Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

بروتوكول مفصلة لتطبيق انقر فوق الكيمياء-وساعدت الاستراتيجية التقاط (كاريك) إينتيراكتومي الحمض النووي الريبي لتحديد البروتينات ملزما لكلا الترميز وفضله يرد الكشف.

Abstract

تعريف شامل للجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) هو المفتاح لفهم هذه الشبكة التنظيمية بوسترانسكريبشونال في الخلايا. استراتيجية تستخدم على نطاق واسع لمكافحة الممارسات التجارية التقييدية التقاط يستغل بوليادينيليشن [poly(A)] للكشف المستهدف، الذي غالباً ما يحدث في حقيقية النواة مرناس ناضجة، ترك معظم البروتينات ملزمة من non-poly(A) الكشف مجهولي الهوية. هنا يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لأسلوب تم الإبلاغ عنها مؤخرا وصف فوق الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي إينتيراكتومي التقاط (كريك)، التي تمكن التقاط الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة للممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A) من خلال الجمع بين العلامات الاستقلابية من الكشف، في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط، ووضع علامات على بيورثوجونال.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم نسخها الجينوم البشري إلى أنواع شتى من الترميز وفضله الكشف (نكرناس)، بما في ذلك مرناس، ررناس، ترنس والكشف النووية الصغيرة (سنرناس) والكشف النوية الصغيرة (سنورناس) والكشف (لنكرناس) منذ فترة طويلة غير الترميز1. معظم هذه الكشف تمتلك ملابس للممارسات التجارية التقييدية وتعمل ك جسيمات (رنبس) ريبونوكليوبروتين2. ولذلك، تعريفاً شاملا للممارسات التجارية التقييدية شرط أساسي لفهم الشبكة التنظيمية بين الكشف والممارسات التجارية التقييدية، الذي تورط في مختلف الأمراض البشرية3،،من45.

وقد شهدت الأعوام القليلة الماضية دفعة كبيرة للممارسات التجارية التقييدية التي اكتشفت في مختلف نظم حقيقية النواة2،6، بما في ذلك الإنسان7،،من89،10،11، ماوس12،،من1314، الخميرة9،،من1516، الزرد17، melanogaster المورفولوجية18،19 ، ايليجانس كاينورهابديتيس16، و أعطيت التمويل20،،من2122، والطفيليات البشرية23،24،25 . وقد سهل هذه السلف باستراتيجية القبض على الممارسات التجارية التقييدية وضعتها كاستيللو et al. 7 وبالتز et al. 8 في عام 2012، الذي يجمع في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط من الجيش الملكي النيبالي والبروتينات المتفاعلة، والتقاط oligo(dT) من poly(A) الكشف، والطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتين التنميط. ومع ذلك، نظراً لحقيقة أن poly(A) معظمها موجود في مرناس الناضجة، التي تمثل لفقط ~ 3%-5% من التوكسينات الترنسكربيتوم26، هذه الاستراتيجية المستخدمة على نطاق واسع ليست قادرة على التقاط التفاعل مع non-poly(A) الكشف، بما في ذلك نكرناس معظم الممارسات التجارية التقييدية وقبل مرناس.

هنا، نحن تقرير الإجراءات المفصلة لاستراتيجية وضعت مؤخرا لإلقاء القبض على الترنسكربيتوم على نطاق المنظومة ل الممارسات التجارية التقييدية poly(A) و non-poly(A)27. ووصف كريك، يجمع هذه الاستراتيجية في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط ووسم الأيضية للكشف مع فوتواكتيفاتابل و "نقر" نوكليوزيد النظير (والتي تحتوي على مجموعة وظيفية بيورثوجونال التي يمكنها المشاركة في رد فوق)، 4- ثيوريديني (4SU)، و 5-اثينيلوريديني (الاتحاد الأوروبي). الخطوات الأساسية للحصول على نتائج مثالية مع استراتيجية كريك هي وسم الأيضية الفعالة والرد العابرة للربط، وانقر فوق الأشعة فوق البنفسجية، والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. لأن Cu(I) يستخدم المحفز في انقر فوق رد فعل يمكن أن يسبب تجزئة الكشف، ضروري يجند Cu(I) التي يمكن أن تقلل من تفتيت الحمض النووي الريبي. ونحن تصف كيفية تنفيذ ردود فعالة انقر في الخلية ليساتيس دون التسبب في تدهور حاد في الجيش الملكي النيبالي.

على الرغم من أن القبض على الممارسات التجارية التقييدية وتحديد الهوية في خلايا هيلا فقط هي المبينة في هذا البروتوكول، يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية كريك لمختلف أنواع الخلايا وربما للكائنات الحية. وإلى جانب الاستيلاء على الممارسات التجارية التقييدية، يوفر هذا البروتوكول أيضا تبسيط الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد نموذج MS وتحديد البروتين، والتقدير الكمي، التي يمكن أن تكون مفيدة لأولئك الذين ليسوا على دراية بتجارب البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تنبيه: عند الاقتضاء، والكواشف المستخدمة ينبغي شراؤها في شكل رناسي خالية، أو حله في رناسي-مجاناً، المذيبات (لمعظم الحالات، في بيروكاربوناتي إثيل (ديبك)-المياه المعالجة). عند التعامل مع عينات الحمض النووي الريبي وخالية من رناسي الكواشف، دائماً ارتداء القفازات والأقنعة، وتغييرها متكرر لتجنب تلوث رناسي.

1-إعداد أيضي المسمى وخلايا Cross-linked الأشعة فوق البنفسجية

  1. إدراج الأيضية للاتحاد الأوروبي و 4SU
    1. خلايا هيلا الثقافة في المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في جو2 CO 5%. الثقافة ~ 4 × 10 خلايا هيلا7 (في اثنين من الأطباق 15 سم) لإعداد واحدة تجريبية أو التحكم بعينه لأحد تشغيل MS القياسي.
    2. عندما خلايا هيلا مثقف التوصل إلى التقاء ~ 80%، إزالة المتوسطة الثقافة وإضافة 15 مل من بريوارميد متوسطة جديدة كل صحن 15 سم.
    3. إضافة 15 ميكروليتر كل طبق من الاتحاد الأوروبي (حله في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)) بتركيز نهائي من 1 مم 100 مم، و 7.5 ميكروليتر كل طبق من 4SU 100 مم (حله في برنامج تلفزيوني) بتركيز نهائي من 0.5 مم للتجريبية وعينات مراقبة noUV. إضافة 15 ميكروليتر كل طبق من 100 مم (حله في برنامج تلفزيوني) الاتحاد الأوروبي إلى تركيز نهائي من 1 ملم لعينات مراقبة no4SU.
      ملاحظة: 4SU صور--أكتيفاتابل؛ وهكذا، الحماية من الضوء بعد إضافة 4SU مطلوب.
    4. تغطية الأطباق مع إحباط وثقافة الخلايا الخاصة بحاء 16 إضافة نصف مقدار من الاتحاد الأوروبي و 4SU أو الاتحاد الأوروبي فقط من الخطوة 1.1.3 إلى التجريبية، noUV-، وعينات مراقبة no4SU، على التوالي، ويستمر في استزراع لآخر ح 2.
  2. في فيفو الأشعة فوق البنفسجية العابرة للربط
    1. إزالة متوسط الثقافة، وتغسل الخلايا 3 x مع 5 مل من برنامج تلفزيوني كل طبق، وإزالة برنامج تلفزيوني المتبقية إلى أقصى حد ممكن.
      ملاحظة: يقلل المخلفات السائلة إلى حد كبير من كفاءة العابرة للربط.
    2. للتجارب ووضع الأطباق على الجليد مع غطاء إزالة عينات مراقبة no4SU، وتشعيع الخلايا مع ضوء في ي/سم 22 كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر.
    3. لعينات مراقبة noUV، وضع الأطباق على الجليد وحمايتهم من الضوء.
      ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات التالية لعينات noUV-التحكم في غرفة مظلمة.
  3. تحلل الخلية والتجانس
    1. أضف 1 مل كل طبق من تحلل قبل المخزن المؤقت (10 مم Tris∙HCl، درجة الحموضة 7.5، 50 ملم حمض ليكل 0.02% P-40 نونيديت والايثيلين (يدتا)-كوكتيل مثبط البروتياز الحرة) إلى الخلايا. تتخلص من الخلايا باستخدام رافعة خلية مطاط وجمع تعليق قبل تحلل في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: هذه الخطوة سوف كسر غشاء الخلية والإفراج عن البروتينات هيولى قابلة للذوبان والكشف. لا الطرد المركزي الأنبوب وإزالة المادة طافية.
    2. للتعليق من اثنين 15-سم الأطباق، ضبط مستوى الصوت إلى 6 مل بإضافة تحلل قبل المخزن المؤقت. إضافة إلى تعليق تحلل قبل وحدة تخزين تساوي R-تحلل المخزن المؤقت (200 ملم Tris∙HCl، درجة الحموضة 7.5، 500 مم ليكل، 2% الليثيوم دوديسيل كبريتات [دس]).
    3. مجانسة الخلية ليستي التي يمر من خلال حقنه بإبرة ضيقة (27-ز) عدة مرات حتى واضحة ومتجانسة. احتضان ليساتي في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف (~ 15 لفة في الدقيقة) ح 1.
      ملاحظة: سوف تسمح هذه الخطوة الأخيرة يشوه كاملة من البروتينات. يمكن تخزينها بأمان في-70 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. التحضير لرد فعل فوق
    1. تمييع بإضافة 20 مجلداً لتمييع المخزن المؤقت (50 مم Tris∙HCl، درجة الحموضة 7.5) وتقسيمه إلى 15 مل الكسور.
      ملاحظة: سوف تضر المحاليل المحتوية على تركيزات عالية من الملح والمنظفات كفاءة Cu (ط)-حفز انقر فوق رد فعل؛ ومن ثم، يجب تغيير المخزن المؤقت.
    2. وتركز كل جزء باستخدام أنبوب أولترافيلتريشن 15 مل (مع قطع وزن الجزيئي من كاتشين 10) حتى الحجم أصغر من 1 مل. استخدام دوار يتأرجح دلو تدور أنبوب أولترافيلتريشن في 4,000 س ز عند 4 درجة مئوية ~ 15 دقيقة.
    3. إضافة 14 مل من المخزن المؤقت لتمييع للكسر ليستي مركزة وكرر الخطوة 1.4.2. الجمع بين الكسور والتركيز عليها إلى وحدة تخزين من 6 مل أولترافيلتريشن (4,000 س ز عند 4 درجة مئوية ~ 15 دقيقة).
      ملاحظة: يمكن إزالة معظم الملح وإرادة LDS الآن، حيث مستعدة لرد الفعل فوق. يمكن تخزينها في-70 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تجنب دورات تجميد أذاب متعددة، لأنها سوف تؤدي إلى تسفران عن تحلل الحمض النووي الريبي. قاسمة إذا كانت الأوصاف الصغيرة مطلوبة.

2-إعداد عينات الحمض النووي الريبي إينتيراكتومي التقاط

  1. بريكليرينج من
    1. إضافة 100 ميكروليتر streptavidin المغناطيسي الخرز الواحدة 6 مل من ليستي، وتدوير بلطف (~ 15 لفة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة البروتينات بيوتينيلاتيد بطبيعة الحال.
    2. بيليه الخرز باستخدام المغناطيس (ل ~ 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية) ونقل بريكلياريد ليساتي إلى أنبوب جديد.
  2. الأداء انقر فوق رد الفعل
    1. إعداد مزيج رد فعل: ميكروليتر 6.5 البيوتين المخزون (100 ملم أزيد-البيوتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]] في تركيز نهائي من 100 ميكرومتر)، 3.25 ميكروليتر من مخزون النحاس (جعله الطازجة؛ 1 CuSO م4 المذابة في الماء بتركيز نهائي 500 ميكرومتر) ، 65 ميكروليتر من يجند الأسهم (200 ملم ثبتا المذابة في الماء بتركيز نهائي 2 مم)، و 262.75 ميكروليتر من H2o.
      ملاحظة: ثبتا تقف تريس أمين [الميثيل (1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)].
    2. إضافة مزيج رد فعل لمل 6 من بريكليريد ليستي ومزيج جيد. ثم قم بإضافة ميكروليتر 162.5 الحد من كاشف (جعله الطازجة؛ اسكوربات الصوديوم 40 مغ/مل بتركيز نهائي 5 مم) إلى ومزيج جيد. يجب أن تكون وحدة التخزين النهائي 6.5 مل.
    3. احتضان الخليط رد فعل ح 2 في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري (800 لفة في الدقيقة). إضافة 5 مم أدتا إلى خليط التفاعل واحتضان لمدة 5 دقائق إخماد رد فعل.
  3. الأوصاف الصغيرة
    1. إعداد مزيج رد الفعل كما هو الحال في خطوة 2.2.1 مع الأسهم البيوتين الاستعاضة عنها بصبغ الأوراق المالية (مثلاً، أزيد 100 مم-Cy5 حله في [دمس]).
      ملاحظة: ينبغي تعديل المبلغ كاشف وفقا لحجم ليستي. نموذجياً، قاسمة 20 ميكروليتر من ما يكفي للأوصاف مثل تحليل fluorescence في جل.
    2. إضافة مزيج رد فعل إلى واحتضان من أجل ح 2 في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإضافة ثلث حجم المخزن المؤقت عينة LDS (4 x) وتجريدها من عند 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وحل العينة في جل مكررا-تريس 10%.
      ملاحظة: لتأكيد الإشارة الأسفار ويرد على الكشف، تتضمن عناصر تحكم مع الهضم رناسي A بعد التفاعل انقر فوق.
  4. تنظيف المخلوط رد فعل
    1. إضافة ثمانية مجلدات من الميثانول بريتشيليد (100%) إلى الخليط تطفئ رد فعل واحتضان أنه لمدة 30 دقيقة عند-30 درجة مئوية لهطول الأمطار. أداء هطول الأمطار في أنابيب 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي.
      ملاحظة: إذا كان إجمالي حجم أكبر من 50 مل، تقسيم الخليط رد فعل إلى أنبوبين 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي.
    2. إعداد المخزن المؤقت إعادة تشكيل: الجمع بين واحد حجم المخزن المؤقت A (الصوديوم 4% دوديسيل كبريتات [الحزب الديمقراطي الصربي] و 10 مم يدتا) مع ثمانية مجلدات من المخزن المؤقت ب (1% بريج-97، 150 كلوريد الصوديوم، و 50 ملم ثلاثي إيثانول أمين، ودرجة الحموضة 7.4).
    3. الطرد المركزي في س 4,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية. إضافة ~ 1-2 مل ميثانول بريشيليد بيليه. ماصة صعودا وهبوطاً لكسر بيليه وتأكد من بيليه مرحلياً تماما مع لا قطع مرئية. ملء الأنبوب مع الميثانول بريشيليد. كرر هذه الخطوة 2 x.
    4. الطرد المركزي في س 4,000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية. وضع مرة أخرى على أنابيب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 4,000 س ز للحد الأدنى 5 بعناية استخلاص الميثانول المتبقية بقدر الإمكان دون الإخلال بيليه.
    5. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لإعادة تشكيل لبيليه. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لإذابة بيليه. أجهزة الطرد المركزي في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. جمع 20 ميكروليتر من العينة لمراقبة الجودة (انظر القسم 4).
      ملاحظة: العينة الآن جاهزة لالتقاط إينتيراكتومي الجيش الملكي النيبالي. ويمكن تخزين العينات المعاد تشكيلها في-70 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

3 القبض على من الجيش النيبالي الملكي-إينتيراكتومي

  1. إعداد الخرز streptavidin-[اغروس]
    1. تأخذ 1,600 ميكروليتر من الملاط streptavidin-[اغروس] (800 ميكروليتر من حبات تمت تسويتها) كل 10 مل عينة أعيد تشكيلها في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
    2. تدور أسفل الخرز في 4000 x ز للحد الأدنى 5 بعناية إزالة المادة طافية دون إزعاج الخرز تمت تسويتها.
    3. أغسل حبات مع 10 مل من 50 مم Tris∙HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5). تدور أسفل الخرز (4,000 س ز لمدة 5 دقائق) وإزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة 2 x.
  2. تقارب المنسدلة
    1. نقل العينة تنظيف المتابعة وأعيد تشكيلها من الخطوة 2.4.6 بالخرز ستريبتافيدين-[اغروس] (راجع الخطوة 3.1). تبني بين عشية وضحاها مع تناوب لطيف في 4 درجات مئوية.
  3. الغسيل من الخرز ستريبتافيدين
    1. وتدور أسفل الخرز (4,000 س ز لمدة 5 دقائق) بنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. جمع 20 ميكروليتر من العينة لمراقبة الجودة.
    2. أغسل حبات مع 10 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (SDS 2% في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4). احتضان لمدة 10 دقيقة مع تناوب لطيف (~ 12 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة. تدور أسفل الخرز (4,000 س ز لمدة 5 دقائق) وإزالة المادة طافية. كرر 1 x.
    3. كرر الخطوة 3.3.2 مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي ب (اليوريا م 8 و 250 ملم NH4HCO3 يذوب في الماء). كرر الخطوة 3.3.2 مع المخزن المؤقت ليغسل ج (2.5 م كلوريد الصوديوم في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4). ثم، يغسل الخرز مع 10 مل من 50 مم Tris∙HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5). تدور أسفل الخرز (4,000 س ز لمدة 5 دقائق) وإزالة المادة طافية.
    4. تقسيم الخرز بالتساوي ونقلها إلى أنبوبين 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
  4. شطف رنبس تم التقاطها
    1. إعداد المخزن المؤقت شطف البيوتين: البيوتين 12.5 ملم, 75 ملم كلوريد الصوديوم، 7.5 مم Tris∙HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5)، يدتا 1.5 مم والحزب الديمقراطي الصربي 0.15% ساركوسيل 0.075% ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.02 في المائة.
      ملاحظة: مخزن المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة، البيوتين قد يعجل في 4 درجات مئوية.
    2. إلى 400 ميكروليتر من حبات استقر غسلها، إضافة 400 ميكروليتر من البيوتين شطف المخزن المؤقت.
    3. احتضان لهم على شاكر مداري (1500 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم احتضانها في شاكر مداري مع كتلة حرارة (1500 دورة في الدقيقة، 65 درجة مئوية) عن 10 دقيقة تدور أسفل الخرز (7,800 س ز لمدة 1 دقيقة) وجمع رنب التيد.
    4. الخرز، إضافة 400 ميكروليتر من البيوتين الطازجة شطف المخزن المؤقت ثم كرر الخطوة 3.4.3. الجمع بين اثنين التيس إلى أنبوب 15 مل واحد.
  5. الهضم رناسي
    1. إضافة ثلاثة مجلدات من المخزن المؤقت لتمييع رنب التيد لتقليل تركيز الحزب الديمقراطي الصربي. تركيز العينة المخففة باستخدام أنبوب ultrafiltration 0.5 مل (مع قطع وزن الجزيئي من كاتشين 10؛ تدور في 12,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة دقيقة ~ 30) إلى ~ 40 ميكروليتر.
    2. إضافة 0.5 ميكروغرام/ميكروليتر رناسي أ واحتضان من أجل ح 2 في 37 درجة مئوية للإفراج عن الممارسات التجارية التقييدية من الكشف cross-linked. جمع 2 ميكروليتر من الممارسات التجارية التقييدية لمراقبة الجودة (انظر القسم 4).

4-مراقبة الجودة

  1. مراقبة كفاءة المنسدلة تقارب
    1. تأخذ 10 ميكروليتر من عينة "قبل المنسدلة" من الخطوة 2.4.6 و 10 ميكروليتر من عينة "بعد الواقعة" من الخطوة 3.3.1.
    2. تحليل العينات باستخدام الإجراءات القياسية لطخة غربية (10% مكررا-تريس هلام).
    3. وصمة عار الغشاء الفينيليدن الفلوريد (PVDF) مع المتقارن streptavidin-برنامج الصحة الإنجابية لرصد الإشارات البيوتين بقايا العينة "بعد الواقعة".
      ملاحظة: إذا كانت إشارة البيوتين من عينة "بعد الواقعة" أكبر من خمس من إشارة عينة "قبل المنسدلة"، زيادة مقدار الخرز streptavidin-[اغروس] المستخدمة في الخطوة 3.1.1.
  2. مراقبة كفاءة القبض على إجمالي
    1. تأخذ 2 ميكروليتر من عينة الممارسات التجارية التقييدية المفرج عنهم من الخطوة 3.5.2 و 0.5 ميكروليتر من عينة "قبل المنسدلة" (كما الإدخال 0.1 ٪) من الخطوة 2.4.6.
    2. تحليل العينات باستخدام إجراءات معيارية تلطيخ الفضة.
      1. إصلاح الهلام مع تثبيت المخزن المؤقت (الإيثانول 40%، وحمض الخليك 10 ٪) لمدة 20 دقيقة تليها توعية (13 مم نا2ق2س3، 83 مم خلات الصوديوم، 30% إيثانول) لمدة 30 دقيقة.
      2. أغسل الجل 3 x مع الماء لمدة 5 دقائق و، ثم، وصمة عار مع مم 15 إنيو3 الحل ل 20 دقيقة أغسل هلام 2 x مع الماء لمدة 1 دقيقة، تطويرها في 0.24 م Na2CO3 و 0.012% فورمالدهايد، وتنتهي مع 45 مم يدتا تلطيخ سوفيسي الآنف والحنجرة.
        ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الفضة تلطيخ الممارسات التجارية التقييدية التي تم التقاطها مماثلة لتلك التي الإدخال 0.1%.

5-إعداد العينات لمرض التصلب العصبي المتعدد

  1. التربسين هضم القبض على الممارسات التجارية التقييدية في جل 28
    1. إضافة ربع حجم المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة (5 س) إلى نماذج الممارسات التجارية التقييدية المفرج عنهم من الخطوة 3.5.2. تؤذي العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. حل الممارسات التجارية التقييدية على جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide 10% 1.5 ملم.
    3. وصمة عار الهلام مع الفضة، البروتوكولات القياسية التالية.
    4. المكوس لين عينة تجريبية أو نموذج عنصر تحكم مع التراص هلام والفرقة الرئيسية من رناسي إزالة (كاتشين ~ 15).
    5. قطع لين قصت إلى قطع صغيرة (~ 1-1.5 مم × ~ 1-1.5 مم).
      ملاحظة: ينبغي أقصر حافة قطعة هلام لا تقل عن 1 مم للحيلولة دون انسداد في نصائح ماصة.
    6. نقل القطع جل لأنبوب ميكروسينتريفوجي وديستاين مع المخزن المؤقت ديستاينينج (خليط كميات متساوية من 100 ملم Na2ق2س3 و 30 مم ك3[Fe(CN)]6[).
    7. تغسل القطع هلام مع بيكربونات الأمونيوم 200 ملم (ABC) حتى يتم قطع جل عديم اللون تماما.
    8. يذوي قطعة جل في 1 مل من مرتبة الاسيتو الانيتريل (ACN). ترطيب مع 200 ميكروليتر من ديثيوثريتول 10 ملم (حله في 50 ملم ABC) واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون قطعة هلام المجففة تماما الصعب جداً وغير شفاف. إذا كانت القطع هلام لينة لا يزال بعد الجفاف، إزالة تزاول وإضافة 1 مل تزاول نظيفة ليذوي مرة أخرى.
    9. تبريد القطع جل لدرجة حرارة الغرفة. إضافة 200 ميكروليتر من إيودواسيتاميدي 58 مم (حله في 50 ملم ABC) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في الظلام.
    10. بعد يغسل موجزة مع المياه، يذوي قطعة جل في 1 مل من تزاول نظيفة.
      ملاحظة: القطع جل يجب أن تكون تماما المجففة.
    11. ترطيب قطعة هلام مع المقدار المناسب من 10 نانوغرام/ميكروليتر التربسين (حله في 50 ملم ABC) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 12-16.
      ملاحظة: القطع هلام ينبغي أن يكون تماما امهاء مع لا النوى معتمة. قم بإزالة أي سوائل زائدة.
  2. تصنيف ثنائي ميثيل النظائر المستقرة من الببتيدات هضمها 29
    1. استخراج هضم الببتيدات من القطع هلام بإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لاستخراج (حمض الفورميك 5% و 50% تزاول في المياه) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع فورتيكسينج (في 1,200 لفة في الدقيقة).
    2. كرر الخطوة 5.2.1 2 x. الجمع بين المقتطفات في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد.
    3. جاف الببتيدات المستخرجة من فراغ الطرد المركزي.
    4. إعادة تشكيل الببتيدات في 200 ميكروليتر من بيكربونات تريثيلامونيوم 100 مم (برنامج، الأس الهيدروجيني 8.5).
      تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات 5.2.4-5.2.6 على الجليد في غطاء دخان.
    5. إضافة 8 ميكروليتر من 4% CH2س و 8 ميكروليتر من 4% 13CD2س إلى التجريبية ومراقبة عينات، على التوالي.
      ملاحظة: للتحكم في التحيز لوسم النظائر المستقرة، مبادلة النظائر المستقرة للتجريبية والتحكم في عينات من تكرار بيولوجيا المستقلة الأخرى.
    6. إضافة 8 ميكروليتر من 0.6 متر نأبه3CN (جعله الطازجة) وتخلط جيدا.
    7. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة ح 1 مع فورتيكسينج.
    8. تبريد العينات على الجليد. إخماد رد فعل عن طريق إضافة 32 ميكروليتر من محلول مائي الأمونيا 1%. ثم، كذلك إخماد رد فعل عن طريق إضافة 16 ميكروليتر من حمض الفورميك.
    9. الجمع بين العينة التجريبية مع نموذج التحكم المقابلة في أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد. الجاف للعينات من فراغ الطرد المركزي.
  3. تجزئة الببتيدات المسمى ثنائي
    1. إعداد نصائح الاستخراج توقف واذهب (ستاجيتيبس)30.
      1. إدراج تلميح 10 ميكروليتر طول مدد، غشاء C18.
      2. إضافة 300 ميكروغرام من درجة الحموضة العالية C18 الخرز علقت في تزاول إلى الحافة.
      3. ضع الطرف تستقيم في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع رف الصنع التي يمكن تثبيت الحافة ورفع غيض قبالة الجزء السفلي.
      4. تدور هذه المعلومة في 1,400 س ز 2 دقيقة تجاهل في التدفق من خلال.
      5. أغسل التلميح مع 50 ميكروليتر من 80% تزاول في 10 ملم ABC (pH 10.0). كرر 1 x.
        ملاحظة: ضبط الأس الهيدروجيني لحل أية بي سي 10 ملم بإضافة هيدروكسيد الأمونيوم 28%.
      6. أغسل التلميح مع 50 ميكروليتر من 50% تزاول في 10 ملم ABC (pH 10.0). كرر 1 x.
      7. أغسل التلميح مع 50 ميكروليتر من 10 ملم ABC (pH 10.0). كرر 1 x.
    2. إعادة تشكيل الببتيدات في 50 ميكروليتر من 10 ملم ABC (pH 10.0).
    3. إضافة العينات المعاد تشكيلها لنصيحة المعدة. تحميل من خلال التدفق إلى الحافة لضمان ربط الببتيد كفاءة.
    4. أغسل التلميح مع 50 ميكروليتر من 10 ملم ABC (pH 10.0). كرر 1 x.
    5. الوت الببتيد التدرجي للكسور 12 مع 50 ميكروليتر من 6%، 9%، 12%، 15%، 18%، 21%، 25%، 30%، 35%، 40%، 80%، و 6% تزاول في 10 ملم ABC (pH 10.0).
    6. الجمع بين اثنين من كسور بفاصل زمني متساو (جزء 1 مع 7، 2 مع 8، وهلم جرا) للحصول على ستة جنبا إلى جنب الكسور.
    7. الجاف للعينات من فراغ الطرد المركزي. ويمكن تخزين الببتيدات المجففة عند-30 درجة مئوية.

6-أداء مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل البيانات

  1. تحليل الببتيد بالترادف اللوني السائل الطيف الكتلي
    1. إعادة تشكيل الكسور الببتيد المجفف من الخطوة 5.3.7 في 15 ميكروليتر من المياه التي تحتوي على حمض الفورميك 0.1%. فحص درجة حموضة الببتيدات المعاد تشكيلها باكتشاف ميكروليتر 1 للحل على شريط الأس الهيدروجيني (درجة الحموضة يجب أن يكون تحت 3).
    2. حقن العينة إعادة العمود اللوني السائل (ش). تطبيق تدرج مناسب من المذيبات (المذيبات A الماء الذي يحتوي على 0.1% حمض الفورميك، المذيب ب تزاول المحتوية على حمض الفورميك 0.1 ٪) في كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). تدرج نموذجية من المذيبات ب على النحو التالي: 5%-35% في 40 دقيقة؛ 35%-70% في 4 دقيقة؛ وعقدت في 75% لمدة 10 دقائق.
    3. تتأين الببتيدات التيد من اليكتروسبراي وتعمل مطياف الشامل في الوضع تعتمد على البيانات. حدد 15 الأيونات الأكثر وفرة (مشحونة بضرب: 2 + 3 + أو أعلى) في MS الأولى المسح الضوئي لمسح الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب (التفكك الناجمة عن التصادم، CID). تعيين حجم الإقصاء الحيوي إلى 500 مع وقت الحد أقصى لمدة 25 ثانية.
  2. والبروتين التحديد الكمي باستخدام ماكسكوانت 31
    1. تعيين معدل اكتشاف كاذبة (FDR) لتحديد البروتين إلى 0.01 وتعيين عدد الببتيدات فريدة من نوعها إلى 2 من أجل زيادة الدقة والموثوقية.
    2. تعيين الحد الأدنى المطلوب حساب نسبة (فريدة من نوعها + أسلاك شائكة) للقياس الكمي البروتين إلى 2، وتمكين إعادة تحديدها كمياً و تطابق بين تشغيل المهام.
  3. التقييم أهمية الإثراء باستخدام ليما حزمة R/بيوكوندوكتور 32
    1. أداء أدار تي-التجارب المنفذة في ليما لاختبار التغيير طي Log2 ضد صفر من replicates البيولوجية ثلاثة على الأقل. استخدم الدالة read.table لقراءة جدول البيانات. ثم، استخدم الدالتين لمفيت و اباييس للبيانات المناسب. استخدم الدالة توبتابل لتصدير نتائج الحساب (بما في ذلك متوسط طي Log2 التغيير وقيم P ).
    2. تصحيح القيم ف استخدام الأسلوب بينجاميني – هوشبيرغ للسيطرة فرانكلين روزفلت.
    3. تطبيق فرانكلين روزفلت 0.01 إنشاء قائمة بالبروتينات التي أثرت إلى حد كبير في العينات التجريبية. تعيين قطع التغيير يومين أو ثلاثة إضعاف إلى مواصلة التحكم إيجابيات كاذبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وترد نتائج تمثيلية لخطوات مراقبة الجودة. وتشمل النتائج الأرقام لتحليل fluorescence في جل الموضحة في الخطوة 2.3.2 (الشكل 1)، وتحليل لطخة غربية الموضحة في الخطوة 4.1.3 (الشكل 2A)، وتحليل الفضة تلطيخ الموضحة في الخطوة 4-2-2 (الشكل 2). خطوات مراقبة الجودة حاسمة بالنسبة للاستفادة المثلى البروتوكولات كريك. تشمل عناصر الجودة دائماً في إعداد تجارب تحديد الممارسات التجارية التقييدية على نطاق واسع.

Figure 1
رقم 1: في جل fluorescence تحليل العينات المسمى فوق الموضحة في الخطوة 2.3.2. () هذه الأسفار يظهر نموذجية في-هلام لوحة نمط العينات المسمى انقر فوق. العينة مضاعف المسمى فقط إظهار شريط تشويه سمعة قوية في وزن الجزيئي عالية (كاتشين > 250)، الذي يمثل إشارة رنبس cross-linked. لإلغاء إشارة رنب، قم بحذف أما 4SU أو الاتحاد الأوروبي أو هضم مع رناسي أ العصابات خلفية حادة في انخفاض وزن الجزيئي تمثل الإشارات غير محددة المسمى البروتينات. (ب) في بعض المناسبات، ويمكن ملاحظة عصابة بقع قوية (كاتشين ~ 130-250) في نموذج no4SU--عنصر تحكم. وتمثل هذه الفرقة إشارة المسمى الكشف uncross-مرتبط، التي ستنخفض خلال تمسخ الحرارة، لمعظم الحالات. أنه لن يتدخل في الإجراءات اللاحقة. مصرف البحرين المركزي = أخذ الزرقاء الرائعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مراقبة جودة تقارب المنسدلة الكفاءة والممارسات التجارية التقييدية تم التقاطها- (أ) هذا الفريق يظهر بتحليل لطخة غربية البيوتين إشارات في العينات قبل المنسدلة (مدخلات) وفي عينات بعد المنسدلة (المادة طافية). تقدير نسبة الإشارات المتبقية وتحسين مقدار حبة المستخدمة في الخطوة 3.1.1. (ب) تعرض هذا الفريق تحليل الفضة تلطيخ القبض على الممارسات التجارية التقييدية، مقارنة بالبروتينات مجموع الإدخال 0.1%. لخلايا هيلا، هو كفاءة التقاط المجموع العام ~0.05%-0.1% بروتينات الإدخال. هذه القيمة يمكن أن تختلف إلى حد كبير نظراً لتباين كفاءة التوسيم الأيضية لأنواع مختلفة من الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نتائج MS الممثل كريك. (أ) هذا الفريق يظهر مؤامرة بركان عرض متوسط تجليد Log2-تغيير وتعديل قيم P البروتينات كمياً، وحسابها بواسطة حزمة ليما. 597 بروتينات مع تغيير طي Log2 > 2 وقيمة ف معدل < 0.01 صنفت "كريك الممارسات التجارية التقييدية". (ب) هذا الفريق يظهر تداخل البروتينات كريك مع poly(A) البشرية التي سبق تحديدها الممارسات التجارية التقييدية7،8،9،،من1011. البروتينات المتراكبة معظمهم الترميز الممارسات التجارية التقييدية، بينما بقية الممارسات التجارية التقييدية كريك من المرجح أن تكون غير ترميز الممارسات التجارية التقييدية. وهذا الرقم طبع من أعمال منشورة سابقا بإذن من "الأكاديمية الوطنية للعلوم في"27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي عادلة أحد مفاتيح نجاح تجارب كريك. بمناسبة يغاندس Cu(I) وعملية متأنية، تدهور الجيش الملكي النيبالي يمكن إلى حد كبير تخفيض، على الرغم من أن تم ملاحظة انخفاض جزئي. أن نسب الاستبدال من الاتحاد الأوروبي و 4SU في العينات التجريبية هي 1.18% و 0.46 في المائة، على التوالي (البيانات لا تظهر). للكشف سليمة بطول ألفي nt، ~ 90% الكشف يحتوي على واحد على الأقل من الاتحاد الأوروبي و 4SU واحد. للكشف جزئيا المتدهورة بطول 1000 nt، ~ 70% الكشف يحتوي على واحد على الأقل من الاتحاد الأوروبي و 4SU واحد. ولذلك، تحلل جزئي للكشف لا كبير نقصان كفاءة كاريك، رغم التدهور الشديد لأمر غير مقبول.

خطوة حاسمة أخرى خطوة 1.4، التحضير لرد فعل انقر فوق. Cu (ط)-رد فعل فوق تشجعهن على الكشف حساس لتركيز LDS. تركيزات عالية (> 0.1 ٪) لقديسي الأيام الأخيرة ستؤدي إلى انخفاض العلامات إشارات على الكشف المحتوية على الاتحاد الأوروبي وزيادة الإشارات الخلفية على البروتينات (البيانات لا تظهر).

بالإضافة إلى الاتحاد الأوروبي، كريك متوافق مع نوكليوسدس نقر الأخرى، مثل النظير الكينيل وأزيدو من الادينوسين33،34،،من3536. ومع ذلك، يقتصر تطبيق كريك إلى حد كبير كفاءة الأيض نوكليوسدس نقر غير طبيعي في نظام بيولوجي للفائدة. ولذلك، قبل أداء كريك استخدام شروط غير تلك التي أثبتت في هذا البروتوكول، تحقق دائماً من كفاءة التوسيم الأيضية (مثلاً، بتصوير فلوري).

في الآونة الأخيرة، كانت استراتيجية مماثلة تسمى ريك (القبض على إينتيراكتومي الحمض النووي الريبي يدون حديثا باستخدام الكيمياء فوق)، الذي يضم الاتحاد الأوروبي فقط لتسمية الكشف التام ويستخدم الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر إلى تشابك الكشف والبروتينات، المبلغ عنها37. جدير بالذكر أن يمكن تنشيط 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية كل أربعة نوكليوسدس الطبيعية، فضلا عن الاتحاد الأوروبي. وهكذا، قد تشابك إشعاع الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر الاتحاد الأوروبي مجاناً وايضه (مثلاً، الفوسفات الاتحاد الأوروبي) بالمقابل ملزم البروتينات، والتي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار كممكّن المغلوطة.

تطبيق فضول أحد كريك هو لتحديد الممارسات التجارية التقييدية في البكتيريا الكشف التي غالباً غير بوليادينيلاتيد. تحديد نطاق واسع من الممارسات التجارية التقييدية ستوفر الموارد لا تقدر بثمن لفهم الأساس الجزيئي للأنظمة بوسترانسكريبشونال في البكتيريا38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين منح 91753206، 21425204، و 21521003 و "البحوث الرئيسية الوطنية" و "مشروع تنمية" 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter