Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

En detaljert protokoll for å bruke Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC) strategi for å identifisere proteiner bindende til både koding og noncoding RNAs presenteres.

Abstract

En omfattende identifikasjon av RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøkkelen til å forstå posttranscriptional regulatoriske nettverket i celler. En brukte strategi for RBP fange utnytter polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, som stort sett oppstår på eukaryote moden mRNAs, forlater de fleste bindende proteiner av non-poly(A) RNAs uidentifisert. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av en nylig rapportert metode kalt Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC), som gjør transcriptome hele erobringen av både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved å kombinere metabolske merkingen av RNAs, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal merking.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det menneskelige genomet er transkribert til ulike typer koding og noncoding RNAs (ncRNAs), inkludert mRNAs, rRNAs, tRNAs, liten kjernefysiske RNAs (snRNAs), liten nucleolar RNAs (snoRNAs) og lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs)1. De fleste av disse RNAs har klær av RBPs og fungerer som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. Derfor er en omfattende identifikasjon av RBPs en forutsetning for å forstå regulatoriske nettverket mellom RNAs og RBPs, som er involvert i ulike menneskelige sykdommer3,4,5.

De siste årene har sett en stor forbedring av RBPs i ulike eukaryote systemer2,6, inkludert menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gjær9,15,16, sebrafisk17 Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskrittene har blitt lettere ved en RBP datafangst strategi utviklet av Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking RNA og samspill proteiner, oligo(dT) fange av poly(A) RNAs og massespektrometri (MS)-basert proteomic profilering. Gitt det faktum at poly(A) hovedsakelig finnes på eldre mRNAs, som står for bare ~ 3-5% av eukaryote transcriptome26, er dette brukte strategi imidlertid ikke kan fange RBPs samspill med non-poly(A) RNAs, inkludert de fleste ncRNAs og pre-mRNAs.

Her rapporterer vi detaljerte prosedyrer på en nylig utviklet strategi for transcriptome hele tatt både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Kalt CARIC, denne strategien kombinerer i vivo UV cross-linking og metabolske merking av RNAs med analogs med photoactivatable og "klikkbare" nukleosid (som inneholder en bioorthogonal funksjonsgruppe som kan delta i Klikk reaksjon), 4 - thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Fremgangsmåten for å få perfekte resultater med CARIC strategi er effektiv metabolske merking, UV cross-linking og klikk reaksjon og vedlikehold av RNA integritet. Fordi Cu(I) brukes som katalysator Klikk reaksjon kan forårsake fragmentering av RNAs, er en Cu(I) ligand som kan redusere RNA fragmentering viktig. Vi beskriver hvordan du utfører effektiv Klikk reaksjoner i celle lysates uten å forårsake alvorlige RNA nedbrytning.

Selv om RBP fange og identifisering i HeLa celler bare er beskrevet i denne protokollen, kan CARIC strategien brukes ulike celletyper og muligens levende organismer. Foruten RBP fange gir denne protokollen også strømlinjeformet trinnvise fremgangsmåter for MS utvalg forberedelse og protein identifikasjon og måling, som kan være nyttig for de som ikke er kjent med proteomic eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FORSIKTIG: Eventuelt reagensene brukes bør kjøpes i form av RNase-fri, eller oppløst i RNase-fri, løsemidler (i de fleste tilfeller, i diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann). Ved håndtering av RNA prøver og RNase-fri reagenser, alltid bruke hansker og masker, og endre dem ofte for å unngå RNase forurensning.

1. forberedelse av Lysate av Metabolically merket og UV krysskoblet celler

  1. Metabolsk innlemmelse av EU og 4SU
    1. Kultur HeLa celler i Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin på 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Kultur ~ 4 x 107 HeLa celler (i to 15 cm retter) for å forberede en eksperimentell eller kontrollere prøven for standard MS kjøre.
    2. Når kulturperler HeLa cellene nå ~ 80% samløpet, fjerner kultur medium og legge 15-mL av prewarmed frisk medium per 15 cm parabolen.
    3. Legge til 15 μL per fat med 100 mM EU (oppløst i fosfat-bufret saltvann (PBS)) til en siste konsentrasjon av 1 mM og 7,5 μL per fat med 100 mM 4SU (oppløst i PBS) til en siste konsentrasjon på 0,5 mM for eksperimentell og noUV-kontroll prøver. Tilsett 15 μL per fat med 100 mM EU (oppløst i PBS) en siste konsentrasjon av 1 mM for no4SU-kontroll prøver.
      Merk: 4SU er Foto-activatable; dermed kreves mot lyset etter 4SU.
    4. Dekke retter med folie og kultur celler for 16 h. Legg halvparten av EU og 4SU eller bare EU trinn 1.1.3 til den eksperimentelle, noUV- og no4SU-kontroll prøver, henholdsvis, og fortsette dyrking for en annen 2 timer.
  2. I vivo UV cross-linking
    1. Fjerne kultur medium, vaske cellene 3 x med 5 mL PBS per fat, og fjern gjenværende PBS som mulig.
      Merk: Rester væske vil redusere cross-linking effektivitet.
    2. For eksperimentelle og no4SU-kontroll prøver, plassere rettene på is med lokk fjernet og irradiate cellene med 365-nm UV-lys på 2 J/cm2 av en UV kryss-linker.
    3. For noUV-kontroll prøver, plasser rettene på is og beskytte dem mot lyset.
      Merk: Alle følgende trinn for noUV-kontroll prøver skal utføres i et mørkt rom.
  3. Cellen lyse og homogenisering
    1. Legge 1 mL per fat med pre lyseringsbuffer (10 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 50 mM LiCl, 0.02% Nonidet P-40 og ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA)-gratis protease hemmer cocktail) til cellene. Skrape cellene med en gummi celle lifter og samle pre lysis suspensjon i en 15-mL tube.
      Merk: Dette trinnet vil bryte cellemembranen og slipp løselig cytoplasmatiske proteiner og RNAs. Ikke sentrifuge røret og fjerne nedbryting.
    2. Justere volumet til 6 mL ved å legge til pre lyseringsbuffer suspensjon fra to 15 cm retter. Legge til pre lysis suspensjon en lik mengde R-lyseringsbuffer (200 mM Tris∙HCl, pH 7.5 500 mM LiCl, 2% litium dodecyl sulfate [LDS]).
    3. Homogenize cellen lysate av passerer det gjennom en sprøyte med en smal nål (27-G) flere ganger til den lysate er klare og homogen. Inkuber lysate på 4 ° C med mild rotasjon (~ 15 rpm) 1t.
      Merk: Dette siste trinnet kan fullstendig denaturing av proteiner. Den lysate kan trygt lagret på-70 ° C i opptil en måned.
  4. Forberedelse til Klikk reaksjon
    1. Fortynne den lysate ved å legge til 20 mengder fortynning buffer (50 mM Tris∙HCl, pH 7.5) og dele den inn i 15-mL fraksjoner.
      Merk: Løsninger som inneholder en høy konsentrasjon av salt og vaskemiddel vil svekke effektiviteten av Cu (I)-katalysert Klikk reaksjon; Dermed må bufferen for det lysate endres.
    2. Konsentrere seg hver fraksjon ved hjelp av en 15 mL ultrafiltrasjon tube (med en molekylvekt cutoff av 10 kDa) til volumet er mindre enn 1 mL. Bruk en svingende bøtte rotor for å spinne ultrafiltrasjon røret 4000 x g på 4 ° C i ~ 15 min.
    3. Legge til 14 mL fortynning bufferen til konsentrert lysate brøk og gjentar trinn 1.4.2. Kombiner fraksjoner og konsentrer dem til et volum på 6 mL av ultrafiltrasjon (4000 x g på 4 ° C i ~ 15 min).
      Merk: De fleste salt og LDS vil nå bli fjernet, så de lysate er klar for klikk reaksjonen. Den lysate kan lagres ved-70 ° C i opptil en uke. Unngå flere fryse-Tin sykluser, fordi de vil føre til betydelig RNA degradering. Aliquot lysate hvis småskala karakteristikk.

2. forberedelse av prøver for RNA-interactome fange

  1. Preclearing av den lysate
    1. Legg 100 μL streptavidin magnetiske perler per 6 mL av lysate, og forsiktig rotere (~ 15 rpm) for 30 min ved romtemperatur å eliminere naturlig biotinylated proteiner.
    2. Pellets perler med en magnet (for ~ 20 min på 4 ° C) og overføring av precleared lysate til en ny tube.
  2. Ytelsen til Klikk reaksjonen
    1. Forberede reaksjonen blanding: 6,5 μL biotin lager (100 mM azide-biotin oppløst i dimethyl sulfoxide [DMSO] i en siste konsentrasjon av 100 μM), 3,25 μL kobber lager (gjør det frisk, 1 M CuSO4 oppløst i vann på en siste konsentrasjon av 500 μM) , 65 μL ligand lager (200 mM THPTA oppløst i vann på en siste konsentrasjon av 2 mM), og 262.75 μL av H2O.
      Merk: THPTA står for Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] Amin.
    2. Legge til reaksjonen blanding 6 mL av precleared lysate og bland godt. Legg deretter til 162.5 μL redusere reagens (gjør det frisk; 40 mg/mL natrium ascorbate på en siste konsentrasjon 5 mM) å det lysate og bland godt. Det siste bindet skal 6,5 mL.
    3. Inkuber reaksjonsblandingen for 2 timer ved romtemperatur på en orbital shaker (800 rpm). Legge til 5 mM EDTA reaksjonsblandingen og ruge for 5 min å slukke reaksjonen.
  3. Småskala karakteristikk
    1. Forberede reaksjonen blanding som i trinn 2.2.1 med biotin lager erstattet av fargestoff lager (f.eks, 100 mM azide-Cy5 oppløst i DMSO).
      Merk: Hvor reagens bør justeres av lysate. En 20-μL aliquot av det lysate er vanligvis nok for karakteristikkene som en i-gel fluorescens analyse.
    2. Legge til reaksjonen blanding av lysate og ruge det for 2 timer ved romtemperatur. Deretter legge til en tredjedel av volumet av LDS eksempel bufferen (4 x) denature det ved 55 ° C i 5 min og løse prøven på en 10% bis-Tris gel.
      Merk: For å bekrefte fluorescens signalet er presentert på RNAs, Inkluder kontroller RNase A fordøyelsen etter Klikk reaksjon.
  4. Opprydding reaksjonsblandingen
    1. Legge til åtte mengder prechilled metanol (100%) Let reaksjonsblandingen og ruge det i 30 min på 30 ° C for nedbør. Utføre nedbør i 50-mL konisk sentrifuge rør.
      Merk: Hvis det totale volumet er større enn 50 mL, dele reaksjonsblandingen i to 50 mL konisk sentrifuge rør.
    2. Forberede rekonstituering buffer: kombinere ett volum bufferen A (4% natrium dodecyl sulfate [SDS] og 10 mM EDTA) med åtte mengder buffer B (1% Brij-97, 150 mM NaCl og 50 mM trietanolamin, pH 7.4).
    3. Sentrifuge 4000 x g i 15 min på 4 ° C og kast nedbryting. Legg ~ 1-2 mL prechilled metanol i pellet. Pipetter opp og ned for å bryte pellet og sikre pellet er helt suspendert med ingen synlig biter. Fyll røret med prechilled metanol. Gjenta dette trinnet 2 x.
    4. Sentrifuge 4000 x g i 15 min på 4 ° C og kast nedbryting. Satt tilbake av rør og sentrifuge igjen på 4000 x g for 5 min. nøye trekke ut resterende metanol som mulig uten å forstyrre pellet.
    5. Legge til 10 mL rekonstituering bufferen i pellets. Pipetter opp og ned for å oppløse pellet. Sentrifuger 4000 x g i 10 min på 4 ° C.
    6. Overføre nedbryting til en ny tube. Samle 20 μL utvalget for kvalitetskontroll (se Seksjon 4).
      Merk: Nå prøven er klar for RNA-interactome fange. Rekonstituert utvalget kan lagres ved-70 ° C i opptil en uke.

3. RNA-interactome fange

  1. Utarbeidelse av streptavidin-agarose perler
    1. Ta 1600 μL streptavidin agarose slurry (800 μL utlignede perler) per 10 mL av rekonstituert prøve et 15-mL konisk sentrifuge rør.
    2. Nedspinning perler på 4000 x g for 5 min. forsiktig fjerne nedbryting uten å forstyrre den utlignede perler.
    3. Vask perler med 10 mL av 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Nedspinning perler (4000 x g i 5 min) og fjerne nedbryting. Gjenta dette trinnet 2 x.
  2. Affinitet pulldown
    1. Overføre renset opp og rekonstituert prøven fra trinn 2.4.6 til streptavidin-agarose perler (se trinn 3.1). Ruge over natten med mild rotasjon på 4 ° C.
  3. Vask av streptavidin perler
    1. Nedspinning perler (4000 x g i 5 min) og overføre nedbryting til en ny tube. Samle 20 μL utvalget for kvalitetskontroll.
    2. Vask perler med 10 mL vaskebuffer en (2% SDS i PBS, pH 7.4). Inkuber i 10 min med mild rotasjon (~ 12 rpm) i romtemperatur. Nedspinning perler (4000 x g i 5 min) og fjerne nedbryting. Gjenta 1 x.
    3. Gjenta trinn 3.3.2 med vaskebuffer B (8 M urea og 250 mM NH4HCO3 oppløst i vann). Gjenta trinn 3.3.2 med vaskebuffer C (2,5 M NaCl i PBS, pH 7.4). Deretter vaskes perler med 10 mL av 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Nedspinning perler (4000 x g i 5 min) og fjerne nedbryting.
    4. Delt perlene jevnt og overføre dem til to 1,5-mL microcentrifuge rør.
  4. Elueringsrør av de fanget RNPs
    1. Forberede biotin elueringsbufferen: 12.5 mM biotin, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris∙HCl (pH 7.5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0.075% sarkosyl og 0.02% natrium deoxycholate.
      Merk: Store bufferen ved romtemperatur, for biotin kan utløse på 4 ° C.
    2. Legge til 400 μL biotin elueringsbufferen 400 μL vasket utlignede perler.
    3. Inkuber dem på en orbital shaker (1500 rpm) ved romtemperatur for 20 min. Deretter ruge på en orbital shaker med en varme blokk (1500 rpm, 65 ° C) i 10 min. spinn ned perler (7800 x g for 1 min) og samle de eluted RNP.
    4. Legge til 400 μL frisk biotin elueringsbufferen perler, og gjenta trinn 3.4.3. Kombinere de to elutes i en 15-mL tube.
  5. RNase fordøyelse
    1. Legge til tre mengder fortynning buffer i eluted RNP å redusere konsentrasjonen av SDS. Konsentrere utvannet prøven ved å bruke en 0,5 mL ultrafiltrasjon tube (med en molekylvekt cutoff av 10 kDa; spinn på 12.000 x g ved 4 ° C i ~ 30 min) til ~ 40 μL.
    2. Legg til 0,5 μg/μL RNase A og ruge det 2 h på 37 ° C å løslate RBPs fra krysskoblet RNAs. Samle 2 μL RBPs for kvalitetskontroll (se Seksjon 4).

4. kvalitetskontroll

  1. Kontroll av effektiviteten av affinitet rullegardinmenyen
    1. Ta 10 μL "før-rullegardinmenyen" utvalget fra trinn 2.4.6 og 10 μL "etter-rullegardinmenyen" utvalget fra trinn 3.3.1.
    2. Analysere eksemplene bruker standard western blot prosedyrer (10% bis-Tris gel).
    3. Flekk polyvinylidene fluor (PVDF) membranen med streptavidin-HRP-konjugert overvåke rester biotin signaler av "etter-rullegardinmenyen" utvalget.
      Merk: Hvis biotin signalet på "etter-rullegardinmenyen" utvalget er større enn en femtedel av "før-rullegardinmenyen" prøven, øke mengden av streptavidin-agarose perler brukt i trinn 3.1.1.
  2. Kontroll av total fangst effektiviteten
    1. Ta 2 μL utgitt RBP prøven fra trinn 3.5.2 og 0,5 μL "før-rullegardinmenyen" prøven (som 0,1% inndata) fra trinn 2.4.6.
    2. Analysere eksemplene bruker standard sølv flekker prosedyrer.
      1. Fastsette gel med fiksering bufferen (40% etanol, 10% eddiksyre) for 20 min etterfulgt av allergi (13 mM Na2S2O3, 83 mM natrium acetate, 30% etanol) i 30 min.
      2. Vask gel 3 x med vann til 5 min og deretter flekk det med 15 mM AgNO3 løsning for 20 min. vask gel 2 x med vann for 1 min, utvikler det i 0,24 M Na2CO3 og 0.012% formaldehyd, og avslutte med 45 mM EDTA når den flekker er suffici ENT.
        Merk: Sølv flekker intensiteten av de fanget RBPs skal sammenlignes med 0,1% input.

5. forberedelse av prøvene til MS

  1. I-gel trypsin fordøyelsen av fanget RBPs 28
    1. Legge til en fjerdedel volumet av SDS eksempel buffer (5 x) utgitt RBP prøvene fra trinn 3.5.2. Denature prøven ved 95 ° C i 10 min.
    2. Løse RBPs på en 1,5 mm 10% SDS-polyakrylamid gel.
    3. Stain gel med sølv, følgende standardprotokoller.
    4. Avgiftsdirektoratet kjørefelt av eksperimentelle utvalg eller kontroll prøven med stabling gel og den store bandet av RNase en (~ 15 kDa) fjernet.
    5. Skjær forbrukeravgift kjørefelt i små biter (~ 1-1,5 x ~ 1-1,5 mm).
      Merk: Den korteste kanten av gel arb skal ikke kortere enn 1 mm å hindre tilstopping i pipette-spisser.
    6. Overføre gel bitene til et microcentrifuge rør og destain med destaining buffer (en blanding av like volum av 100 mM Na2S2O3 og 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Vask gel bitene med 200 mM ammonium bikarbonat (ABC) til gel bitene er helt fargeløs.
    8. Tørke gel bitene i 1 mL av pen acetonitrile (ACN). Rehydrate med 200 μL av 10 mM dithiothreitol (oppløst i 50 mM ABC) og ruge på 56 ° C i 45 min.
      Merk: Helt dehydrert gel stykker bør være veldig hardt og ugjennomsiktig. Hvis gel bitene er fortsatt myk etter dehydrering, fjerner ACN og legger 1 mL av pen ACN å tørke igjen.
    9. Avkjøl gel bitene til romtemperatur. Tilsett 200 μL av 58 mM iodoacetamide (oppløst i 50 mM ABC) og ruge ved romtemperatur for 45 min i mørket.
    10. Etter en kort vask med vann, tørke gel bitene i 1 mL av pen ACN.
      Merk: Gel brikkene må være helt dehydrert.
    11. Rehydrate gel bitene med riktig mengde 10 ng/μL trypsin (oppløst i 50 mM ABC) og ruge ved 37 ° C i 12-16 h.
      Merk: Gel brikkene må være helt utvannet med ingen ugjennomsiktig kjerner. Fjern overflødig væske.
  2. Stabil isotop dimethyl merking av fordøyd peptider 29
    1. Ekstra fordøyd peptidene fra gel bitene av tilføyer 200 μL utvinning bufferen (5% maursyre og 50% ACN i vann) og Inkuber på 37 ° C i 30 min med vortexing (på 1200 rpm).
    2. Gjenta trinn 5.2.1 Oppgi 2 x. Kombinere ekstrakter til en microcentrifuge tube.
    3. Tørr utdraget peptidene med vakuum sentrifugering.
    4. Rekonstituer peptider i 200 μL av 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB, pH 8.5).
      FORSIKTIG: Trinn 5.2.4 - 5.2.6 skal utføres på is i avtrekksvifte.
    5. Tilsett 8 μL av 4% lm2O og 8 μL 4% 13CD2O den eksperimentelle og kontroll prøver, henholdsvis.
      Merk: For å kontrollere skjevheten av stabile isotopanrikning merking, bytte stabil isotopen for eksperimentelle og kontroll prøver av den andre biologisk uavhengig replikere.
    6. Legge til 8 μL 0.6 M NaBH3CN (gjør det friske) og bland godt.
    7. Inkuber prøvene ved romtemperatur 1t med vortexing.
    8. Avkjøl prøvene på is. Slukke reaksjonen ved å legge til 32 μL 1% ammoniakk vandig løsning. Deretter videre slukke reaksjonen ved å legge til 16 μL maursyre.
    9. Kombinere eksperimentelle prøven med tilsvarende kontroll prøven i en microcentrifuge tube. Tørr prøvene av vakuum sentrifugering.
  3. Fraksjoneres av dimethyl-merket peptider
    1. Forberede stopp-og-gå-utvinning tips (StageTips)30.
      1. Sett inn en C18 membran i en utvidet lengde, 10-μL tips.
      2. Legge til 300 μg av høy pH C18 perler suspendert i ACN til spissen.
      3. Plass tuppen oppreist i et microcentrifuge rør med en hjemmelaget rack som kan stabilisere spissen og Løft spissen av bunnen.
      4. Spinne spissen 1400 x g i 2 min. kast gjennomflytsenhet.
      5. Vask spissen med 50 μL av 80% ACN i 10 mM ABC (pH 10.0). Gjenta 1 x.
        Merk: Justere pH i 10 mM ABC løsning ved å legge til 28% ammonium hydroksid.
      6. Vask spissen med 50 μL av 50% ACN i 10 mM ABC (pH 10.0). Gjenta 1 x.
      7. Vask spissen med 50 μL av 10 mM ABC (pH 10.0). Gjenta 1 x.
    2. Rekonstituer peptider i 50 μL av 10 mM ABC (pH 10.0).
    3. Legge til rekonstituert prøven forberedt spissen. Reload gjennomflytsenhet til spissen å sikre effektiv peptid bindende.
    4. Vask spissen med 50 μL av 10 mM ABC (pH 10.0). Gjenta 1 x.
    5. Elute peptid gradvis for 12 brøker med 50 μL av 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% og 6% ACN i 10 mM ABC (pH 10.0).
    6. Kombinere to fraksjoner med en lik intervallet (del 1 i 7 2 med 8, og så videre) å få seks kombinert fraksjoner.
    7. Tørr prøvene av vakuum sentrifugering. Tørket peptidene kan lagres på-30 ° C.

6. ytelsen til MS og dataanalyse

  1. Peptid analyse av flytende kromatografi-tandem massespektrometri
    1. Rekonstituer tørket peptid fraksjoner fra trinn 5.3.7 i 15 μL vann med 0,1% maursyre. Kontrollere pH av rekonstituert peptider ved småblødninger 1 μL løsningen på en pH stripe (pH bør være under 3).
    2. Injisere Rekonstituer prøven i kolonnen flytende kromatografi (Langbane). Bruke en passende forløpning løsemiddel (løsemiddel er vann med 0,1% maursyre, løsemiddel B er ACN som inneholder 0,1% maursyre) i høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). En typisk gradering løsemiddel B er som følger: 5% - 35% i 40 min; 35% - 70% i 4 min; og holdt på 75% for 10 min.
    3. Ionisere de eluted peptidene ved electrospray og drive de masse spectrometer i data-avhengige modus. Velg 15 rikeste ioner (multiplisere ladet: 2 + 3 + og høyere) i første MS skanne en tandem massespektrometri (MS-/ MS) skanning (kollisjon-indusert dissosiasjon, CID). Angi dynamisk utelukkelse til 500 med maksimale varigheten tid 25 s.
  2. Protein identifikasjon og måling med MaxQuant 31
    1. Angi falske funnrate (FDR) protein identifikasjon til 0,01 og angi antall unike peptider til 2 for å øke nøyaktigheten og påliteligheten.
    2. Sett den minimale kreves forholdet teller (unik + barberhøvel) for protein kvantifisering 2, og Aktiver den å kvantifisere og mellom kjører funksjoner.
  3. Berikelse betydningen evaluering bruker R/Bioconductor pakke limma 32
    1. Utføre en moderert t-test i limma å teste Log2-fold endringen mot null fra minst tre biologiske gjentak. Bruk funksjonen read.table for å lese tabellen. Deretter Bruk funksjonene lmFit og eBayes for data passer. Bruk funksjonen topTable eksportere beregningsresultatene (inkludert gjennomsnitt Log2 ganger endre og P -verdier).
    2. Korrigere P verdiene ved hjelp av Benjamini-Hochberg-metoden for å kontrollere FDR.
    3. Bruke en FDR av 0,01 for å generere en liste over proteiner betydelig beriket i eksperimentell utvalgene. Angi en cutoff av to - eller tredelt til å styre den falske positiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Representant resultatene av kvalitetskontroll trinnene presenteres. Resultatene omfatter tall i-gel fluorescens analysen beskrevet i trinn 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet i trinn 4.1.3 (figur 2A) og sølv flekker analysen beskrevet i trinn 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontroll trinnene er avgjørende for optimalisering av CARIC protokoller. Alltid inkludere kvalitetskontroll i utarbeidelsen av store RBP identifikasjon eksperimenter.

Figure 1
Figur 1: I-gel fluorescens analyse av Klikk-merket prøvene beskrevet i trinn 2.3.2. (A) dette panelet viser en typisk i-gel fluorescens mønster av Klikk-merket prøver. Bare dobbelt merket eksemplet viser en sterk smøre band på en høy molekylvekt (> 250 kDa), som representerer signalet fra krysskoblet RNPs. For å avskaffe RNP signalet, Utelat enten 4SU eller EU eller digest med RNase A. Bakgrunn skarpe band på en lavere molekylvekt representerer signaler om ikke-spesifikk merket proteiner. (B) i enkelte tilfeller kan en sterk smurte band (~ 130-250 kDa) kan observeres i no4SU-kontroll prøven. Dette bandet representerer signalet fra merket uncross-koblet RNAs, som vil reduseres under den varme rødsprit, i de fleste tilfeller. Det vil ikke påvirke senere prosedyrer. CBB = Coomassie briljant blå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll affinitet pulldown effektivitet og fanget RBPs. (A) dette panelet viser en western blot analyse av biotin signaler i prøver før pulldown (inngang) og i prøver etter pulldown (nedbryting). Beregne forholdet mellom gjenstående signaler og optimalisere perle beløpet brukt i trinn 3.1.1. (B) dette panelet viser en sølv flekker analyse av fanget RBPs sammenlignet med 0,1% input totale proteiner. HeLa celler er generelle totale fange effektiviteten ~0.05% - 0,1% av input proteiner. Denne verdien kan variere betydelig på grunn av variansen av metabolske merking effektiviteten av forskjellige celletyper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant MS resultatene CARIC. (A) dette panelet viser en vulkan handlingen viser den gjennomsnittlige Log2 ganger endre og justert P -verdier av kvantifisert proteiner, beregnet ved limma pakken. 597 proteiner med Log2-fold endre > 2 og en justert P -verdien for < 0,01 var klassifisert som «CARIC RBPs». (B) dette panelet viser overlappingen av CARIC proteiner med tidligere identifisert menneskelig poly(A) RBPs7,8,9,10,11. Overlappet proteiner er hovedsakelig koding RBPs, mens resten av de CARIC RBPs er mer sannsynlig å være ikke-koding RBPs. Dette tallet er et opptrykk fra tidligere publiserte arbeid med tillatelse fra National Academy of Sciences27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vedlikehold av rettferdig RNA integritet er en av nøklene til vellykket CARIC eksperimenter. Med riktig ligander av Cu(I) og forsiktig operasjon, kan RNA fornedrelse reduseres betydelig, selv om delvis fornedrelse ble observert. Substitusjon prosenter av EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0.46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakt RNAs med en lengde på 2000 nt ~ 90% av RNAs inneholder minst én EU og en 4SU. For delvis dårligere RNAs med en lengde på 1000 nt ~ 70% av RNAs inneholder minst én EU og en 4SU. Derfor reduseres delvis nedbrytning av RNAs dramatisk ikke effektiviteten av CARIC, mens alvorlig degradering ikke er akseptabelt.

Et annet viktig skritt er skritt 1.4, forberedelse til Klikk reaksjonen. Cu (I)-catalyzed Klikk reaksjon på RNAs er følsom for LDS konsentrasjon. En høy konsentrasjon (> 0,1%) av LDS vil føre til en reduksjon av merking signaler på EU-inneholder RNAs og en økning av bakgrunnen signaler på proteiner (data ikke vist).

I tillegg til EU er CARIC også kompatibel med andre klikkbare nucleosides, som alkynyl og azido analogs av adenosin33,34,35,36. Men begrenset anvendelsen av CARIC betydelig av metabolske effektiviteten av unaturlig klikkbare nucleosides i et biologisk system av interesse. Derfor før utføre CARIC betingelser ikke vist i denne protokollen, alltid sjekke metabolske merking effektiviteten (f.eksav fluorescerende tenkelig).

Nylig var en lignende strategi kalt RICK (fange av den nylig transkribere RNA interactome bruker Klikk kjemi), som inneholder bare EU Hvis etiketten totalt RNAs og bruker 254-nm UV for å link RNAs og proteiner, rapportert37. Spesielt kan 254-nm UV aktivere alle fire naturlige nucleosides, i tillegg til EU. 254-nm UV bestråling kan dermed link gratis EU og dets metabolitter (f.eks, EU fosfater) med tilhørende bindingen proteiner, som skal tas i betraktning som mulig falske positiver.

En interessant anvendelse av CARIC er å identifisere RBPs i bakterier som RNAs er hovedsakelig ikke-polyadenylated. Store identifikasjonen av RBPs vil gi uvurderlig ressursene for å forstå molekylær grunnlag av posttranscriptional bestemmelser i bakterier38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er støttet av den nasjonale Natural Science Foundation av Kina tilskudd 91753206, 21425204, og 21521003 og ved nasjonale nøkkelen forskning og utviklingsprosjektet 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter