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Biochemistry

पर कब्जा और क्लिक करें रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति का उपयोग करके आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

क्लिक रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति दोनों कोडिंग और गैर कोडिंग RNAs के लिए बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए लागू करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है ।

Abstract

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की एक व्यापक पहचान कोशिकाओं में posttranscriptional विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । RBP कब्जा के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की रणनीति polyadenylation [पाली (ए)] लक्ष्य RNAs है, जो ज्यादातर eukaryotic परिपक्व mRNAs पर होता है, गैर की सबसे बाध्यकारी प्रोटीन छोड़कर पाली (एक) RNAs अज्ञात कारनामे । यहाँ हम एक हाल ही में रिपोर्ट की विधि की विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन क्लिक करें रसायन विज्ञान सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC), जो दोनों पाली (ए) और गैर पाली (ए) RBPs के चयापचय लेबलिंग के संयोजन के द्वारा transcriptome व्यापक कब्जा सक्षम बनाता है RNAs, vivo में यूवी क्रॉस-लिंकिंग, और bioorthogonal टैगिंग ।

Introduction

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मानव जीनोम कोडिंग और गैर कोडिंग RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs, tRNAs, लघु नाभिकीय RNAs (snRNAs), छोटे nucleolar RNAs (snoRNAs), और लंबे समय नॉन कोडिंग RNAs (lncRNAs)1सहित के विभिंन प्रकार में लिखित है । इन RNAs के अधिकांश RBPs और ribonucleoprotein कणों (RNPs)2के रूप में कार्य के कपड़े के अधिकारी । इसलिए, RBPs की एक व्यापक पहचान RNAs और RBPs, जो विभिंन मानव रोगों में फंसाया है के बीच विनियामक नेटवर्क को समझने के लिए एक शर्त है3,4,5

पिछले कुछ वर्षोंके विभिंन eukaryotic प्रणालियों2,6मानव7,8,9,10,11सहित में पता चला RBPs का एक महान बढ़ावा देखा है, माउस12,13,14, खमीर9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis एलिगेंस16, Arabidopsis थालियाना20,21,22, और मानव परजीवी23,24,25 . इन अग्रिमों Castello एट अल द्वारा विकसित एक RBP कब्जा रणनीति द्वारा सुविधा दी गई है । 7 और Baltz एट अल. 8 में २०१२, जो vivo यूवी पार-आरएनए और उसके बातचीत प्रोटीन, oligo (डीटी) पर कब्जा पाली (ए) RNAs, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-आधारित proteomic profiling के जोड़ने में जोड़ती है । हालांकि, तथ्य यह है कि पाली (एक) ज्यादातर परिपक्व mRNAs, जो केवल ~ 3% eukaryotic transcriptome26के 5% के लिए खाते पर मौजूद है, इस व्यापक रूप से इस्तेमाल किया रणनीति गैर के साथ बातचीत RBPs पर कब्जा करने में सक्षम नहीं है, पाली (एक) RNAs, सहित सबसे ncRNAs और पूर्व mRNAs ।

यहां, हम दोनों पाली (ए) और गैर पाली (ए) RBPs27के transcriptome चौड़ा कब्जा के लिए हाल ही में विकसित रणनीति की विस्तृत प्रक्रियाओं की रिपोर्ट । CARIC, इस रणनीति vivo यूवी पार जोड़ने और photoactivatable और "क्लिक करने वाले" nucleoside सादृश्य के साथ RNAs के चयापचय लेबलिंग में जोड़ती है (जो एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह है कि क्लिक प्रतिक्रिया में भाग लेने के होते हैं), 4- thiouridine (4SU), और 5-ethynyluridine (ईयू) । कदम है कि CARIC रणनीति के साथ आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है कुशल चयापचय लेबलिंग, यूवी पार से जोड़ने और प्रतिक्रिया क्लिक करें, और आरएनए अखंडता के रखरखाव कर रहे हैं । क्योंकि घन (i) में क्लिक करें प्रतिक्रिया में उत्प्रेरक के रूप में उपयोग RNAs के विखंडन, एक घन (i) ligand जो आरएनए फ़्रेग्मेंटेशन कम कर सकते है आवश्यक है कारण हो सकता है । हम गंभीर आरएनए क्षरण के कारण के बिना सेल lysates में कुशल क्लिक प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन ।

हालांकि RBP कब्जा और हेला कोशिकाओं में पहचान केवल इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, CARIC रणनीति विभिंन प्रकार के सेल के लिए लागू किया जा सकता है और संभवतः रहने वाले जीवों के लिए । RBP कैप्चर के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी एमएस नमूना तैयारी और प्रोटीन की पहचान और ठहराव, जो जो proteomic प्रयोगों से परिचित नहीं हैं के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए सुव्यवस्थित कदम दर कदम प्रक्रियाओं प्रदान करता है.

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Protocol

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सावधानी: जब लागू हो, इस्तेमाल किया एजेंट RNase के रूप में खरीदा जाना चाहिए मुक्त, या RNase में भंग-मुक्त, सॉल्वैंट्स (ज्यादातर मामलों के लिए, diethyl pyrocarbonate (DEPC)-इलाज पानी में) । जब आरएनए के नमूनों और RNase मुक्त रिएजेंट हैंडलिंग, हमेशा दस्ताने और मास्क पहनते हैं, और RNase संदूषण से बचने के लिए उन्हें अक्सर बदल जाते हैं ।

1. चयापचयी लेबल और यूवी पार से जुड़े कोशिकाओं के Lysate की तैयारी

  1. यूरोपीय संघ और 4SU के चयापचय निगमन
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में संस्कृति हेला कोशिकाओं (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल streptomycin में ३७ ° c में एक 5% सह2 वातावरण के साथ पूरक । संस्कृति ~ 4 x 107 हेला कोशिकाओं (२ १५ में-मुख्यमंत्री व्यंजन) एक मानक एमएस चलाने के लिए एक प्रयोगात्मक या नियंत्रण नमूना तैयार करने के लिए ।
    2. जब कल्चरल हेला कोशिकाओं तक पहुंच ~ ८०% संगम, संस्कृति मध्यम निकालें और 15-सेमी डिश प्रति गरम ताजा मध्यम के 15 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए १०० mm यूरोपीय संघ (फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) में भंग) के प्रति डिश 15 μL जोड़ें, और १०० मिमी 4SU (पंजाब में भंग) के पकवान प्रति ७.५ μL प्रयोगात्मक और noUV नियंत्रण के नमूनों के लिए ०.५ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए । १०० मिमी यूरोपीय संघ के पकवान प्रति 15 μL जोड़ें (पंजाब में भंग) no4SU के लिए 1 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए नियंत्रण के नमूने.
      नोट: 4SU फोटो-activatable है; इस प्रकार, 4SU जोड़ने के बाद प्रकाश से सुरक्षा की आवश्यकता है ।
    4. पन्नी और संस्कृति के साथ बर्तन कवर 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को यूरोपीय संघ और 4SU या केवल चरण 1.1.3 से प्रायोगिक, noUV के लिए यूरोपीय संघ की राशि का आधा जोड़ें, और no4SU-नियंत्रण नमूने, क्रमशः, और जारी रखें संवर्धन के लिए एक और 2 एच ।
  2. वीवो में यूवी पार से जोड़ने
    1. संस्कृति माध्यम निकालें, डिश प्रति पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं को धोने, और जितना संभव हो अवशिष्ट पंजाबियों को हटा दें ।
      नोट: अवशेष तरल काफी पार से जोड़ने दक्षता कम हो जाएगा ।
    2. प्रयोगात्मक और no4SU-नियंत्रण के नमूनों के लिए, बर्फ पर व्यंजन को हटा दिया ढक्कन के साथ जगह और विकीर्ण ३६५-एनएम यूवी प्रकाश के साथ 2 जे/सेमी2 पर एक यूवी पार से लिंकर द्वारा कोशिकाओं ।
    3. noUV-नियंत्रण के नमूनों के लिए, बर्फ पर व्यंजन रखें और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
      नोट: noUV-नियंत्रण नमूने के लिए सभी निम्न चरणों का पालन एक अंधेरे कमरे में किया जाना चाहिए ।
  3. सेल lysis और homogenization
    1. पूर्व lysis बफर के पकवान प्रति 1 मिलीलीटर जोड़ें (10 मिमी Tris ∙ एचसीएल, पीएच ७.५, ५० mm LiCl, ०.०२% Nonidet पी-४०, और ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)-मुक्त छेड़ने अवरोधक कॉकटेल) कोशिकाओं के लिए । एक रबर सेल लिफ्टर का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्री-lysis निलंबन इकट्ठा ।
      नोट: यह कदम कोशिका झिल्ली टूट जाएगा और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन और RNAs जारी । ट्यूब के केंद्रापसारक और supernatant को दूर नहीं है ।
    2. २ १५-cm डिश से निलंबन के लिए, पूर्व lysis बफर जोड़कर 6 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें । पूर्व lysis निलंबन के लिए जोड़ें आर-lysis बफर के बराबर मात्रा (२०० mm Tris ∙ एचसीएल, पीएच ७.५, ५०० mm LiCl, 2% लिथियम dodecyl सल्फेट [LDS]) ।
    3. Homogenize को संकीर्ण सुई (27-G) के साथ एक सिरिंज के माध्यम से गुजरते हुए सेल lysate से lysate तक कई बार क्लीयर और समरूप है । 1 एच के लिए कोमल रोटेशन (~ 15 rpm) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate की मशीन ।
      नोट: यह अंतिम चरण प्रोटीन की पूरी denaturing की अनुमति देगा । lysate को सुरक्षित रूप से एक महीने के लिए-७० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  4. क्लिक प्रतिक्रिया के लिए तैयारी
    1. कमजोर पड़ने वाले बफर के 20 संस्करणों को जोड़कर lysate को पतला करें (५० mM Tris ∙ एचसीएल, पीएच ७.५) और इसे 15-एमएल अंशों में बांटें ।
      ध्यान दें: नमक और डिटर्जेंट की एक उच्च एकाग्रता युक्त समाधान घन की दक्षता समझौता होगा (I)-catalyzed क्लिक प्रतिक्रिया; इस प्रकार, lysate का बफ़र परिवर्तित करना आवश्यक है ।
    2. एक 15 मिलीलीटर ultrafiltration ट्यूब का उपयोग करके प्रत्येक अंश ध्यान (10 केडीए के एक आणविक वजन कटऑफ के साथ) तक मात्रा 1 मिलीलीटर से छोटी है । ~ 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४,००० x g पर ultrafiltration ट्यूब स्पिन करने के लिए एक झूल-बाल्टी रोटर का प्रयोग करें ।
    3. केंद्रित lysate अंश और दोहराने कदम 1.4.2 करने के लिए कमजोर पड़ने बफर के 14 मिलीलीटर जोड़ें । अंशों को संयोजित करें और उन्हें 6 मिलीलीटर की मात्रा में ultrafiltration (४,००० x g से 4 ° c पर ~ 15 मिनट के लिए ध्यान दें) ।
      नोट: नमक और LDS के अधिकांश अब हटा दिया जाएगा, तो lysate पर क्लिक करें प्रतिक्रिया के लिए तैयार है । lysate-७० ° c एक सप्ताह तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है । कई फ्रीज-गल चक्र से बचें, क्योंकि वे महत्वपूर्ण आरएनए क्षरण में परिणाम होगा । Aliquot lysate यदि छोटे पैमाने पर characterizations की आवश्यकता हो ।

2. आरएनए-interactome कैप्चर के लिए नमूनों की तैयारी

  1. lysate की शुचिता
    1. जोड़ें १००-μL streptavidin lysate के 6 मिलीलीटर प्रति चुंबकीय मोती, और धीरे से (~ 15 rpm) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्राकृतिक रूप से biotinylated प्रोटीन को खत्म करने के लिए घुमाएगी ।
    2. एक चुंबक का उपयोग कर मोती गोली (4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 20 मिनट के लिए) और एक नई ट्यूब के लिए स्पष्ट lysate हस्तांतरण ।
  2. क्लिक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन
    1. प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें: ६.५ μL के बायोटिन स्टॉक (१०० mM azide-बायोटिन की dimethyl sulfoxide में भंग [DMSO] १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता में), ३.२५ तांबा स्टॉक के μL (यह ताजा कर; 1 मीटर CuSO4 पानी में भंग की एक अंतिम एकाग्रता में ५०० माइक्रोन) , ligand स्टॉक की ६५ μL (२०० मिमी THPTA 2 मिमी की अंतिम एकाग्रता में पानी में घुल), और एच2ओ के २६२.७५ μL.
      नोट: THPTA Tris के लिए खड़ा है [(1-hydroxypropyl-1 -1, 2, 3-triazol-4-yl) मिथाइल] अमीन ।
    2. रिएक्शन मिक्स को 6 मिलीलीटर में डालकर साफ lysate और अच्छी तरह मिला लें । फिर, १६२.५ μL को कम करने का एजेंट जोड़ें (इसे ताज़ा करें; ४० मिलीग्राम/एमएल सोडियम ascorbate एक अंतिम एकाग्रता 5 मिमी) lysate और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । अंतिम मात्रा ६.५ मिलीलीटर होनी चाहिए ।
    3. एक कक्षीय शेखर (८०० rpm) पर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण मशीन । प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए 5 मिमी EDTA जोड़ें और प्रतिक्रिया बुझाने के लिए 5 मिनट के लिए यह मशीन ।
  3. छोटे पैमाने पर characterizations
    1. के रूप में बायोटिन स्टॉक डाई स्टॉक (जैसे, १०० mM azide-DMSO में भंग Cy5) द्वारा प्रतिस्थापित के साथ कदम 2.2.1 में प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें ।
      नोट: एजेंट मात्रा lysate की मात्रा के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । आमतौर पर, lysate के एक 20-μL aliquot एक इन-जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण के रूप में characterizations के लिए पर्याप्त है ।
    2. lysate के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए यह मशीन । उसके बाद, एक-तिहाई की वॉल्यूम LDS नमूना बफ़र (4x), 5 मिनट के लिए ५५ ° c पर यह स्वभाव, और 10% बीआईएस-Tris जेल पर नमूने को हल करने के लिए जोड़ें ।
      नोट: प्रतिदीप्ति संकेत RNAs पर प्रस्तुत किया है की पुष्टि करने के लिए, नियंत्रण RNase के साथ क्लिक करें प्रतिक्रिया के बाद एक पाचन शामिल हैं ।
  4. प्रतिक्रिया मिश्रण की सफाई
    1. ठंडा मेथनॉल के आठ संस्करणों को जोड़ें (१००%) शमन प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए और यह 30 मिनट के लिए में-30 डिग्री सेल्सियस वर्षा के लिए गर्मी । ५०-एमएल शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों में वर्षा करते हैं ।
      नोट: कुल मात्रा ५० मिलीलीटर से अधिक है, तो प्रतिक्रिया मिश्रण में विभाजित करें २ ५०-एमएल शंकु केंद्रापसारक ट्यूबों ।
    2. पुनर्गठन बफर तैयार: एक बफर के एक खंड (4% सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस] और 10 मिमी EDTA) बफर बी के आठ संस्करणों के साथ गठबंधन (1% बृज-९७, १५० मिमी NaCl, और ५० मिमी triethanolamine, पीएच ७.४) ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । जोड़ें ~ 1-2 गोली को ठंडा मेथनॉल के मिलीलीटर । पिपेट ऊपर और नीचे गोली तोड़ने के लिए और सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से कोई दिखाई मात्रा के साथ निलंबित कर दिया है । सर्द मेथनॉल के साथ ट्यूब भरें । इस चरण 2x दोहराएं ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । वापस ट्यूबों रखो और 5 मिनट के लिए ४,००० x g पर फिर से केंद्रापसारक । ध्यान से गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा के रूप में अवशिष्ट मेथनॉल आकर्षित ।
    5. गोली के लिए पुनर्गठन बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे गोली भंग करने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ४,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. supernatant एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण । गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 20 μL लीजिए (अनुभाग 4 देखें).
      नोट: अब, नमूना आरएनए-interactome कैप्चर के लिए तैयार है । पुनर्गठन नमूना-७० डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए जमा किया जा सकता है ।

3. आरएनए-interactome कैप्चर

  1. streptavidin-agarose मोतियों की तैयारी
    1. streptavidin-agarose घोल के १,६०० μL ले लो (८०० एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में पुनर्गठन नमूना के प्रति 10 मिलीलीटर के μL मोती) ।
    2. 5 मिनट के लिए ४००० x जी में मोतियों नीचे स्पिन । ध्यान से supernatant को परेशान बिना बसे मोतियों को हटा दें.
    3. ५० mM Tris के 10 मिलीलीटर ∙ एचसीएल (पीएच ७.५) के साथ मोतियों को धो लें । मोती नीचे स्पिन (5 मिनट के लिए ४,००० x g ) और supernatant निकालें । इस चरण 2x दोहराएं ।
  2. अपनत्व pulldown
    1. streptavidin-agarose मोतियों के लिए कदम 2.4.6 से साफ-अप और पुनर्गठन नमूना स्थानांतरण (३.१ कदम देखें) । 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोटेशन के साथ रात भर गर्मी ।
  3. streptavidin मोतियों की धुलाई
    1. नीचे स्पिन (5 मिनट के लिए ४,००० x जी ) और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नमूने के 20 μL लीजिए ।
    2. धो एक बफर के 10 मिलीलीटर के साथ मोती धो (2 पंजाबियों में% एसडीएस, पीएच ७.४) । कमरे के तापमान पर कोमल रोटेशन (~ 12 rpm) के साथ 10 मिनट के लिए मशीन । मोती नीचे स्पिन (5 मिनट के लिए ४,००० x g ) और supernatant निकालें । दोहराएँ 1x.
    3. दोहराएं बफ़र बी के साथ चरण 3.3.2 (8 मीटर यूरिया और २५० mM NH4HCO3 पानी में घुल) । दोहराएं बफर सी के साथ कदम 3.3.2 (२.५ एम पंजाब में NaCl, पीएच ७.४) । फिर, ५० mM Tris के 10 मिलीलीटर ∙ एचसीएल (पीएच ७.५) के साथ मोतियों को धो लें । मोती नीचे स्पिन (5 मिनट के लिए ४,००० x g ) और supernatant निकालें ।
    4. मोतियों को समान रूप से विभाजित करें और उन्हें दो १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित करें ।
  4. छीना RNPs का रेफरेंस
    1. बायोटिन रेफरेंस बफर तैयार करें: १२.५ mm बायोटिन, ७५ mm NaCl, ७.५ mm Tris ∙ एचसीएल (पीएच ७.५), १.५ एमएम EDTA, ०.१५% एसडीएस, ०.०७५% sarkosyl, और ०.०२% सोडियम deoxycholate ।
      नोट: कमरे के तापमान पर बफर स्टोर, बायोटिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हाला हो सकता है ।
    2. धो बसे मोतियों की ४०० μL करने के लिए, जोड़ें ४०० μL के बायोटिन रेफरेंस बफर.
    3. उन्हें 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक कक्षीय शेखर (१,५०० rpm) पर मशीन । फिर, 10 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक (१,५०० rpm, ६५ डिग्री सेल्सियस) के साथ एक कक्षीय शेखर पर मशीन, मोती नीचे स्पिन (७,८०० एक्स जी 1 मिनट के लिए) और eluted RNP इकट्ठा ।
    4. मोतियों को जोड़ने के लिए, ताजा बायोटिन रेफरेंस बफर के ४०० μL को जोड़ें और दोहराएँ स्टेप 3.4.3. १ १५-एमएल ट्यूब में दो elutes का मिश्रण ।
  5. RNase पाचन
    1. एसडीएस की एकाग्रता में कमी करने के लिए eluted RNP के लिए कमजोर पड़ने बफर के तीन संस्करणों जोड़ें । एक ०.५-एमएल ultrafiltration ट्यूब का उपयोग करके पतला नमूना ध्यान केंद्रित (10 केडीए के एक आणविक वजन कटऑफ के साथ; 4 ° c पर १२,००० x g पर स्पिन ~ 30 मिनट के लिए) ~ ४० μL के लिए ।
    2. जोड़ें ०.५ μg/μL RNase A और यह 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर RBPs पार से लिंक RNAs जारी करने के लिए । गुणवत्ता नियंत्रण के लिए RBPs के 2 μL लीजिए (अनुभाग 4 देखें).

4. गुणवत्ता नियंत्रण

  1. अपनत्व की कुशलता का नियंत्रण pulldown
    1. चरण 2.4.6 से "पहले-pulldown" नमूने के 10 μL और "after-pulldown" नमूना से चरण 3.3.1 से 10 ले लो ।
    2. मानक पश्चिमी दाग प्रक्रियाओं (10% बीआईएस-Tris जेल) का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण करें ।
    3. दाग polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) streptavidin के साथ झिल्ली-एचआरपी संयुग्मी के अवशेषों बायोटिन संकेतों की निगरानी के लिए "के बाद pulldown" नमूना ।
      नोट: यदि "after-pulldown" नमूना के बायोटिन संकेत "से पहले pulldown" नमूना के संकेत का एक-पांचवां से अधिक है, चरण 3.1.1 में प्रयुक्त streptavidin-agarose मोतियों की मात्रा में वृद्धि ।
  2. कुल कैप्चर दक्षता का नियंत्रण
    1. चरण 3.5.2 से जारी RBP नमूना के 2 μL ले लो और ०.५ μL "से पहले pulldown" नमूना (के रूप में ०.१% इनपुट) से कदम 2.4.6.
    2. मानक रजत-धुंधला प्रक्रियाओं का उपयोग कर नमूनों का विश्लेषण करें ।
      1. निर्धारण बफर के साथ जेल फिक्स (४०% इथेनॉल, 10% एसिटिक एसिड) 20 30 मिनट के लिए संवेदीकरण (13 मिमी ना2एस23, ८३ मिमी सोडियम एसीटेट, 30% इथेनॉल) के बाद मिनट के लिए.
      2. 5 मिनट के लिए पानी के साथ जेल 3x धो और, फिर, यह एक 15 मिमी AgNO के लिए3 समाधान के साथ दाग 1 मिनट के लिए पानी के साथ जेल 2x धो, यह ०.२४ मीटर ना2CO3 और ०.०१२% formaldehyde में विकसित, और ४५ mM EDTA के साथ समाप्त जब धुंधला suffici है Ent.
        नोट: चांदी पर कब्जा कर लिया RBPs की तीव्रता धुंधला ०.१% इनपुट के समान होना चाहिए ।

5. एमएस के लिए नमूनों की तैयारी

  1. इन-जेल trypsin ने छीना RBPs का पाचन 28
    1. एसडीएस नमूना बफ़र (5x) का एक चौथाई वॉल्यूम चरण 3.5.2 से जारी RBP नमूने के लिए जोड़ें । 10 मिनट के लिए ९५ ° c पर नमूना स्वभाव ।
    2. १.५-mm 10% एसडीएस-polyacrylamide जेल पर RBPs को हल करें ।
    3. दाग चांदी के साथ जेल, मानक प्रोटोकॉल का पालन ।
    4. एक्साइज जेल और स्टैकिंग के साथ प्रयोगात्मक नमूना या नियंत्रण नमूना के लेन RNase ए (~ 15 केडीए) के प्रमुख बैंड हटा दिया ।
    5. एक्साइज लेन को छोटे टुकड़ों में काटें (~ 1-१.५ mm x ~ 1-१.५ mm) ।
      नोट: जेल टुकड़ा का सबसे छोटा किनारा पिपेट सुझावों में कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए कोई छोटा से 1 मिमी होना चाहिए ।
    6. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए जेल टुकड़े स्थानांतरण और धुंधला बफर के साथ दाग (१०० mm Na2एस23 और 30 मिमी K3के बराबर मात्रा का एक मिश्रण [Fe (CN)6]) ।
    7. जेल के टुकड़ों को २०० mM अमोनियम बिकारबोनिट (एबीसी) के साथ धो लें जब तक कि यह पूरी तरह बेरंग न हो जाए ।
    8. निर्जलीकरण साफ acetonitrile (ACN) के 1 मिलीलीटर में जेल टुकड़े । 10 मिमी dithiothreitol के २०० μL के साथ rehydrat (५० mm एबीसी में भंग) और ४५ मिनट के लिए ५६ ° c पर मशीन ।
      नोट: पूरी तरह से निर्जलित जेल टुकड़े बहुत कठिन और अपारदर्शी होना चाहिए । अगर जेल टुकड़े निर्जलीकरण के बाद अभी भी नरम हैं, ACN को हटाने और साफ ACN के 1 मिलीलीटर को फिर से निर्जलीकरण जोड़ें ।
    9. कमरे के तापमान के लिए जेल के टुकड़े नीचे शांत । जोड़ें ५८ mm iodoacetamide के २०० μL (५० mm एबीसी में भंग) और अंधेरे में ४५ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    10. पानी के साथ एक संक्षिप्त धोने के बाद, स्वच्छ ACN के 1 मिलीलीटर में जेल टुकड़े निर्जलीकरण ।
      नोट: जेल के टुकड़े पूरी तरह से निर्जलित होना चाहिए ।
    11. 10 एनजी/μL trypsin (५० mM एबीसी में भंग) और 12-16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन की उचित मात्रा के साथ जेल टुकड़े rehydrat ।
      नोट: जेल टुकड़े पूरी तरह से कोई अपारदर्शी कोर के साथ rehydratेड होना चाहिए । किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें ।
  2. स्थिर आइसोटोप dimethyl लेबलिंग के पच पेप्टाइड्स 29
    1. निष्कर्षण बफर के २०० μL जोड़कर जेल के टुकड़े से पचा पेप्टाइड्स निकालें (5% फार्मिक एसिड और ५०% पानी में ACN) और भंवर के साथ 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (१,२०० rpm पर) ।
    2. दोहराएँ चरण 5.2.1 2x. अर्क एक microcentrifuge ट्यूब में जुडा है ।
    3. वैक्यूम केंद्रापसारक द्वारा निकाले पेप्टाइड्स सूखी ।
    4. १०० mM triethylammonium बिकारबोनिट (TEAB, pH ८.५) के २०० μL में पेप्टाइड्स का पुनर्गठन ।
      चेतावनी: कदम 5.2.4-5.2.6 बर्फ पर एक धुएं डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    5. क्रमशः प्रयोगात्मक और नियंत्रण नमूनों के लिए 4% CH2o और 8 μL 4% 13सीडी2ओ के 8 μL जोड़ें ।
      नोट: स्थिर isotopic लेबलिंग के पूर्वाग्रह को नियंत्रित करने के लिए, प्रायोगिक और अन्य जैविक रूप से स्वतंत्र दोहराने के नमूने के नियंत्रण के लिए स्थिर आइसोटोप स्वैप.
    6. ०.६ M नभ3CN के 8 μL जोड़ें (इसे ताजा करें) और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    7. भंवर के साथ 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
    8. बर्फ पर नमूने शांत । 1% अमोनिया जलीय समाधान के ३२ μL जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने । फिर, आगे के रूप में 16 μL के रूप में जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने एसिड ।
    9. एक microcentrifuge ट्यूब में इसी नियंत्रण नमूना के साथ प्रयोगात्मक नमूना जुडा है । वैक्यूम केंद्रापसारक द्वारा नमूनों सूखी ।
  3. dimethyl-लेबल किए गए पेप्टाइड्स के अंश
    1. तैयार रोको और जाओ-निष्कर्षण युक्तियां (StageTips)30
      1. एक विस्तारित-लंबाई, 10-μL टिप में एक C18 झिल्ली डालें ।
      2. जोड़ें ३०० उच्च पीएच C18 मोतियों की μg टिप को ACN में निलंबित कर दिया ।
      3. एक microcentrifuge ट्यूब में एक घर के साथ टिप ईमानदार रखें रैक जो टिप को स्थिर और नीचे से टिप लिफ्ट कर सकते हैं ।
      4. 2 मिनट के लिए १,४०० x g पर टिप स्पिन-प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
      5. 10 mM ABC (pH १०.०) में ८०% ACN के ५० μL के साथ टिप को धो लें । दोहराएँ 1x.
        नोट: 28% अमोनियम हीड्राकसीड जोड़कर 10 मिमी एबीसी समाधान का पीएच समायोजित करें ।
      6. 10 mM ABC (pH १०.०) में ५०% ACN के ५० μL के साथ टिप को धो लें । दोहराएँ 1x.
      7. 10 मिमी एबीसी के ५० μL (पीएच १०.०) के साथ टिप धो लो । दोहराएँ 1x.
    2. ५० 10 मिमी एबीसी (पीएच १०.०) के μL में पेप्टाइड्स का पुनर्गठन ।
    3. तैयार टिप के लिए पुनर्गठन नमूना जोड़ें । प्रवाह को पुनः लोड-के माध्यम से टिप को कुशल पेप्टाइड बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए ।
    4. 10 मिमी एबीसी के ५० μL (पीएच १०.०) के साथ टिप धो लो । दोहराएँ 1x.
    5. Elute ५० 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, ३५%, ४०%, ८०%, और 6% ACN के साथ 12 भागों के लिए पेप्टाइड stepwise 10 मिमी एबीसी में (पीएच १०.०) ।
    6. एक बराबर अंतराल के साथ दो भागों गठबंधन (7 के साथ भिंन 1, 8 के साथ 2, और इतने पर) छह संयुक्त भागों पाने के लिए ।
    7. वैक्यूम केंद्रापसारक द्वारा नमूनों सूखी । सूखे पेप्टाइड्स-30 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

6. एमएस और डेटा विश्लेषण का प्रदर्शन

  1. तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पेप्टाइड विश्लेषण-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री
    1. ०.१% फार्मल एसिड युक्त पानी की 15 μL में कदम 5.3.7 से सूख पेप्टाइड अंश का पुनर्गठन । एक पीएच पट्टी पर समाधान के 1 μL खोलना द्वारा गठित पेप्टाइड्स के पीएच की जाँच करें (पीएच 3 के तहत किया जाना चाहिए).
    2. reconstitut नमूना तरल क्रोमैटोग्राफी (LC) स्तंभ में इंजेक्ट । विलायक के एक उपयुक्त ढाल लागू करें (विलायक एक ०.१% से युक्त पानी है फार्म का एसिड, विलायक बी ०.१% ACN एसिड युक्त है) उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) में । विलायक बी का एक ठेठ ढाल निंनानुसार है: ४० मिनट में 5%-३५%; ३५%-७०% 4 मिनट में; और 10 मिनट के लिए ७५% पर आयोजित किया ।
    3. electrospray द्वारा eluted पेप्टाइड्स को और डेटा-आधारित मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करें । चुनें 15 सबसे प्रचुर मात्रा में आयनों (चार्ज गुणा: 2 +, 3 +, या उच्चतर) प्रारंभिक एमएस स्कैन में एक मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) स्कैन (टक्कर प्रेरित पृथक्करण, सीआईडी) के लिए । डायनेमिक बहिष्करण आकार 25 s की अधिकतम अवधि समय के साथ ५०० करने के लिए सेट करें ।
  2. प्रोटीन पहचान और ठहराव का उपयोग MaxQuant 31
    1. ०.०१ के लिए प्रोटीन पहचान की झूठी खोज दर (एफडीआर) सेट और सटीकता और विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए 2 के लिए अद्वितीय पेप्टाइड्स की संख्या निर्धारित करें ।
    2. प्रोटीन ठहराव के लिए न्यूनतम आवश्यक अनुपात काउंट्स (unique + रेजर) को 2 पर सेट करें, और रन फंक्शन के बीच फिर से मात्रा और मैच को सक्षम करें ।
  3. संवर्धन महत्व मूल्यांकन आर/कंडक्टर पैकेज limma का उपयोग कर ३२
    1. एक संचालित t-परीक्षण limma में कार्यांवित करने के लिए शूंय के खिलाफ Log2-गुना परिवर्तन से कम तीन जैविक प्रतिकृति का परीक्षण करने के लिए । डेटा तालिका पढ़ने के लिए पढ़ें. table फ़ंक्शन का उपयोग करें । फिर, डेटा फिटिंग के लिए lmFit और ebays कार्यों का उपयोग करें । परिकलन परिणामों (औसत Log2-फ़ोल्ड परिवर्तन और P मानों सहित) को निर्यात करने के लिए topTable फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
    2. एफडीआर को नियंत्रित करने के लिए Benjamini – Hochberg विधि का उपयोग कर P मान को सुधारें ।
    3. ०.०१ के एक एफडीआर लागू करने के लिए काफी प्रयोगात्मक नमूनों में समृद्ध प्रोटीन की एक सूची उत्पंन करते हैं । दो या तिगुना परिवर्तन की एक कटऑफ सेट आगे झूठी सकारात्मक नियंत्रण के लिए ।

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Representative Results

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गुणवत्ता नियंत्रण कदम के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं । परिणाम में जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण के आंकड़े शामिल कदम 2.3.2 (चित्रा1) में वर्णित है, पश्चिमी दाग कदम 4.1.3 (चित्रा 2a) में वर्णित विश्लेषण, और चांदी धुंधला विश्लेषण कदम 4.2.2 (चित्रा 2 बी) में वर्णित है । गुणवत्ता नियंत्रण कदम CARIC प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं । बड़े पैमाने पर RBP पहचान प्रयोगों की तैयारी में हमेशा गुणवत्ता नियंत्रण शामिल करें ।

Figure 1
चित्रा 1: में जेल प्रतिदीप्ति विश्लेषण के क्लिक-लेबल नमूने चरण 2.3.2 में वर्णित है । () इस पैनल के एक ठेठ क्लिक-लेबल नमूने के जेल प्रतिदीप्ति पैटर्न से पता चलता है । केवल दोहरीकरण लेबल नमूना एक उच्च आणविक वजन पर एक मजबूत धब्बा बैंड से पता चलता है (> २५० केडीए), जो पार से जुड़े RNPs के संकेत का प्रतिनिधित्व करता है. RNP संकेत को समाप्त करने के लिए, या तो 4SU या यूरोपीय संघ या डाइजेस्ट RNase A. के साथ चूकना एक कम आणविक वजन पर पृष्ठभूमि तेज बैंड गैर विशिष्ट लेबल प्रोटीन के संकेतों का प्रतिनिधित्व करते हैं । () कुछ अवसरों में, एक मजबूत धब्बा बैंड (~ १३०-२५० केडीए) no4SU-नियंत्रण नमूने में देखा जा सकता है । इस बैंड को पार से जुड़े RNAs, जो गर्मी विकार के दौरान नीचा हो जाएगा लेबल के संकेत का प्रतिनिधित्व करता है, ज्यादातर मामलों के लिए । यह अनुवर्ती प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा । CBB = Coomassie खूब नीला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: संबध pulldown दक्षता और कब्जा कर लिया RBPs की गुणवत्ता नियंत्रण । () इस पैनल के नमूनों में बायोटिन संकेतों के एक पश्चिमी दाग विश्लेषण से पहले pulldown (इनपुट) और नमूनों में pulldown (supernatant) के बाद पता चलता है. शेष संकेतों के अनुपात का अनुमान है और चरण 3.1.1 में इस्तेमाल मनका राशि का अनुकूलन । () यह पैनल ०.१% इनपुट कुल प्रोटीन की तुलना में छीना RBPs के एक चांदी के दाग विश्लेषण से पता चलता है । हेला कोशिकाओं के लिए, सामांय कुल कब्जा दक्षता ~ ०.०५%-इनपुट प्रोटीन के ०.१% है । यह मान भिंन कक्ष प्रकारों के चयापचय लेबलिंग दक्षता के प्रसरण के कारण उल्लेखनीयतया भिंन हो सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: CARIC के प्रतिनिधि एमएस परिणाम । () इस पैनल के एक ज्वालामुखी औसत Log2 गुना परिवर्तन और समायोजित quantified प्रोटीन, limma पैकेज द्वारा गणना के पी मूल्यों को प्रदर्शित करने की साजिश से पता चलता है । ५९७ की एक Log2-गुना परिवर्तन के साथ प्रोटीन का > 2 और एक समायोजित P मान < ०.०१ के रूप में "CARIC RBPs" वर्गीकृत किया गया था । () यह पैनल पहले से पहचाने गए मानव पाली (क) RBPs,,,१०,११के साथ CARIC प्रोटीन के ओवरलैप दिखाता है. छा प्रोटीन्स ज्यादातर कोडिंग RBPs हैं, जबकि बाकी CARIC RBPs के नॉन कोडिंग RBPs होने की संभावना ज्यादा होती है । यह आंकड़ा राष्ट्रीय विज्ञान के27अकादमी से अनुमति के साथ पहले से प्रकाशित काम से पुनर्मुद्रित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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मेला आरएनए अखंडता का रखरखाव सफल CARIC प्रयोगों के लिए कुंजियों में से एक है । घन (I) और सावधान संचालन के उचित लाइगैंडों के साथ, आरएनए क्षरण काफी कम हो सकता है, हालांकि आंशिक क्षरण मनाया गया था । प्रायोगिक नमूनों में यूरोपीय संघ और 4SU के प्रतिस्थापन अनुपात १.१८% और ०.४६%, क्रमशः (डेटा नहीं दिखाया गया है) । २,००० nt की लंबाई के साथ बरकरार RNAs के लिए, ~ ९०% RNAs में कम से एक यूरोपीय संघ और एक 4SU होते हैं । १,००० nt की लंबाई के साथ आंशिक रूप से नीचा RNAs के लिए, ~ ७०% RNAs में कम से एक यूरोपीय संघ और एक 4SU होते हैं । इसलिए, RNAs की आंशिक गिरावट नाटकीय रूप से CARIC की दक्षता में कमी नहीं है, जबकि गंभीर गिरावट स्वीकार्य नहीं है ।

एक और महत्वपूर्ण कदम १.४ कदम है, पर क्लिक करें प्रतिक्रिया के लिए तैयारी । घन (I)-catalyzed क्लिक RNAs पर प्रतिक्रिया LDS एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है । एक उच्च एकाग्रता (> ०.१%) LDS के यूरोपीय संघ पर लेबलिंग संकेतों की कमी को बढ़ावा मिलेगा युक्त RNAs और प्रोटीन पर पृष्ठभूमि संकेतों की वृद्धि (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

यूरोपीय संघ के अलावा, CARIC भी अन्य क्लिक करने वाले nucleosides के साथ संगत है, जैसे कि adenosine३३,३४,३५,३६के alkynyl और azido अनुरूप. हालांकि, CARIC के आवेदन काफी ब्याज की एक जैविक प्रणाली में अप्राकृतिक क्लिक करने वाली nucleosides की चयापचय दक्षता द्वारा सीमित है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शित की तुलना में अंय शर्तों का उपयोग कर CARIC प्रदर्शन से पहले, हमेशा चयापचय लेबलिंग दक्षता की जांच (जैसे, फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा) ।

हाल ही में, एक ऐसी ही रणनीति रिक बुलाया (नव लिखित आरएनए interactome का कब्जा क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग कर), जो केवल यूरोपीय संघ के कुल RNAs लेबल को शामिल किया गया और २५४ का उपयोग करता है-एनएम यूवी पार करने के लिए लिंक RNAs और प्रोटीन,३७की सूचना दी थी । विशेष रूप से, २५४-एनएम यूवी सभी चार प्राकृतिक nucleosides, साथ ही यूरोपीय संघ को सक्रिय कर सकते हैं । इस प्रकार, २५४ एनएम यूवी विकिरण पार मुक्त यूरोपीय संघ और इसके चयापचयों (जैसे, यूरोपीय संघ के फॉस्फेट) इसी बंधन प्रोटीन, जो संभव झूठी सकारात्मक रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए के साथ लिंक कर सकते हैं ।

CARIC के एक पेचीदा आवेदन बैक्टीरिया जिसका RNAs ज्यादातर गैर polyadenylated है में RBPs की पहचान है । RBPs की बड़े पैमाने पर पहचान के लिए अमूल्य संसाधन उपलब्ध कराने के लिए बैक्टीरिया३८में posttranscriptional नियमों का आणविक आधार समझ प्रदान करेगा.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन अनुदान ९१७५३२०६, २१४२५२०४, और २१५२१००३ और राष्ट्रीय मुख्य अनुसंधान और विकास परियोजना 2016YFA0501500 द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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References

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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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