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Biochemistry

Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी

Published: October 19, 2018 doi: 10.3791/58581
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université Grenoble Alpes, INRA, CNRS, CEA

Summary

यहां, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए Arabidopsis पत्तियों और उनके तीन मुख्य उप डिब्बों से बरकरार chloroplasts शुद्ध (लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids), अंतर केंद्रापसारक के एक संयोजन का उपयोग, सतत Percoll ढाल, और निरंतर सुक्रोज ग्रैडिएंट । विधि immunoblotting और प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन के subplastidial और सेलुलर स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है ।

Abstract

Chloroplasts संयंत्र कोशिकाओं के प्रमुख घटक हैं । इस तरह के plastids कार्बन, सल्फर और नाइट्रोजन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आवश्यक चयापचयों के संश्लेषण के आत्मसात के रूप में कई महत्वपूर्ण कार्यों, पूरा । ये organelles निम्नलिखित तीन प्रमुख उप-डिब्बों से मिलकर बनता है. लिफाफा, दो झिल्ली की विशेषता, organelle के चारों ओर और अन्य कोशिका डिब्बों के साथ plastid के संचार को नियंत्रित करता है । स्ट्रोमा chloroplast और मुख्य साइट है जहां कार्बन डाइऑक्साइड कार्बोहाइड्रेट में परिवर्तित हो जाता है की घुलनशील चरण है । thylakoid झिल्ली आंतरिक झिल्ली grana से मिलकर नेटवर्क है (फ्लैट संकुचित sacs) और lamellae (कम घने संरचनाओं), जहां ऑक्सीजन प्रकाश संश्लेषण जगह लेता है । वर्तमान प्रोटोकॉल शुद्धि के लिए आवश्यक कदम से कदम प्रक्रियाओं का वर्णन, विभेदक केंद्रापसारक और Percoll ढाल का उपयोग, Arabidopsisसे बरकरार chloroplasts की, और उनके अंश, सुक्रोज ढाल का उपयोग, तीन में उप डिब्बों (यानी, लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids) । इस प्रोटोकॉल भी विभिंन chloroplast उप डिब्बों से जुड़े मार्करों का उपयोग कर इन अंशों की शुद्धता का आकलन करने के लिए कैसे पर निर्देश प्रदान करता है । यहां वर्णित विधि immunoblotting का उपयोग प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है, लेकिन यह भी उपसेलुलर और subplastidial प्रोटियोमिक् और अंय अध्ययनों के लिए ।

Introduction

Chloroplasts संयंत्र कोशिकाओं के प्रमुख घटक हैं । वे एक cyanobacterial पूर्वज है कि एक endosymbiosis आया है और अंत में विकास के दौरान एक organelle के रूप में विकसित से व्युत्पंन1,2। इस तरह के organelles तीन मुख्य डिब्बों (चित्रा 1) होते हैं । लिफाफा प्रणाली एक आंतरिक और एक बाहरी organelle आसपास की झिल्ली से बना है । इस डबल झिल्ली प्रणाली विभिंन लिपिड और pigments के चयापचय में शामिल एंजाइमों शामिल है और ज्यादातर plastids और cytosol के बीच संचार के नियंत्रण के लिए समर्पित है । यह विभिंन परिवहन प्रणालियों कि परमाणु इनकोडिंग प्रोटीन के आयात की अनुमति है, और आयनों और cytosol और chloroplast के बीच चयापचयों के आदान प्रदान इस प्रकार संयंत्र सेल3,4 के आवश्यक चयापचय कार्यों को विनियमित शामिल . स्ट्रोमा, chloroplast के घुलनशील चरण, केल्विन चक्र के एंजाइमों शामिल (सह2 आत्मसात), एमिनो एसिड और विटामिन सहित विभिंन चयापचयों के संश्लेषण, और प्रतिलेखन और plastid के अनुवाद मशीनरी । thylakoid झिल्ली एक व्यापक रूप से आयोजित आंतरिक झिल्ली नेटवर्क जहां प्रकाश संश्लेषण के चरण जगह लेता है । इस प्रकार, chloroplasts जगह है जहां आवश्यक चयापचय रास्ते होते है5।

आदेश में नए विनियामक तंत्र है कि chloroplast गतिशीलता और शरीर विज्ञान नियंत्रण समझने के लिए, chloroplast प्रोटीन के उप plastidial स्थानीयकरण परिभाषित इस प्रकार बेहतर प्रोटीन कार्यों को समझने के लिए लक्ष्य को लक्षित अध्ययन का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है मॉडल जीवों में6. आदेश में इन प्रोटीन के वास्तविक subplastidial स्थानीयकरण के लिए उपयोग करने के लिए, यह इस प्रकार अत्यधिक शुद्ध subplastidial भागों (लिफाफा झिल्ली, स्ट्रोमा, और thylakoids) से शुरू करने के लिए आवश्यक है । इस संदर्भ में, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य विभेदक केंद्रापसारक और सतत Percoll ढाल का उपयोग कर Arabidopsis पत्तियों से अक्षुण्ण chloroplasts को शुद्ध करने के लिए है, और उन्हें fractionate का उपयोग करने के लिए सतत सुक्रोज ढाल, तीन में उप डिब्बों (यानी, लिफाफा, स्ट्रोमा, और thylakoids) । यहाँ वर्णित विधि भी विभिन्न chloroplast उप-डिब्बों से जुड़े मार्करों का उपयोग करते हुए शुद्ध उप-organellar अंशों की शुद्धता का आकलन करने के निर्देश प्रदान करती है. इस प्रोटोकॉल immunoblotting का उपयोग प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के लिए मूल्यवान है और शुद्ध भागों मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-proteomic अध्ययन आधारित का उपयोग कर के आगे विश्लेषण के लिए ।

Protocol

1. बफ़र्स, स्टॉक समाधानों और ग्रेडिएंट्स को तैयार करना

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक संग्रहित किया जा सकता है कि निंनलिखित स्टॉक समाधान तैयार करें ।
    1. Tricine बफर के 1 एल तैयार (1 एम, पीएच ८.४) और Tricine बफर (1 एम, पीएच ७.६) । KOH छर्रों जोड़कर पीएच समायोजित करें ।
    2. ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, ०.५ मीटर, पीएच 8) और 3-(एन-morpholino) प्रोपेन sulfonic एसिड (MOPS) बफर (1 एम, पीएच ७.८) के 1 एल तैयार करें । NaOH छर्रों जोड़कर पीएच समायोजित करें ।
    3. MgCl2 (1 मी.) की ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    4. तैयार करने के ५० मिलीलीटर के चिढ़ाने अवरोधकों समाधान: phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF isopropanol, १०० मिमी में स्थापित), benzamidine हाइडरोक्लॉराइड हाइड्रेट (१०० मिमी), और ε-एमिनो caproic एसिड (५० मिमी).
      नोट: जबकि PMSF और एमिनो caproic एसिड समाधान में महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं, benzamidine समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  2. प्रयोग के पहले दिन निम्नलिखित समाधानों को तैयार करें और 4 ° c पर सभी समाधानों को संग्रहीत करे ।
    1. Tricine-कोह (20 मिमी, पीएच ८.४), सोर्बिटोल (०.४ मीटर), EDTA (10 मिमी, पीएच 8), और NaHCO3 (10 मिमी) युक्त मध्यम पीएच ८.४ पीस के 4 एल तैयार करें । NaOH छर्रों जोड़कर पीएच समायोजित करें । बस उपयोग करने से पहले ०.१% (डब्ल्यू/वी) में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. धोने मध्यम (2 x) पीएच ७.६ युक्त Tricine-कोह (20 मिमी, पीएच ७.६), सोर्बिटोल (०.८ मीटर), MgCl2 (5 मिमी), और EDTA (२.५ मिमी) के ५०० मिलीलीटर तैयार करें । NaOH छर्रों जोड़कर पीएच समायोजित करें । Percoll ढाल समाधान की तैयारी मध्यम (1 एक्स) धुलाई प्राप्त करने के बाद इस तरह के समाधान को पतला ।
    3. chloroplast शुद्धि के लिए Percoll ढाल समाधान के २०० मिलीलीटर को एक बराबर मात्रा में धोने के माध्यम से Percoll मिश्रण द्वारा तैयार करने के लिए ५०% (v/v) पर एक अंतिम समाधान प्राप्त Percoll/०.४ M सोर्बिटोल ।
    4. MOPS (10 मिमी, पीएच ७.८), MgCl2 (4 मिमी), और सुक्रोज के विभिन्न सांद्रता (०.३ एम, ०.६ एम, और ०.९३ एम) के मिश्रण से chloroplast अंश के लिए सुक्रोज समाधान के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
  3. प्रयोग प्रारंभ करने से पूर्व निंन ग्रेडिएंट और बफ़र्स तैयार करें ।
    1. Percoll ढाल के छह ट्यूबों तैयार (प्रत्येक ५०% Percoll के 30 मिलीलीटर से युक्त/०.४ M सोर्बिटोल) द्वारा 4 डिग्री सेल्सियस पर ५५ मिनट के लिए ३८,७०० x g पर केंद्रापसारक । ढाल के सम्मिश्रण को रोकने के लिए ब्रेक बंद रखें । केंद्रापसारक के बाद, एक ठंडे कमरे में जब तक उपयोग के अनुरूप ढाल युक्त ट्यूबों की दुकान ।
    2. सुक्रोज ढाल के चार ट्यूबों तैयार, प्रत्येक ढाल तीन निंनलिखित सुक्रोज परतों के गठन के साथ: ०.९३ मीटर, ०.६ मीटर की २.५ मिलीलीटर की 3 मिलीलीटर, और ०.३ मीटर सुक्रोज के 2 मिलीलीटर । ध्यान से प्रत्येक परत ओवरले, एक सिकुड़नेवाला नीचे ०.९३ मीटर के साथ शुरू करने और शीर्ष पर ०.३ मीटर के साथ परिष्करण पंप का उपयोग कर ।
    3. chloroplast lysis युक्त MOPS (10 मिमी, पीएच ७.८), MgCl2 (4 मिमी), PMSF (1 मिमी, isopropanol में स्थापित), benzamidine हाइडरोक्लॉराइड हाइड्रेट (1 मिमी), और ε-एमिनो caproic एसिड (०.५ मिमी) के लिए hypotonic मध्यम के ५० मिलीलीटर तैयार करें । उपयोग जब तक बर्फ पर बफर स्टोर ।
    4. MOPS युक्त झिल्ली धोने बफर के ५० मिलीलीटर तैयार (10 मिमी, पीएच ७.८), PMSF (1 मिमी), benzamidine हाइडरोक्लॉराइड हाइड्रेट (1 मिमी), और ε-एमिनो caproic एसिड (०.५ मिमी). उपयोग जब तक बर्फ पर बफर स्टोर ।

2. विकास और Arabidopsis पत्तियों की कटाई

  1. Arabidopsis पौधों के विकास के लिए, प्रत्येक पैन में 30 मिलीग्राम बीज बोने के द्वारा Arabidopsis पौधों की 4 बड़े प्लास्टिक पंस (०.५ 1 मीटर2की कुल सतह के लिए) तैयार करते हैं । 12 पर 5 सप्ताह के लिए Arabidopsis संयंत्रों बढ़ने-h प्रकाश चक्र में 23 ° c (दिन)/18 डिग्री सेल्सियस (रात) १५० माइक्रोन एम-2 एस-1की हल्की तीव्रता के साथ ।
  2. रात भर प्रयोग करने से पहले एक अंधेरे और ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में पौधों की मशीन (chloroplasts में स्टार्च granules की मात्रा को कम करने के लिए) ।
  3. पूर्व एक 1 एल चोंच वजन और फिर पत्ती सामग्री की कटाई शुरू करने से पहले बर्फ पर जगह है ।
  4. मिट्टी (खाद) से परहेज करके फसल Arabidopsis पत्ते । फिर से चोंच का वज़न और टिशू वेट रिकॉर्ड करें ।
    नोट: ४०० से ५०० ग्राम की पत्ती सामग्री की अपेक्षा चार पंस से की जाती है.
  5. Homogenize पीस बफर के 2 एल के साथ एक ठंडे कमरे में छोड़ देता है (उपयोग करने से पहले BSA जोड़ें) तीन बार हर बार, उच्च गति पर एक ब्लेंडर में ।
  6. मलमल के 4 परतों और नायलॉन blutex की एक परत का उपयोग कर एक ठंडे कमरे में homogenate फिल्टर । धीरे सभी तरल निकालने के लिए मलमल/नायलॉन blutex अंदर homogenate पत्तियों निचोड़ ।
  7. एक दूसरे निष्कर्षण के लिए ब्लेंडर कप में शेष ऊतक पुनर्प्राप्त करें । दोहराएं चरण २.५ और २.६ (एक ठंडे कमरे में) मलमल के मध्यम और नए 4-5 परतों पीस के 2 एल का उपयोग कर ।

3. क्रूड Chloroplasts का शुद्धिकरण विभेदक केंद्रापसारक का उपयोग

  1. समान रूप से ६ ५०० मिलीलीटर की बोतलों में कच्चे सेल निकालने को वितरित और बर्फ पर बोतलों के केंद्रापसारक से पहले जगह है । अधिकतम गति (२,०७० x g) के रूप में जल्द ही 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक (अधिकतम त्वरण और ब्रेक पर, 4 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंच गया है ।
  2. धीरे supernatant त्यागें ।
  3. महाप्राण शेष supernatant एक पानी पंप का उपयोग कर और बर्फ पर केंद्रित क्रूड chloroplasts युक्त छर्रों रखने के लिए ।
  4. धीरे मध्यम धोने की एक ंयूनतम मात्रा (1 एक्स) (संयुक्त chloroplast निलंबन के अंतिम खंड = ३६ मिलीलीटर) एक तूलिका या एक घुमावदार प्लास्टिक रंग का उपयोग करके छर्रों को फिर से स्थगित । प्रत्येक बोतल में वाशिंग मीडियम के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का प्रयोग करें ।
    नोट: chloroplasts के टूटना से बचने के लिए बहुत महीन सुझावों के साथ प्लास्टिक का उपयोग न करें । वैकल्पिक रूप से, एक उस्तरा ब्लेड के साथ एक प्लास्टिक के नीले टिप में कटौती करने के लिए एक बड़ा छेद उत्पंन करते हैं ।
  5. एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग करके resuspend chloroplasts एक ट्यूब में ले लीजिए । धीरे Percoll ढाल पर लोड करने से पहले एक समरूप निलंबन प्राप्त करने के लिए ट्यूब पलटने से मिश्रण.

4. निरंतर Percoll ढाल पर अक्षुण्ण Chloroplasts का शुद्धिकरण

  1. धीरे chloroplasts के टूटना से बचने के लिए एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग छह Percoll ढाल के प्रत्येक के शीर्ष पर chloroplast निलंबन के 6 मिलीलीटर लोड ।
  2. १३,३०० x g, 4 ° c एक झूलते-बाल्टी रोटर का उपयोग कर 10 मिनट के लिए ढाल केंद्रापसारक ।
    नोट: त्वरण धीमी होना चाहिए, और ब्रेक Percoll ढाल के सम्मिश्रण को रोकने के लिए (ब्रेक बंद या धीमी गति से मंदी) डिस्कनेक्ट किया जाना चाहिए ।
  3. महाप्राण ऊपरी चरण है कि टूटी हुई chloroplasts और बरकरार mitochondria एक पानी पंप का उपयोग कर रहे हैं, और फिर निचले चरण (व्यापक काले हरे रंग की बैंड) एक 10 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ में मौजूद बरकरार chloroplasts पुनः प्राप्त । महाप्राण नाभिक और सेल मलबे (ट्यूब के नीचे पाया) बरकरार chloroplasts (चित्रा 2a) के साथ करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  4. पतला 3-4-धोने बफर (1 एक्स) के साथ बरकरार chloroplast निलंबन गुना । के रूप में जल्द ही अधिकतम गति (२,०७० x g, 4 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंच गया है 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक (अधिकतम त्वरण और ब्रेक पर) ।
  5. supernatant को सावधानीपूर्वक छोड़ें ।
  6. पूरी तरह से एक पानी पंप के साथ शेष supernatant महाप्राण और बर्फ पर केंद्रित बरकरार chloroplasts की गोली रखो ।
  7. chloroplast lysis से पहले, लगभग 1 मिलीलीटर वाशिंग मध्यम (1 x) में सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) और पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर विश्लेषण के लिए बरकरार chloroplast अंश की एक aliquot रखें । प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए इन बरकरार chloroplasts के एक छोटे से aliquot रखें । आगे प्रयोगों के लिए तरल नाइट्रोजन में बरकरार chloroplast अंश संग्रह ।

5. एक Hypotonic बफर का उपयोग कर बरकरार Chloroplasts का Lysis और Chloroplast उप-डिब्बों का शुद्धिकरण सुक्रोज ढाल पर

  1. लाइसे hypotonic माध्यम में गोली resuspend द्वारा शुद्ध बरकरार chloroplasts है कि तंग अवरोधकों (अंतिम मात्रा 12 मिलीलीटर से अधिक नहीं होना चाहिए) शामिल हैं ।
    नोट: इस कदम से, ठीक सुझाव (ब्लू टिप्स) के साथ प्लास्टिक का उपयोग संभव है chloroplasts की अक्षुण्णता के बाद से कोई अधिक आवश्यक है (pipetting chloroplasts अप और गोली के रूप में लंबे समय के रूप में पूरी तरह से resuspend नहीं है) । Arabidopsis chloroplasts बहुत नाजुक है (जब मटर chloroplasts की तुलना में, उदाहरण के लिए) और उनके lysis hypotonic माध्यम में गर्मी के बाद लगभग तत्काल है ।
  2. धीरे एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर प्रत्येक अनुरूप सुक्रोज ढाल के शीर्ष पर लीजड ड chloroplasts के 3 मिलीलीटर लोड ।
  3. 1 h पर (७०,००० x g, 4 ° c) के लिए ग्रेडिएंट Ultracentrifuge । ट्यूबों के संतुलन जोड़े hypotonic मध्यम बफर का उपयोग करने से पहले केंद्रापसारक ।
  4. ध्यान से (प्रत्येक ढाल से 3 मिलीलीटर) ढाल के ऊपरी चरण pipetting द्वारा घुलनशील stromal प्रोटीन पुनर्प्राप्त (चित्रा 2बी) । प्रोटीन एकाग्रता7के निर्धारण के लिए एक aliquot ले लो । आगे प्रयोगों के लिए तरल नाइट्रोजन में स्ट्रोमा की दुकान ।
  5. महाप्राण एक ढाल के शेष ऊपरी चरण पीले बैंड के लिए एक पानी पंप का उपयोग कर ।
  6. एक प्लास्टिक के साथ पीले बैंड (लिफाफा) पुनः प्राप्त (प्रत्येक ढाल से लगभग 1 मिलीलीटर) । एक ट्यूब में लिफाफे पूल ।
  7. प्रत्येक ढाल के शेष चरण thylakoid एक पानी पंप का उपयोग कर गोली को हटा दें ।

6. Thylakoid और लिफाफा झिल्ली प्रणालियों की धुलाई और एकाग्रता

  1. thylakoid छर्रों (हरी छर्रों) एक ंयूनतम मात्रा (2 मिलीलीटर) झिल्ली धोने बफर (1 एक्स) (चिढ़ाने अवरोधकों के साथ) में resuspend ।
  2. लिफाफा पतला और thylakoid सस्पेंशन 3-4-झिल्ली धोने मध्यम में गुना (10 मिलीलीटर के लिए मात्रा को समायोजित) और ultracentrifuge 1 ज पर (११०,००० x g, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए । ट्यूबों के संतुलन जोड़े झिल्ली धोने बफर का उपयोग करने से पहले केंद्रापसारक ।
  3. ध्यान से एक पानी पंप का उपयोग कर supernatants महाप्राण ।
  4. लगभग १०० µ एल झिल्ली धोने बफर के लिफाफा गोली करने के लिए (छेड़ने अवरोधों) के साथ जोड़ें । प्रोटीन एकाग्रता7के निर्धारण के लिए एक aliquot ले लो । तरल नाइट्रोजन में शुद्ध लिफाफा झिल्ली तैयारी की दुकान ।
  5. झिल्ली धोने बफर के 3 मिलीलीटर में thylakoids गोली resuspend (छेड़ने अवरोधकों के साथ) । प्रोटीन एकाग्रता7के निर्धारण के लिए एक aliquot ले लो । तरल नाइट्रोजन में thylakoid झिल्ली अंश संग्रह ।

Representative Results

शुद्ध chloroplast और उनके उप डिब्बों में जिसके परिणामस्वरूप प्रक्रिया के क्रमिक कदम चित्रा 2में फिर से शुरू कर रहे हैं । Percoll ढाल (चित्रा 2a) टूटी chloroplast और mitochondria (ढाल के ऊपर) या नाभिक और कोशिका मलबे (ढाल के नीचे) से बरकरार chloroplasts भेद की अनुमति देता है । एक आसमाटिक सदमे के लिए Percoll-शुद्ध organelles धंयवाद के टूटना के बाद, परिणामस्वरूप भिन्न एक सुक्रोज ढाल पर अलग कर रहे हैं (चित्रा बी b). स्ट्रोमा (chloroplast के घुलनशील भाग) सुक्रोज ढाल की सतह पर तैर रहा है । प्रकाश लिफाफा झिल्ली बुलबुले 0.6/0.93 एम सुक्रोज इंटरफेस में एक असतत पीले बैंड के रूप में बरामद कर रहे हैं । सबसे भारी thylakoid झिल्ली बुलबुले ट्यूब के तल पर केंद्रित कर रहे हैं । वसूली के बाद, धोने और दो झिल्ली भागों की एकाग्रता, प्रोटीन quantified है और सभी चार भागों की संरचना एक एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 2c) पर विश्लेषण किया है । गलियाँ एक समान प्रोटीन आधार पर भरी जाती हैं (प्रत्येक शुद्ध अंश के २० µ जी). जानते हुए भी कि chloroplasts लिफाफा प्रोटीन और स्ट्रोमा से या thylakoids से प्रोटीन का ५०% का केवल 1% होते हैं, इस पार से अनुमान लगाने के अंय chloroplast उप डिब्बों के साथ शुद्ध लिफाफा तैयारी के संदूषण जाता है । हालांकि, इस विधि से प्रोटीन के मिनट मात्रा का पता लगाने की अनुमति देता है पार-दूषित लिफाफा अंश । प्रत्येक डिब्बे से मार्करों (यानी, प्रचुर मात्रा में प्रोटीन) अंशों के पार संदूषण के मूल्यांकन में बहुत सहायक होते हैं । वास्तव में, thylakoid और लिफाफा झिल्ली भागों RuBisCO (RBCL), स्ट्रोमा (५० केडीए) से सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की बड़ी उपइकाई के बहुत कम मात्रा में शामिल होने की उम्मीद कर रहे हैं. टूटी हुई chloroplasts आसानी से इस stromal प्रोटीन8के नुकसान के कारण बरकरार chloroplast से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन्स (LHCP) हैं 25-केडीए प्रचुर मात्रा में thylakoid घटक है कि मुश्किल से होना चाहिए (से कम 3%) दूषित लिफाफा झिल्ली9. अंत में, फॉस्फेट-triose-फास्फेट translocator (TPT) एक 30-केडीए प्रोटीन है कि शुद्ध लिफाफा में ही दिखाई दे रहा है अपने मजबूत संवर्धन के कारण अंश (यानी, ५० से १०० एक्स) लिफाफा अंश में जब पूरे chloroplast निष्कर्षों की तुलना में. विधि का प्रयोग यहां वर्णित है, chloroplast उप डिब्बों आम तौर पर खराब पार कर रहे है के रूप में पश्चिमी दाग विश्लेषण (चित्रा 2d) के सभी तीन उप डिब्बों के ज्ञात मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी पर निर्भर का उपयोग कर संदूषित: घुलनशील ketol-एसिड reductoisomerase (कारी) से स्ट्रोमा, chloroplast लिफाफा कॉपर ATPase (HMA1), और LHCP झिल्ली से हल्की कटाई जटिल प्रोटीन (thylakoid) में होता है । तीन उप-डिब्बों के परस्पर संदूषण को immunoblotting और जन स्पेक्ट्रोमेट्री िरा9का प्रयोग कर quantified जा सकता है । जबकि स्ट्रोमा आमतौर पर लिफाफा या thylakoid भागों से दूषित नहीं है, शुद्ध लिफाफा अंशों thylakoid प्रोटीन के 3% और स्ट्रोमा से प्रोटीन का 10% तक होते हैं । स्ट्रोमा से प्रोटीन thylakoid झिल्ली को दूषित (कम 1%) लेकिन thylakoids लिफाफा झिल्ली प्रोटीन के 3% तक होते हैं । chloroplast प्रोटीन के वास्तविक subplastidial स्थान की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका होने से अधिक, वर्तमान विधि इस प्रकार भी पार संदूषणों से उत्पंन प्रोटीन के subplastidial स्थानीयकरण के बारे में गलत निष्कर्ष सीमा ।

Figure 1
चित्रा 1: chloroplast उप डिब्बों की प्रतिनिधि योजना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Percoll और सुक्रोज ढाल का उपयोग कर बरकरार chloroplasts और उनके तीन मुख्य उप डिब्बों की शुद्धि । A. Percoll भंग और बरकरार chloroplasts के पृथक्करण की अनुमति ढाल । B. सुक्रोज स्ट्रोमा, लिफाफे की जुदाई की अनुमति ढाल, और thylakoid भागों । C. प्रतिनिधि एसडीएस-बरकरार chloroplasts से प्रोटीन के पृष्ठ और उनके तीन मुख्य उप प्रत्येक उप डिब्बे से प्रचुर मात्रा में मार्करों कल्पना की अनुमति डिब्बों । प्रत्येक लेन में प्रोटीन के 10 µ g होते हैं । आण्विक वजन मार्करों: RBCL, RuBisCO की बड़ी उपइकाई (स्ट्रोमा के लिए मार्कर); TPT, फॉस्फेट/triose-फास्फेट translocator (लिफाफा के लिए मार्कर); LHCP, प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन (thylakoid के लिए मार्कर) । D. पश्चिमी दाग प्रयोग विशिष्ट मार्करों का पता लगाने की अनुमति (विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर) प्रत्येक उप डिब्बे से: chloroplast लिफाफा तांबे ATPase HMA110, प्रकाश संचयन जटिल प्रोटीन thylakoid से LHCP झिल्ली11, और स्ट्रोमा9से ketol-एसिड reductoisomerase कारी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

वर्तमान लेख chloroplasts (और उनके उप डिब्बों) Arabidopsis थालियानासे शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल कदम प्रोटोकॉल द्वारा कदम विस्तार करना है । अपनी पूरी जीनोम अनुक्रम की उपलब्धता के बाद से लगभग दो दशक पहले, और प्रविष्टि म्यूटेंट के बड़े संग्रह समुदाय के लिए उपलब्ध कराया, Arabidopsis अब व्यापक रूप से एक मॉडल संयंत्र के रूप में स्वीकार कर लिया है । हालांकि, जबकि इस संयंत्र पूरी तरह से आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित किया गया था, संयंत्र वैज्ञानिकों को इस उभरते मॉडल को जैव रासायनिक और शारीरिक उपकरणों के अनुकूलन की जरूरत है । photosynthetically के पत्तों से सक्रिय chloroplasts को शुद्ध करने के लिए अनुमति देने वाले प्रोटोकॉल जैसे कि पालक12 या मटर13 जैसे जैव रासायनिक मॉडल को अनुकूलित किया जाना चाहिए । पहली विधि Arabidopsis chloroplasts की शुद्धि का वर्णन १९९८14में प्रकाशित किया गया था, बस Arabidopsis जीनोम अनुक्रम के रिलीज से पहले । कई साल बाद, Arabidopsis chloroplasts अलग करने के लिए सरल तरीके अध्ययन के साथ संगत में विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य इन विट्रो शुद्ध organelles में प्रोटीन के आयात उपलब्ध कराए गए15,16. हालांकि, इन तरीकों की अनुमति के लिए उच्च स्तर की पवित्रता और संश्लेषक गतिविधि के संरक्षण शुद्ध chloroplasts का गठबंधन नहीं था । हाल ही में17, एक तेजी से विधि स्थापित किया गया था, जो Percoll ढाल के उपयोग पर निर्भर करता है, और प्रकाश संश्लेषण Arabidopsis के शुरू पत्तियों में मापा दर के लगभग ९०% बनाए रखने के लिए अनुमति देता है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित शुद्धता का एक उत्कृष्ट स्तर पर Arabidopsis chloroplasts शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है । वास्तव में, प्रतिरक्षा अंय सेल डिब्बों से संदूषणों का पता लगाने का प्रदर्शन किया है कि शुद्ध organelles mitochondrial और प्लाज्मा झिल्ली मार्करों9,10से रहित हैं । इस प्रोटोकॉल भी कई Arabidopsis ecotypes18, कोलंबिया (कर्नल) या Wassilewskija (WS), यानी, ecotypes कि जीनोम के लिए इस्तेमाल किया गया या अनुक्रम टैग (सैकड़ा) sequencing व्यक्त की तरह chloroplasts से शुद्ध करने के लिए कुशल था परियोजनाओं लेकिन यह भी Arabidopsisमें टी डीएनए प्रविष्टि म्यूटेंट उत्पंन करने के लिए । दूसरे शब्दों में, जब प्रोटियोमिक् अध्ययन किया जाना है, वर्तमान प्रोटोकॉल Arabidopsisसे इन दो संदर्भ ecotypes के साथ संगत है । अंत में, chloroplasts की उपज वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त एक जब पालक या मटर के पत्तों से शुरू करने के समान है (यानी, 3%, के रूप में Percoll-शुद्ध chloroplast में क्लोरोफिल सामग्री से मापा जब कुल की तुलना में क्लोरोफिल शुरू पत्तियों में मौजूद राशि) । प्रोटीन की दृष्टि से, उपज chloroplast प्रोटीन के ५० मिलीग्राम के करीब है, जब organelles 5 सप्ताह पुराने Arabidopsis पत्तियों की ५०० ग्राम से शुद्ध कर रहे हैं ।

इस तरह के एक अच्छी उपज (और chloroplast अखंडता) तक पहुंचने के लिए, एक लेकिन कई कदम जब वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए विशेष ध्यान देना चाहिए । Arabidopsis में chloroplast एक अत्यंत नाजुक संरचना है (यह मटर chloroplasts के लिए मामला नहीं है, उदाहरण के लिए) । विशेष ध्यान इस प्रकार के लिए शुद्धि के दौरान organelles के बड़े पैमाने पर टूटना से बचने के लिए आवश्यक है । chloroplasts में मौजूद स्टार्च granules की संख्या और आकार बरकरार chloroplasts की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण हैं । दरअसल, chloroplasts बड़े स्टार्च अनाज युक्त आम तौर पर प्रारंभिक अंतर केंद्रापसारक के लिए कच्चे chloroplast भागों12ध्यान लक्ष्य कदम के दौरान टूट जाएगा । इसलिए, एक अंधेरे और ठंडे कमरे में रात भर रखा जाना चाहिए (4 ° c) प्रयोग करने से पहले, स्टार्च की मात्रा को कम करने के लिए ।

वर्तमान प्रोटोकॉल के नए उपयोगकर्ताओं को पत्ती सामग्री की बड़ी मात्रा से शुरू करने के लिए परीक्षा हो सकती है (बड़ा पत्तियों के साथ पुराने Arabidopsis पौधों से विशाल rosettes) को शुद्ध chloroplasts की वसूली बढ़ाने की कोशिश कर रहा । हालांकि, हमारे हाथों में, युवा पत्तियों (5 सप्ताह पुराने) से शुरू करने के लिए उपज, पवित्रता गठबंधन और शुद्ध organelles की अखंडता का सबसे अच्छा समझौता है । दरअसल, बहुत पुरानी पत्तियों phenolic यौगिकों कि chloroplast अखंडता19पर एक नकारात्मक प्रभाव है दिखाया गया में अत्यधिक समृद्ध कर रहे हैं ।

अंत में, प्रारंभिक निष्कर्षण कदम (ऊतक के पीस) एक और महत्वपूर्ण कदम है । सम्मिश्रण प्रक्रिया कुछ सेकंड तक ही सीमित होनी चाहिए. जैसा कि ऊपर कहा, नए उपयोगकर्ताओं को अब सम्मिश्रण का उपयोग करें परीक्षा हो सकती है, इस प्रकार दृढ़ता से शुद्ध organelles की उपज में सुधार की उंमीद । हालांकि, अगर अब प्रभावी ढंग से पत्तियों से अधिक सामग्री विज्ञप्ति सम्मिश्रण, ऐसा लगता है कि टूटी हुई chloroplasts का अनुपात तेजी से कच्चे सेल निकालने में बढ़ जाती है । इस उच्च अनुपात के कारण टूटे हुए chloroplasts को मध्यम में बरकरार रखने के लिए, आगे शुद्धिकरण कदम (Percoll ढाल पर जुदाई) दृढ़ता से प्रभावित होते हैं और शुद्धि की उपज अप्रत्याशित रूप से कम होती है ।

organelles शुद्ध करने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की उपलब्धता chloroplast नमूनों पर आयोजित किया जा करने के लिए उच्च प्रवाह प्रोटियोमिक्-आधारित प्रयोगों की एक श्रृंखला की अनुमति दी है. इन आंकड़ों के कई सार्वजनिक डेटाबेस6में उपलब्ध कराए गए थे, इस प्रकार क्षेत्र में जीव को उपलब्ध कराने के एक सटीक उपसेलुलर (और subplastidial) कई chloroplast प्रोटीन के लिए स्थानीयकरण । यह लिफाफा प्रोटीन जिनकी पहचान और स्थान के लिए विशेष रूप से सच था इन विश्लेषण से पहले ज्यादातर अज्ञात है, के बाद से लिफाफा झिल्ली एक छोटी chloroplast घटक (chloroplast प्रोटीन का 1-2%) प्रतिनिधित्व करते हुए chloroplast में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा चयापचय और उत्पत्ति5,20। प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, हम हाल ही में Arabidopsis से तीन मुख्य chloroplast डिब्बों की संरचना का विश्लेषण (यानी, स्ट्रोमा, thylakoids, और लिफाफा झिल्ली प्रणाली)9। एक अर्द्ध मात्रात्मक प्रोटियोमिक् दृष्टिकोण (वर्णक्रम गिनती) के आधार पर, हम इन तीन chloroplast डिब्बों में प्रोटीन के सैकड़ों के विभाजन का आकलन करने में सक्षम थे ।

जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल Arabidopsisसे chloroplast के तीन मुख्य डिब्बों को शुद्ध करने की अनुमति देता है, यह भी chloroplast में अतिरिक्त उप डिब्बों भेद संभव है । दरअसल, लिफाफा झिल्ली प्रणाली आंतरिक और बाहरी लिफाफा झिल्ली (चित्रा 1) से बना है । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, Arabidopsis chloroplasts से भीतरी और बाहरी लिफाफा झिल्ली को शुद्ध करने के लिए एक विधि स्थापित किया जा करने के लिए बनी हुई है । भीतरी और बाहरी लिफाफा झिल्ली पालक21 या मटर22 chloroplasts से शुद्ध किया जा सकता है । Arabidopsis की मुख्य सीमा शुरू सामग्री की सीमित मात्रा से ज्यादातर परिणाम है । Arabidopsis के पत्तों की ५०० ग्राम से शुरू (जो पहले से ही एक विकास चैंबर में 1 मीटर2 सतह की आवश्यकता है) लिफाफा प्रोटीन के केवल १०० µ जी शुद्ध करने की अनुमति देता है । दूसरी ओर, यह बाजार से पालक के पत्तों की 5-10 किलो के साथ शुरू करने के लिए आसान है, chloroplasts8 की बड़ी राशि को शुद्ध करने के लिए और इस सामग्री से लिफाफा प्रोटीन के 3 से 10 मिलीग्राम की एक उपज के साथ समाप्त करने के लिए ।

thylakoid उप-डिब्बों के लिए भी यही सच है. दरअसल, thylakoids प्रकाश झिल्ली बुलबुले (lamellae) और घने संरचनाओं (grana) (चित्रा 1) के बने होते हैं । विशिष्ट प्रोटोकॉल Arabidopsis23,24में इन दो डिब्बों भेद करने के लिए उपलब्ध हैं । फिर, एक मात्रात्मक प्रोटियोमिक् विश्लेषण के आधार पर, हम हाल ही में इन दो उप डिब्बों में मौजूद प्रोटीन inventoried24। इन दृष्टिकोण, साहित्य की एक में गहराई से जांच के साथ, मांयता की अनुमति दी, या के लिए परिकल्पनाओं का प्रस्ताव, thylakoid प्रोटीन के सैकड़ों के subplastidial स्थान । हालांकि, यह ध्यान रखें कि अतिरिक्त झिल्ली microdomains thylakoids के घुमावदार मार्जिन पर मौजूद है महत्वपूर्ण है । इन लिपोप्रोटीन उप डिब्बों, या plastoglobules, स्थाई रूप से thylakoid झिल्ली के लिए युग्मित कर रहे है और25प्रोटीन का एक विशिष्ट सेट होते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह इस प्रकार अन्य thylakoid घटकों से इन विशिष्ट प्रोटीन भेद करने के लिए संभव नहीं है.

कुछ वास्तविक (प्रसिद्ध) लिफाफा, स्ट्रोमा, या thylakoid घटक अभी भी पता चला प्रोटीन की सूची से कमी कर रहे हैं । एक साथ लक्षित जैव रासायनिक और प्रतिरक्षा विश्लेषण के साथ, एमएस संवेदनशीलता के नित्य सुधार बहुत मदद की होगी अपनी विभिंन उप-डिब्बों की संरचना का एक पूरा प्रदर्शनों की समीक्षा की दिशा में chloroplast सामग्री फिर से आना ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए इणरा संयंत्र जीवविज्ञान और प्रजनन प्रभाग से आईबी को एक संयुक्त पीएचडी फैलोशिप और Labex ग़ाल (ANR-10-LABX-49-01) से समर्थन किया गया था । हम यह भी ANR परियोजना ANR-15-IDEX-02, डॉ ओलिवर वैल्हम (IBPC पेरिस) LHCP और डॉ Renaud Dumas (LPCV, ग्रेनोबल) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए कारी के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17089101
Tricine Roth 6977.2
Sorbitol Roth 6213.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Promega H5032
NaHCO3 Roth 8551.1
Bovine serum albumin (BSA) Roth 8076.5
MgCl2 Roth 2189.1
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Benzamidine Sigma B6506
ε-amino caproic acid Fluka 21530
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) Roth 6979.3
Sucrose Roth 9286.2
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide Roth 3029.1
Tris Fisher BP152-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Roth 1057.1
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T-8133
Ammonium persulfate (APS) Roth 9592.1
Glycerol Roth 3783.1
Bromophenol blue USB US12370
Glycin Roth 3908.3
Gel staining medium Clini-sciences GEN-QC-STAIN
Ethanol CARLO ERBA 528151
NaCl Euromedex 1112-A
Triton X-100 Promega H5141
Fat-free milk powder Régilait
HCl Fisher H/1150/PB15
KOH pellets Sigma 1.05012
NaOH pellets CARLO ERBA 480507
Anti-HMA1 antibody Seigneurin-Berny et al, 2006 Used at a 1:1000 dilution
Anti-KARI antibody Ferro et al, 2010 Used at a 1:1000 dilution
Anti-LHCP antibody Vallon et al, 1991 Used at a 1:25,000 dilution
P-coumaric acid Sigma C-9008
Luminol (3-aminophalhydrazin) Fluka 9253
Dimethyl sulfoxide (DMSO). Sigma D5879
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases Puteaux 162135
A. thaliana seeds Around 30 mg of seeds for a whole case
Compost "Floragard" Puteaux 16311770
Growth rooms 12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m2/s.
Muslin or cheesecloth Raffin 70116 80-cm-large
Nylon blutex 50 μm aperture Tripette et Renaud, Sailly Saillisel 50 μm aperture
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity Waring Blender
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles) Beckman Coulter
Beckman JA-20 rotor Beckman Coulter
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes) Sorvall instruments
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes) Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes) Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes) Beckman Coulter
Ultracentrifuge (Beckman L7) Beckman Coulter
Centrifuge (Beckman JSE-06D18) Beckman Coulter
Microcentrifuge Eppendorf 5415D or equivalent
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.
Nitrocellulose membranes BA85, Schleicher and Schuell
Filter paper 3MM, Whatman, Maidstone
Liquid nitrogen
Peristaltic pump Gilson
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus). Bio-Rad Protean 3 or equivalent
System for protein transfer to nitrocellulose membranes Bio-Rad Protean 3 or equivalent

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References

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Tags

जैव रसायन अंक १४० पादप Arabidopsis chloroplast organelle plastid लिफाफा स्ट्रोमा thylakoid कोशिका भिन्नीकरण Percoll स्थानीयकरण immunoblotting
Immunoblotting या प्रोटियोमिक् द्वारा प्रोटीन स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए Arabidopsis से Chloroplast उप-डिब्बों की तैयारी
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Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D.,… More

Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics. J. Vis. Exp. (140), e58581, doi:10.3791/58581 (2018).

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