Summary
Представлен подробный протокол для применения нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC) стратегии для идентификации белков, обязательного для обеих кодирования и некодирующей РНК.
Abstract
Всеобъемлющее выявление RNA-связывая протеинов (ОДП) является ключом к пониманию посттранскрипционного регулирования сети в клетках. Широко используется стратегия для захвата ОДП использует сплайсингу [poly(A)] целевой РНК, которая в основном происходит на эукариотические зрелой мРНК, оставляя большинство связывания белков non-poly(A) РНК неизвестные. Здесь мы описываем подробные процедуры недавно сообщили метода называется нажмите при содействии химия РНК interactome захвата (CARIC), который позволяет транскриптом широкий захват ОДП, poly(A) и non-poly(A), объединяя метаболических маркировки РНК, в естественных условиях УФ cross-linking и bioorthogonal пометки.
Introduction
Человеческий геном транскрибируется в различные типы кодирования и некодирующей РНК (ncRNAs), включая мРНК, теорией, tRNAs, малые ядерные РНК (промотор), малые ядрышковые РНК (snoRNAs) и длиной некодирующих РНК (lncRNAs)1. Большинство из этих молекул РНК обладают одежда ОДП и функционировать как рибонуклеопротеида частиц (RNPs)2. Таким образом всеобъемлющее выявление ОДП является необходимым условием для понимания регулирования сети между РНК и ОДП, которая подразумевается в различных заболеваний человека3,,4-5.
За последние несколько лет стали свидетелями большой импульс ОДП, обнаружены в различных систем эукариотической2,6, включая человека7,8,9,10,11, мышь12,13,14, дрожжи9,,1516, данио рерио17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,,2122и паразитов человека23,24,25 . Эти достижения способствовали ОДП захвата стратегии, разработанной в Кастелло и др. 7 и Бальтца и др. 8 в 2012 году, который сочетает в себе в vivo УФ cross-linking РНК и взаимодействуя белками, oligo(dT) захват poly(A) РНК и масс-спектрометрия (МС)-proteomic профилирования на основе. Однако учитывая тот факт, что poly(A) в основном существует на зрелой мРНК, которые составляют для только ~ 3% - 5% эукариотических транскриптом26, эта широко используется стратегия не способна снимать ОДП, взаимодействующих с non-poly(A) РНК, включая большинство ncRNAs и пре мРНК.
Здесь мы приводим подробные процедуры недавно разработанной стратегии для захвата транскриптом всей poly(A) и non-poly(A) ОДП27. Назвать CARIC, эта стратегия объединяет в vivo УФ cross-linking и метаболических маркировки РНК с photoactivatable и «активная» Нуклеозидные аналоги (которые содержат bioorthogonal функциональной группы, могут участвовать в нажмите реакции), 4 - thiouridine (4СУ) и 5-ethynyluridine (ЕС). Шаги, которые являются ключевыми для получения идеальных результатов с ЦАРСКОЕ стратегии являются эффективным метаболических маркировки, УФ реакции структурообразования и нажмите кнопку и поддержания целостности РНК. Потому что Cu(I), используется в качестве катализатора в нажмите реакции может привести к фрагментации РНК, Cu(I) лиганд, который может уменьшить фрагментацию РНК имеет важное значение. Мы опишем, как для выполнения эффективного нажмите реакции в lysates клетки не вызывая серьезной деградации РНК.
Хотя ОДП захвата и идентификации в клетки HeLa только описан в настоящем Протоколе, ЦАРСКОЕ стратегия может применяться для различных типов клеток и возможно для живых организмов. Помимо захвата ОДП этот протокол также обеспечивает упрощенные пошаговые процедуры для MS пробоподготовки и белка идентификации и количественной оценки, которая может быть полезна для тех, кто не знаком с proteomic экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Предупреждение: Когда это применимо, реагентов, используемых следует приобрести в виде свободных РНКазы или растворенных в РНКазы бесплатно, растворителей (в большинстве случаев, в диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды). При обработке образцов РНК и реагенты, RNase бесплатно, всегда надевайте перчатки и маски и изменить их часто, чтобы избежать загрязнения РНКазы.
1. Подготовка Lysate о метаболически помечены и УФ сшитого клетки
-
Метаболические включение ЕС и 4СУ
- Культура клетки HeLa в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C в атмосфере 5% CO2 . Культура ~ 4 x 107 НеЬа клетки (в два блюда 15-см) для подготовки экспериментальных или управлять для одного запуска MS стандартного образца.
- Когда культивируемых клеток HeLa достигают слияния ~ 80%, удалите питательной среды и добавить 15-мл подогретую свежей среды за 15-см блюдо.
- Добавить 15 мкл за блюдо 100 мм ЕС (растворяют в фосфат амортизированное saline (PBS)) до конечной концентрации 1 мм и 7,5 мкл за блюдо 4СУ 100 мм (растворяют в PBS) до конечной концентрации 0,5 мм для экспериментальных и noUV контрольных образцов. Добавьте 15 мкл за блюдо 100 мм ЕС (растворяют в PBS) в конечной концентрации 1 мм для no4SU-контрольных образцов.
Примечание: 4СУ фото активации; Таким образом требуется защита от света после добавления 4СУ. - Обложка блюда с фольгой и культура клетки для 16 х. Добавить половину суммы ЕС и 4СУ или только ЕС от шага 1.1.3 к экспериментальной, noUV- и no4SU-контрольных образцов, соответственно и культивирования для еще 2 ч.
-
В естественных условиях Сшивки УФ
- Удалите средство культуры, вымыть клетки 3 x с 5 мл PBS за блюдо, и удалить остаточные PBS насколько это возможно.
Примечание: Остаток жидкости позволит значительно уменьшить сшивки эффективность. - Для экспериментальных и no4SU-контрольных образцов, блюда на льду со снятой крышкой и излучают клетки с 365 Нм УФ света 2 Дж/см2 , крест-компоновщик УФ.
- Для образцов noUV управления поместите блюда на льду и защищать их от света.
Примечание: Все следующие шаги для noUV контрольных образцов должны быть выполнены в затемненной комнате.
- Удалите средство культуры, вымыть клетки 3 x с 5 мл PBS за блюдо, и удалить остаточные PBS насколько это возможно.
-
Лизис клеток и гомогенизации
- Добавить 1 мл на блюдо предварительно литического буфера (10 мм Tris∙HCl, рН 7,5, 50 мм LiCl, 0,02% Nonidet P-40 и Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-коктейль ингибитор протеазы бесплатно) в клетки. Очистить ячейки, используя погрузчик клеток резины и собирать предварительно лизис подвеска в 15 мл.
Примечание: Этот шаг будет разорвать клеточной мембраны и отпустить растворимых цитоплазматических белков и РНК. Не центрифуга трубки и удалить супернатант. - Для подвески из двух блюд 15см Отрегулируйте громкость до 6 мл, добавив предварительно литического буфера. Добавьте предварительно лизис подвеска равное количество R-литического буфера (200 мм Tris∙HCl, рН 7,5, 500 мм LiCl, 2% литий Додециловый сульфат [LDS]).
- Однородный lysate клетки путем передачи его через шприц с иглой узкий (27-G) несколько раз до lysate ясно и однородной. Инкубируйте lysate на 4 ° C с нежным вращения (~ 15 мин) за 1 ч.
Примечание: Этот последний шаг позволит полностью денатурации белков. Lysate могут безопасно храниться на-70 ° C на срок до одного месяца.
- Добавить 1 мл на блюдо предварительно литического буфера (10 мм Tris∙HCl, рН 7,5, 50 мм LiCl, 0,02% Nonidet P-40 и Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-коктейль ингибитор протеазы бесплатно) в клетки. Очистить ячейки, используя погрузчик клеток резины и собирать предварительно лизис подвеска в 15 мл.
-
Подготовка к реакции нажмите
- Разбавить lysate путем добавления 20 томов буфера для разведения (50 мм Tris∙HCl, рН 7,5) и разделите его на 15 мл фракций.
Примечание: Решения, содержащие высокую концентрацию соли и моющих средств поставит под угрозу эффективность Cu (I)-катализированное нажмите реакции; Таким образом буфер lysate должны быть изменены. - Концентрат каждой фракции с помощью трубки 15 мл ультрафильтрации (с молекулярной массой отсечки 10 кДа) до тома меньше, чем 1 мл. Используйте размахивая ведро ротор вращаться ультрафильтрации трубки на 4000 x g при 4 ° C на ~ 15 мин.
- Добавить 14 мл буфера для разведения в концентрированной lysate дроби и повторите шаг 1.4.2. Объединить фракций и сконцентрировать их объемом 6 мл ультрафильтрацией (4000 x g на 4 ° C на ~ 15 мин).
Примечание: Большинство из соли и теперь LDS будет быть удалены, поэтому lysate готовы к реакции нажмите. Lysate может храниться на-70 ° C до одной недели. Избегайте несколько циклов замораживания оттаивания, потому, что они приведут к значительной деградации РНК. Алиготе lysate если мелкие характеристики необходимы.
- Разбавить lysate путем добавления 20 томов буфера для разведения (50 мм Tris∙HCl, рН 7,5) и разделите его на 15 мл фракций.
2. подготовка проб для РНК interactome захват
-
Preclearing от lysate
- Добавить 100 мкл стрептавидина магнитные бусы на 6 мл lysate и осторожно поверните (~ 15 мин) за 30 мин при комнатной температуре для ликвидации естественно биотинилированным белки.
- Пелле бусины с помощью магнита (на ~ 20 минут при температуре 4 ° C) и передачи проверяться lysate к новой пробке.
-
Производительность нажмите реакции
- Подготовьте смесь реакции: 6,5 мкл акций (100 мм азид биотин растворяют в диметилсульфоксида [ДМСО] в конечной концентрации 100 мкм), биотин 3.25 мкл запасов меди (сделать его свежим; 1 M CuSO4 растворяют в воде в конечной концентрации 500 мкм) , 65 мкл лигандом запасов (200 мм THPTA растворяют в воде в конечной концентрации 2 мм) и 262.75 мкл H2O.
Примечание: THPTA означает трис [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) метил] аминов. - Добавьте в смесь реакции до 6 мл проверяться lysate и хорошо перемешайте. Затем, добавьте 162.5 мкл сокращения реагента (сделать свежий; 40 мг/мл натрий аскорбината в конечной концентрации 5 мм) в lysate и хорошо перемешайте. Окончательный объем должен быть 6,5 мл.
- Инкубируйте реакционную смесь втечение 2 ч при комнатной температуре на орбитальный шейкер (800 об/мин). Добавить 5 мм ЭДТА в реакционной смеси и проинкубируйте его на 5 минут, чтобы утолить реакции.
- Подготовьте смесь реакции: 6,5 мкл акций (100 мм азид биотин растворяют в диметилсульфоксида [ДМСО] в конечной концентрации 100 мкм), биотин 3.25 мкл запасов меди (сделать его свежим; 1 M CuSO4 растворяют в воде в конечной концентрации 500 мкм) , 65 мкл лигандом запасов (200 мм THPTA растворяют в воде в конечной концентрации 2 мм) и 262.75 мкл H2O.
-
Мелкие характеристики
- Подготовьте смесь реакции как шаг 2.2.1 с запасом биотина заменены краситель запасов (например, 100 мм азид Cy5 растворяют в ДМСО).
Примечание: Сумма Реагент должен корректироваться по объему lysate. 20 мкл Алиготе от lysate обычно достаточно для характеристики таких, как анализ флуоресценции в гель. - Добавьте в смесь реакции lysate и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре. Затем, добавьте одну треть объема буфера выборки LDS (4 x), денатурировать при 55 ° C за 5 мин и разрешить образец на бис трис гель 10%.
Примечание: Чтобы подтвердить, что сигнал флуоресценции представлена на РНК, включают элементы управления с пищеварением РНКазы A после щелчка реакции.
- Подготовьте смесь реакции как шаг 2.2.1 с запасом биотина заменены краситель запасов (например, 100 мм азид Cy5 растворяют в ДМСО).
-
Очистка реакционной смеси
- Добавьте восемь томов prechilled метанола (100%) закаленных реакционной смеси и Инкубируйте 30 мин при температуре-30 ° C для высыпания. Выполните осадков в 50-мл конические пробирок.
Примечание: Если общий объем превышает 50 мл, разделите смесь реакции на два 50-мл конические пробирок. - Подготовить воссоздание буфера: объединить один объем буфера A (4% натрия Додециловый сульфат [ПБ] и 10 мм ЭДТА) с восемь томов буфера B (Бридж-97, 150 NaCl и 50 мм триэтаноламин 1%, рН 7,4).
- Центрифуга на 4000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Добавьте ~ 1-2 мл метанола prechilled в гранулах. Пипетка вверх и вниз, чтобы сломать гранулы и убедитесь, что гранулы полностью приостановлены с без видимых куски. Заполните трубу с prechilled метанола. Повторите этот шаг 2 x.
- Центрифуга на 4000 x g 15 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Положил обратно, что трубы и центрифуги снова на 4000 x g 5 мин тщательно вытянуть остаточный метанол как можно больше не нарушая гранулы.
- Добавьте 10 мл буфера растворения гранул. Пипетка вверх и вниз до полного растворения гранул. Центрифуга на 4000 x g 10 мин при 4 ° C.
- Супернатант передать новой трубки. Соберите 20 мкл пример для контроля качества (см. раздел 4).
Примечание: Теперь образец готова для захвата РНК interactome. Восстановленный пример может храниться на-70 ° C до одной недели.
- Добавьте восемь томов prechilled метанола (100%) закаленных реакционной смеси и Инкубируйте 30 мин при температуре-30 ° C для высыпания. Выполните осадков в 50-мл конические пробирок.
3. РНК interactome захват
-
Подготовка стрептавидина агарозы бусины
- Учитывать 1600 мкл стрептавидина агарозы навозной жижи (800 мкл поселились бусы) на 10 мл восстановленный образца 15 мл конические пластиковых пробирок.
- Спин вниз бусины в 4000 x g для 5 минут тщательно удалить супернатант не нарушая поселились бусины.
- Вымойте бусины с 10 мл 50 мм Tris∙HCl (рН 7,5). Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант. Повторите этот шаг 2 x.
-
Сродство пулдаун
- Передать образец очищен и восстановленный из шага 2.4.6 стрептавидина агарозы бусины (см. шаг 3.1). Инкубируйте на ночь с нежным вращения при 4 ° C.
-
Мойка из бисера стрептавидина
- Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и передать новой трубки супернатант. Соберите 20 мкл пример для контроля качества.
- Вымойте бусины с 10 мл буфера мытья (2% SDS в PBS, рН 7,4). Проинкубируйте втечение 10 мин с нежным вращения (~ 12 мин) при комнатной температуре. Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант. Повторите 1 x.
- Повторите шаг 3.3.2 с мыть буфера B (8 M мочевины и 250 мм NH4HCO3 растворяется в воде). Повторите шаг 3.3.2 с мыть буфера C (2,5 М NaCl в PBS, рН 7,4). Затем вымойте бусины с 10 мл 50 мм Tris∙HCl (рН 7,5). Спин вниз бусины (4000 x g 5 мин) и удалить супернатант.
- Сплит бисера равномерно и передавать их на 2 пробки microcentrifuge 1,5 мл.
-
Элюирующий захватили RNPs
- Подготовить биотин Элюирующий буфер: биотин 12,5 мм, 75 мм NaCl, 7,5 Tris∙HCl (рН 7,5), 1,5 мм ЭДТА, 0,15% SDS, sarkosyl 0,075% и Дезоксихолат натрия 0,02%.
Примечание: Магазин буфера при комнатной температуре, биотина может осадить при 4 ° C. - Для 400 мкл промывают поселились бусы добавьте 400 мкл буфера биотин.
- Инкубируйте их на орбитальный шейкер (1500 об/мин) при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем инкубировать на орбитальный шейкер с блоком тепла (1500 об/мин, 65 ° C) для 10 min. спин вниз бусины (7800 x g 1 мин) и собирать eluted RNP.
- Бисер добавить 400 мкл буфера свежие биотина и повторите шаг 3.4.3. Объединить два elutes в одну трубу 15-мл.
- Подготовить биотин Элюирующий буфер: биотин 12,5 мм, 75 мм NaCl, 7,5 Tris∙HCl (рН 7,5), 1,5 мм ЭДТА, 0,15% SDS, sarkosyl 0,075% и Дезоксихолат натрия 0,02%.
-
РНКазы пищеварение
- Добавьте три тома буфера для разведения eluted RNP уменьшить концентрацию SDS. Концентрат разреженных образца с помощью ультрафильтрации 0,5 мл трубки (с молекулярной массой отсечки 10 кДа; спина на 12000 x g при 4 ° C ~ 30 мин) до ~ 40 мкл.
- Добавить 0,5 мкг/мкл РНКазы A и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C выпустить ОДП из сшитого РНК. Сбор 2 мкл ОДП для контроля качества (см. раздел 4).
4. контроль качества
-
Контроль эффективности пулдаун сходства
- Возьмите 10 мкл «до пулдаун» образца 2.4.6 и 10 мкл шаг «после пулдаун» образца из шага 3.3.1.
- Анализ образцов, с использованием стандартной западной помарке процедур (10% бис трис гель).
- Пятно винилидена фторида (PVDF) мембраны с стрептавидина ПХ конъюгата контролировать остаток биотина сигналы «после пулдаун» образца.
Примечание: Если сигнал биотина образца «после пулдаун» больше чем одной-пятой сигнала «до пулдаун» образца, увеличьте количество стрептавидина агарозы бусы, используемые на шаге 3.1.1.
-
Контроль эффективности общего захвата
- Возьмите 2 мкл выпустила ОДП образца от шаг 3.5.2 и 0,5 мкл образца «до пулдаун» (как 0.1% Ввод) с шагом 2.4.6.
- Анализ образцов, с использованием стандартных процедур окрашивания серебра.
- Исправьте гель с фиксации буфера (40% этанола, 10% уксусной кислоты) за 20 мин, затем сенсибилизации (13 мм2S Na2O3, ацетат натрия 83 мм, 30% этиловом спирте) за 30 мин.
- Промойте гель 3 x с водой на 5 мин и затем, выведение его с 15 мм AgNO3 решение для 20 мин мыть гель 2 x с водой для 1 мин, развивать его в 0,24 М Na2CO3 и 0,012% формальдегида и прекратить с 45 мм ЭДТА, когда окрашивание suffici ent.
Примечание: Интенсивность окрашивания серебра захваченных ОДП должна быть аналогична ввода 0,1%.
5. Подготовка образцов для MS
-
Пищеварение трипсина захваченных ОДП в гель 28
- Добавьте одной четвертой объема буфера выборки SDS (5 x) выпустила ОДП образцы из шага 3.5.2. Денатурируйте образца на 95 ° C в течение 10 мин.
- Разрешить ОДП на геле полиакриламида SDS 10% 1,5 мм.
- Пятно гель с серебром, следующие стандартные протоколы.
- Акцизный Лейн экспериментального образца или образца управления с штабелируя гель и основные группы РНКазы (~ 15 кДа) удалены.
- Подакцизным Лейн мелко нарежьте (~ 1-1,5 мм x ~ 1-1,5 мм).
Примечание: Короткий край гель кусок должен быть не короче, чем 1 мм для предотвращения засорения в пипетку советы. - Передача части гель пробки microcentrifuge и Отмойте с минигелей буфера (смесь равных объемов 100 мм Na2S2O3 и 30 мм K3[Fe(CN)6]).
- Промойте гель куски бикарбонат аммония 200 мм (ABC) до абсолютно бесцветный гель штук.
- Обезвоживает гель куски в 1 мл аккуратные Ацетонитрил (АКС). Увлажняет с 200 мкл 10 мм Дитиотреитол (растворяют в 50 мм ABC) и Инкубируйте на 56 ° C на 45 мин.
Примечание: Полностью обезвоженный гель частей должна быть очень сложной и непрозрачной. Если по-прежнему мягкие куски гель после обезвоживания, удалите АКС и добавьте 1 mL аккуратные ACN к обезвоживанию снова. - Охладить гель штук до комнатной температуры. Добавить 200 мкл iodoacetamide 58 мм (растворяют в 50 мм ABC) и инкубации при комнатной температуре 45 мин в темноте.
- После краткого мыть с водой обезвоживает гель куски в 1 мл аккуратные АКС.
Примечание: Гель кусочки должны быть полностью обезвоженная. - Увлажняет гель штук с соответствующим количеством 10 нг/мкл трипсина (растворяют в 50 мм ABC) и инкубировать при 37 ° C для 12-16 ч.
Примечание: Куски гель следует полностью Регидратированные без непрозрачной ядер. Удалите любой избыток жидкости.
-
Стабильных изотопов диметил маркировки переваривается пептидов 29
- Экстракт переваривается пептиды из кусочков гель, добавив 200 мкл буфера извлечения (Муравьиная кислота 5% и 50% АКС в воде) и проинкубируйте при 37 ° C за 30 минут с vortexing (на 1200 об/мин).
- Повторите шаг 5.2.1 2 x. Объединить экстрактов в одну трубу microcentrifuge.
- Сухие извлеченные пептиды вакуумной центрифугированием.
- Воссоздать пептидов в 200 мкл бикарбоната triethylammonium 100 мм (СТОС, рН 8,5).
Предупреждение: Шаги 5.2.4 - 5.2.6 следует выполнять на льду в зонта. - Добавьте 8 мкл 4% CH2O и 8 мкл 4% 13CD2O в экспериментальных и контрольных образцов, соответственно.
Примечание: Для управления предвзятости стабильных изотопов маркировки, своп стабильных изотопов для экспериментальных и контроль образцов других биологически независимо реплицировать. - Добавить 8 мкл 0,6 М NaBH3CN (сделать его свежие) и хорошо перемешать.
- Проинкубируйте образцы при комнатной температуре за 1 час с vortexing.
- Охладить образцы на льду. Утолите реакции, добавив 32 мкл 1% водного раствора аммиака. Затем Далее утолите реакции, добавив 16 мкл муравьиной кислоты.
- Объедините экспериментальный образец с образцом из соответствующего управления в одном пробки microcentrifuge. Сухие образцы вакуумной центрифугированием.
-
Фракционирование диметил меченых пептидов
- Подготовьте остановить и го добыча советы (StageTips)30.
- Вставьте наконечник 10-мкл Расширенный Длина, C18 мембраны.
- Добавьте 300 мкг высоком рН C18 бисера приостановлено в АКС до кончика.
- Место кончике upright в microcentrifuge трубки с домашним стойку, которые могут стабилизировать кончик и поднимите кончик от дна.
- Вращайте кончик на 1400 x g на 2 мин отклонения потока через.
- Вымойте кончик с 50 мкл 80% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
Примечание: Регулировка рН раствора 10 мм ABC, добавив 28% Окисоводопод аммония. - Вымойте кончик с 50 мкл 50% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
- Вымойте кончик с 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
- Воссоздать пептидов в 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0).
- Добавьте восстановленный пример подготовленный наконечник. Перезагрузите потока через наконечник для обеспечения эффективного пептид привязки.
- Вымойте кончик с 50 мкл 10 мм ABC (рН 10,0). Повторите 1 x.
- Элюировать пептида поэтапная 12 фракций с 50 мкл 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% и 6% АКС в 10 мм ABC (рН 10,0).
- Объединить две дроби с равным интервалом (фракция 1 с 7, 2 с 8, и так далее) чтобы получить шесть расход дроби.
- Сухие образцы вакуумной центрифугированием. Сушеные пептиды могут храниться при температуре-30 ° C.
- Подготовьте остановить и го добыча советы (StageTips)30.
6. производительность MS и анализа данных
-
Пептид анализ по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии
- Воссоздать сушеные пептидных фракций от шага 5.3.7 в 15 мкл воды, содержащие 0,1% муравьиной кислоты. Проверьте pH восстановленный пептиды, пятнистость 1 мкл раствора на полосе pH (pH следует до 3 лет).
- Inject воссоздать образца в столбце жидкостной хроматографии (LC). Применить соответствующий градиент растворителя (растворитель, который A является вода, содержащие 0,1% муравьиной кислоты, растворитель B ACN, содержащие 0,1% муравьиной кислоты) в высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Типичный градиент растворителя B является следующим: 5% - 35% в 40 мин; 35% - 70% в 4 мин; и в 75% за 10 мин.
- Ионизировать eluted пептиды, электроспрей и эксплуатации масс-спектрометр в зависящих от данных режиме. Выбор 15 самых распространенных ионов (умножить заряженных: 2 +, 3 + или выше) в первоначальной MS сканировать тандемные масс-спектрометрия (МС/МС) сканирования (столкновения индуцированной диссоциации, CID). Установите размер динамического исключения 500 с максимальная продолжительность 25 s.
-
Белка идентификация и количественная оценка с использованием MaxQuant 31
- Установите частоту ложных обнаружения (ФДР) идентификации белков 0,01 и задать количество уникальных пептиды 2 в целях повышения точности и надежности.
- Минимальный набор необходимых рассчитывает коэффициент (уникальный + бритва) для количественной оценки белков до 2 и включить повторно количественно и матч между запусками функций.
-
Обогащение значение оценки с использованием Лимма пакет R/Bioconductor 32
- Выполнение управляемых t-тест, Реализовано Лимма для тестирования изменений Log2-раза против zero из по меньшей мере три биологических реплицирует. Используйте функцию read.table для чтения таблицы данных. Затем используйте функции lmFit и eBayes для установки данных. Используйте функцию topTable для экспорта результатов вычислений (включая усредненное изменение Log2-фолд и значения P ).
- Исправьте значения P с помощью метода Benjamini – Хёхберг для контроля ФДР.
- Примените ФДР 0.01 для создания списка белков, значительно обогатили в экспериментальных образцов. Задайте частоту среза двух - или три изменения для дальнейшего управления ложных срабатываний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель результаты контроля качества шаги представлены. Результаты включают показатели анализа флуоресценции в гель, описанный в шаге 2.3.2 (рис. 1), Западный анализ помаркой описано в шаге 4.1.3 (рисунок 2A) и Серебряный пятнать анализа, описанный в шаге 4.2.2 (рис. 2B). Меры контроля качества важны для оптимизации ЦАРСКОЕ протоколов. Всегда включайте контроль качества при подготовке широкомасштабных экспериментов идентификации ОДП.
Рисунок 1: гель флуоресценции анализ образцов нажмите кнопку с надписью, описанные в шаге 2.3.2. (A) этой группы показывает типичный в гель флуоресценции шаблон, нажмите кнопку с надписью образцов. Только в вдвойне помечены примере группа сильных мазка на высокой молекулярной массой (> 250 кДа), который представляет сигнал сшитого RNPs. Чтобы отменить сигнал RNP, опустите 4СУ или ЕС или дайджест с РНКазы а. Фон острые полосы на более низкой молекулярной массой представляют сигналы неспецифических белков с надписью. (B) в некоторых случаях, может наблюдаться сильные смазывают группы (~ 130-250 кДа) в образце no4SU-управления. Эта группа представляет собой сигнал помечены uncross-связанных РНК, которые будет ухудшаться во время тепловой денатурации, в большинстве случаев. Он не будет мешать последующих процедур. CBB = Кумасси синий блестящий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: контроль качества сродства пулдаун эффективности и захватили ОДП. (A) Эта панель показывает Западный анализ помаркой биотина сигналов в образцах до пулдаун (вход) и в образцах после пулдаун (супернатант). Оценить отношение остальных сигналов и оптимизировать шарик сумму, используемые на шаге 3.1.1. (B) Эта группа показывает серебряный пятнать анализа захваченных ОДП, по сравнению с 0,1% ввода общего белка. Для клетки HeLa общий всего улавливания является ~0.05% - 0,1% ввода белков. Это значение может значительно отличаться из-за дисперсии метаболической эффективности маркировки различных типов клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: результаты представитель МС CARIC. (A) Эта панель показывает вулкан сюжет отображения среднем Log2-фолд изменить и скорректировать значения P количественных белков, вычисленное пакетом Лимма. 597 белков с Log2-фолд изменение > 2 и скорректированное значение P < 0,01 были классифицированы как «ЦАРСКОЕ ОДП». (B) Эта группа показывает перекрытие ЦАРСКОЕ белков с ранее выявленных человека poly(A) ОДП7,8,9,10,11. Перекрытые белки главным образом кодирования ОДП, в то время как остальная часть ЦАРСКОЕ ОДП с большей вероятностью некодирующих ОДП. Эта цифра является перепечатано из ранее опубликованных работ с разрешения Национальной академии наук27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сохранение целостности ярмарка РНК является одним из ключей к успешной ЦАРСКОЕ экспериментов. С соответствующие лигандами Cu(I) и тщательной работы деградация РНК может быть значительно меньше, хотя наблюдалось частичной деградации. Коэффициенты замещения ЕС и 4СУ в экспериментальных образцов, 1,18% и 0,46%, соответственно (данные не показаны). Для нетронутыми РНК с длиной 2000 nt, ~ 90% РНК содержат по крайней мере один из ЕС и один 4СУ. Для частично деградировавших РНК с длиной 1000 nt, ~ 70% РНК содержат по крайней мере один из ЕС и один 4СУ. Таким образом частичной деградации РНК не резко снизить эффективность CARIC, тогда как серьезной деградации не является приемлемым.
Еще один важный шаг — шаг 1.4, подготовка нажмите реакции. Cu (I)-нажмите катализируемой реакции на РНК чувствительны к концентрации LDS. Высокая концентрация LDS (> 0,1%) приведет к уменьшению маркировки сигналов на ЕС содержащие РНК и увеличение фонового сигналов на белки (данные не показаны).
В дополнение к ЕС CARIC также совместим с другими интерактивными нуклеозидов, таких как алкинилфосфонатов и azido аналогов аденозин33,34,35,36. Однако применение CARIC существенно ограничена метаболические эффективность неестественным интерактивными нуклеозидов в биологической системе интерес. Поэтому прежде чем выполнять CARIC, используя условия, отличные от тех, кто продемонстрировал в этом протоколе, всегда проверяйте метаболических маркировки энергоэффективности (например, путем флуоресцентных изображений).
Недавно аналогичная стратегия под названием Рик (захват недавно транскрипции РНК interactome с помощью клик-химия), которая включает в себя только ЕС для обозначения всего РНК и использует 254 Нм УФ перекрестные ссылки РНК и белков, был сообщил37. В частности 254 Нм УФ может активировать все четыре природных нуклеозидов, а также ЕС. Таким образом 254 Нм УФ облучение может перекрестные ссылки бесплатно ЕС и его метаболитов (например, ЕС фосфаты) с соответствующей связывания белков, которые должны быть приняты во внимание в качестве возможных ложных срабатываний.
Один интригующий CARIC применяется для выявления ОДП в бактерии, чьи РНК в основном не polyadenylated. Крупномасштабные идентификации ОДП обеспечит бесценными ресурсами для понимания молекулярные основы посттранскрипционного правил в бактерии38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается национальные естественные науки фонд из Китая грантов 91753206, 21425204 и 21521003 и Национальный исследовательский ключ и 2016YFA0501500 развития проекта.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HeLa | ATCC | ||
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
- Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
- Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
- Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
- Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
- Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
- Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
- Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
- Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
- Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
- Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
- Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
- Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
- Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
- Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
- Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
- Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
- Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
- Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
- Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
- Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
- Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
- Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , Published online (2018).