Summary
Burada nicelik eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklayın.
Abstract
Alzheimer hastalığı (Ah) bir ilerici nörodejeneratif durumda tau toplanan ve sonunda neden bilişsel gerileme için nöronal disfonksiyon neden beyin amiloid proteinler birikir var. Nöron hyperphosphorylated tau toplamları en çok reklam ile ilişkili patoloji neden inanılıyor. Bu toplamları ekstraselüler bölmesine yayımlanması için kabul ve nerede daha fazla tau toplama neden bitişik sağlıklı nöronlar tarafından alınan. Bu "deli dana gibi" yayılan antikorlar bağlama ve "reklam preklinik fare modellerinde gösterildiği gibi hücre dışı tau toplamları nötralize" özelliği tarafından durdurulabilir. Hangi tarafından patoloji terapötik antikorlar azaltmak önerilen mekanizmaları antikor aracılıklı alımı ve gümrükleme tau microglia tarafından patolojik toplanan formları biridir. Burada, tau alımı microglia tarafından değerlendirmek için nicel bir hücre tabanlı tahlil açıklayın. Bu tahlil fare mikroglial hücre kültürünü BV-2 kullanır, yüksek özgüllük, düşük değişkenliği ve orta üretilen iş sağlar. Bu tahlil ile oluşturulan veri Anti-tau antikor efektör fonksiyonları daha iyi bir karakterizasyonu için katkıda bulunabilir.
Introduction
Alzheimer hastalığı (Ah) konformasyonal değişim ve kendinden montajlı amiloid Beta peptid ve tau protein patolojik toplamları ile karakterize bir ilerici nörodejeneratif durumdur. Anormal derecede fosforile tau reaksiyonlar ve neurofibrillary düğüm1,2biriken iken normal çözünür amiloid Beta peptid oligomeric ve fibriler amiloid β dönüştürülür. Bu protein toplamları hafıza kaybı ve sonraki ilerici bilişsel gerileme için önde gelen nöronal ölüme neden. Üretken olmayan neuroinflammation ve misfolded proteinler, temizlemek için azaltılmış bir yeteneği de dahil olmak üzere diğer faktörler, azdırmak ve hastalık hızlandırmak. Şu anda, müdahale stratejilerinin reklam karşı büyük ölçüde semptomatik rahatlama sağlar, ama hiçbir hastalığı değiştirme tedavisi veya önleme.
Kanıt artan önemli bir rol hyperphosphorylated tau toplamları içinde reklam patoloji göstermektedir. Patolojik olmayan haliyle tau mikrotübüller için bağlar ve nöronal sitoiskeleti onların derlemeye yerli gelişeceğini bir proteindir. Tau hyperphosphorylated olduğunda, sitoiskeleti ayırır ve içine hangi reklam3ile ilişkili patoloji çoğunu neden inanılıyor tau toplamları nöron kümeleri. İlk intracellularly biriken tau başlar toplanan, ancak hastalık ilerledikçe etkilenen neurons ekstrasellüler alana hangi o-ebilmek alınmak bitişik veya synaptically bağlı sağlıklı nöronlarda tarafından yayımlanması için kabul edilir bir " deli dana benzeri şekilde". İçselleştirilmiş bir kez tau toplamak daha fazla tau toplama yolu ile şablonu esas alan konformasyonal değişim4neden olmaktadır.
Bu varsayıma göre tedaviler tau tohum kesintiye uğratmasını yetenekli yavaşlatmak veya tau-aracılı nörodejeneratif hastalık seyri ters. Bu destek, azaltılmış tau patoloji ve geliştirilmiş bilişsel işlev5,6,7,8 genetik mutasyon tauopathy için duyarlı yapılır ve pasif Anti-tau antikorlar ile enjekte fareler gösterir ,9. Ancak, hangi tarafından patoloji terapötik antikorlar azaltmak mekanizmaları hala zor kalır.
Önerilen mekanizmaları antikor aracılıklı alımı ve gümrükleme tau microglia, beynin yerleşik bağışıklık hücreleri tarafından patolojik toplanan formları biridir. Son yayınlar microglia verimli bir şekilde içselleştirmesi ve patolojik tau türler bozulmasına yol açar ve bu yeteneği yüzeyinde ifade Fc reseptörü içeren anti-tau antikorlar ile Fc bağımlı mekanizma tarafından geliştirilmiş öneririm fagositoz10,11microglia ve reseptör aracılı. Bu veri microglia terapötik antikorlar potansiyel olarak önemli effectors tanımlayın.
Biz burada nicelik tau alımı microglia tarafından değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil tanımlamak. Bu tahlil ile oluşturulan veri eylem böylece Anti-tau antikorlar gelişimleri potansiyel reklam tedavi olarak daha fazla adımlardan geçmek için yararlı bir araç temsil eden Anti-tau antikorların mekanizmaları elucidating yardımcı olabilir.
Protocol
1. BV-2 hücreleri kültür
Not: Tanıtıcı BV-2 hücreleri seviye 2 koruma altında. BV-2 hücre kültürünü bir saran rekombinant ecotropic retrovirüsü (yalnızca fare hücreleri bulaşmasını yeteneğine sahip)12üretir; öyle virüs dönüştürme yeteneği ve in vivo tumorigenic potansiyel onların vitro için bilinir.
- Kültür BV-2 hücreleri yüksek glikoz Dulbecco'nın % 10 fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin (kodlamayla aracı olarak şu andan itibaren anılacaktır) ile 4 x 104 hücreleri tohum tarafından desteklenen kartal Orta (DMEM) modifiye hücre/mL.
- 37 ° C'de % 5 CO2 oksijen bir atmosferde kültürleri korumak
Not: gevşek bağlı ve süspansiyon hücreleri büyümek.
2. etiket rekombinant Tau toplamları pH duyarlı floresan boya
Not: Apetri ve ark. içinde açıklandığı gibi Tau toplamları hazırlanmıştır 13 ile farkı yok Thioflavin T (ThT) tepki arabelleğe eklendi. Toplanan örnekler 1,5 mL santrifüj tüplerde toplanmıştır. Son floresans sinyal havuzu örnek 118 µL 50 µM ThT eriyik 12 µL ile karıştırılarak kontrol edildi. Toplamları 20.000 x g 4 ° C'de 1 h için toplama tepki karisimin centrifuging tarafından ayrı kaldık Süpernatant monomeric tau toplamları dönüştürüldü onaylamak için sn-MALS tarafından analiz edildi. Dondurulmuş ve derin dondurucu-80 ° C'de depolanan ek granül (tau toplamları) olduğunu
- PH 8,5 konsantrasyonu 1 mg/ml 0.1 M sodyum bikarbonat tampon (NaHCO3) Tau toplamları resuspend (~ 20 µM).
Not: Tau toplamları konsantrasyon ilk monomer konsantre tau monomerleri, 280 emilimini tarafından değerlendirildi gibi dayanmaktadır 0.31 mLmg-1cm-1bir tükenme katsayısı kullanarak nm. - Çok ısınmaya önlemek için buz tutarken bir sonda sonicator kullanarak resuspended toplamları solüsyon içeren temizleyicide.
- Bir genliği % 65 (ile sonicator güç 250 W) kullanın.
- 3 ve 8 darbeleri gerçekleştirmek duraklar 15 s s arasında bakliyat ısınmayı önlemek için.
- PH-duyarlı boya üreticisinin öğretim takip dimetil sülfoksit (DMSO) (bundan sonra başvuru için pH boya olarak) bir 8,9 mM hisse senedi çözümü hazırlayın.
Not: Her zaman taze bir çözüm hazırlamak ve sadece hazırlanan gününde kullanabilirsiniz. - Boya köstebek protein başına 10 mol 0.2 mM son boya konsantrasyon için ekleyin.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
- 45-60 dakika oda sıcaklığında ışıktan korunan tepki karışımı kuluçkaya.
- Bu arada, üreticinin yönergeleri sütun desalting bir çapraz bağlı dextran jel bir araya getirin.
- Sütun 25 mL 0.1 M NaHCO3 tampon pH 8,5 içeren %3 DMSO ile equilibrate. Aracılığıyla akış atmak.
- 2,5 mL toplam hacmi sütununda tepki etiketleme tau agrega ürün ekleyin. Örnek daha az 2.5 mL 2.5 mL toplam hacmi elde kadar arabellek ekleyin.
- Paketlenmiş jel tamamen girin, akışı aracılığıyla atın örnek ver.
- 3,5 mL 0.1 M NaHCO3 tampon pH 8,5 içeren %3 DMSO ile elute ve eluate 2 mL tüpler 4 eşdeğer kesirler toplamak.
- 4 kesirler protein konsantrasyonları bicinchoninic asit (BCA) tahlil tarafından belirler.
- Etiketli protein-20 ° C dondurucuda saklayın.
3. alımı tahlil ile floresan aktif hücre okuma (FACS) sıralama
-
Gün 1 – Tohum hücreleri
- Orta ve ekleme 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x kültür kaldırarak şişeye yıkama BV-2 hücreleri.
Not: cilt yıkama kullanılan hücre balonun büyüklüğüne göre değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için 10 mL 1 x PBS ile yıkayın. - PBS balonun kaldır ve hücreleri tarafından kuluçka hücreleri şişeye (yaklaşık 5 dk) ayırmak kadar tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) %0,05 37 ° C ve % 5 CO2 ile bağlantısını kesin.
Not: % 0.05 tripsin-EDTA hacmi kullanılan cep şişesi boyutuna bağlıdır. Örneğin, bir T175 şişesi için 2 mL % 0.05 tripsin-EDTA kullanın. - Orta 3'e beş kez yukarı ve aşağı pipetting tarafından kültür hücreler resuspend.
Not: Orta kültür, birim boyutu kullanılan cep şişesi ve böylece şişeye hücre toplam sayısı bağlı olarak değişir. Örneğin, bir T175 şişesi için orta kültür 8 mL kullanın. - Hücreleri saymak ve 1 x 105 hücre/mL kültür 200 μg/mL heparin içeren ortamda son bir konsantrasyon ile bir hücre süspansiyon oluşturun.
- Hücre süspansiyon kuyuda bir 96-iyi doku kültürü düz alt plaka (2. 5 x 104 hücreleri), 250 µL plaka.
- Gecede 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
- Orta ve ekleme 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x kültür kaldırarak şişeye yıkama BV-2 hücreleri.
-
Gün 1 – Immunocomplexes hazırlamak
- PH boya-tau buz çözme.
- Koşul bir 500 nM çözüm pH başına 65 μl Orta (SFM) (yüksek glikoz DMEM 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 200 µg/mL heparin ile desteklenmiş) serum-Alerjik boya-tau toplamları hazırlayın.
- Antikor dilutions SFM ve bir konsantrasyon içinde 65 µl çift son bir hazırlayın. PH boya-tau toplamları ve bir 96-şey u-alt plaka antikor karıştırın. Koşul başına son hacim şimdi 130 µl ve pH boya-tau toplamları konsantrasyon 250 nM. Seyreltme plaka mühür ve gece 37 ° C'de kuluçkaya
-
2. gün-Immunocomplexes alımı
- Kodlamayla orta BV-2 hücreleri kaldırın. Hücreleri bir kez 100 µL oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
- İmmunocomplexes 125 µL bir çok kanallı pipet kullanarak hücreleri aktarın. İmmunocomplexes 2 h 37 ° C ve % 5 CO2için hücrelerle kuluçkaya.
- Kuluçka orta hücrelerdeki kaldırmak ve o atın. Hücreleri bir kez 100 µL oda sıcaklığında 1 x PBS ile yıkayın.
- 1 x PBS kaldırmak ve 50 µL tripsin-EDTA %0.25 37 ° C'de 20 dk için ve % 5 hücrelerle tedavi CO2.
- 200 µL kodlamayla orta ekleyin ve de yukarı ve aşağı hücreleri ayırmak için pipetting tarafından resuspend. Hücreleri bir 96-şey U-yukarıdan aşağıya doğru transfer plaka. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
- Plaka buza koyun, iki kez 150 µL buz soğuk 1 x PBS içinde hücre granül resuspending tarafından orta ve yıkama hücre kültürü çalışmalarının kaldırın. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
- Hücreleri buza koy, eklenen 1 x PBS ve onlar tarafından resuspending granül 150 µL soğuk FACS arabellek (1 x PBS, % 0.5 Sığır serum albumin (BSA), 2 mM EDTA) içinde hücreleri yıkama kaldırmak. 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj plaka
- Hücreleri buza koy, eklenen FACS arabellek kaldırmak ve 200 µL soğuk FACS arabellek hücrelerde resuspend.
- Örneklerini hemen 2 x 104 olayları canlı hücreleri kapısında edinme FACS tarafından (bkz. Adım 4.1).
4. FACS Analizi
Not: Gating strateji için Şekil 1 ' e bakın.
- İleri dağılım alanı kullanarak karşı tarafı dağılım alanı (SSC-A) yoğunluk çizim, kapı alt ileri dağılım düzeyleri (Yani, enkaz ve ölü hücreleri) olaylarla hariç tarafından canlı hücrelerde (FSC-A).
- Canlı hücre nüfus içinde kullanmak FSC-A karşı ileri dağılım yükseklik (FSC-H) hücre birini ve toplamları dışarıda bırakmak için. Singlet kapı bu.
- Olayları singlet kapıyı kullanarak, bir pH boya tek parametre çubuk grafik oluşturun.
- Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek. BV-2 tek denetim kullanarak negatif hücreler olarak hariç tarafından pH boya-tau pozitif hücrelerinin yüzdesi, kararlı belirlemek.
5. Immunocomplexes alımını mikroskobu okuma ile
-
Gün 1 – Tohum hücreleri
- BV-2 hücreleri 3.1.1, 3.1.2 ve 3.1.3 adımlarda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Hücreleri saymak ve onları Orta 104 hücre/mL nihai bir konsantrasyon olarak kültür resuspend.
- Hücre süspansiyon 150 µL plaka (1.5 x 103) bir poli-D-lizin bir kuyu başına 96-şey siyah plaka açık düz dipli ile kaplı.
- 48 h 37 ° C ve % 5 CO2 plaka kuluçkaya.
-
Gün 3-Immunocomplexes hazırlamak
Not: Etiketli tau toplamları ile antikor, kuluçka önce hafif sonication mikroskobu sonuçlarını iyileştirmek için gerçekleştirilen.- PH boya-tau buz çözme ve buz tutarken bir sonda sonicator kullanarak solüsyon içeren temizleyicide. Bir genlik % 15 (250 W sonicator güç) kullanın. 2 ve bekle 20 leri bakliyat arasında 30 darbeleri gerçekleştirmek.
- Koşul bir 500 nM çözüm pH boya-tau toplamları SFM başına 65 μl hazırlayın.
- SFM 65 µl bir konsantrasyon için seyreltik antikor son bir çift. PH boya-tau toplamları ve bir 96-şey u-alt plaka antikor karıştırın. Koşul başına son hacim şimdi 130 µl ve pH boya-tau toplamları konsantrasyon 250 nM. Seyreltme plaka mühür ve gece 37 ° C'de kuluçkaya
- Orta hücre plaka kaldırmak ve 150 µL 200 µg/mL heparin ile desteklenmiş kodlamayla orta yerine. Gecede 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
-
Gün 4-Immunocomplexes alımı
- Kodlamayla orta BV-2 hücrelerden kaldırma. İmmunocomplexes 125 µL bir çok kanallı pipet kullanarak hücreleri aktarın.
- 1 saat 45 dk % 5 CO237 ° C'de immunocomplexes hücrelerle kuluçkaya.
Hücre çekirdeği DNA belirli boya ve seçime bağlı olarak düşük pH hücresel kompartmanlarda lekeleri bir sonda ile asidik organelleri leke. Hücreleri % 5 CO237 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
Not: SFM boyalar sulandırmak. - Canlı hücre eleme confocal sistemi yüksek bir içerik görüntüleme kullanarak gerçekleştirin. Sıcaklığı 37 ° C ve % 5 CO2olarak ayarlayın. Yüksek kaliteli görüntüler, 63 X su daldırma objektif kullanın ve görüntülü alan başına 0.5 µm uçaklar (Z-yığın başına 20) elde etmek.
Representative Results
Toplanan rekombinant tau kovalent bir pH duyarlı yeşil boya ile etiketli. Bu boya üzerine asidik organelleri, böylece hücre içi miktar için izin onun içselleştirilmesi, floresans önemli ölçüde artırır. Etiketli tau toplamları Anti-tau monoklonal antikorlar ile inkübe. Özellikle, biz CBTAU 28,1 chimeric bir sürümünü (fare Igg1 Fc bölgesi) kullanılır. Bu insan antikoru tau N-terminal Ekle bölgesine bağlar ve oluşturulan vitro tau liflerinde13bağlamak yapabiliyor. Bu tahlil, de CBTAU-28,1-dmCBTAU-28,1 benzeşme geliştirilmiş bir sürümünü test. CBTAU-28,1, Fab parçaları ebeveyn ve yüksek-benzeşme mutant olarak biçimlendirmek ve izotip kontrol olarak kullanılan bir fare Igg1 denetler.
BV-2 hücreleri önceden biçimlendirilmiş immunocomplexes ile inkübe veya tau varlığında antikor bağımsız tau alımını engellemek için heparin iki saat yalnız toplanan. Kuluçka sonra hücreleri ekstrasellüler membran için bağlı tau kaldırmak için trypsinized ve tau alımı için akış sitometresi tarafından analiz edildi. Biz son zamanlarda13açıklandığı gibi bu CBTAU 28,1 terfi türevleri alımını tau BV-2 hücrelerdeki bir doz bağımlı şekilde görülmektedir. Alımı CBTAU-28,1 Fab parçaları bazal tau alımı (Şekil 2) artmamıştır beri aracılı Fc olduğunu. Ayrıca, yüksek benzeşme dmCBTAU 28,1 antikor BV-2 hücrelere daha vahşi tipi antikor (Şekil 2) daha yüksek bir ölçüde tau alımını aracılık.
Antikor aracılıklı tau alımı ve yerelleştirme tau toplamları endolysosomal yerde olduğunu doğruladı tarafından confocal mikroskobu (Şekil 3) nerede asidik hücresel bölmesi düşük pH organelleri için bir sonda seçici kullanarak lekeli. Yeşil pH boya ve hücre içi puncta toplamları CBTAU-28,1 ile inkübe hücrelere gözlendi tau etiketli. Ayrıca, hücre içi tau toplamları kez böylece asidik organelleri tau toplamları varlığı öne düşük pH yuvası seçici kırmızı boya ile colocalized. CBTAU-28,1 Fab parçaları yeniden bir Fc reseptör aracılı içselleştirilmesi mekanizması (Şekil 3) bildiren tau alımı artmamıştır.
Şekil 1: Akış Sitometresi Analizi tau içselleştirilmesi BV-2 hücreleri tarafından algılamak için kullanılan strateji geçişi. Örnek veriyi BV-2 tek kontrol (A-C), izotip kontrol (D-F) ve dmCBTAU-28,1 (G-ben) gösterilir. BV-2 hücre nüfus enkaz ve ölü hücreleri (A, D, G) hariç FSC-A vs SSC-A yoğunluğu arsa üzerinde geçişli. BV-2 hücreleri daha sonra daha fazla hücre birini ve toplamları (B, E, H) dışarıda bırakmak için FSC-A vs FSC-H yoğunluğu arsa üzerinde kapı. Tek hücre kapısı bir pH boya (FITC temsilcisi bu sonuçları) tek parametre çubuk grafik oluşturmak için kullanılan (C, F, ben) ve geometrik ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek. Alternatif olarak, pH boya-tau pozitif hücrelerinin yüzdesi, BV-2 tek denetimi kullanarak belirlenen negatif hücreleri hariç hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: CBTAU-28,1 aracılık eder tau toplamları mikroglial BV-2 hücreleri içine alımını. Toplanan rekombinant tau kovalent yeşil floresans pH duyarlı boya ile etiketli ve inkübe bir fare chimeric sürümüyle insan anti-tau antikor CBTAU-28,1, kendi benzeşim gelişmiş format, dmCBTAU-28,1, karşılık gelen Fab parçaları, bir fare Igg1 izotip kontrol antikor veya hiçbir antikor (tau toplamları yalnız). Immunocomplexes daha sonra iki saat varlığında antikor bağımsız tau alımını engellemek için heparin BV-2 hücreleri ile inkübe. İmmunocomplexes alımını akış sitometresi tarafından değerlendirildi ve geometrik ortalamasını (GM) Floresan yoğunluğu(a)veya tau pozitif (tau +) yüzdesi hücreleri (B) dile getirdi. Hata Çubuklarõn (a) iki bağımsız deney'nin standart sapması, (B) gösterir tek bir deneme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Tau toplamları BV-2 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve hücresel asidik organelleri yerelleştirilmesine. Ön şekillendirilmesi tau-antikor immunocomplexes BV-2 hücreleri ile antikor bağımsız alımını engellemek için heparin huzurunda iki saat inkübe. Kuluçka sonra çekirdekleri bir DNA belirli mavi boya ve düşük pH yuvası seçici kırmızı boya ile asidik hücresel yuvası ile lekeli. Canlı hücre görüntüleme etiketli tau toplamları (yeşil) CBTAU-28,1 ve dmCBTAU 28,1, ancak değil izotip kontrol inkübe hücrelere hücre içi puncta ortaya koydu. Ayrıca, hücre içi tau toplamları kez kırmızı ile colocalized (böylece tau toplamları asidik hücresel yerde varlığını düşündüren sarı) boya. CBTAU-28,1 Fab parçaları bir Fc reseptör aracılı içselleştirilmesi mekanizması gösteren tau alımı artmamıştır. Görüntüleri bir 63 X su daldırma amacı ile alınan en fazla yoğunluk projeksiyonlar 20 uçak Z-yığın (0.5 µm uçakları) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Microglia, ikamet beynin bağışıklık hücreleri, son zamanlarda tespit edilmiştir antikor aracılıklı tedavi yaklaşımları tauopathies10,11önemli oyuncular olarak. Antikor aracılıklı tau izni tarafından microglia nöronal alımını9, inhibisyon veya istikrarsızlık fibril oluşumu13,14 ve intraneuronal liflerinde ile boşluk lizozomal engelleme ile birlikte, yol15, tüm tauopathy5,6,7,8,9fare modelde gözlenen Anti-tau antikor etkinliği katkı.
Biz burada kantitatif eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil nitelendirdi.
Bu tahlil, Funk ve ark. adapte 11, ölümsüzleştirdi fare mikroglial hücreler BV-2 hücreleri kullanır. Birincil mikroglial hücrelere tam olarak karşılaştırılamaz iken, onlar birçok özelliği birincil microglia özelliklerini sağlam yeteneği dahil olmak üzere Aβ ve tau liflerinde11,16,17 phagocytose ,18,19. Ayrıca, onları tahlil geliştirme ve en az deneysel değişkenlik gerektiren nicel çalışmalar için son derece uygun yapılmış bir tekrarlanabilir davranış vitro gösterdiler. Bu, yanında ölümsüzleştirdi hücre satır tahlil akışı sağlayarak daha yüksek izin ve birincil microglia kullanımına göre hayvan kurban etmek için gereksinimini ortadan kaldırır.
Bu tahlil kullandığımız tau toplamları son zamanlarda13ve gösteri için benzer görünümdeki helisel filamentler (PHFs) reklam beyin izole eşleştirilmiş açıklanan son derece tekrarlanabilir vitro toplama yordamı kullanarak elde edilmiştir hastalar. Biz tau toplamları bağlılık plastik ya da cam yüzeyler tarafından neden olabilir herhangi bir beklenmedik sonuçlar gözlemlemek değil iken, istikrarlı ve iyi karakterize tau agrega kullanımı bu tahlil tekrarlanabilirlik içinde önemli bir rol oynadı.
Önemli ölçüde tekrarlanabilirlik tahlil katkıda başka bir yönü hücre yoğunluğu oldu. İyi iletişim kuralında tanımlanan başına hücre sayısı optimum hücre yoğunluğu açıklanan koşullarda temsil eder.
Farklı daha ne Funk vd. açıklanan 11 , biz böylece hücre içi miktar için izin tau toplamları, floresans içselleştirilmesi asidik organelleri, üzerine önemli ölçüde artıran bir pH hassas boya ile etiketlenmiş. Bu, immunocomplexes ve/veya tau tripsin sindirim yüzey ile birlikte bağlı, floresans sinyal akış sitometresi tarafından ölçülen garanti tau alımını tercihan--dan bağlama hücresel yüzeye sonucu. Ayrıca, hücre yeniden kaplama ve kurtarma içselleştirilmiş tau toplamları mikroskobu deneylerde yüzey sindirerek gerek kalmadan tespiti o zaman-cekti immunocomplexes/tau toplamları bağlı bir pH hassas boya hareket hızları kullanımını gerektirir.
Biz de daha ne daha önce açıklanan11için olmuştur göre bizim testin mikroskobu eşleştirmeyi optimize, bize izin verilmez bizim mikroskobu deneylerde asidik organelleri için çok seçici bir boya kullanarak onaylamak için tek antikor aracılı Tau alımı, aynı zamanda yerelleştirme tau toplamları endolysosomal yerde.
Geliştirdiğimiz, tahlil iyi bir deneysel penceresini olumlu ve olumsuz örnekleri arasında güçlü bir ayrım sonucunda en iyi özgüllük vardır. İlginçtir, tahlil böylece Anti-tau antikor efektör fonksiyonları eğitim için güçlü bir araç temsil eden antikor benzeşme farklılıkları dolaylı olarak algılar.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Alberto Carpinteiro Soares onun değerli teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1x) | Gibco | 10010-015 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| DMEM 4.5 g/dL glucose | Gibco | 41966-029 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
| pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
| Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
| PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
| Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
| Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
| BSA | Sigma | A7030-100G | |
| EDTA 0.5 M, pH8 | |||
| FACS Canto II | BD | ||
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
| Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |
References
- Hefti, F., Goure, W. F., Jerecic, J., Iverson, K. S., Walicke, P. A., Krafft, G. A. The case for soluble Aβ oligomers as a drug target in Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (5), 261-266 (2013).
- Castillo-Carranza, D. L., Lasagna-Reeves, C. A., Kayed, R. Tau aggregates as immunotherapeutic targets. Frontiers in bioscience (Scholar edition). 5, 426-438 (2013).
- Martin, L., Latypova, X., Terro, F. Post-translational modifications of tau protein: Implications for Alzheimer's disease. Neurochemistry International. 58 (4), 458-471 (2011).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: The importance of extracellular Tau as a therapeutic target. Journal of Biological Chemistry. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Giacobini, E., Gold, G. Alzheimer disease therapy--moving from amyloid-beta to tau. Nature Reviews Neurology. 9 (12), 677-686 (2013).
- Asuni, A. A., Boutajangout, A., Quartermain, D., Sigurdsson, E. M. Immunotherapy targeting pathological tau conformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associated functional improvements. Journal of Neuroscience. 27 (34), 9115-9129 (2007).
- Boutajangout, A., Ingadottir, J., Davies, P., Sigurdsson, E. M. Passive immunization targeting pathological phospho-tau protein in a mouse model reduces functional decline and clears tau aggregates from the brain. Journal of Neurochemistry. 118 (4), 658-667 (2011).
- Chai, X., et al. Passive immunization with anti-Tau antibodies in two transgenic models: reduction of Tau pathology and delay of disease progression. Journal of Biological Chemistry. 286 (39), 34457-34467 (2011).
- Yanamandra, K., et al. Anti-tau antibodies that block tau aggregate seeding in vitro markedly decrease pathology and improve cognition in vivo. Neuron. 80 (2), 402-414 (2013).
- Luo, W., Liu, W., Hu, X., Hanna, M., Caravaca, A., Paul, S. M. Microglial internalization and degradation of pathological tau is enhanced by an anti-tau monoclonal antibody. Scientific Reports. 5, 11161 (2015).
- Funk, K. E., Mirbaha, H., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. Distinct Therapeutic Mechanisms of Tau Antibodies: Promoting Microglial Clearance Versus Blocking Neuronal Uptake. Journal of Biological Chemistry. 290 (35), 21652-21662 (2015).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. Journal of neuroimmunology. 27 (2-3), 229-237 (1990).
- Apetri, A., et al. A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities. Acta neuropathologica communications. 6 (1), 43 (2018).
- Schneider, A., Mandelkow, E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Neurotherapeutics. 5 (3), 443-457 (2008).
- Congdon, E. E., Gu, J., Sait, H. B., Sigurdsson, E. M. Antibody uptake into neurons occurs primarily via clathrin-dependent Fcgamma receptor endocytosis and is a prerequisite for acute tau protein clearance. Journal of Biological Chemistry. 288 (49), 35452-35465 (2013).
- Bocchini, V., Mazzolla, R., Barluzzi, R., Blasi, E., Sick, P., Kettenmann, H. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. Journal of Neuroscience Research. 31 (4), 616-621 (1992).
- Koenigsknecht, J. Microglial Phagocytosis of Fibrillar β-Amyloid through a β1 Integrin-Dependent Mechanism. Journal of Neuroscience. 24 (44), 9838-9846 (2004).
- Kopec, K. K., Carroll, R. T. Alzheimer's β-Amyloid Peptide 1-42 Induces a Phagocytic Response in Murine Microglia. Journal of Neurochemistry. 71 (5), 2123-2131 (2002).
- Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (9), E1316-E1325 (2016).
