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Biochemistry

利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/58580
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2,3,4,5
1College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center, Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

本文介绍了应用单击化学辅助 RNA-路特捕获 (无花果) 策略来识别与编码和非编码 rna 结合的蛋白质的详细协议。

Abstract

RNA 结合蛋白 (限制性商业惯例) 的综合鉴定是了解细胞转录后调控网络的关键。一种广泛使用的策略, 用于限制性捕获利用酸化 [聚 (a)] 的靶 rna, 这主要发生在真核成熟 mRNAs, 留下大多数非聚 (A) rna 的结合蛋白不明。在这里, 我们描述了一个最近报告的方法称为单击化学辅助 RNA-路特捕获 (无花果) 的详细过程, 这使转录组范围捕获的聚 (a) 和非聚 (a) 限制性商业惯例的代谢标签结合rna,体内UV 交联, 和叠标记。

Introduction

人类基因组转录成各种类型的编码和非编码 rna (非编码 rna), 包括 mRNAs、rRNAs、tRNAs、小核 rna (snRNAs)、小核仁 rna (snoRNAs) 和长非编码 rna (lncRNAs)1。大多数 rna 具有限制性商业惯例的服装和功能作为核糖颗粒 (RNPs)2。因此, 限制性商业惯例的综合识别是了解 rna 和限制性商业惯例之间的调控网络的先决条件, 这是涉及各种人类疾病3,4,5。

过去几年见证了限制性商业惯例在各种真核系统2,6, 包括人类7,8,9,10,11中发现的巨大的促进作用,鼠标12,13,14, 酵母9,15,16, 斑马鱼17,果蝇18,19,线虫线虫16,拟南芥20,21,22, 和人类寄生虫23,24,25.这些进步是由城堡等开发的一个限制性的捕获策略促进。7和巴尔茨等。8在 2012年, 它结合了在体内UV 交联的 RNA 及其相互作用的蛋白质, 寡核苷酸 (dT) 捕获聚 (A) rna 和质谱 (MS) 基于蛋白质组分析。然而, 鉴于聚 (a) 多数存在于成熟的 mRNAs 上, 它仅占真核转录组26的 3%-5%, 这种广泛使用的策略无法捕获与非聚 (A) rna 的限制性商业惯例交互, 包括大多数非编码 rna和预 mRNAs。

在这里, 我们报告了一个最近制定的战略的详细程序, 以转录组全捕获的聚 (a) 和非聚 (a) 限制性商业惯例27。被称为无花果, 这种策略结合体内UV 交联和 rna 代谢标记与光敏和 "可点击的" 核苷类似物 (其中包含一个叠功能组, 可以参与点击反应), 4-thiouridine (4SU) 和 5-ethynyluridine (EU)。通过无花果策略获得理想结果的关键步骤是有效的代谢标记、UV 交联和点击反应以及 RNA 完整性的维护。因为 cu (i) 作为催化剂在单击反应可能导致 rna 碎片, 一个 Cu (i) 配体, 可以减少 RNA 碎片是必不可少的。我们描述如何在细胞裂解液中执行高效的单击反应, 而不会导致严重的 RNA 降解。

虽然在 HeLa 细胞中的限制性捕获和鉴定仅在本协议中描述, 无花果策略可应用于各种细胞类型和可能的生物体。除了限制性捕获, 该协议还提供了简化的分步过程, 用于 MS 样品制备和蛋白质鉴定和定量, 这对于那些不熟悉蛋白质组实验的人是有帮助的。

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Protocol

注意: 在适用的情况下, 使用的试剂应以无 rna 的形式购买, 或在无核糖核酸酶中溶解, 溶剂 (大部分为酯二乙酯 (DEPC) 处理的水)。在处理 RNA 样品和无核糖核酸酶试剂时, 务必戴上手套和口罩, 并经常更换, 以避免核糖核酸酶污染。

1. 代谢标记和 UV 交联细胞裂解物的制备

  1. 欧盟和4SU 的代谢合并
    1. 杜尔贝科的改良鹰培养基 (DMEM) 中培养的 HeLa 细胞, 辅以10% 胎牛血清 (FBS)、100毫升青霉素和100微克/毫升链霉素, 37 摄氏度, 5% CO2大气。培养约 4 x 107 HeLa 细胞 (在两个15厘米的盘子) 为一个标准 MS 运行准备一个实验或控制样本。
    2. 当培养的 HeLa 细胞达到约80% 汇合, 去除培养基和添加15毫升的预热新鲜培养基每15厘米的菜。
    3. 添加15微升每盘100毫米欧盟 (溶解在磷酸盐缓冲盐水 (PBS)) 到最终浓度1毫米, 和7.5 微升每盘的100毫米 4SU (溶解在 PBS) 到最终浓度0.5 毫米的实验和 noUV 控制样品。添加15微升每碟100毫米欧盟 (溶解在 PBS) 到最终浓度1毫米的 no4SU-control 样品。
      注: 4SU 为照片可激活;因此, 需要在添加4SU 后保护光线。
    4. 用铝箔和培养基覆盖盘子16小时. 将欧盟和4SU 或仅欧盟的一半从步骤1.1.3 增加到实验、noUV 和 no4SU-control 样本, 并继续培养2小时。
  2. 体内UV 交联
    1. 除去培养基, 用5毫升的 pbs 每碟洗涤细胞 3x, 并尽可能去除残留 pbs。
      注: 残留液体将显著降低交联效率。
    2. 对于实验和 no4SU-control 样品, 将盘子放在冰上, 取下盖子, 用 uv 交叉链接器将 365 nm 紫外光照射在 2 J/厘米2的细胞上。
    3. 对于 noUV 样品, 把盘子放在冰上, 保护它们免受光线的影响。
      注意: 所有以下步骤的 noUV 控制样品应在黑暗的房间里执行。
  3. 细胞裂解和均质化
    1. 每盘添加1毫升预裂解缓冲液 (10 mm Tris∙HCl、pH 7.5、50 mM 氯化锂、0.02% Nonidet P-40 和乙酸酸 (EDTA) 无蛋白酶抑制剂鸡尾酒) 到细胞。使用橡胶细胞升降器刮去细胞, 并在15毫升管中收集预裂解悬浮液。
      注意: 此步骤将打破细胞膜和释放可溶性细胞质蛋白和 rna。不要离心管并移除上清液。
    2. 从两个15厘米的盘子中悬挂, 通过添加预裂解缓冲液调节音量至6毫升。加入预裂解悬浮液等量的 R 裂解缓冲液 (200 mm Tris∙HCl, pH 7.5, 500 mm 氯化锂, 2% 烷基硫酸锂 [LDS])。
    3. 通过注射器通过一个窄针 (27 克) 数次, 直到裂解物是清楚和均匀的, 使细胞裂解液匀质。在4摄氏度孵育裂解液, 轻柔旋转 (约 15 rpm), 1 h。
      注意: 最后一步将允许蛋白质的完全变性。裂解液可安全储存在-70 摄氏度, 长达一个月。
  4. 单击反应准备
    1. 通过添加20卷稀释缓冲液 (50 mM Tris∙HCl, pH 7.5) 稀释裂解物, 并将其分成15毫升的馏分。
      注: 含有高浓度盐和洗涤剂的溶液将损害 Cu (I) 催化的点击反应的效率;因此, 必须更改裂解液的缓冲器。
    2. 使用15毫升超滤管 (分子量截止率为 10 kDa) 浓缩每个分数, 直到体积小于1毫升。使用摆动铲斗转子将超滤管在 4000 x g处旋转4摄氏度, 以实现15分钟。
    3. 将14毫升稀释缓冲液添加到浓缩裂解物馏分中, 重复步骤1.4.2。组合的分数和集中他们到6毫升的超滤量 (4000 x g在4摄氏度为 ~ 15 分钟)。
      注意: 大多数盐和 LDS 现在都将被移除, 因此裂解液已准备好进行点击反应。裂解液可储存在-70 摄氏度, 长达一周。避免多次冻融循环, 因为它们会导致显著的 RNA 降解。如果需要小尺度表征, 等分裂解液。

2. RNA 路特捕获样品的制备

  1. 裂解液的 Preclearing
    1. 每6毫升裂解液添加100微升链霉素磁珠, 在室温下轻轻旋转 (约 15 rpm), 以消除自然生物素化蛋白。
    2. 使用磁铁 (在4摄氏度时为20分钟) 颗粒珠子, 并将 precleared 裂解液转移到新管上。
  2. 单击反应的性能
    1. 准备反应混合物: 6.5 微升的生物素库存 (100 毫米叠氮化物生物素溶于二甲基亚砜 [DMSO] 在最后浓度100微米), 3.25 微升铜库存 (使其新鲜; 1 M 丘索4溶解在水中最终浓度为500微米), 65 微升的配体库存 (200 毫米 THPTA 溶解在水中的最后浓度2毫米), 和262.75 微升的 H2O。
      注: THPTA 代表三 [(1-羟丙基-1 h-12, 3-triazol-4 基) 甲基] 胺。
    2. 将反应混合物添加到6毫升的 precleared 裂解液中, 混合均匀。然后, 添加162.5 微升的还原试剂 (使其新鲜; 40 毫克/毫升抗坏血酸钠在最终浓度5毫米) 到裂解液和混合好。最后一卷应为6.5 毫升。
    3. 在室温下, 在一个轨道振动筛 (800 rpm) 孵育2小时的反应混合物。在反应混合物中加入5毫米 EDTA, 孵育5分钟以淬火反应。
  3. 小尺度表征
    1. 准备反应混合物如在步骤2.2.1 与生物素的股票取代染料库存 (例如, 100 毫米 azide-Cy5 溶解在 DMSO)。
      注: 试剂用量应根据裂解物的体积调整。通常, 裂解液的20微升等分足以用于表征, 如凝胶荧光分析。
    2. 将反应混合物添加到裂解液中, 在室温下孵育2小时。然后, 添加1/3 的 LDS 样本缓冲区 (4x) 的体积, 变性它在55摄氏度5分钟, 并解决样品在10% 双三凝胶。
      注意: 要确认荧光信号是在 rna 上显示的, 请在单击反应后加入核糖核酸酶的控制。
  4. 反应混合物的清洗
    1. 将八体积的 prechilled 甲醇 (100%) 添加到淬火反应混合物中, 在-30 摄氏度下孵育30分钟, 沉淀。在50毫升锥形离心管中进行沉淀。
      注: 如果总容积大于50毫升, 将反应混合物分成两个50毫升锥形离心管。
    2. 准备重构缓冲液: 将一卷缓冲液 A (4% 硫酸钠 [SDS] 和10毫米 EDTA) 与八个缓冲液 B (1% Brij-97、150 mm 氯化钠和 50 mm 三乙醇胺、pH 7.4) 相结合。
    3. 离心在 4000 x g 15 分钟在4摄氏度和放弃上清。将 1-2 毫升的 prechilled 甲醇添加到颗粒中。移液器上下, 以打破颗粒, 确保颗粒完全悬浮, 没有可见区块。用 prechilled 甲醇填充管子。重复此步骤2x。
    4. 离心在 4000 x g 15 分钟在4摄氏度和放弃上清。将管子和离心机重新放回 4000 x g , 5 分钟. 仔细抽出剩余甲醇尽可能不干扰颗粒。
    5. 将10毫升的重构缓冲液添加到颗粒中。移液器向上和向下溶解颗粒。离心 4000 x g , 10 分钟, 4 摄氏度。
    6. 将上清液转移到新管上。收集20微升样品进行质量控制 (见第4节)。
      注意: 现在, 样品已准备好进行 RNA 路特捕获。重组后的样品可存储在-70 摄氏度, 长达一周。

3. RNA-路特捕获

  1. 链霉素-琼脂糖珠的制备
    1. 每10毫升的重组样品, 以1600微升的链霉素-琼脂糖浆 (800 微升沉淀珠) 为15毫升锥形离心管。
    2. 将珠子向下旋转 4000 x g , 5 分钟. 小心移除上清液, 而不会干扰已沉淀的珠子。
    3. 用10毫升50毫米 Tris∙HCl (pH 7.5) 清洗珠子。旋下珠子 (4000 x g 5 分钟) 并移除上清液。重复此步骤2x。
  2. 亲和力下拉
    1. 将清理和重组样品从步骤2.4.6 转移到链霉素-琼脂糖珠 (参见步骤 3.1)。在4摄氏度轻柔旋转的夜间孵育。
  3. 链霉素珠的洗涤
    1. 旋下珠子 (4000 x g 5 分钟) 并将上清液转移到新管上。收集20微升样品进行质量控制。
    2. 用10毫升洗涤缓冲液 (PBS 中 2% SDS, pH 7.4) 洗涤珠子。在室温下孵育10分钟, 轻柔旋转 (约 12 rpm)。旋下珠子 (4000 x g 5 分钟) 并移除上清液。重复1x。
    3. 重复步骤3.3.2 与洗涤缓冲液 B (8 米尿素和250毫米 NH4HCO3溶于水)。重复步骤3.3.2 与洗涤缓冲液 C (2.5 M 氯化钠在 PBS, pH 7.4)。然后, 用10毫升的50毫米 Tris∙HCl (pH 7.5) 清洗珠子。旋下珠子 (4000 x g 5 分钟) 并移除上清液。
    4. 均匀地拆下珠子, 将它们转移到两个1.5 毫升的微量离心管上。
  4. 被捕获的 RNPs 的洗脱
    1. 制备生物素洗脱缓冲液: 12.5 mm 生物素、75 mm 氯化钠、7.5 mM Tris∙HCl (pH 7.5)、1.5 mM EDTA、0.15% SDS、0.075% sarkosyl 和0.02% 脱氧胆酸钠。
      注: 储存在室温下的缓冲液, 生物素可能沉淀在4摄氏度。
    2. 到400微升的水洗沉淀珠, 加入400升生物素洗脱缓冲液。
    3. 在室温下将它们孵育到轨道振动筛 (1500 rpm), 20 分钟。然后, 在带有热块的轨道振动筛上孵育 (1500 rpm, 65 °c) 10 分钟. 旋下珠子 (7800 x g 1 分钟) 并收集洗脱的 RNP。
    4. 对珠子, 加入400微升的新鲜生物素洗脱缓冲液和重复步骤3.4.3。将两个洗脱组合成一个15毫升的管子。
  5. 核糖核酸酶消化
    1. 在洗脱 RNP 添加三卷稀释缓冲液, 降低 SDS 浓度。使用0.5 毫升超滤管浓缩稀释样品 (分子量截止为 10 kDa; 旋转 1.2万 x g , 4 摄氏度, 约30分钟) 至 ~ 40 微升。
    2. 加入0.5 微克/微升核糖核酸酶 A 并孵育 2 h 在37摄氏度, 以释放限制性商业惯例从交叉链接 rna。收集2微升的限制性商业惯例进行质量控制 (见第4节)。

4. 质量控制

  1. 亲和力下拉效率的控制
    1. 采取10微升的 "前下拉" 样品从步骤2.4.6 和10微升的 "后下拉" 样品从步骤3.3.1。
    2. 使用标准的西方印迹程序 (10% 双三凝胶) 分析样品。
    3. 用链霉素-HRP 共轭法对聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜进行染色, 以监测 "后下" 样品的残留生物量信号。
      注: 如果 "后下拉" 样品的生物素信号大于 "前下拉" 样品信号的 1/5, 增加步骤3.1.1 中使用的链霉亲和糖珠的用量。
  2. 控制总捕获效率
    1. 采取从步骤3.5.2 和0.5 微升的 "前下拉" 样品 (作为0.1% 输入) 从步骤 2.4.6 2 微升的发布的限制性样品。
    2. 使用标准银染色程序分析样品。
      1. 用固定缓冲液 (40% 乙醇, 10% 乙酸) 固定凝胶, 20 分钟后进行敏化处理 (13 mM Na2S2O3, 83 mM 醋酸钠, 30% 乙醇) 30 分钟。
      2. 将凝胶3x 用水冲洗5分钟, 然后用15毫米的阿加诺3溶液对其进行染色, 20 分钟. 将凝胶2x 用水冲洗1分钟, 在 0.24 M Na2CO3和0.012% 甲醛中开发, 并在染色时以 45 mm EDTA 终止 sufficient.
        注: 捕获的限制性商业惯例的银染强度应与0.1% 输入的亮度相似。

5. 制备 MS 样品

  1. 捕获限制性商业惯例的凝胶胰蛋白酶消化28
    1. 将1/4 卷 SDS 样本缓冲器 (5x) 添加到步骤3.5.2 中已发布的限制性样品样本中。在95摄氏度变性样品10分钟。
    2. 解决限制性商业惯例1.5 毫米 10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
    3. 用银色染色凝胶, 遵循标准协议。
    4. 将实验样品或控制样品的车道与堆叠凝胶和核糖核酸酶 A (约 15 kDa) 的主要波段移除。
    5. 将切除后的车道切成小块 (约 1-1.5 毫米 x ~ 1-1.5 毫米)。
      注意: 凝胶片的最短边缘应不小于1毫米, 以防止移液器吸头堵塞。
    6. 将凝胶件转移到微量离心管和脱色与脱色缓冲液 (等于体积的100毫米 Na2S2O3和30毫米 K3[Fe (CN)6]) 的混合物。
    7. 用200毫米碳酸氢钠 (ABC) 清洗凝胶片, 直到凝胶片完全无色。
    8. 在1毫升的整齐乙腈 (华置) 中脱水凝胶片。水化与200微升10毫米 dithiothreitol (溶解在50毫米 ABC) 和孵育在56摄氏度为45分钟。
      注: 完全脱水的凝胶件应非常坚硬和不透明。如果凝胶件在脱水后仍保持柔软, 请取出华能, 再加入1毫升的净华置再脱水。
    9. 将凝胶片冷却至室温。加入200微升58毫米 iodoacetamide (溶于50毫米 ABC), 在室温下孵育45分钟在黑暗中。
    10. 用清水洗净后, 将凝胶片脱水1毫升的净华华。
      注: 凝胶件必须完全脱水。
    11. 用适量的 10 ng/微升胰蛋白酶 (溶于50毫米 ABC) 补充凝胶片, 在37摄氏度孵育 12-16 h。
      注: 凝胶件应完全水化, 无不透明芯。除去多余的液体。
  2. 消化肽的稳定同位素二甲基标记29
    1. 通过加入200微升的萃取缓冲液 (5% 甲酸和50% 华置水), 在37摄氏度孵育30分钟, 用涡旋 (1200 rpm), 从凝胶片中提取消化肽。
    2. 重复步骤 5.2.1 2x。将提取物组合成一个微量离心管。
    3. 通过真空离心干燥萃取的多肽。
    4. 在200微升的100毫米铵缓冲液碳酸氢钠 (TEAB, pH 8.5) 重组肽。
      警告: 步骤 5.2.4-5.2.6 应在冰上执行在烟雾罩。
    5. 分别将8微升的4% 通道2o 和8微升的 4% 13CD2o 添加到实验和控制样本中。
      注意: 为了控制稳定同位素标记的偏置, 可将稳定同位素交换到其他生物独立复制的实验和控制样本中。
    6. 添加8微升 0.6 M NaBH3CN (使其新鲜) 和混合良好。
    7. 用涡旋在室温下孵育样品1小时。
    8. 在冰上冷却样品。加入32微升1% 氨水溶液, 淬火反应。然后, 加入16微升甲酸, 进一步淬火反应。
    9. 将实验样品与相应的控制样品组合成一个微量离心管。通过真空离心干燥样品。
  3. 二甲基标记肽的分馏
    1. 准备停止和 go 萃取技巧 (StageTips)30。
      1. 将 C18 膜插入延伸长度的10微升尖端。
      2. 添加300微克的高 pH C18 珠悬浮在华置到尖端。
      3. 将尖端直立在微量离心管中, 用自制的机架, 可以稳定尖端并将尖端从底部提起。
      4. 将尖端旋转 1400 x g , 2 分钟即可丢弃流过。
      5. 在 10 mM ABC (pH 10.0) 中, 用50微升80% 华置洗涤尖端。重复1x。
        注: 加入28% 氢氧化铵, 调节 10 mM ABC 溶液的 pH 值。
      6. 在 10 mM ABC (pH 10.0) 中, 用50微升50% 华置洗涤尖端。重复1x。
      7. 用50微升 10 mM ABC (pH 10.0) 清洗尖端。重复1x。
    2. 在50微升的10毫米 ABC (pH 10.0) 中重组肽。
    3. 将重组后的样品添加到准备好的尖端。重新加载流向尖端, 以确保有效的肽结合。
    4. 用50微升 10 mM ABC (pH 10.0) 清洗尖端。重复1x。
    5. 洗脱的肽逐步为12个分数与50微升 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80%, 和6% 华置在10毫米 ABC (pH 10.0)。
    6. 将两个分数与相等的间隔 (分数1与7、2和8等) 合并, 以获得六组合分数。
    7. 通过真空离心干燥样品。干燥的肽可以储存在-30 摄氏度。

6. MS 的性能和数据分析

  1. 液相色谱-串联质谱法测定肽的研究
    1. 在含有0.1% 甲酸的15微升水中, 从步骤5.3.7 中重组干肽馏分。通过在 ph 带上发现溶液的1微升 (ph 值应低于 3), 检查重组肽的 ph 值。
    2. 将重组样品注入液相色谱 (LC) 柱。在高效液相色谱 (HPLC) 中应用适当的溶剂梯度 (溶剂 a 为含0.1% 甲酸的水, 溶剂 B 为含0.1% 甲酸的华能)。溶剂 B 的典型梯度如下: 5%-35%, 40 分钟;35%-70% 在4分钟;并在75% 举行10分钟。
    3. 用电喷雾电离洗脱肽, 并在数据依赖模式下操作质谱仪。在初始 MS 扫描中选择15最丰富的离子 (乘以电荷: 2 +、3 + 或更高), 用于串联质谱 (ms/ms) 扫描 (碰撞诱导解离, CID)。将动态排除大小设置为 500, 最大持续时间为二十五年代。
  2. 用 MaxQuant 进行蛋白质鉴定和定量31
    1. 将蛋白质鉴定的误发现率 (FDR) 设置为 0.01, 并将唯一肽的数量设置为 2, 以提高准确性和可靠性。
    2. 将蛋白质定量的最小所需比率计数 (唯一 + 剃须刀) 设置为 2, 并启用运行函数之间的重新量化和匹配。
  3. 利用 Bioconductor 包 limma 的富集意义评估32
    1. 执行在 limma 中实现的经审查的t-测试, 以从至少三个生物复制中测试 Log2-fold 对零的更改。使用读取. table函数读取数据表。然后, 使用lmFit和eBayes函数进行数据拟合。使用topTable函数导出计算结果 (包括平均 Log2-fold 更改和P值)。
    2. 使用用于控制 FDR 的 Benjamini–Hochberg 方法更正P值。
    3. 应用0.01 的 FDR 来生成在实验样品中显著丰富的蛋白质列表。设置两个或三重更改的中断, 以进一步控制误报。

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Representative Results

提出了质量控制步骤的代表性结果。结果包括步骤2.3.2 中所述的凝胶荧光分析的数字 (图 1)、步骤4.1.3 中描述的西方印迹分析 (图 2A) 和步骤4.2.2 中描述的银染色分析 (图 2B)。质量控制步骤对于优化无花果协议至关重要。在大规模的限制性鉴定实验的制备中始终包括质量控制。

Figure 1
图 1: 在步骤2.3.2 中描述的单击标记样本的凝胶荧光分析.(A) 此面板显示了一个典型的凝胶荧光模式的点击标记样本。只有双重标记的样品显示强涂片带在高分子量 (> 250 kDa), 代表交叉链接 RNPs 的信号。要取消 RNP 信号, 请省略4SU 或 EU 或与核糖核酸酶 A 一起消化。低分子量的背景尖锐波段代表非特异标记蛋白的信号。(B) 在某些情况下, 可以在 no4SU-control 样品中观察到强烈的污迹带 (约 130-250 kDa)。此波段表示标记的半球链 rna 的信号, 在热变性期间, 大多数情况下会降解。它不会干扰后续的程序。CBB = 考马斯明亮的蓝色。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 2
图 2: 亲和下拉效率和捕获限制性商业惯例的质量控制.(A) 此面板显示了在下拉 (输入) 和下拉 (上清) 后样品中生物素信号的西方印迹分析。估计剩余信号的比率, 并优化步骤3.1.1 中使用的磁珠量。(B) 此面板显示了与0.1% 个输入总蛋白相比, 捕获的限制性商业惯例的银染色分析。对于 HeLa 细胞, 总捕获效率约为 0.05%-0.1% 的输入蛋白质。由于不同细胞类型的代谢标记效率差异, 此值可能会有很大差异。请点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3: 无花果的代表性 MS 结果.(A) 此面板显示一个火山图, 显示由 limma 包计算的量化蛋白的平均 Log2-fold 变化和调整P值。597的蛋白 Log2-fold > 2 的变化和调整后的P值 < 0.01 被归类为 "无花果限制性商业惯例"。(B) 此面板显示无花果蛋白与先前确定的人类聚 (A) 限制性商业惯例7、8、9、10、11的重叠。重叠的蛋白质大多是编码限制性商业惯例, 而其余的无花果限制性商业惯例更可能是非编码限制性商业惯例。这个数字是从美国国家科学院27批准的以前出版的作品转载。请点击这里查看这个数字的更大版本.

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Discussion

保持公平 RNA 完整性是成功无花果实验的关键之一。随着 Cu (I) 的适当配体和仔细操作, RNA 降解可以大大减少, 虽然部分降解被观察到。在实验样品中, 欧盟和4SU 的替代比分别为1.18% 和 0.46% (未显示数据)。对于长度为 2000 nt 的完整 rna, 约90% 的 rna 包含至少一个欧盟和一个4SU。对于部分退化的 rna, 长度为 1000 nt, 约70% 的 rna 包含至少一个欧盟和一个4SU。因此, rna 的部分降解不会显著降低无花果的效率, 而严重的降解是不可接受的。

另一个关键步骤是步骤 1.4, 即单击反应的准备工作。在 rna 上的 Cu (I) 催化点击反应对 LDS 浓度敏感。LDS 的高浓度 (> 0.1%) 将导致对含欧盟 rna 的标记信号减少, 并增加蛋白质的背景信号 (未显示数据)。

除了欧盟, 无花果还与其他可点击的核苷兼容, 如腺苷33、34、35、36的炔基和叠氮类似物。然而, 无花果的应用在生物系统中的非自然可点击核苷的代谢效率受到极大的限制。因此, 在使用本协议中演示的其他条件执行无花果之前, 请始终检查代谢标记效率 (例如, 通过荧光成像)。

最近, 一个类似的策略叫瑞克 (捕获新转录的 RNA 路特使用点击化学), 其中仅包含欧盟标签总 rna 和使用254纳米紫外线交叉链接 rna 和蛋白质, 报告37。值得注意的是, 254 纳米紫外线可以激活所有四天然核苷, 以及欧盟。因此, 254 纳米紫外线照射可能会将游离欧盟及其代谢产物 (例如, 欧盟磷酸盐) 与相应的结合蛋白交叉连接, 这应考虑为可能的假阳性。

无花果的一个有趣的应用是在细菌中鉴定限制性商业惯例, 其 rna 大多是非 polyadenylated 的。限制性商业惯例的大规模鉴定将提供宝贵的资源, 以了解细菌38中转录后规则的分子基础。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由国家自然科学基金资助91753206、21425204和21521003和国家重点研究开发项目2016YFA0501500。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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生物化学 问题 140 rna rna-蛋白质相互作用 蛋白质组学 叠化学 非编码 RNA
利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白
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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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