1cm-1. - Sonikera återsuspenderade aggregaten med en sond någon sonikator samtidigt på isen för att undvika överhettning.
- Använd en amplitud på 65% (med någon sonikator maktens 250 W).
- Utför 8 pulser av 3 s med paus på 15 s mellan pulserna att undvika överhettning.
- Förbereda en 8.9 mM stamlösning av pH-känsliga färgämne (hädanefter hänvisning till som pH färgämne) i dimetyl sulfoxid (DMSO) följa tillverkarens instruktioner.
Obs: Alltid förbereda en ny lösning och endast använda den på dagen det är förberett. - Lägga till 10 mullvadar färgämne per mol protein i en slutlig dye koncentration av 0,2 mM.
- Blanda genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Inkubera reaktionsblandningen 45 – 60 minuter i rumstemperatur, skyddas från ljus.
- Under tiden, montera en tvärbunden dextran gel avsaltning kolumnen enligt tillverkarens anvisningar.
- Jämvikta kolonnen med 25 mL 0,1 M NaHCO3 buffert pH 8.5 som innehåller 3% DMSO. Kassera flödet genom.
- Lägga till produkten av tau sammanlagda märkning reaktion till kolumnen i en total volym om 2,5 mL. Om provet är mindre än 2,5 mL, lägga till buffert tills en total volym på 2,5 mL uppnås.
- Låt provet ange packade gelen helt, kassera genomflöde.
- Eluera med 3,5 mL 0,1 M NaHCO3 buffert pH 8.5 som innehåller 3% DMSO och samla eluatet i 4 motsvarande fraktioner i 2 mL rör.
- Fastställa protein koncentrationer av 4 fraktioner av bicinchoninic syra (BCA) analys.
- Förvaras märkta proteinet i-20 ° C frys.
3. upptag Assay med sortering (FACS) avläsning av fluorescens-aktiverad Cell
-
Dag 1 – utsäde cellerna
- Tvätta BV-2-celler i kolven genom att ta bort odla medelstora och lägger till 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Obs: Tvätta volym varierar beroende på storleken på cellen kolven används. Till exempel för en T175 kolv, tvätta med 10 mL 1 x PBS. - Ta bort PBS från kolven och lossa cellerna genom inkubation med trypsin-etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) 0,05% vid 37 ° C och 5% CO2 tills cellerna lossnar från kolven (ca 5 min).
Obs: Volymen av trypsin-EDTA 0,05% beror på storleken på cellen kolven används. Till exempel för en T175 kolv, Använd 2 mL av trypsin-EDTA 0,05%. - Att resuspendera cellerna i odling medium genom pipettering upp och ned tre till fem gånger.
Obs: Volymen av odlingsskålar medium varierar beroende på storlek cell kolvens används och därmed totala antalet celler i kolven. Till exempel för en T175 kolv, använda 8 mL odlingsskålar medium. - Räkna celler och skapa en cellsuspension med en slutlig koncentration på 1 x 105 celler/mL i odlingsmedium som innehåller 200 μg/mL heparin.
- Tallrik 250 µL cellsuspension (2,5 x 104 celler) per brunn i en platta med 96 brunnar vävnadsodling i platt botten.
- Inkubera plattan över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tvätta BV-2-celler i kolven genom att ta bort odla medelstora och lägger till 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
-
Dag 1 – Förbered Immunocomplexes
- Tina pH dye-tau på is.
- Förbereda 65 µl per villkora av en 500 nM lösning med pH dye-tau aggregat i serumfritt medium (SFM) (hög glukos DMEM kompletteras med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 200 µg/mL heparin).
- Förbereda antikropp spädningar i 65 µl av SFM och vid en koncentration av dubbel den sista kvalifikationsperioden. Blanda pH dye-tau aggregat och antikroppar i en u-bottenplatta med 96 brunnar. Slutliga volym per tillstånd är nu 130 µl och pH dye-tau aggregat koncentrationen är 250 nM. Försegla utspädning plattan och inkubera över natten vid 37 ° C.
-
Dag 2 – Immunocomplexes upptag
- Ta bort odlingsskålar medium från BV-2-celler. Tvätta cellerna en gång med 100 µL rumstemperatur 1 x PBS.
- Över 125 µL av immunocomplexes till celler med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera cellerna med immunocomplexes under 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort inkubation medium från cellerna och kassera den. Tvätta cellerna en gång med 100 µL rumstemperatur 1 x PBS.
- Ta bort 1 x PBS och behandla celler med 50 µL trypsin-EDTA 0,25% under 20 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tillsätt 200 µL av odlingsskålar medium och resuspendera väl av pipettering uppåt och nedåt för att lossa cellerna. Överföra celler till en 96 brunnar U-botten plattan. Centrifugera platta 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Satte plattan på is, ta bort odla cellerna medium och tvätta två gånger av omblandning cell pellets i 150 µL is kallt 1 x PBS. Centrifugera platta 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Pålagda is celler, ta bort extra 1 x PBS och tvätta dem genom omblandning celler pellets i 150 µL kallt FACS buffert (1 x PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA), 2 mM EDTA). Centrifugera platta 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Pålagda is celler, ta bort extra FACS buffert och resuspendera cellerna i 200 µL kallt FACS buffert.
- Analysera prover omedelbart av FACS förvärva 2 x 104 händelser i utfärda utegångsförbud för levande celler (se steg 4.1).
4. FACS analys
Obs: Se figur 1 för Usenets strategin.
- Med hjälp av framåt scatter-området (FSC-A) kontra sida område (SSC-A) densitet spridningsdiagram, grind på levande celler genom att utesluta händelser med lägre framåt scatter (dvs, skräp och döda celler).
- Inom levande cell befolkningen, använda FSC-A kontra framåt scatter höjd (FSC-H) för att utesluta cell dubletter och aggregat. Detta är singlet grinden.
- Med händelserna i utfärda utegångsförbud för linne, generera ett pH dye enda parameter histogram.
- Bestämma medelvärdet fluorescensintensiteten. Fastställa andelen pH dye-tau positiva celler genom att utesluta negativa celler som fastställs med hjälp av BV-2 enda kontrollen.
5. Immunocomplexes upptag med mikroskopi avläsningssystem
-
Dag 1 – utsäde cellerna
- Förbereda BV-2-celler som beskrivs i steg 3.1.1, 3.1.2 och 3.1.3.
- Räkna celler och återsuspendera dem i odling medium till en slutlig koncentration av 104 celler/mL.
- Tallrik 150 µL cellsuspension (1,5 x 103) per brunn i en poly-D-lysin belagda 96 brunnar svart plåt med tydlig platt botten.
- Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 för 48 h.
-
Dag 3 – förbereda Immunocomplexes
Obs: Mild ultraljudsbehandling av märkta tau aggregat före inkubation med antikropp, utfördes för att förbättra mikroskopi resultat.- Tina pH dye-tau på is och Sonikera använder en sond någon sonikator samtidigt på isen. Använd en amplitud på 15% (någon sonikator makt 250 W). Utföra 30 pulser av 2 s och vänta 20 s mellan pulser.
- Förbereda 65 µl per villkora av en 500 nM lösning av pH dye-tau aggregat i SFM.
- Späd antikroppar i 65 µl av SFM en koncentration dubbel den sista kvalifikationsperioden. Blanda pH dye-tau aggregat och antikroppar i en u-bottenplatta med 96 brunnar. Slutliga volym per tillstånd är nu 130 µl och pH dye-tau aggregat koncentrationen är 250 nM. Försegla utspädning plattan och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Ta bort mediet från cell plattan och ersätter med 150 µL av odlingsskålar medium kompletteras med 200 µg/mL heparin. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
-
Dag 4 – Immunocomplexes upptag
- Ta bort odlingsskålar medium från BV-2 celler. Över 125 µL av immunocomplexes till celler med hjälp av en flerkanalspipett.
- Inkubera cellerna med immunocomplexes för 1 h och 45 min vid 37 ° C med 5% CO2.
Fläcken cellkärna med DNA specifika färgämne och sura organeller med en sond som selektivt fläckar lågt pH cellulära fack. Inkubera cellerna 15 min vid 37 ° C med 5% CO2.
Obs: Späd färgerna i SFM. - Utföra live-cell imaging med hög halt screening confocal system. Ställa in temperatur till 37 ° C och 5% CO2. För bilder av hög kvalitet, Använd en 63 X målsättningen för nedsänkning i vatten och förvärva 0,5 µm flygplan (20 per Z-stack) per avbildad fält.
Representative Results
Aggregerade rekombinant tau var kovalent märkt med ett pH-känsliga gröna färgämne. Denna färg ökar dramatiskt dess fluorescens vid dess internalisering i sura organeller, vilket gör det möjligt för intracellulära kvantifiering. Märkt tau aggregat inkuberades med anti tau monoklonala antikroppar. I synnerhet använde vi en chimär version (Mus IgG1 Fc region) av CBTAU-28,1. Detta human antikropp binder till N-terminala insert regionen av tau och kunna binda in vitro- genererade tau fibriller13. I denna analys testade vi också en affinitet-förbättrad version av CBTAU-28,1 – dmCBTAU-28,1. Fab fragment av CBTAU-28,1, i föräldraledighet och hög affinitet mutant format och en mus IgG1 isotypen kontroll användes som styr.
BV-2-celler inkuberades med den redan bildade immunocomplexes eller aggregerade tau ensam i två timmar i närvaro av heparin att blockera antikropp-oberoende tau upptag. Efter inkuberingen celler var trypsinized för att ta bort den tau bunden till extracellulära membranet och analyserades för tau upptag av flödescytometri. Som vi nyligen beskrivit13, konstaterade vi att CBTAU-28,1 varianter främjas upptaget av tau i BV-2-celler på ett dosberoende sätt. Upptaget var Fc medierad eftersom CBTAU-28,1 Fab-fragment inte ökade basal tau upptag (figur 2). Dessutom medierad hög affinitet dmCBTAU-28,1 antikroppen tau upptag i BV-2-celler i högre utsträckning än vildtyp antikroppen (figur 2).
Antikroppsmedierad tau upptag och lokalisering av tau aggregat i endolysosomal facket bekräftades av konfokalmikroskopi (figur 3) där den sura mobilfack var målat med en sond som är selektiv för lågt pH organeller. Intracellulära puncta grön pH färgämne märkt tau aggregat observerades inuti cellerna som inkuberades med CBTAU-28,1. Dessutom intracellulära tau aggregat ofta colocalized med lågt pH fack selektiv röda färgämnet vilket tyder på förekomsten av tau aggregat i sura organeller. CBTAU-28,1 Fab-fragment ökade inte tau upptag igen indikerar en Fc-receptor medierad internalisering mekanism (figur 3).
Figur 1: Gating strategi som används i flödescytometri Flödesanalys för att upptäcka tau internalisering av BV-2 celler. Exempeldata från BV-2 enda kontrollen (A-C), isotyp kontroll (D-F) och dmCBTAU-28,1 (G-jag) visas. BV-2 cell befolkningen var gated på en FSC-A vs SSC-A densitet tomt exklusive skräp och döda celler (A, D, G). BV-2-celler var sedan ytterligare gated på en FSC-A vs FSC-H densitet tomt att utesluta cell dubletter och aggregat (B, E, H). Enstaka cell porten användes för att generera ett pH färgämne (FITC i dessa representativa resultat) enda parameter histogram (C, F, jag) och avgör geometriskt medelvärde fluorescensintensiteten. Alternativt, beräknades andelen pH dye-tau positiva celler exklusive negativa celler som bestäms med hjälp av BV-2 enda kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CBTAU-28,1 förmedlar upptag av tau aggregat till mikrogliaceller BV-2. Aggregerade rekombinant tau var kovalent märkta med grön fluorescens pH-känsliga färgämne och inkuberas med en mus chimära version av den human anti tau antikroppen CBTAU-28,1, dess affinitet förbättrat format, dmCBTAU-28,1, motsvarande Fab fragment, en Mus IgG1 isotypen kontroll antikropp eller ingen antikropp (tau aggregat ensam). Immunocomplexes inkuberades därefter med BV-2-celler i två timmar i närvaro av heparin att blockera antikropp-oberoende tau upptag. Upptag av immunocomplexes bedömdes genom flödescytometri och uttryckt som det geometriska medelvärdet (GM) av fluorescensintensiteten (A) eller procentandel av tau positiva (tau +) celler (B). Felstaplar i (A) ange standardavvikelsen för två oberoende experiment, medan b visar en enda experimentera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tau aggregat är internaliseras av BV-2-celler och lokalisera i cellulära sura organeller. Förformade tau-antikropp immunocomplexes inkuberades med BV-2-celler i två timmar i närvaro av heparin att blockera antikropp-oberoende upptag. Efter inkubation, var kärnor fläckade av en DNA specifika blått färgämne och den sura mobilfack med ett lågt pH fack selektiv rött färgämne. Live-cell imaging visade intracellulära puncta av märkt tau aggregat (grön) inne i cellerna som inkuberades med CBTAU-28,1 och dmCBTAU-28,1, men inte med kontrollen isotypen. Dessutom färg intracellulära tau aggregat ofta colocalized med röd (gul) vilket tyder på förekomsten av tau aggregat i den sura mobilfack. CBTAU-28,1 Fab-fragment ökade inte tau upptag som anger en Fc-receptor medierad internalisering mekanism. Bilderna representerar maximalstyrkan projektioner av en 20 flygplan Z-stack (0,5 µm plan) förvärvade en 63 X vatten nedsänkning syfte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Mikroglia, bosatt hjärnans immunceller, har nyligen identifierats som viktiga aktörer i antikroppsmedierad behandlingsmetoder för tauopathies10,11. Antikroppsmedierad tau clearance av mikroglia, tillsammans med blockering av neuronala upptag9, hämning eller destabilisering av fibrillcellulosa bildandet13,14 och clearance av intraneuronala fibriller via den lysosomala väg15, kan alla bidra till anti tau antikropp effekten observerades i musmodell tauopathy5,6,7,8,9.
Vi beskrivs här en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia med syftet att skapa ett prövningsläkemedel verktyg att bättre karaktärisera verkningsmekanismer av anti tau antikroppar.
Denna analys, anpassad från Funk et al. 11, använder BV-2 celler, som förevigade murina mikrogliaceller. Medan de inte kan helt jämföras med primära mikrogliaceller, de har många av egenskaperna hos primära mikroglia, inklusive möjligheten för kraftfullt phagocytose både Aβ och tau fibriller11,16,17 ,18,19. Dessutom visade de en reproducerbar beteende i vitro som gjorde dem mycket lämpliga för test utveckling och kvantitativa studier, som kräver minimal experimentella variabilitet. Bredvid denna, förevigade cellinjer tillåta högre assay genomströmning och eliminera behovet av djuroffer jämfört med användning av primära mikroglia.
Tau aggregaten vi använt i denna analys erhölls med mycket reproducerbara in vitro- aggregering procedur att vi nyligen beskrivit13och Visa liknande morfologi för att paras ihop spiralformade filament (PHFs) isolerade från hjärnan hos AD patienter. Medan vi inte observera några oväntade resultat som kan ha orsakats av tau aggregat adherencen till plast eller glas ytor, spelade användning av stabila och väl karakteriserade tau aggregat en avgörande roll i denna analys reproducerbarhet.
En annan aspekt som väsentligt bidragit till assay reproducerbarhet var cell densiteten. Antalet celler per brunn beskrivs i protokollet representerar optimal cell densiteten i de beskrivna förhållandena.
Olikt än vilken Funk et al. 11 beskrivs, vi märkt tau aggregat med en pH-känsliga färgämne som avsevärt ökar dess fluorescens vid internaliseringen i sura organeller, vilket möjliggör för intracellulära kvantifiering. Detta, tillsammans med trypsin rötning av yta bundna immunocomplexes eller tau, garantier fluorescens signalen mäts av flödescytometri är resultatet av tau upptag i stället för bindning till cellulära ytan. Dessutom förutsätter en pH känsliga dye underlättar upptäckt av internaliserade tau aggregat i mikroskopi experiment utan att behöva smälta yta bundna immunocomplexes/tau aggregat som skulle sedan att cellen åter plätering och återhämtning.
Vi har också ytterligare optimerat den mikroskopi avläsning av vår analys, jämfört med vad som tidigare varit beskrivs11, med hjälp av en mycket selektiv färga för sura organeller i våra mikroskopi experiment vilket inte gjorde att vi bara att bekräfta antikroppsmedierad Tau upptag, men också lokalisering av tau aggregat i endolysosomal facket.
Den analys som vi utvecklat, har optimal specificitet vilket resulterar i ett bra experimentella fönster som möjliggör en stark separation mellan positiva och negativa prover. Intressant är upptäcker analysen indirekt skillnader i antikropp affinitet som alltså representerar ett kraftfullt verktyg att studera anti tau antikropp effektor funktioner.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Alberto Carpinteiro Soares för hans värdefulla tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
- Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
- Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
- Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
- Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
- Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
- Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
- Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
- Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
- Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
- Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
- Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
- Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
- Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
- Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).
