Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी-आधारित दृष्टिकोण को सेल-सेल बातचीत मध्यस्थता प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच, यानी प्रोटीन सेल जंक्शनों में स्थानीयकृत, सीधे रहने वाले कोशिकाओं में । हम साधन अंशांकन, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण, संभव मूर्ति स्रोतों को सुधार सहित पर विस्तृत दिशानिर्देश प्रदान करते हैं ।

Abstract

जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म सेल सेल बातचीत, आम तौर पर प्रोटीन है कि पड़ोसी कोशिकाओं के बीच इंटरफेस पर बातचीत से मध्यस्थता शामिल है । ब्याज की, केवल कुछ परख विशेष रूप से ऐसी बातचीत के रहने की कोशिकाओं में सीधे जांच करने में सक्षम हैं । यहां, हम एक परख प्रस्तुत करने के लिए प्रोटीन के बंधन को मापने के पड़ोसी कोशिकाओं की सतहों पर व्यक्त की, सेल में सेल संपर्क । यह परख दो कदम होते हैं: अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े ब्याज के प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के मिश्रण, सेल में प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी माप द्वारा पीछा किया-सेल संपर्कों एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । हम एक जैविक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में इस परख की व्यवहार्यता का प्रदर्शन amyloid के अग्रदूत-जैसे प्रोटीन 1 सेल जंक्शनों के पार (APLP1) की बातचीत को मापने । हम प्रतिदीप्ति-आधारित तकनीकों का उपयोग कर डेटा प्राप्ति पर विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं (स्कैनिंग प्रतिदीप्ति क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी, क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक विश्लेषण) और आवश्यक साधन अंशांकन । इसके अलावा, हम डेटा विश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम और कैसे की पहचान करने और बाहरी, नकली संकेत रूपांतरों, जैसे photobleaching या सेल आंदोलन के कारण उन के रूप में सही चर्चा ।

सामांय में, प्रस्तुत परख किसी भी होमो-या heterotypic प्रोटीन-सेल संपर्क में प्रोटीन संपर्क के लिए लागू है, एक ही या विभिंन प्रकार की कोशिकाओं के बीच, और एक वाणिज्यिक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर लागू किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण आवश्यकता प्रणाली है, जो कई मिनट से अधिक ब्याज की प्रोटीन की प्रसार गतिशीलता जांच करने के लिए पर्याप्त होने की जरूरत की स्थिरता है ।

Introduction

सेल-सेल इंटरैक्शन, जैसे, सेल-सेल आसंजन1,2,3, सेल-सेल फ्यूजन4 और सेलुलर मान्यता5की साइटों पर कई जैविक प्रक्रियाएं होती हैं । इस तरह के आयोजन कोशिकीय जीवों के विकास के दौरान और कोशिका-कोशिका संचार के लिए, जैसे प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण होते हैं । इन प्रक्रियाओं को आम तौर पर प्रोटीन है कि सतह पर स्थानीयकृत रहे हैं, अर्थात्, प्लाज्मा झिल्ली में (प्रधानमंत्री) पड़ोसी कोशिकाओं और सेल सेल संपर्क है कि ठीक अंतरिक्ष और समय में विनियमित रहे है पर विशिष्ट बातचीत से गुजरना कर रहे हैं । कई मामलों में, इन बातचीत सीधे होमो-या heterotypic प्रोटीन-प्रोटीन ट्रांस बातचीत कर रहे हैं, लेकिन यह भी आयनों या लाइगैंडों extracellular लिंकर्स1के रूप में अभिनय को शामिल कर सकते हैं । हालांकि बुनियादी महत्व के, वहां परख की कमी है इन विशिष्ट प्रोटीन की जांच सीधे रहने वाले कोशिकाओं के मूल वातावरण में प्रोटीन बातचीत । कई तरीकों या तो सेल व्यवधान की आवश्यकता होती है (जैसे, co-immunoprecipitation6के रूप में जैव रासायनिक परख), निर्धारण (जैसे, सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक और कोशिका कोशिका के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के कुछ संपर्क7), या गैर विशिष्ट हैं, उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण/आसंजन परख8,9। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, प्रतिदीप्ति तकनीक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)10 या प्रतिदीप्ति पूरक11के आधार पर लागू किया गया है । हालांकि, fluorophores के बीच पर्याप्त छोटी दूरी को प्राप्त करने के लिए, इन तरीकों प्रोटीन10, संभावित ट्रांस बातचीत के साथ हस्तक्षेप के extracellular ओर फ्लोरोसेंट लेबल की आवश्यकता है ।

यहां, हम एक वैकल्पिक प्रतिदीप्ति-सेल-सेल संपर्कों पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के लिए परख आधारित मौजूद हैं । यह दृष्टिकोण प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध दृष्टिकोण को जोड़ती है (स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (sFCCS), पार सहसंबंध संख्या और चमक (ccN और बी)) और एक फ्यूजन की प्रोटीन के निर्माण की कोशिकाओं का मिश्रण ब्याज, उदाहरण के लिए, एक आसंजन रिसेप्टर । दो बातचीत कोशिकाओं में जांच रिसेप्टर्स दो के साथ लेबल कर रहे हैं वर्णक्रम से अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस), intracellular पक्ष से ( चित्र 1aदेखें).

नियोजित तरीके प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव के एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के फोकल मात्रा के माध्यम से फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की प्रसार गति से प्रेरित के सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित हैं । और अधिक विस्तार से, परख जांच सह सेल में दोनों पड़ोसी पीएमएस में ब्याज की प्रोटीन के प्रसार सेल संपर्क । यदि प्रोटीन ट्रांस बातचीत से गुजरना, इन ट्रांस परिसरों दोनों वर्णक्रमीय चैनलों में उत्सर्जक फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले जाएगा, दोनों उत्सर्जक के प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव के कारण । दूसरी ओर, अगर कोई बाध्यकारी होता है, पीएमएस सामना करने में प्रोटीन की संख्या में उतार चढ़ाव स्वतंत्र होगा, जिससे कोई उतार चढ़ाव के कारण । अधिग्रहण दो मायनों में किया जा सकता है: 1) sFCCS एक लाइन के आकार का सेल सेल संपर्क भर में स्कैन पर आधारित है और प्रभावी ढंग से संपर्क क्षेत्र में स्थित एक स्थान में बातचीत की जांच । प्रतिदीप्ति उतार चढ़ाव का एक लौकिक विश्लेषण के माध्यम से, sFCCS भी गतिशीलता जानकारी प्रदान करता है, यानी, प्रोटीन परिसरों के प्रसार गुणांक; 2) ccN और बी सेल सेल संपर्क क्षेत्रों में अधिग्रहीत छवियों के एक अनुक्रम के एक पिक्सेल वार विश्लेषण पर आधारित है । यह जांच करने के लिए और पूरे संपर्क क्षेत्र (एक फोकल विमान में) के साथ बातचीत का नक्शा करने की क्षमता है, लेकिन गतिशीलता पर जानकारी प्रदान नहीं करता है । दोनों तरीकों आणविक चमक, यानी के एक विश्लेषण के साथ जोड़ा जा सकता है , औसत प्रतिदीप्ति एकल फैलाना प्रोटीन परिसरों द्वारा समय इकाई में उत्सर्जित संकेत और, इस प्रकार, पर प्रोटीन परिसरों के stoichiometry का अनुमान प्रदान कक्ष-कक्ष संपर्क ।

इस अनुच्छेद में, हम नमूना तैयारी, साधन अंशांकन, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक वाणिज्यिक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर प्रस्तुत परख करते हैं । प्रयोगों फोटॉन गिनती या एनालॉग डिटेक्टरों और उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक उद्देश्य के साथ सुसज्जित किसी भी साधन पर प्रदर्शन किया जा सकता है । हम आगे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा और कई artefactual संकेत उतार चढ़ाव के कारण प्रक्रियाओं के लिए सुधार योजनाओं प्रदान करते हैं, जैसे, डिटेक्टर शोर, photobleaching या सेल आंदोलन । मूलतः अनुयाई कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के लिए विकसित, परख निलंबन कोशिकाओं के लिए संशोधित किया जा सकता है, या मॉडल झिल्ली प्रणालियों के लिए अनुकूलित, उदाहरण के लिए, विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs) या विशाल प्लाज्मा झिल्ली बुलबुले (GPMVs), की अनुमति विभिन्न लिपिड वातावरण में या एक संगठित cytoskeleton12,13के अभाव में बातचीत के ठहराव.

स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध14 स्पेक्ट्रोस्कोपी का एक संशोधित संस्करण है और विशेष रूप से लिपिड झिल्ली15में धीमी गति से प्रसार गतिशीलता जांच करने के लिए बनाया गया था । यह ब्याज की फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त पीएम को सीधा एक लाइन स्कैन अधिग्रहण पर आधारित है । दो अलग लेबल प्रोटीन प्रजातियों की बातचीत की जांच करने के लिए, अधिग्रहण दो लेजर लाइनों और दो का पता लगाने खिड़कियों के लिए वर्णक्रम से अलग fluorophores का उपयोग करने में किया जाता है । पीएम (D ≤ ~ 1 µm2/) में प्रोटीन की धीमी प्रसार गतिशीलता के कारण, एक क्रॉस-टॉक-फ्री माप लाइन से15लाइन के लिए उत्तेजना योजना बारी द्वारा किया जा सकता है । विश्लेषण के साथ शुरू होता है: 1) एक संरेखण एल्गोरिथ्म पार्श्व सेल आंदोलन के आधार पर ब्लॉक वार के लिए सही ~ १००० लाइनों का औसत, 2) अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत के साथ स्थिति का निर्धारण, यानी, प्रधानमंत्री की स्थिति, प्रत्येक ब्लॉक में और 3) स्थानांतरण सभी ब्लॉकों के एक आम मूल12,15, प्रत्येक चैनल में अलग से । फिर, प्रधानमंत्री के लिए इसी पिक्सेल का एक स्वत: चयन सभी गठबंधन लाइनों (यानी, केंद्र ± २.५ σ) के योग के एक गाऊसी फिट से मध्य क्षेत्र का चयन करके किया जाता है । प्रत्येक पंक्ति में संकेत के एकीकरण प्रत्येक चैनल में झिल्ली प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला एफ (टी) पैदावार (जी = ग्रीन चैनल, आर = लाल चैनल) । ध्यान दें कि पिक्सेल आकार के लिए पर्याप्त छोटा होना चाहिए, जैसे, < 200 एनएम, पॉइंट स्प्रेड फंक्शन के आकार को दोबारा बनाने के लिए और पीएम की स्थिति के अनुरूप इसका केंद्र ढूंढें । पर्याप्त photobleaching की उपस्थिति में, प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला एक डबल-घातांक फ़ंक्शन के साथ modeled हो सकता है और उसके बाद निम्न सूत्र के साथ ठीक किया गया:16

Equation 1.    1

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस फार्मूले को प्रभावी ढंग से दोनों आयाम और प्रसार एफ (टी)सीके सहसंबंध विश्लेषण से प्राप्त समय, पैरामीटर अनुमान है कि सही एफ (टी)से प्राप्त किया जाएगा की तुलना में सही है । फिर, प्रतिदीप्ति संकेतों के स्वत:-और परस्पर सहसंबंध फ़ंक्शंस (ACFs/CCFs) की गणना की जाती है

Equation 2, (२)

Equation 3, (३)

जहां δfi = चiक (t) Image 1 -fi(tImage 2 ) और i = g, r।

एक दो आयामी प्रसार मॉडल तो सभी सहसंबंध कार्यों (सीएफएस) के लिए फिट है:

Equation 4.   4

यहां, N अवलोकन मात्रा में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संख्या का अर्थ है और τघ प्रसार समय प्रत्येक चैनल के लिए । इस मॉडल के खाते में है कि वर्णित प्रयोगात्मक सेटिंग में, पीएम में प्रोटीन का प्रसार होता है एक्स-जेड विमान में होता है, प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) प्रयोगों के सामांय रूप से इस्तेमाल किया विंयास के विपरीत झिल्ली की जांच पर फोकल खंड17के एक्स-वाई विमान में प्रसार । कमर डब्ल्यू0 और संरचना कारक एस, बढ़ाव w का वर्णन जेड में फोकल मात्रा केजेड , एस = डब्ल्यूz/w0, एक बिंदु FCS से प्राप्त कर रहे है अंशांकन माप वर्णक्रमीय समान रंगों और एक ही ऑप्टिकल सेटिंग्स के साथ प्रदर्शन प्रसार गुणांक डीडाई के लिए पहले से ही उपलब्ध मूल्यों का उपयोग:

Equation 5, (५)

जहां τडी, डाई है मापा औसत प्रसार समय डाई अणुओं, तीन के लिए एक मॉडल फिटिंग से प्राप्त आयामी प्रसार के लिए डेटा, सभी N अणुओं का एक अंश टी के खाते में संक्रमण लेने के लिए एक एक समय लगातार ττ के साथ triplet राज्य:

Equation 6.   6

अंत में, प्रसार गुणांक (D), आणविक चमक मान (ε) और sFCCS डेटा (rel.cc.) के सापेक्ष परस्पर सहसंबंध निम्नानुसार परिकलित किए जाते हैं:

Equation 7, (७)

Equation 8, (८)

Equation 9, (९)

जहां Gcross(0) क्रॉस-सहसंबंध फ़ंक्शन का आयाम है और Equation 14 i-th चैनल में सहसंबंध फ़ंक्शन का आयाम है ।

सापेक्ष पार के इस परिभाषा-सहसंबंध, यानी अधिकतम का उपयोग कर के बजाय समीकरण 9 में मतलब है, खाते है कि विभिंन सांद्रता में मौजूद दो प्रोटीन प्रजातियों के परिसरों की अधिकतम संख्या द्वारा सीमित है लेता है कम संख्या में मौजूद प्रजातियां ।

क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक एक छवि के प्रत्येक पिक्सेल के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक पल विश्लेषण पर आधारित है नमूना में एक निश्चित स्थिति में समय पर अधिग्रहीत की, आम तौर पर शामिल ~ 100-200 फ्रेम, दो वर्णक्रमीय चैनलों के साथ ( जी = ग्रीन चैनल, आर = लाल चैनल) । Image 1 लौकिक से मैंImage 2मैं और विचरण Equation 16 मतलब है, आणविक चमक εमैं और संख्या nमैं प्रत्येक पिक्सेल और वर्णक्रमीय चैनल में गणना कर रहे है (मैं = जी, आर)18:

Equation 10, (१०)

Equation 11. 11

यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि दिए गए समीकरणों एक सच्चे फोटॉन-गिनती डिटेक्टर के आदर्श मामले पर लागू होते हैं । एनालॉग डिटेक्शन सिस्टमों के लिए, निम्न समीकरणों19,20लागू करें:

Equation 12, (१२)

Equation 13.   13

यहां, एस पता चला फोटॉनों और दर्ज की गई डिजिटल गिनती के बीच रूपांतरण कारक Equation 24 है, readout शोर और ऑफसेट है डिटेक्टर तीव्रता ऑफसेट को संदर्भित करता है । आम तौर पर, इन मात्रा स्थिर रोशनी19, जैसे, एक चिंतनशील धातु सतह या सूखे डाई समाधान के लिए तीव्रता के एक समारोह के रूप में डिटेक्टर विचरण को मापने के आधार पर, किसी भी डिटेक्टर प्रकार के लिए, नपेed किया जाना चाहिए । ऑफसेट उत्तेजना लाइट के बिना एक नमूने के लिए गिनती की दर को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । डिटेक्टर की एक रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन करके (I) Equation 25 तीव्रता (I) भूखंड, एस और Equation 24 19निर्धारित किया जा सकता है जुड़े विचरण:

Equation 14.   14

अंत में, क्रॉस-सहसंबंध चमक प्रत्येक पिक्सेल में परिकलित की जाती है और21 के रूप में सामान्य रूप में परिभाषित किया जाता है

Equation 15, (१५)

पार Equation 29 विचरण Equation 30 कहां है ।

लंबे समय तक रहने वाले उतार चढ़ाव को फ़िल्टर करने के लिए, सभी ccN & B परिकलन प्रत्येक पिक्सेल22के लिए स्वतंत्र रूप से, एक मालगाड़ी फ़िल्टरिंग के बाद किया जाता है । संक्षेप में, nमैं, εमैं (i = जी, आर) और बीसीसी की गणना कर रहे हैं जैसे, 8-15 फ्रेम के क्षेत्रों फिसलने । इस प्रकार प्राप्त मूल्यों तो अंतिम पिक्सेल संख्या और चमक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए औसत किया जा सकता है ।

Stoichiometry विश्लेषण
आदेश में सेल-सेल संपर्कों पर प्रोटीन परिसरों के stoichiometry का अनुमान लगाने के लिए, आणविक चमक अलग से sFCCS या ccN & B डेटा के लिए प्रत्येक वर्णक्रमीय चैनल में विश्लेषण किया जा सकता है । sFCCS में, प्रत्येक चैनल में प्रति मापन एक चमक मान प्राप्त किया जाता है. ccN & B में, कक्ष-कक्ष संपर्क के संगत सभी पिक्सेल की चमक हिस्टोग्राम प्राप्त की जाती है और औसत (या माध्य) मान माप के लिए प्रतिनिधि चमक के रूप में उपयोग किया जा सकता है । एक monomeric संदर्भ पर एक ही विश्लेषण प्रदर्शन करके, सभी चमक मूल्यों को सीधे पता लगाया प्रोटीन परिसरों की औसत oligomeric राज्य प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है । इस बिंदु पर, यह गैर-फ्लोरोसेंट एफपीएस कि oligomeric राज्य के एक अनुमान में परिणाम हो सकता है की उपस्थिति के लिए सही करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आमतौर पर एक होमो-dimeric संदर्भ प्रोटीन23,24 एक रंग एसएफसी या संख्या और चमक (एन एंड बी) का उपयोग कर की चमक को मापने के द्वारा किया जाता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. नमूना तैयारी: सेल सेल परख मिश्रण

नोट: निम्न प्रोटोकॉल अनुयाई कक्षों के लिए मिश्रण प्रक्रिया का वर्णन करता है । यह निलंबन में कल्चर्ड कक्षों के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

  1. बीज एक 6-well प्लेट पर कोशिकाओं की एक उचित संख्या, जैसे, ८००,००० HEK 293T कोशिकाओं (एक Neubauer गिनती चैंबर के साथ गिना जाता है), अभिकर्मक से पहले एक दिन । नंबर सीडिंग और अभिकर्मक के बीच के समय के आधार पर संशोधित किया जा सकता है और अन्य कोशिका प्रकार के लिए समायोजित. एक बुनियादी प्रयोग करने के लिए (यानी, ब्याज और नकारात्मक नियंत्रण के प्रोटीन), कम से 4 कुओं तैयार करते हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) मध्यम, भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक (10%) और एल-glutamine (1%)
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को Transfect ( सामग्री की तालिकादेखें).
    1. एक बुनियादी प्रयोग करने के लिए, transfect, अलग कुओं में, ब्याज के प्रोटीन के लिए plasmids एक ' हरी ' से जुड़े (जैसे, monomeric बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mEGFP), या पीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mEYFP)) या ' लाल ' (जैसे, mCherry, या mCardinal) फ्लोरोसेंट प्रोटीन ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, हम APLP1-mEYFP और APLP1-mCardinal12, और इसी नकारात्मक नियंत्रण, जैसे, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-पाम-mEYFP) और-mCardinal (myr-पाम-mCardinal)12पर ध्यान केंद्रित । आम तौर पर, २०० प्लाज्मिड डीएनए के एनजी-1 µ जी पर्याप्त हैं । उच्च अभिकर्मक दक्षता संपर्क में ' लाल ' और ' ग्रीन ' कोशिकाओं को खोजने का मौका बढ़ जाता है । अभिकर्मक दक्षता ऑप्टिमाइज़ करने के लिए प्लाज्मिड और अभिकर्मक रिएजेंट की मात्रा संशोधित करें । महत्वपूर्ण: कोशिका प्रवाह ७०% के आसपास होना चाहिए जब transfecting कोशिकाओं । यदि कोशिकाओं पर है-धाराप्रवाह, अभिकर्मक क्षमता कम हो जाएगा । कोशिकाओं पर्याप्त धाराप्रवाह नहीं कर रहे हैं, अभिकर्मक और मिश्रण तनाव पैदा कर सकते हैं और मिश्रण के बाद उचित लगाव से कई कोशिकाओं को रोकने के ।
  3. अभिकर्मक के बाद सेल मिश्रण ~4 ± 2 एच प्रदर्शन ।
    1. विकास के माध्यम निकालें और 1 मिलीलीटर पंजाब मिलीग्राम2 + और Ca2 +के साथ पूरक के साथ एक अच्छी तरह से धीरे धो लो । फिर, पंजाबियों को हटा दें । (महत्वपूर्ण) अच्छी तरह से किनारे पर छोड़ पंजाबियों धोने के दौरान कोशिकाओं की टुकड़ी को रोकने के लिए ।
    2. जोड़ें ~ ५० µ l trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान ड्रॉप वार कोशिकाओं की टुकड़ी की सुविधा के लिए एक अच्छी तरह से । 2 min. after के लिए ३७ ° c पर मशीन, धीरे से 6 अच्छी प्लेट बाद में मिलाने के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए ।
      नोट: कुछ कक्ष प्रकारों के लिए विस्तारित मशीनिंग समय की आवश्यकता हो सकती है ।
    3. विकास माध्यम के ९५० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से और resuspend कोशिकाओं को कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा, जिससे अच्छी तरह से नीचे से सभी कोशिकाओं को अलग । (महत्वपूर्ण) यह सुनिश्चित करें कि कक्ष पुनर्निलंबन के बाद बड़े सेल समुच्चय की अनुपस्थिति के लिए जांच करके एक दूसरे से अलग किए गए कक्षों को ठीक से सस्पैंड कर रहे हैं । अन्यथा कई ' red'-'red ' या ' green'-'green ' संपर्कों को मिलाने के बाद प्राप्त किया जा सकेगा.
    4. एक अच्छी तरह से (ब्याज या नकारात्मक नियंत्रण के प्रोटीन) के सेल समाधान स्थानांतरण इसी अच्छी तरह से, यानी, ' लाल ' (जैसे, APLP1-mCardinal transfected) को ' हरी ' (जैसे, APLP1-mEYFP transfected) कोशिकाओं । मिश्रण धीरे से कुछ समय ऊपर और नीचे pipetting । फिर, ३५-mm ग्लास नीचे व्यंजन पर मिश्रित कोशिकाओं बीज (डिश प्रति मिश्रित सेल समाधान के 1 मिलीलीटर, प्लस विकास के माध्यम से 1 मिलीलीटर) और संस्कृति एक और दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO2में कोशिकाओं बीज ।

Figure 1
चित्रा 1 . सेल-सेल संपर्कों में प्रतिदीप्ति क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी और क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक विश्लेषण स्कैनिंग का प्रायोगिक कार्यप्रवाह और योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । (क) नमूना तैयारी की योजना: दो सेल आबादी ब्याज के प्रोटीन के साथ transfected (जैसे, APLP1) दो वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े (जैसे, mEYFP और mCardinal) अभिकर्मक के बाद मिश्रित कर रहे हैं । अलग transfected कोशिकाओं के संपर्क सूक्ष्म प्रयोगों में चुना जाता है । extracellular बाध्यकारी डोमेन के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज की प्रोटीन की intracellular टर्मिनस से जुड़े होना चाहिए । (ख) स्कैनिंग FCCS (sFCCS) माप दो वर्णक्रमीय चैनल (चैनल 1, ग्रीन और चैनल 2, लाल) में सेल-सेल संपर्क करने के लिए सीधा किया जाता है । स्कैन लाइनों (kymographs के रूप में प्रस्तुत) संरेखित और झिल्ली पिक्सेल अभिव्यक्त कर रहे हैं । फिर, ACFs और CCFs तीव्रता निशान एफi(टी)से गणना कर रहे हैं । ACFs लाल और हरे रंग में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । CCF नीले रंग में प्रतिनिधित्व किया है । (C) क्रॉस-सहसंबंध N & b (ccN और b) अधिग्रहण परिणाम में एक त्रि-आयामी (x-y-समय) छवि स्टैक । सेल-सेल संपर्क के चारों ओर ROI का चयन किया जाता है. फिर चैनल और क्रॉस-सहसंबंध चमक (ε1, ε2, और Bcc) मान प्रत्येक कक्ष-कक्ष संपर्क पिक्सेल में परिकलित किए जाते हैं । परिणाम तो हिस्टोग्राम के रूप में visualized रहे हैं, सभी चयनित पिक्सल पूलिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

2. नमूना तैयारी: परस्पर सहसंबंध प्रयोगों और होमो-डिमर चमक विश्लेषण के लिए निर्माण के लिए सकारात्मक नियंत्रण

  1. बीज ६००,००० HEK 293T कोशिकाओं, एक सेल गिनती चैंबर के साथ गिना जाता है, पर ३५-mm ग्लास नीचे व्यंजन अभिकर्मक से पहले एक दिन । संस्कृति ३७ ° c, 5% CO2 में पूर्ण DMEM मध्यम (चरण १.१) एक और दिन के लिए देखने में कोशिकाओं ।
  2. Transfect कोशिकाओं के साथ ~ २५० प्लाज्मिड डीएनए के एनजी निर्माता निर्देश के अनुसार । सकारात्मक पार सहसंबंध नियंत्रण के लिए, एक प्लाज्मिड एंकोडिंग का उपयोग एक झिल्ली-फ्लोरोसेंट प्रोटीन hetero-डिमर, लंगर , जैसे, myr-पाम-mCherry-mEGFP या myr-पाम-mCardinal-mEYFP12 इसी ब्याज के प्रोटीन की एफपीएस के लिए इसी । चमक अंशांकन के लिए, दोनों एक झिल्ली-लंगर FP मोनोमर और होमो-डिमर हित के प्रोटीन से जुड़े एफपीएस के लिए इसी एंकोडिंग का उपयोग करें, जैसे, myr-पाम-mEYFP और myr-पाम-mEYFP-mEYFP की चमक विश्लेषण जांचने के लिए plasmids APLP1-mEYFP12.
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं, 5% पूर्ण DMEM माध्यम में सह2 (चरण १.१ देखें) एक और दिन के लिए ।

3. फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी: सेटअप और फोकल वॉल्यूम अंशांकन

नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप पर mEGFP/mEYFP और mCherry/mCardinal के साथ निष्पादित प्रयोगों के लिए निम्न प्रोटोकॉल लिखा गया है । ऑप्टिकल सेटअप, सॉफ्टवेयर सेटिंग्स (लेजर लाइनों, dichroic दर्पण, फिल्टर) और अंशांकन रंजक के विकल्प अन्य एफपीएस और माइक्रोस्कोप setups के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

  1. लेजर स्थिरता और तापमान के equilibration को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग से कम एक घंटे पहले माइक्रोस्कोप और पराबैंगनीकिरण को चालू करें ।
  2. तैयार 100-200 µ l उपयुक्त पानी में घुलनशील फ्लोरोसेंट डाई समाधान (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) पानी या पंजाब में 10-50 एनएम रेंज में सांद्रता के साथ, फोकल मात्रा जांचना करने के लिए ।
  3. एक साफ ३५ मिमी ग्लास नीचे पकवान #1 .5, यानी, 0.16-0.19 मिमी की मोटाई होने पर डाई समाधान प्लेस ।
    नोट: आदर्श रूप में, उच्च प्रदर्शन कवर ग्लास के साथ व्यंजन का उपयोग एक कम मोटाई सहिष्णुता होने, उदाहरण के लिए, ०.१७० ± ०.००५ mm, एक इष्टतम कॉलर अंगूठी सुधार (चरण ३.६) की अनुमति । निम्नलिखित प्रयोगों के लिए बाद में प्रयोग किया जाता है के रूप में पकवान का एक ही प्रकार का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. सीधे उद्देश्य पर डाई समाधान युक्त पकवान (अधिमानतः, जल विसर्जन, एनए १.२ के साथ) के समाधान में ध्यान केंद्रित सुनिश्चित करने के लिए जगह है । वैकल्पिक रूप से, नमूना धारक पर पकवान प्लेस और नमूने में ध्यान केंद्रित (जैसे, पकवान के तल से ऊपर 10-20 µm) ।
    नोट: हम तेल के कारण गरीब जब जलीय नमूनों में गहरी ध्यान केंद्रित संकेत प्राप्त उद्देश्यों का उपयोग करने की सिफारिश नहीं है ।
  5. उत्तेजना और उत्सर्जन पथ की स्थापना, जैसे, ४८८ एनएम लेजर, एक 488/561 एनएम dichroic मिरर, पता लगाने खिड़की 499-552 एनएम और 1 हवादार इकाई (AU) के एक pinhole आकार का चयन करें । सुनिश्चित करें कि pinhole आकार एक है कि परस्पर सहसंबंध माप में इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में ही है ।
  6. गिनती दर को अधिकतम करने के लिए pinhole स्थिति (pinhole समायोजन) और उद्देश्य कॉलर अंगूठी समायोजित करें । अधिकतम गणना दर का पता चला है जब तक इस उद्देश्य के लिए, कॉलर अंगूठी बारी ।
    नोट: कॉलर अंगूठी का इस्तेमाल किया कवर कांच की विशिष्ट मोटाई के लिए सुधार खातों । अधिकतम गिनती दर, यानी, के रूप में संभव के रूप में अणु प्रति कई फोटॉनों संग्रह, माप का संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  7. बिंदु FCS माप की एक श्रृंखला (उदाहरण के लिए, विभिन्न स्थानों पर 6 माप, 10 एस के 15 पुनरावृत्तियों से मिलकर प्रत्येक,यानी, २.५ मिनट कुल समय, 1 µs के साथ नमूना समय या कम) एक ही लेजर शक्ति में उपयोग के रूप में पार सहसंबंध में इस्तेमाल किया माप (आमतौर पर ~ 1%, यानी, ~ 1-2 µW) ।
  8. एक triplet योगदान (समीकरण 6) डेटा के लिए सहित एक तीन आयामी प्रसार मॉडल फिट ।
    नोट: आमतौर पर, प्राप्त प्रसार बार के आसपास है 30 µs और संरचना कारक 4-8 के आसपास है ।
  9. मापा औसत प्रसार समय से कमर डब्ल्यू0 की गणना और समीकरण 5 के अनुसार कमरे के तापमान25 पर इस्तेमाल किया डाई के प्रसार गुणांक के लिए प्रकाशित मूल्यों । ठेठ मान रहे है 200-250 एनएम ।
  10. (जैसे, ५६१ एनएम उत्तेजना और ५७० एनएम और ६९५ एनएम के बीच का पता लगाने) की जरूरत है, तो एक दूसरे का पता लगाने चैनल के लिए एक अलग फ्लोरोसेंट डाई के साथ अंशांकन दिनचर्या (चरण 3.4-3.9) दोहराएँ । pinhole स्थिति और आकार के रूप में इसे पहले पहचान चैनल के लिए सेट किया गया था रखें ।
  11. अंशांकन माप से आणविक चमक (समीकरण 8) की गणना, और प्राप्त मूल्यों की दुकान.
    नोट: उपयोग किए गए सेटअप के लिए विशिष्ट मान है ~8-10 kHz/अणु (मॉल) के लिए १.८ µW ४८८ एनएम उत्तेजना पावर । सामान्य मूल्यों की तुलना में कम उद्देश्य पर गंदगी का संकेत हो सकता है, सेटअप या एक कम लेजर उत्पादन के ग़लत संरेखण. जांच करें और नियमित रूप से एक बिजली मीटर का उपयोग उद्देश्य पर लेजर उत्पादन शक्तियों की दुकान । अलग setups की तुलना के लिए, उत्तेजना लेजर शक्ति द्वारा सामान्यीकृत आणविक चमक सबसे सार्थक पैरामीटर माइक्रोस्कोप प्रदर्शन का आकलन करने के लिए है ।

4. स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी: अधिग्रहण

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल mEGFP/mEYFP (' ग्रीन ') और mCherry/mCardinal (' लाल ') लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप इस अध्ययन में प्रयुक्त पर के साथ प्रदर्शन प्रयोगों के लिए लिखा है । ऑप्टिकल सेटअप और सॉफ्टवेयर सेटिंग्स (लेजर लाइनों, dichroic दर्पण, फिल्टर) अन्य एफपीएस या माइक्रोस्कोप setups के लिए अलग हो सकता है ।

  1. ऑप्टिकल पथ सेट करें, जैसे, ४८८ एनएम और ५६१ एनएम उत्तेजना और एक 488/561 एनएम dichroic मिरर, pinhole पर 1 AU के लिए ४८८ एनएम उत्तेजना । वर्णक्रमीय पार बात से बचने के लिए, उत्तेजित और mEGFP/mEYFP (४८८ एनएम उत्तेजना, ग्रीन चैनल) और mCherry/mCardinal (५६१ एनएम उत्तेजना, लाल चैनल) क्रमिक रूप से का पता लगाने और स्विच पटरियों हर लाइनका चयन करने के लिए दो अलग पटरियों का चयन करें । पता लगाने के लिए, दोनों चैनलों के लिए उपयुक्त फिल्टर, उदाहरण के लिए , ग्रीन चैनल में 499-552 एनएम और लाल चैनल में 570-695 एनएम का उपयोग करें ।
  2. यदि वैकल्पिक उत्तेजना संभव नहीं है, तो लाल चैनल के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग वर्णक्रमीय क्रॉस-टॉक को कम करने के लिए करें (यानी ६०० एनएम से नीचे नहीं mCherry/mCardinal प्रतिदीप्ति) । यह लाल चैनल में पाया फोटॉनों की मात्रा को कम करने और इस तरह SNR कम हो सकती है ।
  3. नमूना धारक पर मिश्रित कोशिकाओं युक्त पकवान रखें । तापमान equilibration सुनिश्चित करने के लिए और फोकस बहाव को कम करने के लिए न्यूनतम 10 मिनट रुको ।
  4. पता लगाएँ मेनू में ट्रांसमिशन लाइट का उपयोग कर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित.
  5. एक दूसरे के संपर्क में एक ' लाल ' और एक ' ग्रीन ' सेल की एक जोड़ी के लिए खोज । सकारात्मक परस्पर सहसंबंध या होमो-डिमर चमक नियंत्रण (अनुभाग 2 देखें) के लिए, दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाली एक पृथक कोशिका या संबंधित होमो-डिमर सिग्नल को पीएम के लिए खोजें ।
    नोट: (महत्वपूर्ण) प्री-ब्लीचिंग से बचने के लिए कक्षों की खोज करते हुए नमूना एक्सपोज़र कम करें, जो कि परस्पर सहसंबंध26को कम कर सकता है. इसलिए, सबसे तेजी से स्कैन गति और कम लेजर शक्तियों पर स्कैन । इमेजिंग दृढ़ता से व्यक्त कोशिकाओं, एकीकरण मोडमें खोज करते हुए डिटेक्टर संतृप्ति से बचने के लिए । हालांकि, जोखिम को कम करने के लिए, कम लेजर शक्तियों पर स्कैनिंग फोटॉन गिनती मोड में संभव है ।
  6. कक्ष-कक्ष संपर्क करने के लिए सीधा स्कैन पथ का चयन करें (या सकारात्मक परस्पर सहसंबंध या होमो-डिमर चमक नियंत्रण के लिए किसी एकल कक्ष के PM के लिए) के रूप में आंकड़े 1b और 2aमें चित्रित फसल बटन का उपयोग कर ।
    नोट: कुछ पुराने सूक्ष्मदर्शी मनमाने ढंग से स्कैन दिशाओं की अनुमति नहीं है । इस मामले में, स्कैन दिशा के लिए सीधा एक अभिविन्यास के साथ सेल-सेल संपर्क स्थित होना चाहिए.
  7. ज़ूम 50-200 एनएम के एक पिक्सेल आकार प्राप्त करने के लिए और स्कैन मोडमें रेखा का चयन करें । १२८ × 1 पिक्सल के लिए फ्रेम आकार सेट करें ।
    नोट: ठेठ पिक्सेल आकार १६० एनएम, लगभग 20 µm की एक स्कैन की लंबाई के लिए इसी है ।
  8. अधिकतम अनुमत मान, उदा., ४७२.७३ µs प्रति पंक्ति स्कैन गति सेट करें ।
    नोट: एक वैकल्पिक उत्तेजना योजना के लिए, यह करने के लिए संगत ९५४.४५ µs स्कैन समय, अर्थात ~ १००० स्कैन/s सेटअप का उपयोग किया जाता है । स्कैन की गति ब्याज की प्रोटीन के प्रसार गुणांक के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । झिल्ली-लंगर प्रोटीन के लिए, ठेठ प्रसार बार के आसपास है 10-20 ms. स्कैन समय से कम दस बार प्रसार समय से छोटा होना चाहिए । कम स्कैन गति मजबूत photobleaching प्रेरित और कम रोशनी शक्ति की आवश्यकता हो सकती है । वैकल्पिक रूप से, एक एक ठहराव लागू कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, 5 ms, के बीच में एक बहुत धीरे से समय श्रृंखला सबमेनू में अंतराल का उपयोग कर परिसरों को फैलाना के लिए स्कैन ।
  9. उपयुक्त लेजर शक्तियों का चयन, उदा, ~ 1-2 ४८८ एनएम के लिए µW और ~ 5-10 µW ५६१ एनएम उत्तेजना के लिए ।
    नोट: उच्च लेजर शक्तियों SNR में सुधार, लेकिन photobleaching वृद्धि हुई है । इसलिए, लेजर शक्तियों को इस तरह चुना जाना चाहिए कि photobleaching प्रारंभिक गणना दर के ५०% से कम हो ।
  10. 100000-500000 के लिए चक्र सेट करें ।
    नोट: स्कैन की संख्या, यानी, माप की अवधि, भिन्न हो सकते हैं: लंबे समय तक माप समय SNR में सुधार होगा और धीरे से अणुओं को फैलाना के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है, तथापि, कोशिकाओं की गति और photobleaching सीमा अधिक से अधिक माप समय. यहां प्रस्तुत डेटा नियमित रूप से ~ 3-6 मिनट, यानी, 200000-400000 लाइन स्कैन के लिए अधिग्रहीत किया गया ।
  11. सेट डिटेक्टरों फोटॉन गिनती मोड के लिए । अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें प्रयोग दबाएं । दूसरे कक्ष को मापने के लिए 4.5-4.11 चरणों को दोहराएँ ।
    नोट: यह अलग अभिव्यक्ति स्तर पर नमूना प्रति 10-15 कोशिकाओं को मापने के लिए सिफारिश की है. (महत्वपूर्ण) उच्च अभिव्यक्ति के स्तर पर डिटेक्टर संतृप्ति से बचें । अधिकतम गणना दर ~ 1 मेगाहर्ट्ज से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
  12. चमक विश्लेषण oligomeric राज्यों का निर्धारण करने के लिए किया जाता है, तो संशोधित चरणों के अनुसार होमो-डिमर चमक अंशांकन माप प्रदर्शन 4.1-4.11: प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन होमो-डिमर अलग से उपाय (अलग कोशिकाओं में, का उपयोग कर तैयार प्रोटोकॉल अनुभाग 2) और केवल एक वर्णक्रमीय चैनल में माप प्रदर्शन.

5. स्कैनिंग प्रतिदीप्ति क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी: डेटा विश्लेषण

नोट: निम्न प्रोटोकॉल पिछले आलेख12,15में विवरण में वर्णित विश्लेषण कार्यविधि के कार्यांवयन का अनुसरण करता है । सॉफ्टवेयर कोड लेखकों के अनुरोध पर उपलब्ध है ।

  1. raw डेटा स्वरूप में एक RGB TIFF छवि के लिए अपुष्ट डेटा (उदा., CZI) फ़ाइलों को निर्यात करें । इस फ़ाइल में क्रमश: चैनल टर्म्ड G और R छवि के, हरे और लाल चैनल डेटा के साथ एक kymograph शामिल होंगे ।
  2. उचित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ TIFF फ़ाइल आयात करें और विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: निम्न चरणों का पालन (चरण 5.3-5.7) प्रत्येक चैनल के लिए अलग से लागू होते हैं:
  3. 500-1000 रेखाओं के खंडों के साथ खंड-वार या चलायमान समय औसत प्रदर्शन करते हुए रेखाओं को संरेखित करें । झिल्ली की स्थिति, यानी, अधिकतम गिनती दर के साथ पिक्सेल स्थिति, प्रत्येक ब्लॉक में निर्धारित करते हैं । सभी ब्लॉकों को एक ही पार्श्व स्थिति में शिफ्ट करें । सेल-सेल संपर्क के पार्श्व विस्थापन के लिए यह प्रक्रिया सही है, जैसे, कोशिका आंदोलन के कारण ।
  4. समय अक्ष के साथ सभी संरेखित पंक्तियों का योग करें और एक गाऊसी फ़ंक्शन का उपयोग करके औसत तीव्रता प्रोफ़ाइल को फ़िट करे । महत्वपूर्ण intracellular पृष्ठभूमि की उपस्थिति में, एक गाऊसी प्लस एक अवग्रह समारोह का उपयोग करें । इस झिल्ली के रूप में सभी पिक्सेल के रूप में इसी पिक्सेल को परिभाषित झिल्ली की स्थिति के २.५ σ और प्रत्येक पंक्ति में इन पिक्सल की तीव्रता योग, प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक एकल प्रतिदीप्ति संकेत मूल्य प्राप्त (यानी, प्रत्येक लाइन के लिए स्कैन) ।
  5. यदि आवश्यक हो (जैसे, पृष्ठभूमि > झिल्ली संकेत के 10%), कोशिका द्रव्य में औसत पिक्सेल तीव्रता घटाकर २.५ σ (पिक्सेल इकाइयों में) झिल्ली प्रतिदीप्ति से, १००० लाइनों के ब्लॉक में से गुणा करके एक पृष्ठभूमि सुधार लागू होते हैं । उज्ज्वल intracellular बुलबुले से बचें जब पृष्ठभूमि पिक्सल का चयन ।
  6. यदि photobleaching मनाया जाता है, एक ब्लीचिंग सुधार लागू होते हैं । इसलिए, एक डबल-घातांक फ़ंक्शन के साथ झिल्ली प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला फ़िट करें और उपयुक्त सुधार सूत्र लागू करें, समीकरण 116.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, रूपान्तर स्पेक्ट्रम आधारित सुधार योजनाओं को27लागू किया जा सकता है । (महत्वपूर्ण) यदि photobleaching मौजूद है लेकिन के लिए सही नहीं है, सीएफएस गंभीर रूप से विकृत हो सकता है और पैरामीटर अनुमान दृढ़ता से पक्षपातपूर्ण हो सकता है (उदा., चित्रा 5ईदेखें) ।
  7. गणना ACFs और CCFs समीकरण 2 और 3 के अनुसार का उपयोग करना, उदा, एक बहु ताऊ एल्गोरिथ्म28. विश्लेषण की विश्वसनीयता को बेहतर बनाने और कलाकृतियों से बचने के लिए, कुल माप के 10-20 बराबर क्षेत्रों के लिए गणना करते हैं । प्रत्येक खंड में प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला और सीएफएस का निरीक्षण करें और स्पष्ट रूप से विकृत क्षेत्रों को हटा दें ( चित्र 4a-4dमें उदाहरण देखें) । सभी गैर विकृत खंडों औसत ।
    नोट: यह कार्यविधि स्वचालित डेटा29के लिए एक व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह से बचने के लिए किया जा सकता है । बहुत अस्थिर माप के लिए कई छोटे खंडों होने सहायक हो सकता है । हालांकि, एक खंड की लंबाई अभी भी प्रसार समय के ऊपर परिमाण के कम से तीन आदेश होना चाहिए सांख्यिकीय नमूना त्रुटियों29,30,17से बचने के लिए ।
  8. एक दो आयामी प्रसार मॉडल, 4 समीकरण, प्राप्त सीएफएस को फिट । इसलिए, संरचना फ़ैक्टर अंशांकन माप (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) में प्राप्त मान को ठीक करें । फिट की सटीकता एकाधिक ताऊ एल्गोरिथ्म से प्राप्त प्रत्येक डेटा बिंदु के सांख्यिकीय भार का उपयोग कर एक भारित फिट प्रदर्शन से सुधार किया जा सकता है ।
  9. समीकरण 7 के अनुसार नपे कमर का उपयोग प्रसार गुणांक की गणना.
  10. कणों की इसी संख्या से प्रत्येक चैनल में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके आणविक चमक की गणना, समीकरण 8. oligomeric राज्य प्राप्त करने के लिए इसी monomeric संदर्भ की औसत चमक द्वारा प्रत्येक चैनल में निर्धारित चमक मूल्य को सामान्य, खाते में गैर फ्लोरोसेंट एफपीएस23ले. इस लक्ष्य के लिए, गैर फ्लोरोसेंट एफपीएस23के अंश की गणना करने के लिए एक रंग विश्लेषण से औसत होमो-डिमर चमक मूल्यों का निर्धारण ।
  11. समीकरण 9 के अनुसार सापेक्ष परस्पर संबंध की गणना ।

6. पार सहसंबंध संख्या और चमक: डिटेक्टर अंशांकन

नोट: निम्न प्रोटोकॉल पता लगाना सिस्टम जांचने के लिए कैसे के बारे में एक सामान्य दिशानिर्देश प्रदान करता है । यह प्रक्रिया एनालॉग का पता लगाने प्रणालियों के लिए अनिवार्य है, लेकिन जब सच फोटॉन गिनती डिटेक्टरों इस्तेमाल कर रहे हैं सख्ती की जरूरत नहीं है.

  1. सूखी उचित पानी में घुलनशील डाई समाधान (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) पर एक ३५-mm ग्लास नीचे पकवान । ऑप्टिकल पथ तदनुसार सेट, अर्थात्, ४८८ या ५६१ एनएम उत्तेजना और पता लगाने के 499-552 एनएम या 570-695 एनएम, क्रमशः ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक चिंतनशील धातु की सतह का इस्तेमाल किया जा सकता है बजाय सूखे डाई समाधान के उद्देश्य के शीर्ष पर सीधे धातु टुकड़ा रखकर ।
  2. विभिन्न डाई सांद्रता या विभिन्न लेजर शक्तियों के साथ क्षेत्रों में एक रंग एन और बी माप प्रदर्शन. इसलिए, ज़ूम का उपयोग करने के लिए पिक्सेल आकार प्राप्त करने के लिए ३०० एनएम, स्कैन गति निर्धारित करने के लिए उपयुक्त पिक्सेल निवास समय, उदाहरण के लिए, 25 µs और सेट चक्र 100-200 फ्रेम करने के लिए.
  3. फोटॉन गिनती सेट डिटेक्टरों (या माप एनालॉग का पता लगाने के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं तो एनालॉग मोड ) और अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रेस शुरू प्रयोग . माप तीव्रता ऑफ़सेट निर्धारित करने के लिए शून्य उत्तेजना पावर पर निष्पादित करें ।
  4. सभी मापी गई पिक्सेल के लिए पिक्सेल तीव्रता के एक फंक्शन के रूप में पिक्सेल प्रसरण प्लॉट करें और इन डेटा के रेखीय फ़िट को निष्पादित करे । निर्धारित रैखिक फ़िट की ढलान के रूप में एस । y-अवरोधन से readout शोर की गणना, एस और निर्धारित तीव्रता समीकरण 14 के अनुसार ऑफसेट का उपयोग कर ।

7. पार सहसंबंध संख्या और चमक: अधिग्रहण

  1. sFCCS प्राप्ति प्रोटोकॉल के 4.1-4.4 चरणों का पालन करें ।
  2. एक सेल-सेल संपर्क के आसपास ५१२ × १२८ पिक्सल के एक फ्रेम का चयन करने के लिए फसल का उपयोग करें (या होमो-डिमर चमक नियंत्रण के लिए पृथक प्रधानमंत्री) और 50-100 एनएम के एक पिक्सेल आकार को प्राप्त करने के लिए ज़ूम ।
  3. उपयुक्त पिक्सेल निवास समय सेट करने के लिए स्कैन गति का उपयोग करें, उदा., ६.३ µs.
    नोट: N & B में, पिक्सेल निवास समय ब्याज की प्रोटीन के प्रसार समय से बहुत छोटा होना चाहिए । यदि एक वैकल्पिक उत्तेजना योजना चुना है, उदाहरण के लिए, हर लाइन पटरियों स्विचन, दो पटरियों के बीच समय ब्याज की प्रोटीन के प्रसार समय से छोटी होनी चाहिए । अन्यथा detectable परस्पर संबंध कम हो जाता है.
  4. 100-200 फ्रेम के लिए चक्र सेट करें ।
    नोट: एक उच्च फ्रेम संख्या SNR में सुधार होगा, तथापि, सेल आंदोलन कुल माप समय सीमा हो सकती है । प्रति फ्रेम स्कैन समय ब्याज की प्रोटीन के प्रसार के समय की तुलना में बहुत अधिक होना चाहिए । अन्यथा स्पष्ट चमक कम हो जाती है, अर्थात, कणों के रूप में प्रकट होते हैं । बहुत धीरे प्रसार परिसरों के लिए, एक ठहराव थोपना, जैसे, 2 एस, समय श्रृंखला सबमेनू में अंतराल का उपयोग कर फ्रेम के बीच में ।
  5. सेट लेजर शक्तियों को उचित मूल्यों (विशिष्ट मान रहे है ~ 1-2 µW के लिए ४८८ एनएम और ~ 5-10 µW के लिए ५६१ एनएम उत्तेजना) ।
    नोट: उच्च लेजर शक्ति उच्च चमक और बेहतर SNR की ओर जाता है, लेकिन यह भी बढ़ाया photobleaching । लेजर शक्तियों के लिए पर्याप्त उच्च होना चाहिए एक का पता चला चमक को प्राप्त करने में कम से ~ 1 kHz/लेकिन कम पर्याप्त 10-20% photobleaching से बचने के लिए रखा । mEGFP/mEYFP या mCherry/mCardinal के लिए, 10% से कम photobleaching आम तौर पर प्राप्त कर रहे हैं ।
  6. फोटॉन गिनती को सेट डिटेक्टरों (या माप एनालॉग का पता लगाने के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, तो एनालॉग मोड ). अधिग्रहण प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ करें प्रयोग दबाएं ।
  7. फोटॉन गणना दर का मूल्यांकन करें । यदि कक्ष-कक्ष संपर्क पिक्सेल में गणना की दर 1 MHz से अधिक हो, तो कम व्यंजक स्तरों वाले लेज़र पावर या कक्षों का चयन करें । दोहराएं चरण 7.2-7.7 । कक्षों की अगली जोड़ी को मापने के लिए । यह विभिंन अभिव्यक्ति के स्तर पर प्रयोग प्रति 10-15 कोशिकाओं को मापने के लिए सिफारिश की है ।
  8. चमक विश्लेषण oligomerization यों करने के लिए किया जाता है, तो संशोधित कदम के अनुसार होमो-डिमर चमक अंशांकन माप प्रदर्शन 7.1-7.7: प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन होमो-डिमर अलग से उपाय (अलग कोशिकाओं में, का उपयोग कर तैयार प्रोटोकॉल अनुभाग 2) और केवल एक वर्णक्रमीय चैनल में माप प्रदर्शन.

8. क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक: डेटा विश्लेषण

नोट: निम्न प्रोटोकॉल पहले वर्णित विश्लेषण प्रक्रिया12,31अनुसरण करता है । सॉफ्टवेयर कोड अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है ।

  1. raw डेटा आयात करें (उदा., CZI फ़ाइलों का उपयोग कर आयात किया जा सकता है । सभी फ़्रेम को औसत करें और कक्ष-कक्ष संपर्क के आस-पास ब्याज (ROI) का एक क्षेत्र चुनें.
  2. एक छवि संरेखण एल्गोरिथ्म३३, उदाहरण के लिए, मनमाने ढंग से पार्श्व अनुवाद के लिए बाद में फ्रेम में ROIs के बीच स्थानिक सहसंबंध अधिकतम द्वारा, दोनों चैनलों पर औसत । यह प्रक्रिया कोशिकाओं के पार्श्व आंदोलन के लिए सही होगा ।
  3. बाहरी लंबे समय तक रहने वाले उतार चढ़ाव, से उद्भव, जैसे, अवशिष्ट कोशिका आंदोलन या पृष्ठभूमि ब्लीचिंग को कम करने के लिए एक मालगाड़ी फिल्टर22 लागू करें । वैकल्पिक रूप से, एक trending विधि photobleaching३४के लिए सही करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
    नोट: अगर कोई सेगमेंट-वार विश्लेषण या विट्रेंडिंग लागू नहीं किया गया है, तो स्पष्ट चमक को काफी हद तक आंका जा सकता है.
    1. , उदाहरण के लिए, 8 से 15 फ्रेम (जैसे, फ्रेम 1 से 8, 2 से 9 और इतने आगे) की रपट क्षेत्रों को परिभाषित करने और प्रत्येक खंड में समीकरण 10, 11 और 15 पिक्सेल वार के अनुसार चैनल और पार सहसंबंध चमक मूल्यों की गणना । यदि डिटेक्टरों सही नहीं कर रहे है फोटॉन गिनती डिटेक्टरों, खाते में नपे डिटेक्टर पैरामीटर ले जब चमक की गणना, यानी, का उपयोग समीकरण 12 और 13 के बजाय ।
      नोट: 8 से 15 फ़्रेंस के सेगमेंट में चमक मानों की गणना करने से निरपेक्ष चमक का 10-20% का आंकलन होता है और कण संख्याओं का 10-20% अधिक आंकलन होता है । फिर भी, चमक अनुपात (जैसे, डिमर मोनोमर चमक करने के लिए) प्रभावित नहीं हैं, जब तक खंड लंबाई विश्लेषण भर में लगातार रखा है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । एक दिया खंड लंबाई के लिए सांख्यिकीय त्रुटि सिमुलेशन के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है और इस तरह के लिए सही ।
    2. सभी सेगमेंट पर प्राप्त चमक मान पिक्सेल-वार का औसत. इस चरण में, एक खंड चमक मानों का औसत से सबसे अधिक और निंनतम 5% निकाल सकता है या उन सेगमेंट को छोड़ सकते हैं, जो तीव्रता में स्पष्ट विकृति दिखाते हैं, उदाहरण के लिए, जैसे, एक intracellular पुटिका या समग्र क्षणिक रूप से इन में मौजूद पिक्सेल.
  4. पिक्सेल चमक मानों को पिक्सेल तीव्रता के एक फंक्शन के रूप में प्लॉट करें और उस पिक्सेल की जनसंख्या चुनें जो सेल-सेल संपर्क से मेल खाती हो । पृष्ठभूमि पिक्सेल बहुत कम तीव्रता मान होगा । इस बिंदु पर, अधिकतम गणना दर का पुन: मूल्यांकन करें । ढेर-अप प्रभावों को रोकने के लिए 1 मेगाहर्ट्ज से ऊपर की गिनती दरों के साथ पिक्सल को छोड़ दें ।
  5. चयनित कक्ष-कक्ष संपर्क पिक्सेल्स के चैनल और क्रॉस-सहसंबंध चमक हिस्टोग्राम बनाएं और ROI औसत चमक मान प्राप्त करें । oligomeric राज्य को प्राप्त करने के लिए इसी monomeric संदर्भ की औसत चमक से औसत चैनल चमक मूल्य को सामान्य, खाते में गैर फ्लोरोसेंट एफपीएस23ले. इसलिए, गैर फ्लोरोसेंट एफपीएस23के अंश की गणना करने के लिए एक रंग विश्लेषण से औसत होमो-डिमर चमक मूल्यों का निर्धारण ।
  6. उदाहरण के लिए, प्लॉट चैनल और क्रॉस-सहसंबंध चमक मानचित्र ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटीन के लिए एक पहले परीक्षण-प्रोटीन संपर्क परख, यानी, sFCCS/ccN और बी माप (चित्रा 1) के बाद वर्णक्रमीय विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के मिश्रण, प्रोटीन है कि उंमीद नहीं कर रहे है पर किया जाना चाहिए सेल-सेल संपर्क (यानी, एक नकारात्मक नियंत्रण) पर बातचीत । इसलिए, HEK 293T कोशिकाओं व्यक्त myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-पाम-mEYFP) या-mCardinal मिश्रित थे और sFCCS सेल-सेल संपर्क (चित्रा 2ए) भर में किया गया था । एक आदर्श मामले में, प्रत्येक चैनल में प्रतिदीप्ति संकेत एक स्थिर मतलब के आसपास उतार चढ़ाव, प्रधानमंत्री में प्रोटीन की प्रसार गति और फोकल मात्रा में प्रोटीन की संख्या के सांख्यिकीय रूपांतरों का एक परिणाम के रूप में माना जाता है । प्रोटीन है कि बातचीत नहीं करते, दोनों चैनलों में उतार चढ़ाव एक दूसरे से स्वतंत्र है और, इस प्रकार, वर्णक्रमीय पार सहसंबंध शूंय के आसपास उतार चढ़ाव की उंमीद है । दरअसल, एक रिश्तेदार पार शूंय के करीब संबंध ठेठ माप (चित्रा 2सी) में मनाया गया । ACFs शो की विशेषता क्षय समय ~ 10-20 ms (इसी के लिए, औसत पर, dmyr-पाम = १.३ ± ०.३ µm2/(± एसडी, एन = 20 कोशिकाओं)), के रूप में myr के प्रसार के लिए आशा-पाम-mEYFP और-mCardinal में प्रधानमंत्री, जैसे, डीmyr-पाम = ०.८८ ± ०.११ µm2/(± SEM मतलब) photobleaching (frap है) प्रयोगों३५के बाद प्रतिदीप्ति वसूली पर आधारित है । विशेष रूप से, इन बल्कि धीमी गतिशीलता एक बारी उत्तेजना योजना के उपयोग की अनुमति, यानी, केवल हरे और केवल लाल उत्तेजना और हर लाइन का पता लगाने के बीच स्विचन, कारण एक ~ ०.५ ms दोनों चैनलों में संकेतों के बीच देरी लेकिन दबा वर्णक्रमीय पार बात । औसत पर, एक बहुत कम औसत पार ०.०८ ± ०.१० के सहसंबंध (± एसडी मतलब, एन = 17 कोशिकाओं) नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्राप्त किया गया था (चित्रा 3ई), के रूप में की उंमीद है ।

अगला, एक सकारात्मक पार सहसंबंध नियंत्रण ऑप्टिकल सेटअप में अधिकतम संभव पार सहसंबंध जांचने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसलिए, झिल्ली-लंगर hetero-डिमर myr-पाम-mCardinal-mEYFP HEK 293T कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था और sFCCS मापन एकल कोशिकाओं (चित्रा 2ख) पर प्रदर्शन किया गया । प्राप्त CCFs सकारात्मक आयाम था और ACFs के रूप में समान क्षय बार दिखाया, फिर से ~ 10-20 ms (चित्रा 2डी) । औसत पर, एक रिश्तेदार पार ०.९६ ± ०.१८ के सहसंबंध (± एसडी, n = 14 कोशिकाओं मतलब) सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 3ई) के लिए मापा गया था ।

Figure 2
चित्रा 2 . स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी नियंत्रण मापन । (क) myr-पाम-mEYFP/-mCardinal के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में व्यक्त मिश्रित HEK 293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों ट्रांस बातचीत के लिए । पीला तीर sFCCS स्कैन पथ को इंगित करता है । स्केल बार्स 5 µm हैं । (ख) myr-पाम-mCardinal-mEYFP hetero-डिमर (बाएँ: ग्रीन चैनल, दाएँ: लाल चैनल) सकारात्मक पार सहसंबंध नियंत्रण के रूप में व्यक्त HEK 293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियाँ. पीला तीर sFCCS स्कैन पथ को इंगित करता है । स्केल बार्स 5 µm हैं । (ग) प्रतिनिधि सीएफएस (हरा: ग्रीन चैनल (mEYFP) में ACF, लाल: लाल चैनल में ACF (mCardinal), नीला: CCF) नकारात्मक नियंत्रण के लिए sFCCS माप में प्राप्त. सॉलिड लाइंस शो सीएफएस के लिए एक दो आयामी प्रसार मॉडल के फिट बैठता है । (D) प्रतिनिधि सीएफएस (हरा: ACF ग्रीन चैनल (mEYFP), लाल: रेड चैनल (ACF), ब्लू: CCF) में mCardinal सकारात्मक नियंत्रण के sFCCS माप में प्राप्त की । सॉलिड लाइंस शो सीएफएस के लिए एक दो आयामी प्रसार मॉडल के फिट बैठता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

इस परख की उपयुक्तता तो एक जैविक रूप से प्रासंगिक संदर्भ में amyloid के ट्रांस बातचीत की जांच की थी प्रोटीन की तरह 1 (APLP1), एक प्रकार मैं transmembrane प्रोटीन है कि एक ंयूरॉंस आसंजन के रूप में कार्य करने का प्रस्ताव किया गया है रिसेप्टर. इस उद्देश्य के लिए, APLP1 mEYFP या mCardinal से जुड़े HEK 293T कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था । extracellular बाध्यकारी डोमेन के साथ हस्तक्षेप को बाहर करने के लिए, एफपीएस intracellular डोमेन पर सी-APLP1 के टर्मिनस से जुड़े हुए थे, यानी, ( चित्र 1एकदेखें) । फिर, sFCCS मापन सेल-सेल संपर्कों पर APLP1-mEYFP और APLP1-mCardinal एक्सप्रेस कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया (चित्रा 3ए), जिसके परिणामस्वरूप ACFs और CCFs (चित्रा 3सी) है कि APLP1 प्रसार के बारे में जानकारी प्रदान और बातचीत । एक सकारात्मक सापेक्ष पार ०.४५ ± ०.२१ के सहसंबंध (± एसडी, एन = 17 कोशिकाओं), अर्थात, एक मूल्य काफी नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 3ई) की तुलना में बड़ा मनाया गया था । दिलचस्प है, औसत सापेक्ष पार-सहसंबंध सकारात्मक नियंत्रण की तुलना में कम था (चित्रा 3ई), केवल आंशिक ट्रांस बाध्यकारी का संकेत है ।

अंत में, परख दिखाने के लिए कि जस्ता आयनों की सुविधा बढ़ाकर APLP1 ट्रांस बाध्यकारी12,31इस्तेमाल किया गया था । sFCCS सेल में APLP1 समूहों में माप से प्राप्त सीएफएस-सेल संपर्क (APLP1-mEYFP और APLP1-mCardinal के एक मजबूत सह स्थानीयकरण की विशेषता और जस्ता आयनों की उपस्थिति में तेजी से गठन, चित्रा 3ख) दृढ़ता से दिखाया कम गतिशीलता, बड़े क्षय समय और बड़े अंतराल समय पर दोलनों से स्पष्ट रूप में (चित्रा 3डी). फिर भी, छोटे अंतराल समय पर आयाम का विश्लेषण ०.८ ± ०.३ के सापेक्ष पार-सहसंबंध की एक महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला (± एसडी मतलब, एन = 17 कोशिकाओं), अर्थात्, ~ नपे अधिकतम के ८०% (चित्रा 3ई) । यह उम्मीद की जा रही है कि इस तरह के धीमी गतिशीलता सहसंबंध घटता के गंभीर विकृतियों प्रेरित ( चित्रा 3डीदेखें) सीमित माप समय के दौरान पता लगाया जा सकता है कि प्रसारात्मक घटनाओं, तथाकथित कण उत्प्रेरण के दौरान का लिमिटेड संख्या के कारण रव30. एक सटीक ठहराव के लिए, अधिकतम अंतराल के समय प्रसार समय के ऊपर परिमाण के ंयूनतम 3 आदेश होना चाहिए (अधिक जानकारी के लिए पिछले समीक्षाएं30,17 देखें) ।

sFCCS APLP1 डेटा से आणविक चमक और विश्लेषण किया गया था, प्रत्येक चैनल में एक monomeric संदर्भ के रूप में myr-पाम नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर और गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन23की राशि के लिए सही । जस्ता आयन इसके अलावा पर, आणविक चमक काफी छोटे oligomers (~ dimers) से बड़ा multimers प्रत्येक कोशिका (चित्रा 3एफ) पर ~ 10-50 मोनोमर से मिलकर वृद्धि हुई है । इस प्रकार, औसत पर, अप करने के लिए ~ १०० APLP1 मोनोमर सेल-सेल जंक्शन के पार एक पूरे प्रोटीन क्लस्टर में मौजूद हैं ।

Figure 3
चित्रा 3 . स्कैनिंग प्रतिदीप्ति पार सहसंबंध सेल-सेल संपर्कों पर APLP1 बातचीत के स्पेक्ट्रोस्कोपी माप । (A, B) HEK 293T कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियां APLP1-mEYFP (हरा)/APLP1-mCardinal (लाल) से पहले (A) और जस्ता आयन उपचार के बाद 30 मिनट (बी, विभिंन कोशिकाओं) । पीले तीर sFCCS स्कैन पथ इंगित करते हैं । स्केल बार्स 5 µm हैं । (ग, घ) प्रतिनिधि सीएफएस (हरा: ग्रीन चैनल (mEYFP) में ACFs, लाल: रेड चैनल में ACFs (mCardinal), नीला: CCFs) जस्ता आयन उपचार से पहले (ग) sFCCS के लिए APLP1 माप में प्राप्त और (घ) के बाद जिंक आयन उपचार । ठोस लाइनों शो सीएफएस के लिए एक दो आयामी प्रसार मॉडल के फिट बैठता है । (ई) रिश्तेदार पार के बॉक्स भूखंडों नकारात्मक नियंत्रण के sFCCS विश्लेषण से प्राप्त सहसंबंध ("नकारात्मक"), अनुपस्थिति और जस्ता आयनों की उपस्थिति में APLP1, और सकारात्मक क्रॉस-सहसंबंध नियंत्रण ("धनात्मक") । भूखंडों औसत मूल्यों और ंयूनतम से अधिकतम मूल्यों को लेकर मूंछ दिखाओ । (च) ग्रीन चैनल में सामान्यीकृत आणविक चमक के बॉक्स भूखंडों (mEYFP) के अभाव और जस्ता आयनों की उपस्थिति में कोशिका-सेल संपर्कों में APLP1 के sFCCS विश्लेषण से प्राप्त की. चमक मूल्यों गैर फ्लोरोसेंट mEYFP के लिए सही थे myr-पाम-mEYFP-mEYFP होमो-dimers के एसएफसी मापन के आधार पर HEK 293T कोशिकाओं में व्यक्त, एक ही शर्तों के तहत मापा23. भूखंडों औसत मूल्यों और ंयूनतम से अधिकतम मूल्यों को लेकर मूंछ दिखाओ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सभी माप अब तक दिखाया अतिरिक्त, नकली उतार चढ़ाव कोशिकाओं है कि, अगर खाते में नहीं लिया, sFCCS विश्लेषण चुनौतीपूर्ण बनाना होगा में होने वाली के लिए सही थे । नकारात्मक नियंत्रण के लिए, उदाहरण के लिए, ये एक गलत-धनात्मक परस्पर-सहसंबंध के कारण हो सकता है, यदि कोई सुधार योजनाएं लागू की गई हैं । दो प्रमुख प्रक्रियाओं है कि गंभीर रूप से विकृत कर सकते हैं सीएफएस हैं: 1) दर्जी प्रतिदीप्ति संकेत में instabilities कि क्षणिक फोकल मात्रा या धीमी गति से झिल्ली गतिशीलता दर्ज करें, जैसे, जेड दिशा में बहाव, और 2) photobleaching । क्षणिक instabilities की पहचान करने के लिए, यह 10-20 समान आकार के क्षेत्रों में पूर्ण माप विभाजित करने के लिए और नेत्रहीन प्रत्येक खंड में तीव्रता समय श्रृंखला और सीएफएस का निरीक्षण करने के लिए सिफारिश की है. यह कार्यविधि चित्र 4में सचित्र है, जो एक नकारात्मक नियंत्रण माप के विश्लेषण में प्राप्त स्पष्ट रूप से विकृत खंडों का एक उदाहरण देता है । क्षणिक instabilities (चित्रा 4ए, खंड 1 और 2 की तीव्रता निशान) एक CCF नकारात्मक मूल्यों (चित्रा 4बी, खंड 1) या एक उच्च झूठी सकारात्मक पार सहसंबंध (4 आंकड़ाबीमें परिणाम हो सकता है, सेगमेंट 2). सामांयतया, ऐसे instabilities धीमे संकेत रूपांतरों (चित्रा 4A) के रूप में तीव्रता श्रृंखला में दृश्यमान होते हैं । इसी सीएफएस आम तौर पर क्षेत्रों के बहुमत के सीएफएस से दृढ़ता से विचलित, प्रदर्शित, उदाहरण के लिए, उच्च आयाम और अधिक धीमी ~ द्वितीय स्केल पर क्षय समय ( चित्रा 4B-4dदेखें) । यह विश्लेषण से ऐसे क्षेत्रों को दूर करने के लिए और सभी गैर विकृत क्षेत्रों, यानी, सीएफएस के बहुमत से deviating नहीं सीएफएस द्वारा विशेषता क्षेत्रों औसत द्वारा अंतिम सीएफएस की गणना करने के लिए सिफारिश की है. सामान्यतया, यह एक ग्राफिकल में किया जाता है द्वारा इंटरफेस 1) iteratively खंड की जांच, 2) औसत से स्पष्ट रूप से विकृत क्षेत्रों को हटाने और 3) खंडों के अद्यतन औसत सीएफएस के संबंध में शेष खंडों के सीएफएस का निरीक्षण किया है कि नहीं हटा दिया गया । इस प्रक्रिया को लागू करने से, आंशिक रूप से विकृत लंबी माप (चित्रा 5ए), धीरे (भ्रष्ट) सीएफएस (चित्रा 5बी) को सफलतापूर्वक सही और सार्थक सहसंबंध घटता गया दिखा रहे थे बरामद (चित्रा 5सी) । आम तौर पर, इस सुधार प्रक्रिया को स्वचालित किया जा सकता है29, उपयोगकर्ता द्वारा एक दृश्य निरीक्षण से बचने, जो व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह से ग्रस्त हो सकता है । तीव्रता आधारित फ़िल्टरिंग पद्धतियों की तुलना में३६, जिसमें माप के छोटे डिब्बे को पूर्ण माप की औसत तीव्रता की तुलना में उनकी तीव्रता के आधार पर मूल्यांकित किया जाता है और थ्रेशोल्ड पैरामीटर से अधिक होने पर निकाल दिया जाता है, वर्णित प्रक्रिया बाहरी मापदंडों पर निर्भर नहीं है और संवेदनशील भी नाबालिग instabilities के लिए है ।

आदेश में photobleaching के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, वर्णित गणितीय सुधार, समीकरण 1, लागू किया गया था. आमतौर पर, photobleaching प्रतिदीप्ति संकेतों की एक घातीय क्षय द्वारा पहचाना जा सकता है (चित्रा 5डी), सीएफएस, जो तो एक झूठी सकारात्मक पार सहसंबंध और ~ ंयूनतम पैमाने पर क्षय बार दिखाने पर हावी (ठेठ वक्र आकार देखें चित्रा 5ईमें) । सुधार प्रक्रिया गैर विकृत सीएफएस (चित्रा 5एफ) बरामद किया । के रूप में पहले से ही उल्लेख किया, एकल माप के भीतर इसी तरह की तीव्रता भिन्नता भी पीएम आंदोलन, जैसे, z-बहाव, या बड़े धीरे चलती संरचनाओं के कारण हो सकता है. हालांकि, अगर इसी तरह घातीय क्षय सभी माप में दिखाई देते हैं, photobleaching सबसे अधिक संभावना स्रोत हो जाएगा । आम तौर पर, सुधार योजनाओं संयुक्त किया जा सकता है, जैसे, तीव्रता फ़िल्टरिंग, CF आधारित फ़िल्टरिंग और आगे की विधियों जैसे रूपान्तर आवृत्ति अंतरिक्ष में धीमी गति से संकेत रूपांतरों के आधार फ़िल्टरिंग बदलना27.

Figure 4
चित्र 4 . नकारात्मक क्रॉस-सहसंबंध नियंत्रण के स्पेक्ट्रोस्कोपी मापन प्रतिदीप्ति स्कैनिंग का सेगमेंट-वार विश्लेषण । (A) प्रतिदीप्ति तीव्रता हरे (f1) और लाल चैनल (f2) में दो अलग समय क्षेत्रों (प्रत्येक माप के 20 खंडों में विश्लेषण किया गया था ~ 20 s प्रत्येक), sFCCS माप से प्राप्त नकारात्मक नियंत्रण. (ख) प्रत्येक २० प्रखंडों का CCFs. सेगमेंट 1 और 2 के लिए CCFs क्रमशः लाल और नारंगी रंग में हाइलाइट किए गए हैं. (सी, डी) ग्रीन (C) और लाल (D) चैनल में प्रत्येक खंड के ACFs । सेगमेंट 1 और 2 के लिए ACFs क्रमशः लाल और नारंगी रंग में हाइलाइट किए गए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . सेल-सेल संपर्कों में प्रतिदीप्ति क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी मापन स्कैनिंग में Perturbations, नकारात्मक क्रॉस-सहसंबंध नियंत्रण के लिए उदाहरण । (A) हरे (f1) और लाल चैनल (f2) में एक अनुकरणीय मापन के लिए पूर्ण प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला. ठोस लाल रेखाएं प्रत्येक चैनल में समय श्रृंखला के दोहरे-घातांकीय फ़िट का प्रतिनिधित्व करती हैं । (ख, ग) सीएफएस (ग्रीन: ग्रीन चैनल में ACFs, रेड: रेड चैनल में ACFs, ब्लू: CCFs) में दिखाया गया प्रतिदीप्ति टाइम सीरीज का, (B) correlating की गणना पूरी माप या (ग) correlating 20 खंडों को अलग से और औसत से कम विकृत सीएफएस की ~ ८०% (ग्रीन चैनल) और ~ ५०% (लाल चैनल) के खंडों । सॉलिड रेखाएं डेटा में दो-आयामी प्रसार मॉडल के फ़िट का प्रतिनिधित्व करती हैं । (घ) पूर्ण प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला और डबल-घातांक फ़िट (माप की ठोस लाल रेखाएँ) हरे (f1) और लाल चैनल (f2) में पर्याप्त ब्लीचिंग द्वारा विशेषता । (ङ, च) सीएफएस (हरा: ग्रीन चैनल में ACFs, लाल: रेड चैनल में ACFs, नीला: CCFs) में दिखाया गया है प्रतिदीप्ति समय श्रृंखला के डी, द्वारा परिकलित (E) correlating पूरे माप या (च) ब्लीचिंग सुधार लागू करने, समीकरण 1, correlating 20 सेगमेंट अलग से और सेगमेंट के ~ ९०% (दोनों चैनल) के कम विकृत सीएफएस का औसत । सॉलिड रेखाएं डेटा में दो-आयामी प्रसार मॉडल के फ़िट का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

sFCCS, ccN और बी (चित्रा 1सी) के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में सेल मिश्रण के बाद प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । sFCCS के विपरीत, ccN और बी प्रोटीन गतिशीलता पर कोई जानकारी प्रदान करता है, लेकिन पूरे सेल एक फोकल विमान में सेल संपर्क के साथ ट्रांस बातचीत को मापने की अनुमति देता है । APLP1 नमूनों पर माप से पहले और ५० µ एम ZnCl2के साथ उपचार के बाद प्रदर्शन किया, साथ ही साथ नकारात्मक myr-पाम नियंत्रण पर थे । इन माप सेल आंदोलनों के प्रति संवेदनशील हैं, विशेष रूप से जस्ता आयन के लिए नमूनों का इलाज, लंबे समय तक अधिग्रहण समय की आवश्यकता के लिए APLP1 क्लस्टर की धीमी गतिशीलता के लिए खाते. इसलिए, एक छवि संरेखण एल्गोरिथ्म कक्ष३३के पार्श्व आंदोलन के लिए सही करने के लिए लागू किया गया था । इसके अलावा, एक मालगाड़ी फ़िल्टर22 (8 फ्रेम बॉक्स का आकार, ~ 5 एस) मापा संकेतों के कम आवृत्ति उतार चढ़ाव को दूर करने के लिए लागू किया गया था । यह प्रक्रिया बहुत अंय N और ख में इस्तेमाल किया फिल्टर के समान है३७ औसत से जुड़े विश्लेषण या18,३४प्रवृत्ति, लेकिन मूल डेटा, यानी अनछुए रहता है, पिक्सल स्वतंत्र रूप से व्यवहार कर रहे है और कोई औसत या संकेतों के घटाव किया जाता है । इस कार्यविधि को प्रभावी रूप से समय स्केल्स पर लंबा-रहता उतार चढ़ाव बॉक्स का आकार22से अधिक दबा देता है । इस तरह के डेटा विश्लेषण के बाद, क्रॉस-सहसंबंध चमक मान सभी नमूनों के लिए क्रॉस-सहसंबंध चमक हिस्टोग्राम में सभी कक्ष-कक्ष संपर्क पिक्सेल्स पूलिंग द्वारा तुलना किए गए थे । जिंक आयनों के अभाव में APLP1 के लिए (चित्रा 6A और 6D), ०.०६८ ± ०.००४ की एक सकारात्मक औसत बीसीसी (± SEM मतलब, n = 18 कोशिकाओं) मनाया गया था । जिंक आयन इसके अलावा (चित्रा 6बी और 6E), बीप्रतिलिपि मूल्य ०.२६६ ± ०.००६ (± SEM, n = 19 कोशिकाओं) के लिए वृद्धि हुई है । नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 6सी और 6F) के लिए, एक कम औसत पार सहसंबंध चमक का पता लगाया गया था (Bcc = ०.०२२ ± ०.००२, मतलब ± SEM, n = 26 कोशिकाओं) । सेल-सेल संपर्कों में APLP1 परिसरों के stoichiometry का अनुमान लगाने के लिए, APLP1-mEYFP की चमक myr-पाम-mEYFP (यानी, नकारात्मक नियंत्रण) के लिए प्राप्त औसत मूल्य का उपयोग कर सामान्यीकृत किया गया था और गैर-फ्लोरोसेंट की मात्रा के लिए सही प्रोटीन्स23. sFCCS डेटा के साथ समझौते में, चमक वितरण dimers (चित्रा 6जी) के लिए इसी मूल्य के आसपास केंद्रित था, जस्ता आयनों के अभाव में, एक औसत 2:2 stoichiometry का सुझाव । जिंक आयन उपचार के बाद, सामान्यीकृत चमक दृढ़ता से बड़े मूल्यों के लिए स्थानांतरित कर दिया, से लेकर ~ 10 ~ ६० (चित्रा 6एच), यानी, stoichiometries कम से 10:10 या बड़ा, फिर sFCCS डेटा के साथ अच्छे समझौते में.

Figure 6
चित्रा 6 . सेल-सेल संपर्कों में APLP1 इंटरैक्शन की क्रॉस-सहसंबंध संख्या और चमक माप. (A-C) प्रतिनिधि ccN और बी छवि APLP1-mEYFP और APLP1-mCardinal के बीच सेल संपर्क का फ्रेम (ए) और जस्ता आयनों के साथ (ख) या HEK-पाम-293T और myr-पाम-mEYFP व्यक्त कोशिकाओं के रूप में नकारात्मक के रूप में एक्सप्रेस myr कोशिकाओं क्रॉस-सहसंबंध नियंत्रण (C) । स्केल पट्टियां 5 µm होती हैं । (d-F) क्रॉस-सहसंबंध चमक (Bcc) सभी जांचे गए पिक्सेल्स और कक्ष-कक्ष संपर्कों के APLP1 नमूनों में ccN & B विश्लेषण से प्राप्त कोशिकाओं के हिस्टोग्राम (d), जस्ता-इलाज APLP1 नमूने ( ङ) और नमूने युक्त myr-खजूर-mEYFP और myr-खजूर-mCardinal (च). (छ, ज) APLP1 नमूनों की सामान्यीकृत चमक हिस्टोग्राम (G: जस्ता आयनों के बिना, एच: जस्ता आयनों के साथ) के लिए हरी चैनल (mEYFP) समान कोशिकाओं और ROIs की गणना के लिए इस्तेमाल किया की चमक विश्लेषण से प्राप्त बीसीसी. जी में इनसेट-2 से 10 की सामान्यीकृत चमक रेंज में एक आवर्धन दिखाता है । चमक मूल्यों गैर फ्लोरोसेंट mEYFP के लिए सही थे एन एंड बी माप के आधार पर myr-पाम-mEYFP-mEYFP होमो-dimers HEK 293T कोशिकाओं में व्यक्त, एक ही शर्तों के तहत मापा23. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

आदेश में ccN और बी विश्लेषण, डिटेक्टरों की एक सावधान अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए किया जाना चाहिए । इस अध्ययन में प्रयुक्त प्रयोगात्मक सेटअप के लिए, ऐसे अंशांकन की आवश्यकता तब स्पष्ट हो गई जब आणविक चमक को निश्चित नमूनों में विश्लेषण किया गया (यानी, संख्या के उतार-चढ़ाव के अभाव में) । इस मामले में, आणविक चमक समीकरण 10 के अनुसार शून्य होने की उम्मीद है, के बाद से विचरण केवल डिटेक्टर शोर से शुरू करना चाहिए. हालांकि, जब एक रॉय है कि केवल (मोबाइल) पृष्ठभूमि पिक्सल का विश्लेषण किया गया था (चित्रा 7ए और 7B), की एक सकारात्मक चमक ~ ०.१ सीटीएस./(मॉल एक्स आवास समय) निर्धारित किया गया था । एक समान मूल्य प्रदर्शन एन और बी HEK 293T कोशिकाओं के मापन glycosylphosphatidylinositol-mCherry (जीपीआई-mCherry, चित्रा 7सी) अलग लेजर शक्तियों और extrapolating के साथ मापा आणविक चमक को व्यक्त प्राप्त किया गया शूंय लेजर शक्ति । इस आशय के लिए सही करने के लिए, हम डिटेक्टर के एक व्यवस्थित अंशांकन प्रदर्शन किया, के रूप में पहले की रिपोर्ट (12 समीकरण देखें)19,20. इसलिए हम एक एक सूखे फ्लोरोसेंट डाई समाधान से मिलकर नमूना पर डिटेक्टर काउंट दर के एक समारोह के रूप में विचरण मापा और मापदंडों निर्धारित किया है Equation 24 , और अंधेरे गिनती दर ऑफसेट । उत्तरार्द्ध शूंय लेजर शक्ति पर तीव्रता को मापने से प्राप्त किया गया था और था, हमारे मामले में, नगण्य । की एक रैखिक फिट से प्रसरण बनाम तीव्रता भूखंड, हम निर्धारित, समीकरण के अनुसार 14, S की एक ढलान = १.१, और एक नगण्य readout शोर. निर्धारित मान (S = १.१, Equation 24 = 0, ऑफ़सेट = 0) तब सही रूप से आणविक चमक और संख्या के अनुसार समीकरण 12 और 1319की गणना करने के लिए उपयोग किए गए थे । वैकल्पिक रूप से, एक अधिक अनुभवजंय सुधार योजना इस तथ्य के आधार पर लागू किया जा सकता है कि एक superpoissonian डिटेक्टर शोर, यानी, ~ 10% Poissonian शॉट शोर से बड़ा शोर, भी में एक सकारात्मक आणविक चमक के अवलोकन की व्याख्या करेगा संख्या में उतार चढ़ाव के बिना पिक्सल । इस धारणा का उपयोग करना, की निर्धारित चमक ~ ०.१ सीटीएस./(मॉल एक्स आवास समय) ऐसे पिक्सल में एक निरंतर चमक ऑफसेट के रूप में माना जा सकता है और इस प्रकार सभी चमक समीकरण 10 के साथ गणना मूल्यों से घटाया जाना चाहिए । सबसे महत्वपूर्ण बात, दोनों वर्णित दृष्टिकोण एक ही परिणाम के लिए नेतृत्व जब चमक अनुपात की गणना, के रूप Equation 24 में लंबे समय के रूप में और ऑफसेट नगण्य हैं । यह उल्लेख के लायक है कि एक ही प्रकार के विभिंन सूक्ष्मदर्शी (एक ही विक्रेता, एक ही मॉडल, फोटॉन गिनती मोड में GaAsP डिटेक्टरों) विभिंन एस मूल्यों के बीच मनाया गया, प्रत्येक व्यक्ति के सेटअप पर एक सावधान डिटेक्टर अंशांकन के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला ।

चमक माप में डिटेक्टर प्रदर्शन को प्रभावित करने के लिए एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर डिटेक्टर मृत समय है । के रूप में यह पहले दिखाया गया है, डिटेक्टर मृत समय काफी पता चला आणविक चमक को कम कर सकते हैं, यहां तक कि मध्यम गिनती दरों पर (102से ऊपर-103 kHz)३८. इस मूर्ति से बचने के लिए, माप या तो कम गिनती दर पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए, या मृत समय की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला में N & B या FCS प्रदर्शन के आधार पर तुले होना चाहिए, जैसे, बफर समाधान में EGFP. फिर, मापा गिनती दर एक नपे मृत समय३८का उपयोग कर सही किया जा सकता है । इस अध्ययन में प्रयुक्त सेटअप के लिए, इस तरह के एक अंशांकन N और B का उपयोग कर पतला डाई समाधान पर पता चला स्थिर आणविक चमक मूल्यों के लिए की दर की गणना करने के लिए ~ ०.५ मेगाहर्ट्ज और एक इसी मृत समय के ~ 6 एनएस (चित्रा 7ई). उच्च गिनती दर में कमी इस प्रकार एक पहले से प्रकाशित सुधार फार्मूला३८का उपयोग करके सही हो सकता है, के एक निरंतर चमक मूल्य में जिसके परिणामस्वरूप ~ 8 kHz/

Figure 7
चित्र 7 . संख्या और चमक विश्लेषण के लिए डिटेक्टर अंशांकन । (क) जीपीआई-mCherry व्यक्त HEK 293T कोशिकाओं के एन एवं बी माप से प्रतिनिधि छवि. एक रॉय (नीले डैश्ड आयत) पृष्ठभूमि में चुना गया था । (ख) सभी पिक्सेल के पिक्सेल चमक हिस्टोग्राम एकमें दिखाया रॉय के अनुरूप । औसत पिक्सेल चमक, एक गाऊसी समारोह के साथ पिक्सेल चमक हिस्टोग्राम फिटिंग से प्राप्त की है, ~ ०.१ सीटीएस./(मॉल एक्स आवास समय) । डेटा 25 µs पिक्सेल निवास समय पर अधिग्रहीत किए गए थे । (ग) जीपीआई के एन और बी विश्लेषण से प्राप्त आणविक चमक-mCherry HEK 293T कोशिकाओं में व्यक्त, तीन अलग लेजर शक्तियों में मापा (6 कोशिकाओं प्रत्येक, ५६१ एनएम उत्तेजना, 25 µs पिक्सेल समय रहते) । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं । एक रेखीय प्रतीपगमन (लाल रेखा) ०.११ ± ०.०२ सीटीएस./(मॉल एक्स आवास समय) की एक ऑफसेट मूल्य प्रदान करता है । (घ) एक फ्लोरोसेंट डाई की एक सूखे समाधान के एन और बी माप से पिक्सेल तीव्रता के एक समारोह के रूप में पिक्सेल विचरण की साजिश (५६१ एनएम पर उत्तेजित), नमूना के विभिन्न क्षेत्रों में कई माप के सभी पिक्सल से परित. ठोस लाल रेखा डेटा के एक रैखिक फिट दिखाता है, १.१ के एक ढलान में जिसके परिणामस्वरूप, डिटेक्टर अंशांकन के एस कारक प्रदान करते हैं । (ई) डिटेक्टर गणना दर के एक समारोह के रूप में आणविक चमक, पतला fluorophore समाधान के एन और बी माप से प्राप्त (४८८ एनएम पर उत्तेजित) । एक पहले प्रकाशित सुधार योजना३८ डिटेक्टर मृत समय के लिए विभिन्न संभव मूल्यों का उपयोग कर लागू किया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रायोगिक प्रक्रिया यहां वर्णित सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन ट्रांस बातचीत की जांच की अनुमति देता है, प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक, अर्थात् sFCCS और ccN और बी रोजगार । इन तरीकों दो पड़ोसी कोशिकाओं के एक संपर्क में ब्याज की प्रोटीन (ओं) से जुड़े एक प्रतिदीप्ति द्वारा उत्सर्जित दोनों वर्णक्रम से अलग एफपीएस के एक सांख्यिकीय विश्लेषण शामिल, प्रत्येक व्यक्त एक या अंय फ्यूजन प्रोटीन । ट्रांस परिसरों की उपस्थिति सह की डिग्री की जांच-पड़ोसी पीएमएस में प्रोटीन के प्रसार द्वारा quantified है । नमूना तैयार करने पर विस्तृत प्रोटोकॉल के अलावा, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण, इस लेख में न्यूरॉन आसंजन प्रोटीन APLP1 पर परख के सफल आवेदन के प्रायोगिक सबूत प्रदान करता है । हम बताते है कि APLP1, सेल-सेल संपर्कों पर homotypic ट्रांस बातचीत विशिष्ट । इसके अलावा, जस्ता आयनों सेल सेल संपर्कों कि ट्रांस बातचीत के लिए एक multivalent मंच प्रदान करते हैं और, इस प्रकार, बढ़ाया ट्रांस बाध्यकारी प्रेरित में APLP1 समूहों के गठन को बढ़ावा देने के ।

पिछले परख के लिए इसके विपरीत में विघटनकारी जैव रासायनिक तरीकों6पर आधारित बातचीत का पता लगाने के लिए, प्रस्तुत दृष्टिकोण सीधे जीवित कोशिकाओं पर किया जा सकता है, निर्धारण या प्रोटीन परिसरों के अलगाव के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । इसके अलावा, यह आनुवंशिक रूप से ब्याज की प्रोटीन से जुड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा आणविक विशिष्टता और जानकारी प्रदान करता है, इसके विपरीत में पिछले गुणात्मक परख8,9। इस तरह के10 और प्रतिदीप्ति पूरक11झल्लाहट के रूप में अंय प्रतिदीप्ति आधारित दृष्टिकोण से अलग, वहां फ्लोरोसेंट लेबल के लिए कोई आवश्यकता नहीं है extracellular पक्ष पर स्थानीयकृत (संभवतः के साथ हस्तक्षेप प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन). फिर भी, यह है कि सी-टर्मिनल एफपीएस अभी भी intracellular घटकों के लिए बाध्यकारी बदल सकता है ध्यान दिया जाना है, जैसे, अनुकूलक प्रोटीन कि cytoskeleton के साथ बातचीत मध्यस्थता । विशेष रूप से, परख दोनों होमो-और heterotypic बातचीत के लिए लागू है ।

प्रस्तुत परख के एक सफल आवेदन के लिए कुछ आवश्यकताओं का उल्लेख लायक हैं । प्रदर्शन प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव तरीकों लौकिक माप है कि उज्ज्वल और photostable monomeric एफपीएस, जो कई लाल एफपीएस23के लिए एक प्रमुख बाधा है की आवश्यकता पर आधारित हैं । हालांकि प्रस्तुत स्कैनिंग योजना विशेष रूप से अच्छी तरह से transmembrane प्रोटीन की धीमी गतिशीलता है, जो आम तौर पर सेल सेल बातचीत में शामिल है की जांच के लिए अनुकूल है, अवशिष्ट photobleaching अभी भी हो सकता है । इसलिए, हम सुधार योजनाओं का एक विस्तृत विवरण, यानी, ccN और बी के लिए sFCCS और मालगाड़ी फिल्टर के लिए एक ब्लीचिंग सुधार प्रस्तुत करते हैं, जो इस तरह के perturbations को कम करता है । इसके अलावा, हम संख्यात्मक संरेखण एल्गोरिदम पर चर्चा करते हैं जो अन्य व्यवस्थित perturbations के लिए प्रभावी रूप से सही होते हैं, जैसे कक्षों की पार्श्व आंदोलन, और क्षणिक instabilities को निकालने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं. इस तरह के instabilities का एक प्रमुख स्रोत vesicular परिवहन, यानी, intracellular ब्याज कि क्षणिक फोकल मात्रा में प्रवेश के प्रोटीन ले जाने के बुलबुले है । हालांकि मामले से मामले में बदलती है, इस घटना को सामांय रूप से डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण परेशान कर सकते हैं । हालांकि, सुधार एल्गोरिदम के आवेदन अधिग्रहण की स्थिरता में सुधार, विस्तारित माप समय है कि विशेष रूप से धीमी प्रसार गतिशीलता जांच की जरूरत है की अनुमति । इस संबंध में, यह रेखांकित किया है कि प्रसार गतिशीलता की उपस्थिति विधि काम करने के लिए एक अनिवार्य शर्त है । जिंक आयन की मध्यस्थता APLP1 clustering का उदाहरण बड़े, बहुत धीमी प्रोटीन परिसरों (D ≈ ०.००१ µm2/) है कि अपनी सीमा के लिए तकनीक धक्का और अंतर्निहित गतिशीलता का एक सटीक ठहराव को रोकने के एक कठोर उदाहरण से पता चलता है, बड़े शोर के कारण सीमित अधिग्रहण समय30,17द्वारा प्रेरित ।

इस संदर्भ में, मुसलिम एसएफसी और सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोणों पर हाल ही में अग्रिमों, जैसे, स्कैनिंग प्रेरित उत्सर्जन घट FCS (STED-FCS), एक छोटे फोकल मात्रा प्रदान करके लाभप्रद हो सकता है और इस प्रकार छोटे प्रभावी प्रसार बार३९ ,४०. यह भी सेल-सेल संपर्कों में ब्याज की प्रोटीन की एक सजातीय स्थानीयकरण के मामले में प्रोटीन समूहों को हल करने में मदद कर सकता है, के रूप में जस्ता की उपस्थिति में APLP1 के लिए मनाया । दुर्भाग्य से, STED स्कैनिंग के एक पार सहसंबंध कार्यांवयन-FCS, अर्थात्, STED-FCCS, कि सीधे यहां लागू किया जा सकता है, नहीं सफलतापूर्वक दो रंग STED-FCS के लिए संगत रंगों को खोजने की कठिनाई के कारण अभी तक प्रदर्शन किया गया है । पर्याप्त तेजी से गतिशीलता के मामले में (D ≥ ~ ०.०५ µm2/), sFCCS विश्लेषण सेल सेल संपर्कों में या प्रधानमंत्री12के अंय क्षेत्रों में प्रोटीन के प्रसार को यों तो अनुमति देता है ।

इसके अलावा, एक चमक विश्लेषण सभी डेटा (sFCCS और ccN और बी), ट्रांस प्रोटीन परिसरों के stoichiometry का एक अनुमान प्रदान करने के लिए किया जा सकता है । यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि stoichiometry ठहराव की सटीकता को पार में बांध कि प्रोटीन की मात्रा के साथ बढ़ जाती है (यानी, अगर वहाँ केवल कुछ सीआईएस कॉम्प्लेक्स जो भी चमक निर्धारण को प्रभावित कर सकता है). चमक विश्लेषण अलग oligomeric राज्यों, जैसे, सीआईएस मोनोमर और ट्रांस tetramers के मिश्रण को हल करने की अनुमति नहीं है । अधिक सामांय में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि N & B विभिंन oligomeric प्रजातियों में से एक नमूना में वितरित homogeneously के मिश्रण का समाधान नहीं कर सकता । एक पिक्सेल के भीतर कई प्रजातियों मौजूद हैं, तो चमक के एक एकल मूल्य मापा जाएगा (यानी, प्रत्येक oligomeric प्रजातियों की चमक का भारित औसत). मनाया चमक मूल्यों के सांख्यिकीय वितरण (उदाहरण के लिए, अलग पिक्सल में) oligomeric प्रजातियों के सापेक्ष मात्रा से सीधे जुड़ा हुआ नहीं है । इस तरह के मिश्रण को हल करने के लिए, अन्य विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए (जैसे, स्थानिक तीव्रता वितरण विश्लेषण (SpIDA)४१, फोटॉन गिनती हिस्टोग्राम (PCH)४२). इसी तरह, sFCCS में वर्णक्रमीय पार सहसंबंध के ठहराव केवल सरल, ज्ञात stoichiometries, जैसे, 1:1 के लिए बाध्य और असीम प्रोटीन के अंश का एक सटीक ठहराव प्रदान करता है । एक और अधिक जटिल stoichiometry के लिए, आगे मांयताओं के लिए किया जाना है४३। कुल मिलाकर, चमक विश्लेषण एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक उपकरण रहता है, अगर डिटेक्टर प्रणाली और गैर फ्लोरोसेंट एफपीएस के अंश के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित23 पर तुले हुए हैं ।

हालांकि आवेदन यहां प्रस्तुत अनुयाई कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत पर ध्यान केंद्रित है, परख नमूनों की एक व्यापक श्रेणी के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे, निलंबन कोशिकाओं । ऐसी प्रणालियों के लिए, पार्श्व कोशिका आंदोलन के लिए सुधार विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है । इसके अलावा, यह आसानी से ऐसे GUVs या GPMVs के रूप में मॉडल झिल्ली प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है, अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों के तहत आणविक बातचीत के ठहराव की अनुमति, जैसे, अलग लिपिड रचनाओं या एक संगठित कमी झिल्ली cytoskeleton । जब इस तरह के बुलबुले पर sFCCS प्रदर्शन, ऊर्ध्वाधर गति अतिरिक्त संकेत उतार चढ़ाव का कारण हो सकता है, लेकिन जब बड़े बुलबुले पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है छोटा । इस संदर्भ में, कई संयोजन का वादा कर रहे हैं, जैसे, गुव-/GPMV-सेल12मिश्रण । के रूप में हाल ही में एक प्रकाशन में दिखाया गया है, प्रतिरक्षा synapses के गठन को सफलतापूर्वक ऐसी प्रणालियों४४द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है । इस प्रकार, प्रस्तुत परख निश्चित रूप से सेल सेल बातचीत की एक बड़ी विविधता की जांच के लिए उपयोगी होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम आंशिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) अनुदान २५४८५०३०९ द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Madlen Luckner धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Tags

जैव रसायन अंक १४२ प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन सेल-सेल इंटरैक्शन सेल-सेल आसंजन प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी संख्या और चमक N & B
सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunsing, V., Chiantia, S. A… More

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter