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Biochemistry

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

단백질 바인딩 두 코딩 및 noncoding 식별을 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC) 전략을 적용 하기 위한 자세한 프로토콜 RNAs 제공 됩니다.

Abstract

RNA 의무적인 단백질 (RBPs)의 포괄적인 식별 셀에 posttranscriptional 규제 네트워크를 이해 하는 열쇠입니다. RBP 캡처에 대 한 널리 사용 되는 전략은 polyadenylation [많은] 대상 RNAs의 미확인 non-poly(A) RNAs의 대부분 바인딩 단백질을 떠나 진 성숙한 mRNAs에 주로 발생 하는 이용 한다. 여기 클릭 화학 기반 RNA 위하여 캡처 (CARIC)의 대사 라벨을 결합 하 여 많은 non-poly(A) RBPs transcriptome 전체 캡처를 가능 하 게 되 나 최근 보고 된 방법의 자세한 절차 설명 RNAs vivo에서 UV cross-linking, 그리고 bioorthogonal 태그.

Introduction

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인간 게놈은 코딩 및 noncoding RNAs (ncRNAs), mRNAs, rRNAs tRNAs, 작은 핵 RNAs (snRNAs), 작은 nucleolar RNAs (snoRNAs), 그리고 긴 비 코딩 RNAs (lncRNAs)1의 다양 한 형식으로 복사할 수 있습니다. 대부분 이러한 RNAs의 RBPs의 의류를 보유 하 고 ribonucleoprotein 입자 (RNPs)2로 작동. 따라서 RBPs의 포괄적인 식별 다양 한 인간 질병3,,45에 연루 RNAs 사이의 RBPs, 규제 네트워크를 이해 하기 위한 전제 조건입니다.

지난 몇 년 동안 다양 한 진 핵 시스템2,6, 인간의7,,89,10,11를 포함 하 여 발견 RBPs의 큰 향상을 목격 했다 마우스12,,1314, 효 모9,,1516, zebrafish17, 초파리 melanogaster18,19 , 꼬마 선 충16, 애기 thaliana20,,2122, 그리고 인간의 기생충23,24,25 . 이러한 진보 카스텔로 연구진이 개발한 RBP 캡처 전략에 의해 촉진 되어 있다 7 , Baltz 외. 8 2012 년에 RNA와 단백질 상호 작용, 많은 RNAs의 oligo(dT) 캡처 및 질량 분석 (MS)의 cross-linking vivo에서 UV-proteomic 프로 파일링 기반. 그러나, 그 많은 계정에 대 한 3%-5%만 진 핵 transcriptome26의 성숙한 mRNAs에 주로 존재 하는 사실을 감안할 때이 널리 사용 되는 전략은 RBPs non-poly(A) RNAs, 대부분 ncRNAs를 포함 한 상호 작용을 캡처할 수 그리고 사전 mRNAs입니다.

여기, 우리는 많은 non-poly(A) RBPs27transcriptome 전체 캡처에 대 한 최근 개발 된 전략의 세부 절차를 보고합니다. CARIC 되 나,이 전략 결합 vivo에서 UV cross-linking 및 photoactivatable 및 "클릭" nucleoside 유사 체 (는 클릭 반응에 참여할 수는 bioorthogonal 기능 그룹 포함)와 RNAs의 대사 라벨 4- thiouridine (4SU), 그리고 5-ethynyluridine (유럽 연합). CARIC 전략 이상적인 결과 얻기 위해 중요 단계는 효율적인 대사 라벨, UV cross-linking 및 클릭 반응, 그리고 RNA 무결성의 유지 관리 합니다. 클릭 반응에서 촉매로 사용 하는 Cu(I)는 RNAs의 조각화를 발생할 수 있습니다, 때문에 RNA 조각화를 줄일 수 있는 Cu(I) ligand 필수적 이다. 우리는 심각한 RNA 저하를 유발 하지 않고 세포 lysates의 효율적인 클릭 반응을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

RBP 캡처만 HeLa 세포에서 식별이이 프로토콜에서 설명 하는 있지만 다양 한 세포 유형으로, 그리고 아마도 생물 CARIC 전략을 적용할 수 있습니다. RBP 캡처, 게다가이 프로토콜 또한 MS 샘플 준비, 단백질 식별 및 정량화, proteomic 실험에 익숙하지 않는 사람들을 위해 도움이 될 수 있는 효율적인된 단계별 절차를 제공 합니다.

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Protocol

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주의: 해당 되는 경우, 사용 시 약 되어야 RNase 무료의 형태로 구입 하거나 RNase-무료, 용 매에 용 해 (diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 대부분의 경우-처리 물). 때 RNA 샘플 및 RNase 무료 시 약 처리, 항상 장갑 및 마스크를 착용 하 고 자주 RNase 오염을 피하기 위하여 그들을 변경.

1. 준비의 Lysate의 Metabolically 표시 및 UV 복사해올된 셀

  1. EU와 4SU의 변화 관
    1. 문화 HeLa 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린, 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 100 μ g/mL 스 보완. ~ 107 헬 라 세포 (두 15 cm 요리) x 4 실험 하나를 준비 하기 위한 문화 또는 표준 MS 실행 한 샘플을 제어 합니다.
    2. 교양된 HeLa 세포 합류 ~ 80%에 도달, 문화 매체를 제거 하 고 15 cm 접시 당 prewarmed 신선한 매체의 15 mL를 추가 합니다.
    3. 100 mM (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 용 해) 1 m m의 최종 농도에 EU의 접시 당 15 μ와 0.5 m m의 최종 농도를 100 m m 4SU (PBS에 녹아 있는)의 접시 당 7.5 μ 추가 실험 및 noUV 제어 샘플. No4SU 제어 샘플 1 m m의 최종 농도를 100 mM (PBS에 녹아 있는) EU의 접시 당 15 μ를 추가 합니다.
      참고: 4SU는 사진 활성화; 따라서, 4SU를 추가한 후 빛 으로부터 보호는 필요 합니다.
    4. 커버 호 일 요리 하 고 각각 16 h. 추가 대 한 셀 EU 및 4SU 또는 단계 1.1.3 실험, noUV-및 no4SU 제어 샘플만 EU의 금액의 절반 문화 다른 2 h에 대 한 배양을 계속.
  2. Vivo에서 UV cross-linking
    1. 문화 매체를 제거, 세포 3 세척 접시, 당 PBS와 가능한 한 많이 제거 잔여 PBS의 5 mL x.
      참고: 잔류물 액체 상호 효율을 줄일 것 이다.
    2. 대 한 실험적 고 no4SU 제어 샘플 요리 얼음에 뚜껑을 제거 하 고 셀 365 nm UV UV cross-linker에 의해 2 J/c m2 에서 빛을 비추는.
    3. NoUV 제어 샘플 요리 얼음에 놓고 빛에서 그들을 보호 합니다.
      참고: noUV 제어 샘플에 대 한 모든 다음 단계 어두운된 실내에서 수행 되어야 합니다.
  3. 세포 세포의 용 해 및 균질 화
    1. 전 세포의 용 해 버퍼의 접시 당 1 mL을 추가 (10 m m Tris∙HCl, pH 7.5, 50mm LiCl, 0.02% Nonidet P-40 및 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)-무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 셀에. 고무 셀 기중 장치를 사용 하 여 셀을 긁 고 사전 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 수집 합니다.
      참고:이 단계 세포 막 중단 되며 녹는 세포질 단백질 및 RNAs. 하지 마십시오 원심 관 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
    2. 두 개의 15 cm에서 서 스 펜 션에 대 한 사전 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 6 mL을 볼륨을 조정 합니다. 사전 세포 현 탁 액에 R-세포의 용 해 버퍼 (200 m m Tris∙HCl, pH 7.5, 500mm LiCl, 2% 리튬 라우릴 황산 [민 변])의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
    3. 전달 하 여 주사기를 통해 좁은 바늘 (27 G) 여러 번까지는 lysate 명확 하 고 동종 세포 lysate를 균질. 부드러운 회전 (~ 15 rpm) 1 시간에 4 ° C에서 lysate를 품 어.
      참고:이 마지막 단계는 단백질의 완전 한 변성 시키기 허용할 것 이다. lysate 안전 하 게 저장할 수-70 ° C에서 최대 한 달 동안.
  4. 클릭 반응에 대 한 준비
    1. lysate 희석 버퍼 (50 m m Tris∙HCl, pH 7.5)의 20 볼륨을 추가 하 여 희석 하 고 15 mL 조각으로 나눕니다.
      참고: 소금 및 세제의 높은 농도 포함 하는 솔루션은 타협을 Cu (I)의 효율성-촉매 클릭 반응; 따라서,는 lysate의 버퍼는 변경 되어야 합니다.
    2. 볼륨 1 mL 보다 작은 때까지 (10 kDa의 분자량 컷오프)와 15 mL 한 튜브를 사용 하 여 각 분수를 집중. 진동 물통 회전자를 사용 하 여 4000 x g ~ 15 분 동안 4 ° C에에 한 튜브를 회전.
    3. 14 mL 희석 버퍼의 집중된 lysate 분수를 추가 하 고 단계 1.4.2를 반복. 분수를 결합 하 고 한 (4000 x g ~ 15 분 동안 4 ° C에서)에 의해 그들을 6 mL의 볼륨에 집중.
      참고: 소금, LDS 것 지금의 대부분 제거, 그래서는 lysate 클릭 반응에 대 한 준비. lysate 저장할 수 있습니다-70 ° C에서 최대 1 주일. 그들은 중요 한 RNA 강 직 귀 착될 것 이다 때문에 여러 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오. 약 수 lysate 소규모 characterizations 필요한 경우입니다.

2. RNA-위하여 샘플의 준비 캡처

  1. Preclearing는 lysate의
    1. 100 μ streptavidin 자석 구슬, lysate의 6 mL 당을 추가 하 고 부드럽게 자연스럽 게 biotinylated 단백질 제거를 실 온에서 30 분 (~ 15 rpm) 회전.
    2. 구슬을 사용 하 여 (4 ° C에서 ~ 20 분)에 대 한 자석은 precleared 전송 lysate 새로운 튜브에 작은
  2. 클릭 반응의 성능
    1. 반응 혼합 준비: 6.5 μ biotin 주식 (100 m m 아 지 드-비오 틴 디 메 틸 sulfoxide [DMSO] 100 μ M의 최종 농도에 녹아 있는)의 구리 재고의 3.25 μ (신선한 게; 1 M CuSO4 500 μ M의 최종 농도에 물에 용 해) Ligand 재고 (200 m m 2 m m의 최종 농도에 물에 녹아 있는 THPTA), 65 μ 그리고 262.75 μ H2o.
      참고: THPTA 트리 스 [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) 메 틸] 아민의 약자입니다.
    2. 반응 혼합 lysate precleared의 6 mL을 추가 하 고 잘 혼합. 다음, 추가 시 약을 줄이는 162.5 μ (신선한; 게 40 mg/mL 나트륨 하는데 최종 농도에 5 m m)는 lysate를 섞어 잘. 마지막 볼륨 6.5 mL 이어야 한다입니다.
    3. 궤도 셰이 커 (800 rpm)에 실 온에서 2 h에 대 한 반응 혼합물을 품 어. 5 mM EDTA 반응 혼합물에 추가 하 고 반응을 풀기 위해 5 분 동안 그것을 품 어.
  3. 소규모 characterizations
    1. 염료 (예를 들어, 100 m m 아 지 드-Cy5 DMSO에 용 해) 주식 대체 biotin 재고 단계 2.2.1에서 반응 혼합을 준비 합니다.
      참고: 시 약 양은 lysate의 볼륨에 따라 조정 되어야 한다. 일반적으로 lysate의 약 20 μ 수 characterizations 젤에 형광 분석 등을 위해 충분 하다.
    2. 반응 혼합은 lysate를 추가 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 다음, LDS 샘플 버퍼 (4 배)의 볼륨의 1 / 3을 추가 하 고 5 분, 55 ℃에서 변성 10% 두번째-트리 스 젤에 샘플을 해결 합니다.
      참고: 형광 신호 RNAs에 표시를 확인 하려면 컨트롤 클릭 반응 후 RNase A 소화 포함.
  4. 반응 혼합물의 정리
    1. Prechilled 메탄올 (100%)의 8 볼륨 침묵과 반응 혼합물에 추가 하 고 강 수-30 ° C에서 30 분 동안 품 어. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 강 수를 수행 합니다.
      참고: 총 볼륨 50 mL 보다 큰 경우에, 2 개의 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 반응 혼합물을 나눕니다.
    2. 준비 재구성 버퍼: 버퍼 B 8 볼륨 (1 %Brij-97, 150 mM NaCl, 그리고 50 m m triethanolamine, pH 7.4) 버퍼 A (4% 나트륨 라우릴 황산 [SDS] 및 10 mM EDTA) 한 양의 결합.
    3. 4 ° C에서 15 분 동안 4000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 펠 릿에 prechilled 메탄올의 1 ~ 2 mL를 추가 합니다. 펠 릿을 휴식 하 고 펠 릿 있는지 확인을 아래로 피 펫 완전히 없는 보이는 덩어리와 함께 일시 중단 됩니다. Prechilled 메탄올으로 튜브를 채우십시오. 2 x이이 단계를 반복 합니다.
    4. 4 ° C에서 15 분 동안 4000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 튜브 및 5 분에 대 한 다시 4000 x g 에서 원심 분리기 신중 하 게 밖으로 그릴 가능한 잔여 메탄올은 펠 렛을 방해 하지 않고 다시 넣어.
    5. 펠 릿을 재구성 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 플라스틱 펠 릿을 해산 하기 위해 위쪽 및 아래쪽. 4 ° c.에서 10 분 동안 4000 x g 에서 원심 분리기
    6. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송. 20 μ의 품질 관리 (섹션 4 참조)에 대 한 샘플을 수집 합니다.
      참고: 이제, 샘플은 RNA 위하여 캡처에 대 한 준비. 재구성 된 샘플-70 ° C에서 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.

3. RNA-위하여 캡처

  1. Streptavidin agarose 구슬의 준비
    1. 원심 분리기 15 mL 원뿔 튜브로 재구성 된 샘플의 10 mL 당 streptavidin agarose 슬러리 (800 μ 정착된 구슬의)의 1600 μ를 가져가 라.
    2. 5 분 정착된 구슬 방해 하지 않고 신중 하 게 제거 하는 상쾌한 대 4000 x g 에서 구슬 아래로 회전 합니다.
    3. 워시 50 m m Tris∙HCl (pH 7.5) 10 mL와 구슬. 구슬 (4000 x g 5 분 동안) 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 2 x이이 단계를 반복 합니다.
  2. 선호도 풀 다운
    1. 단계의 2.4.6 streptavidin agarose 구슬 (단계 3.1 참조) 정리 및 재구성 샘플을 전송. 4 ° c.에 부드러운 회전 밤새 품 어
  3. Streptavidin 구슬의 세척
    1. 구슬 (4000 x g 5 분 동안) 아래로 회전 시키십시오 그리고 새로운 튜브에는 상쾌한 전송. 20 μ의 품질 관리에 대 한 샘플을 수집 합니다.
    2. 워시 워시 버퍼는 (2 %SDS PBS, pH 7.4) 10 mL와 구슬. 부드러운 회전 (~ 12 rpm) 실 온에서 10 분 동안 품 어. 구슬 (4000 x g 5 분 동안) 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한. 1 x를 반복 합니다.
    3. 3.3.2 워시 버퍼 B (8 M 요소 및 250 m m NH4HCO3 물에 녹아 있는) 단계를 반복 합니다. 반복 단계 3.3.2 워시 버퍼 C (PBS, pH 7.4에에서 2.5 M NaCl). 다음, 워시 50 m m Tris∙HCl (pH 7.5) 10 mL와 구슬. 구슬 (4000 x g 5 분 동안) 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.
    4. 비즈를 균등 하 게 분할 하 고 두 개의 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.
  4. 캡처된 RNPs의 차입
    1. Biotin 차입 버퍼 준비: 12.5 m m biotin, 75 m m NaCl, 7.5 m m Tris∙HCl (pH 7.5), 1.5 m m EDTA, 0.15 %SDS, 0.075 %sarkosyl 및 나트륨 deoxycholate 0.02%.
      참고: 저장소 biotin에 대 한 실 온에서 버퍼 수 있습니다 침전 4 ° c.에
    2. 씻어 정착된 구슬의 400 μ, 400 μ biotin 차입 버퍼 추가 합니다.
    3. 궤도 셰이 커 (1500 rpm) 실 온에서 20 분 동안에 그들을 품 어. 그리고는 궤도 흔드는 열 블록 (1500 rpm, 65 ° C)와 10 분 회전 구슬 (7800 x g 1 분 동안) 아래에 품 어 eluted RNP 수집 합니다.
    4. 구슬, 하 신선한 biotin 차입 버퍼의 400 μ를 추가 하 고 3.4.3 단계를 반복 합니다. 2 개의 결합 한 15 mL 튜브에 elutes.
  5. RNase 소화
    1. SDS의 농도가 감소 하는 eluted RNP를 희석 버퍼의 3 개의 볼륨을 추가 합니다. 0.5 mL 한 튜브를 사용 하 여 희석된 샘플을 집중 (; 10 kDa의 분자량 컷오프와 스핀에서 ~ 30 분 동안 4 ° C에서 12000 x g ) ~ 40 μ를.
    2. 0.5 μ g/μ RNase A 추가 하 고 출시에서 복사해올된 RNAs RBPs 37 ° C에서 2 시간을 위해 그것을 품 어. 품질 관리 (섹션 4 참조) RBPs의 2 μ를 수집 합니다.

4입니다. 품질 관리

  1. 선호도 풀 다운의 효율의 제어
    1. 3.3.1 단계에서 "-풀 다운 후" 샘플의 단계 2.4.6와 10 μ에서 "-풀 다운 하기 전에" 샘플의 10 μ를 가져가 라.
    2. 표준 서쪽 오 점 절차 (10% 두번째-트리 스 젤)을 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
    3. Polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 "-풀 다운 후" 샘플의 잔류물 biotin 신호를 모니터링 하는 streptavidin HRP 켤레와 얼룩.
      참고: "-풀 다운 후" 샘플의 biotin 신호 "-풀 다운 하기 전에" 샘플의 신호의 1 / 5 보다 큰 경우에, 단계 3.1.1에서에서 사용 하는 streptavidin agarose 구슬의 양을 증가.
  2. 총 캡처 효율의 제어
    1. 받아 "-풀 다운 하기 전에" 샘플의 단계 3.5.2와 0.5 μ에서 나온된 RBP 샘플의 2 μ (0.1% 입력)로에서 2.4.6 단계.
    2. 실버 얼룩 표준 절차를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다.
      1. 민감 화 (13 m m 나2S2O3, 83 m m 나트륨 아세테이트, 30% 에탄올) 30 분 뒤 20 분 동안 고정 버퍼 (40% 에탄올, 초 산 10%)와 젤을 수정 합니다.
      2. 워시 젤 3 x 5 분 물으로 하 고, 다음, 15 m 20 분 세척에 대 한 어 그 노3 솔루션 젤 2 그것은 얼룩 1 분 물으로 x 0.24 M 나2CO3 및 0.012% 포름알데히드, 그것을 개발 하 고 45 mM EDTA는 얼룩 때 suffici 종료 ent입니다.
        참고: 캡처한 RBPs의 실버 얼룩 강도 0.1% 입력의 저것과 유사 해야 합니다.

5입니다. MS에 대 한 샘플의 준비

  1. 젤 트립 신 소화 캡처된 RBPs의 28
    1. 단계 3.5.2에서에서 출시 RBP 샘플을 1 / 4 양의 SDS 샘플 버퍼 (5 배)를 추가 합니다. 10 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성
    2. 1.5 m m 10% SDS polyacrylamide 젤에 RBPs 해결.
    3. 실버, 다음 표준 프로토콜 젤 얼룩.
    4. 실험 샘플 또는 스태킹 젤 컨트롤 샘플 (~ 15 kDa) 제거 하는 RNase의 주요 밴드의 레인 삭제하시오
    5. 작은 조각 (1 ~ 1.5 m m x 1 ~ 1.5 m m)으로 삭제 레인을 잘라.
      참고: 젤 조각의 짧은 가장자리 해야 1 m m 보다 더 짧은 피 펫 팁에 막힘을 방지 합니다.
    6. Microcentrifuge 관 젤 조각을 전송 하 고 destaining 버퍼 (100 m m 나2S2O3 의 동등한 양의 혼합물 및 30 m m K3[Fe(CN)6])와 destain.
    7. 워시 200 m m 염화 중 탄산염 (ABC)와 젤 조각 젤 조각은 완전히 무색까지.
    8. 깔끔한 이기 (ACN)의 1 mL에 젤 조각 탈수. 10 m m dithiothreitol (50mm ABC에에서 녹아 있는)의 200 μ와 함께 rehydrate 하 고 45 분 동안 56 ° C에서 품 어.
      참고: 완전히 탈수 젤 조각 매우 하드 하 고 불투명 해야 합니다. 젤 조각 인 경우 여전히 부드러운 탈수 후는 ACN을 제거 하 고 다시 탈수 깔끔한 ACN의 1 mL을 추가.
    9. 실내 온도에 젤 조각 아래로 냉각 하십시오. 58 m m iodoacetamide (50mm ABC에에서 녹아 있는)의 200 μ를 추가 하 고 어둠 속에서 45 분 동안 실 온에서 품 어.
    10. 물으로 간단히 세척 후 깔끔한 ACN의 1 mL에 젤 조각 탈수.
      참고: 젤 조각 해야 합니다 수 완전히 탈수.
    11. 적절 한 양의 10 ng/μ 트립 신 (50mm ABC 해산) 젤 조각을 rehydrate 하 고 37 ° C 12-16 h에서 품 어.
      참고: 젤 조각 해야 합니다 수 완전히 rehydrated 없는 불투명 코어. 어떤 과잉 액체를 제거 합니다.
  2. 안정 동위 원소 소화 펩 티 드의 디 메 틸 라벨 29
    1. 추출 버퍼의 200 μ를 추가 하 여 소화 펩 티 드 젤 조각에서 추출 (5% 개미 산 성 및 50% 물에 ACN)와 vortexing (1200 rpm)에서 30 분 동안 37 ° C에서 품 어.
    2. 반복 단계 5.2.1 2 배. 결합 한 microcentrifuge 관으로 추출.
    3. 진공 원심 분리 하 여 추출 된 펩 티 드를 건조.
    4. 100 mM triethylammonium 중 탄산염 (TEAB, pH 8.5)의 200 μ에 펩 티 드 reconstitute
      주의: 단계 5.2.4-5.2.6 증기 두건에서 얼음에 수행 되어야 한다.
    5. 각각 4% 채널2O 8 4 %13CD2O 실험의 μ와 제어 샘플의 8 μ를 추가 합니다.
      참고: 안정 동위 원소 라벨의 바이어스를 제어 하려면 스왑에 대 한 안정 동위 원소 실험 및 다른 생물학으로 독립적인 복제의 샘플을 제어.
    6. 0.6 M NaBH3CN의 8 μ 추가 (신선한 확인)와 섞어 잘.
    7. Vortexing와 함께 1 시간 실 온에서 샘플을 품 어.
    8. 얼음에 샘플을 식혀. 1% 암모니아 용액의 32 μ를 추가 하 여 반응을 끄다. 다음, 더 포 름 산의 16 μ를 추가 하 여 반응을 끄다.
    9. 해당 컨트롤 샘플 실험 샘플을 결합 하 여 하나의 microcentrifuge 관으로. 진공 원심 분리에 의해 샘플을 건조.
  3. 디 메 틸 표시 된 펩 티 드의 분류
    1. 준비 중지-및-이동-추출 팁 (StageTips)30.
      1. C18 막 확장 길이 10 μ 팁 삽입.
      2. 높은 pH C18 구슬 끝에 ACN에 정지의 300 μ g을 추가 합니다.
      3. 팁 팁을 안정화 하 고 바닥에서 팁을 리프트 수 있는 집에서 만든 랙 microcentrifuge 튜브에 똑바로 놓습니다.
      4. 통해 흐름에서 1400 x g 2 분 삭제에 대 한 팁을 회전 합니다.
      5. 80%의 50 μ와 팁을 씻어 10 mM ABC (pH 10.0) = 뉴스. 1 x를 반복 합니다.
        참고: 28% 수산화 암모늄을 추가 하 여 10 m m ABC 솔루션의 pH를 조정 합니다.
      6. 50%의 50 μ와 팁을 씻어 10 mM ABC (pH 10.0) = 뉴스. 1 x를 반복 합니다.
      7. 10 mM ABC (pH 10.0)의 50 μ와 팁 세척. 1 x를 반복 합니다.
    2. 10 mM ABC (pH 10.0)의 50 μ에 펩 티 드 reconstitute
    3. 재구성 된 샘플 준비 끝에 추가 합니다. 효율적인 펩타이드 바인딩 되도록 끝에 흐름 통해 다시 로드 합니다.
    4. 10 mM ABC (pH 10.0)의 50 μ와 팁 세척. 1 x를 반복 합니다.
    5. 펩 티 드의 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80%, 및 6 %50 μ와 12 분수에 대 한 단계적 elute 10 mM ABC (pH 10.0) = 뉴스.
    6. 동일한 간격으로 두 분수를 결합 (분수 1 7, 8, 2 등) 6을 결합 분수.
    7. 진공 원심 분리에 의해 샘플을 건조. 말린된 펩 티 드-30 ° c.에 저장 될 수 있다

6. MS 및 데이터 분석의 성능

  1. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석에 의해 펩 티 드 분석
    1. 0.1% 개미 산을 포함 하는 물의 단계 15에서 5.3.7 μ에서 말린된 펩 티 드 분수 reconstitute (PH 3 이어야 한다) 산도 스트립에 솔루션의 탐지 1 μ에 의해 재구성 된 펩 티 드의 pH를 확인 합니다.
    2. 액체 크로마토그래피 (LC) 열에 다시 구성 샘플을 주사. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 용 매 (용 매 물 0.1% 포 름 산, 용 매 B 포함 하는 ACN 0.1% 개미 산을 포함 하는)의 적절 한 그라디언트를 적용 합니다. 용 매 B의 전형적인 그라디언트는 다음과 같습니다: 5%-35%에서 40 분; 35-70 %를 4 분; 그리고 10 분 동안 75%에서 개최.
    3. 분무에 의해 eluted 펩 티 드를 이온화 하 고 데이터 종속 모드에서 질량 분석기를 작동. 15 가장 풍부한 이온 선택 (곱하기 충전: 2 +, 3 +, 또는 더 높은) 초기 MS에서 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 검사 (충돌 유도 된 분리, CID)에 대 한 검색. 25의 최대 기간 시간 500 동적 제외 크기 설정 s.
  2. 단백질 식별 및 MaxQuant를 사용 하 여 정량화 31
    1. 단백질 식별의 틀린 발견 비율 (루즈벨트) 0.01을 설정 하 고 정확성과 신뢰성을 증가 시키기 위해 독특한 펩 티 드의 수를 2로 설정.
    2. 세트는 최소한의 필요한 비율 계산 (고유 + 면도기) 2, 다시 계량 하는 지원 하기 위한 단백질 정량화 및 실행 사이의 일치 기능에 대 한.
  3. R/Bioconductor 패키지 limma를 사용 하 여 농축 중요성 평가 32
    1. 검토 t을 수행-적어도 3 개의 생물 복제에서 0에 대하여 Log2 배 변화를 테스트 하는 limma에 구현 된 테스트. Read.table 함수를 사용 하 여 데이터 테이블을 읽을 수 있습니다. 그런 다음 lmFiteBayes 함수를 사용 하 여 피팅 데이터에 대 한. TopTable 함수를 사용 하 여 (를 포함 하 여 평균 Log2 배 변화와 P 값) 계산 결과 내보냅니다.
    2. 루즈벨트를 제어 하기 위한 Benjamini-Hochberg 메서드를 사용 하 여 P 값을 수정 합니다.
    3. 0.01의 실험 샘플 크게 농축 단백질의 목록을 생성 하는 루즈벨트를 적용 합니다. 틀린 확실성 더 제어를 2-3 배 또는 변경의 구분을 설정 합니다.

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Representative Results

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품질 관리 단계의 대표적인 결과 표시 됩니다. 결과 단계 2.3.2 (그림 1)에서 설명 하는 젤에 형광 분석, 단계 4.1.3 (그림 2A)에서 설명 하는 서쪽 오 점 분석 및 단계 4.2.2 (그림 2B)에 설명 된 실버 얼룩 분석 수치 포함. 품질 관리 단계는 CARIC 프로토콜의 최적화를 위해 중요 합니다. 항상 대규모 RBP 식별 실험의 준비에서 품질 컨트롤을 포함 합니다.

Figure 1
그림 1: 젤 단계 2.3.2에서에서 설명 클릭 표시 된 샘플의 형광 분석. (A)이 패널 쇼 전형적인 젤 형광 패턴 클릭 표시 샘플입니다. 이중 레이블된 샘플만 높은 분자 무게 (> 250 kDa), 교차 결합 된 RNPs의 신호를 나타내는 강한 얼룩 밴드를 보여 줍니다. RNP 신호를 폐지 하려면 4SU 또는 EU 또는 다이제스트 RNase a.와 생략 낮은 분자량에서 배경 날카로운 밴드 비 특정 단백질 분류의 신호를 나타냅니다. (B) 어떤 경우에는 강한 듯한 밴드 (~ 130-250 kDa) no4SU 컨트롤 샘플에서 관찰 될 수 있다. 이 밴드는 대부분의 경우에 대 한 열 변성 동안 저하 될 것입니다 분류 uncross-연결 된 RNAs의 신호를 나타냅니다. 그것은 후속 절차 방해 하지 않습니다. CBB Coomassie = 화려한 블루. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 선호도 풀 다운 효율성 및 캡처된 RBPs의 품질 관리. 서쪽 오 점 분석은 biotin의 풀 (상쾌한) 다운 후 풀 다운 (입력) 전에 샘플 및 샘플 신호 (A)이이 패널 표시 합니다. 나머지 신호의 비율을 추정 하 고 최적화 단계 3.1.1에서에서 사용 된 비드 금액. (B)이이 패널은 얼룩 캡처된 RBPs 0.1% 입력된 총 단백질에 비해 분석을 보여줍니다. HeLa 세포에 대 한 일반적인 총 캡처 효율 ~0.05%-입력된 단백질의 0.1%를은. 이 값은 다른 세포 유형의 대사 라벨 효율의 분산으로 인해 크게 달라질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: CARIC의 대표 MS 결과. (A)이이 패널 표시 표시는 평균 화산 플롯 Log2 배 변경 및 정량된 단백질, limma 패키지에서 계산의 P 값을 조정 합니다. > 2 변화의 Log2 배와 < 0.01의 조정된 P 가치 단백질의 597 "CARIC RBPs"로 분류 되었다. (B)이이 패널 오버랩 이전 확인 된 인간의 많은 RBPs7,8와 CARIC 단백질의,9,,1011보여줍니다. 겹친된 단백질 CARIC RBPs의 나머지는 더 많은 가능성이 될 비 코딩 RBPs RBPs를 코딩 주로 있다. 이 그림은 국립 과학 아카데미27허가 이전에 게시 작업에서는 재발급. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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공정한 RNA 무결성의 유지 관리는 성공적인 CARIC 실험 키 중 하나입니다. Cu(I) 및 주의 적절 한 ligands와 RNA 저하 줄일 수 있습니다 상당히, 비록 부분 저하 관찰 했다. EU와 실험 샘플에서 4SU의 대체 비율은 1.18%와 0.46%, 각각 (데이터 표시 되지 않음). 2000의 길이 그대로 RNAs에 대 한 nt, RNAs의 ~ 90% 이상의 EU 및 한 4SU 포함. 부분적으로 저하 RNAs의 길이 대 한 nt, RNAs의 ~ 70% 포함 하나 이상 EU와 한 4SU. 따라서, RNAs의 부분 저하는 극적으로 감소 하지 CARIC의 효율성 동안 심각한 저하 허용 되지 않습니다.

또 다른 중요 한 단계는 단계 1.4, 클릭 반응에 대 한 준비입니다. Cu (I)-촉매 클릭 RNAs에 반응이 LDS 농도에 민감 하다. LDS의 높은 농도 (> 0.1%)는 라벨 EU 포함 된 RNAs에 신호와 배경 신호 단백질 (데이터 표시 되지 않음)에 한 증가의 감소를 이어질 것입니다.

EU, 뿐만 아니라 CARIC 또한 아데노신33,,3435,36의 alkynyl 및 azido 아날로그 같은 다른 가능한 nucleosides와 호환 됩니다. 그러나, CARIC의 응용 프로그램은 크게 관심의 생물 학적 시스템에서 부자연 스러운 클릭할 nucleosides의 대사 효율에 의해 제한 됩니다. 따라서,이 프로토콜에서 설명 이외의 조건을 사용 하 여 CARIC를 수행 하기 전에 항상 대사 라벨 효율 (예를 들어, 형광 영상에 의해) 확인 합니다.

최근, 릭 (클릭 화학을 사용 하 여 새로 베 껴 진된 RNA 위하여 캡처)는 총 RNAs 라벨만 유럽 통합 및 RNAs 및 단백질 상호 링크를 254 nm 자외선을 사용 하 여, 라는 비슷한 전략 보고37이었다. 특히, 모든 4 개의 자연 nucleosides로 EU 254 nm UV 활성화할 수 있습니다. 따라서, 254 nm UV 방사선 조사 수 있습니다 상호 링크 무료 EU와 그것의 대사 산물 (예를 들면, EU 인산 염) 수 고려 한다 가능한 가양성으로 해당 바인딩 단백질으로.

CARIC의 한 흥미로운 응용 프로그램은 RBPs 누구의 RNAs는 주로 비 polyadenylated 박테리아에서입니다. RBPs의 대규모 식별 박테리아38posttranscriptional 규정의 분자 기초를 이해 하는 귀중 한 자원을 제공할 것 이다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 보조금 91753206, 21425204, 21521003 그리고 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 2016YFA0501500에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략
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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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