Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

Denne protokol beskriver et fluorescens udsving spektroskopi-baseret tilgang til at undersøge interaktioner mellem protein mægle celle-celle interaktioner, dvs protein lokaliseret i celle vejkryds, direkte i levende celler. Vi leverer detaljerede retningslinjer på instrument kalibrering, dataopsamling og analyse, herunder rettelser til mulige artefakt kilder.

Abstract

En bred vifte af biologiske processer indebærer celle-celle interaktioner, typisk medieret af proteiner, der interagerer på grænsefladen mellem naboceller. Af interesse kan kun få assays specifikt sondering sådanne interaktioner direkte i levende celler. Her præsenterer vi en analyse for at måle bindingen af proteiner udtrykt på overflader af tilstødende celler på celle-celle kontakter. Denne analyse består af to trin: blanding af celler, der udtrykker interesse smeltet til forskellige fluorescerende proteiner proteiner, efterfulgt af fluorescens udsving spektroskopi målinger på celle-celle kontakter ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop. Vi bevise gennemførligheden af denne analyse i forbindelse med biologisk relevante ved at måle interaktioner af amyloid forløber-lignende protein 1 (APLP1) på tværs af celle-celle vejkryds. Vi leverer detaljerede protokoller på dataopsamling ved hjælp af fluorescens-baserede teknikker (scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi, kors-sammenhæng antallet og lysstyrke analyse) og nødvendigt instrument kalibreringer. Vi drøfte kritiske trin i dataanalyse, og hvordan at identificere og rette eksterne, falske signal variationer, som dem på grund af photobleaching eller celle bevægelse.

I almindelighed, præsenteres analysen er gældende til homo- eller Heterotypiske protein-protein interaktion på celle-celle kontakter, mellem celler i de samme eller forskellige typer og kan gennemføres på en kommerciel Konfokal laser scanning mikroskop. Et vigtigt krav er stabiliteten i systemet, som skal være tilstrækkelig til at probe diffuserende dynamics af proteiner af interesse over flere minutter.

Introduction

Mange biologiske processer forekommer ved lokaliteter af celle-celle interaktioner, f.eks. celle-celle vedhæftning1,2,3, celle-celle fusion4 og cellular anerkendelse5. Sådanne begivenheder er særlig vigtigt i forbindelse med udviklingen af flercellede organismer og cell-celle kommunikation, fx under immunrespons. Disse processer er typisk formidlet af proteiner, der er lokaliseret på overfladen, dvs, på plasma membran (PM) af tilstødende celler og underkastes specifikke interaktioner på celle-celle-kontakt, der er præcist reguleret i tid og rum. I mange tilfælde disse interaktioner er direkte homo- eller Heterotypiske protein-protein trans interaktioner, men kan også involvere ioner eller ligander som ekstracellulære linkers1. Selv om af grundlæggende betydning, er der en mangel på assays sondering disse specifikke protein-protein interaktioner direkte i native miljøet af levende celler. Mange metoder enten kræve celle forstyrrelser (fx, biokemiske analyser som co-immunoprecipitation6), fiksering (f.eks. nogle af super-resolution Optisk mikroskopi-teknikker og elektronmikroskopi af celle-celle kontakter7), eller er ikke-specifikke, fx sammenlægning / vedhæftning-undersøgelser,8,9. For at afhjælpe dette problem, er blevet gennemført fluorescens teknikker, baseret på fluorescens resonans energi overførsel (FRET)10 eller fluorescens komplementering11. Disse metoder kræver dog, for at opnå tilstrækkelig små afstande mellem fluorophores, fluorescerende etiketter på den ekstracellulære side af proteiner10, potentielt forstyrre trans interaktioner.

Her præsenterer vi en alternativ fluorescens-baseret analyse for protein-protein interaktioner på celle-celle kontakter. Denne metode kombinerer fluorescens cross-korrelation tilgange (scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi (sFCCS), kors-sammenhæng antallet og lysstyrke (ccN & B)) og blanding af celler, der udtrykker en fusion konstruktion af protein af interesse, fx en vedhæftning receptor. De undersøgte receptorer i de to interagerende celler er mærket med to spektralt adskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulære side (Se figur 1A).

De erhvervsdrivende metoder er baseret på den statistiske analyse af fluorescens udsving induceret af diffuserende bevægelse af fluorescerende fusion proteiner gennem den fokale volumen af en Konfokal laser scanning mikroskop. Mere detaljeret sonder analysen Co udbredelsen af proteiner af interesse i både nærliggende PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteinerne undergår trans interaktioner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner udsender i begge spektrale kanaler, forårsager korreleret fluorescens udsving af begge udledere. På den anden side, hvis ingen bindende opstår, vil de nummer udsving af proteiner i forbindelse med PMs være uafhængige, forårsager ingen korreleret udsving. Erhvervelsen kan udføres på to måder: 1) sFCCS er baseret på en linie-formede scanning på tværs af celle-celle-kontakt og effektivt sonder interaktioner i et spot, beliggende i regionen kontakt. Gennem en tidsmæssig analyse af fluorescens udsving giver sFCCS også dynamics oplysninger, dvs., diffusion koefficienterne af proteinkomplekser; 2) ccN & B er baseret på en pixel-wise analyse af en sekvens af billeder erhvervet på celle-celle kontakt regioner. Det har evnen til at probe og kort interaktioner langs hele kontakte region (i en fokalplan), men indeholder ikke oplysninger om dynamik. Begge metoder kan kombineres med en analyse af den molekylære lysstyrke, dvs, gennemsnitlige fluorescens signalet udsendes i enheden af enkelt spreder proteinkomplekser og således give et skøn over støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter.

I denne artikel leverer vi detaljerede protokoller for prøveforberedelse, instrument kalibrering, dataopsamling og analyse til at udføre præsenteres analysen på en kommerciel Konfokal laser scanning mikroskop. Forsøgene kan udføres på ethvert instrument udstyret med photon optælling eller analog detektorer og et mål med høj numerisk blænde. Vi videre diskutere kritisk trin i protokollen og give korrektion ordninger for flere processer, der forårsager artefactual signal udsving, fx detektor støj, photobleaching eller celle bevægelse. Oprindeligt udviklet til at probe interaktioner mellem vedhængende celler, analysen kan ændres for affjedring dataceller eller tilpasset model membran systemer, fx giant unilamellar vesikler (GUVs) eller kæmpe plasma membran vesikler (GPMVs), så den kvantificering af interaktioner i forskellige lipid miljøer eller i mangel af en organiseret cytoskeleton12,13.

Scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi er en modificeret version af fluorescens cross-korrelations-spektroskopi14 og var specielt designet til at probe langsom diffuserende dynamics i lipid membraner15. Det er baseret på en line scan erhvervelse vinkelret på PM indeholdende de fluorescerende proteiner af interesse. For at sonde vekselvirkninger mellem to anderledes mærket protein arter, udføres erhvervelse i to spektrale kanaler ved hjælp af to laser linjer og to påvisning windows for spektralt adskilte fluorophores. På grund af den langsomme diffusion dynamics af proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan udføres ved vekslende excitation ordningen fra linje til linje15. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for laterale celle bevægelse baseret på block-wise gennemsnit af ~ 1000 linjer, 2) bestemmelse af position med maksimal fluorescens signaldet vil sige, PM position, i hver blok og 3) skiftende af alle blokke til en fælles oprindelse12,15, separat i hver kanal. Derefter udføres en automatisk valg af pixels svarende til PM ved at vælge den centrale region fra en Gaussisk pasform af summen af alle linje linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integration af signalet i hver linje udbytter membran fluorescens tidsserien f(v) i hver kanal (g = grøn kanal, r = rød kanal). Bemærk, at pixelstørrelse har at være lille nok, f.eks < 200 nm, at rekonstruere form af punkt spredt funktion og finde sin center, svarende til placeringen af PM. Ved tilstedeværelse af betydelige photobleaching, fluorescens tidsserier i hver kanal kan modelleres med en dobbelt-eksponentiel funktion og derefter korrigeres med følgende formel:16

Equation 1.    (1)

Det er vigtigt at bemærke, at denne formel effektivt korrigerer både amplituder og diffusion gange korrelation analysen af f(v)c, sammenlignet med parameteren skøn, der ville være opnået fra den ukorrigeret f(v). Derefter, auto - og cross-korrelation funktioner (ACFs / CCFs) af fluorescens signaler beregnes:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

hvor δFjeg = Fjeg(t) - Image 1 , F,jeg(t)Image 2 og jeg = g, r.

En to-dimensionel diffusion model monteres derefter at alle korrelation funktioner (CFs):

Equation 4.   (4)

Her, angiver N antallet af fluorescerende proteiner i observation volumen og τd diffusion tid for hver kanal. Denne model tager hensyn at i indstillingen beskrevet eksperimentelle diffusion af proteiner i PM opstår i x-z planet, i modsætning til den anvendte konfiguration af fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner sondering Diffusion i x-y plane Konfokal bind17. Taljen w0 og struktur faktor S, der beskriver brudforlængelse wz af fokale volumen i z, S = wz/w0, er fremstillet af et punkt FCS kalibrering måling udført med samme optiske indstillinger og spektralt lignende farvestoffer ved hjælp af allerede tilgængelige værdier for diffusion koefficient Dfarvestof:

Equation 5, (5).

hvor τd, farvestof er den målte gennemsnitlige diffusion tid af farvestof molekyler, fremstillet af montering af en model for tre-dimensionelle diffusion til data, under hensyntagen til konto overgange i en brøk T af alle N molekyler til en triplet stat med en gang konstant ττ:

Equation 6.   (6)

Endelig, diffusion koefficienter (D), Molekylær lysstyrkeværdierne (ε) og den relative cross-samkøring af sFCCS data (rel.cc.) beregnes som følger:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

hvor Gcross(0) er amplituden af cross-korrelationsfunktionen og Equation 14 er amplituden af funktionen autokorrelation i jeg-th kanal.

Denne definition af den relative Kors-sammenhæng, dvs bruger max i stedet for at betyde i ligning 9, tager i betragtning, at det maksimale antal komplekser af to protein der forekommer i forskellige koncentrationer er begrænset af den arter, der forekommer i et lavere tal.

Kors-sammenhæng antallet og lysstyrke er baseret på et øjeblik analyse af fluorescens-intensiteten for hver pixel i en billedstak erhvervet over tid til en fast stilling i stikprøven, typisk bestående af ~ 100-200 billeder, med to spektrale kanaler () g = grøn kanal, r = rød kanal). Fra den tidsmæssige betyder Image 1 jegImage 2jeg og varians Equation 16 , Molekylær lysstyrke εjeg og nummer, njeg beregnes i hver pixel og spektral kanal (jeg = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Det er vigtigt at bemærke, at de givne ligninger gælder den ideelle sag af en ægte photon-optælling detektor. For analoge detektionssystemer gælder følgende ligninger19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Her, S er omregningsfaktoren mellem fundne fotoner og de optagede digitale tællinger, Equation 24 er udlæsning støj og offset henviser til detektor intensitet forskydning. Generelt bør disse mængder kalibreres, for enhver detektor type, baseret på måling detektor afvigelse som funktion af intensitet for jævn belysning19, fx en reflekterende metal overflade eller tørrede farvestof løsning. Forskydning kan bestemmes ved at måle count sats for en prøve uden excitations lys. Ved at udføre en lineær regression af detektor-associerede variansen Equation 25 versus intensitet, (jeg) plot, S og Equation 24 kan være beslutsom19:

Equation 14.   (14)

Endelig, cross-korrelation lysstyrke beregnes i hver pixel og defineres generelt som21

Equation 15, (15).

hvor Equation 29 er cross-afvigelsen Equation 30 .

For at filtrere langlivede udsving, udføres alle ccN & B beregninger efter en boxcar filtrering, uafhængigt for hver pixel22. Kortvarigt, njeg, ε,jeg (jeg = g, r) og Bcc beregnes i glidende segmenter af fx 8-15 frames. De dermed opnåede værdier kan derefter gennemsnit for at opnå den endelige pixel antallet og lysstyrken værdier.

Støkiometrisk analyse
For at kunne vurdere støkiometrisk af proteinkomplekser på celle-celle kontakter, kan den molekylære lysstyrke analyseres separat i hver spektrale kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS opnås en lysstyrkeværdi pr. maaling i hver kanal. CcN & B, en lysstyrke histogram af alle pixels svarende til celle-celle-kontakt er opnået og den gennemsnitlige (eller median) værdi kan bruges som repræsentative lysstyrke til måling. Ved at udføre den samme analyse på en monomere reference, kan alle lysstyrkeværdierne normaliseres du kan direkte hente den gennemsnitlige oligomere stat af de fundne proteinkomplekser. På dette tidspunkt, er det vigtigt at korrigere for tilstedeværelsen af ikke-fluorescerende FPs, som kan resultere i en undervurdering af den oligomere stat. Dette er typisk udføres ved at måle lysstyrken af en homo-dimerisk reference protein23,24 ved hjælp af en farve sFCS eller antal og lysstyrke (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøvetilberedning: Celle-celle blanding Assay

Bemærk: Følgende protokol beskriver blanding proceduren for vedhængende celler. Det kan ændres til celler dyrkes i suspension.

  1. Seed et passende antal celler på et 6-godt plade, fx 800.000 HEK 293T celler (tælles med en Neubauer tælle kammer), en dag før Transfektion. Antallet kan ændres afhængigt af tiden mellem såning og Transfektion og justeret i forhold til andre celletyper. Hvis du vil udføre en grundlæggende eksperiment (dvs. proteiner af interesse og negativ kontrol), forberede mindst 4 brønde. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) medium, suppleret med føtal bovint serum (10%) og L-glutamin (1%).
  2. Transfect celler ifølge producentens anvisninger (Se Tabel af materialer).
    1. Hvis du vil udføre en grundlæggende eksperiment, transfect i separate brønde, plasmider for protein af interesse smeltet til en 'grøn' (fx monomere øget grøn fluorescerende proteiner (mEGFP), eller gul fluorescerende proteiner (mEYFP)) eller «red» (f.eks. mCherry, eller mCardinal) fluorescerende proteiner.
      Bemærk: I denne protokol, vi fokuserer på APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal12, og de tilhørende negativ kontrol, fx myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) og -mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. Generelt, 200 ng - 1 µg af plasmid DNA er tilstrækkelig. Høj Transfektion effektivitet øges chancen for at finde 'røde' og 'green' celler i kontakt. Ændre mængden af plasmid og Transfektion reagens til at optimere Transfektion effektivitet. Kritisk: Celle confluency bør være omkring 70% når transfecting cellerne. Hvis celler er overdreven sammenflydende, vil Transfektion effektivitet falde. Hvis celler ikke sammenflydende nok, kan Transfektion og blande fremkalde stress og forebygge mange celler fra ordentlig udlæg efter blanding.
  3. Udføre celle blande ~4 ± 2 h efter Transfektion.
    1. Fjerne vækstmediet og vaske hver godt forsigtigt med 1 mL PBS suppleret med Mg2 + og Ca2 +. Fjern derefter PBS. (Kritisk) Drop PBS på godt kant for at forhindre udstationering af celler under vask.
    2. Tilsæt ~ 50 µL trypsin ethylendiamintetra syre (EDTA) løsning Dråbevist til hver brønd fremme udstationering af celler. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 min. bagefter, langsomt ryste den 6-godt plade lateralt for at frigøre cellerne.
      Bemærk: Udvidet inkuberingstider kan være påkrævet til nogle celletyper.
    3. Tilføje 950 µL af vækstmedium til hver brønd og resuspend celler af pipettering et par gange op og ned, hvorved afmonterer alle celler fra at nå bunden. (Kritisk) Sikre at cellerne er genopslemmes korrekt og løsrevet fra hinanden ved besigtigelse for fravær af store celle aggregater efter resuspension. Ellers vil mange 'røde'-'røde' eller 'grønne'-'grøn' kontakter være opnået efter blanding.
    4. Oploesningen celle af en brønd (protein af interesse eller negativ kontrol) til tilsvarende nå, dvs 'røde' (f.eks. APLP1-mCardinal transfekteret) til 'grøn' (f.eks. APLP1-mEYFP transfekteret) celler. Mix af forsigtigt pipettering et par gange op og ned. Derefter, frø af blandede celler på 35-mm glas bund retter (1 mL af blandet celle løsning pr. parabol), plus 1 mL af vækstmediet og kultur seedede celler til en anden dag ved 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Figur 1 . Eksperimentel arbejdsproces og skematisk gengivelse af scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi og Kors-sammenhæng antallet og lysstyrke analyse på celle-celle kontakter. (A) ordningen til forberedelse af prøven: to cellepopulationer transfekteret med protein af interesse (f.eks. APLP1) smeltet til to spektralt forskellige fluorescerende proteiner (f.eks. mEYFP og mCardinal) er blandet efter Transfektion. Kontakter af forskelligt transfekteret celler er markeret i mikroskopi eksperimenter. For at undgå interferens med ekstracellulære bindende domæner, bør den fluorescerende proteiner være smeltet til den intracellulære endestation for protein af interesse. (B) Scanning FCCS (sFCCS) målinger er udført vinkelret på celle-celle-kontakt i to spektrale kanaler (kanal 1, grønne og kanal 2, rød). Skanne linier (repræsenteret som kymographs) er justeret og membran pixels summeres. Derefter ACFs og CCFs er beregnet ud fra intensitet sporene Fjeg(t). ACFs er repræsenteret i rød og grøn. CCF er repræsenteret i blå. (C) Kors-sammenhæng N & B (ccN & B) erhvervelse resulterer i en tre-dimensionelle (x-y-tid) billedstak. En ROI er valgt i nærheden af celle-celle-kontakt. Derefter kanal og cross-korrelation lysstyrke (ε1, ε2og Bcc) værdier beregnes i hver celle-celle kontakt pixel. Resultaterne er derefter visualiseres som histogrammer, samle alle markerede pixel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

2. Prøvetilberedning: Positiv kontrol for Cross-korrelation eksperimenter og Homo-Dimer konstruere for lysstyrke analyse

  1. Seed 600.000 HEK 293T celler, tælles med en celle tælle kammer på 35-mm glas bund retter en dag før Transfektion. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i komplet DMEM medium (Se trin 1.1) til en anden dag.
  2. Transfect celler med ~ 250 ng af plasmid DNA ifølge producentens anvisninger. Bruge en plasmid kodning en membran-forankrede fluorescerende proteiner hetero-dimer, fx myr-palm-mCherry-mEGFP eller myr-palm-mCardinal-mEYFP12 svarer til FPs af protein af interesse for kontrolelementet positiv cross-sammenhæng. For lysstyrke kalibrering, bruge plasmider kodning både en membran-forankrede FP monomere og homo-dimer svarende til FPs sammensmeltet til protein af interesse, fx myr-palm-mEYFP og myr-palm-mEYFP-mEYFP til at kalibrere lysstyrke analyse af APLP1-mEYFP12.
  3. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i komplet DMEM medium (Se trin 1.1) til en anden dag.

3. Konfokal Laser Scanning mikroskopi: Setup og fokale volumen kalibrering

Bemærk: Følgende protokol er skrevet for eksperimenter udført med mEGFP/mEYFP og mCherry/mCardinal på laser scanning Konfokal mikroskop bruges i denne undersøgelse. Den optiske setup, softwareindstillinger (laser linjer, dichroic spejle, filtre) og valg af kalibrering farvestoffer kan ændres til andre FPs og mikroskop opsætninger.

  1. Tænde mikroskopet og lasere mindst en time før forsøget at sikre laser stabilitet og ækvilibrering af temperatur.
  2. Forberede 100-200 µL af passende vandopløselige fluorescerende farvestof løsninger (Se Tabel af materialer til eksempler) i vand eller PBS til at kalibrere den fokale mængde med koncentrationer i området 10-50 nM.
  3. Placer farvestof løsninger på en ren 35-mm glas bund fad #1.5, dvs, med en tykkelse på 0,16-0,19 mm.
    Bemærk: Brug ideelt, retter med højtydende cover glas har en lav tykkelse tolerance, fx 0.170 ± 0,005 mm, muliggør en optimal krave ring korrektion (trin 3.6). Det er vigtigt at bruge den samme type parabol som bruges senere til de følgende forsøg.
  4. Placer fadet indeholdende farvestof løsningen direkte på mål (helst, vand fordybelse, med NA 1.2) for at sikre, at fokus i løsningen. Alternativt, Placer skålen på prøveholderen og fokus i stikprøven (f.eks. 10-20 µm over bunden af fadet).
    Bemærk: Vi anbefaler ikke brug af olie mål på grund af dårlig signal fremkommer når der fokuseres dybt ind i vandige prøver.
  5. Oprette excitations- og stien, fx vælge 488 nm laser, en 488/561 nm dichroic spejl, afsløring vindue 499-552 nm og en pinhole størrelse 1 luftige enhed (AU). Sørg for at pinhole størrelse er den samme som den, der vil blive brugt i cross-korrelation målinger.
  6. Justere pinhole position (pinhole justering) og den objektive krave ring til at maksimere count sats. Til dette formål, drej krave ring indtil maksimalt antal sats er registreret.
    Bemærk: Krave ring korrektion tegner sig for den specifikke tykkelse af dækslet glas anvendes. Maksimering af Grev sats, dvs., indsamle så mange fotoner pr. molekyle som muligt, er afgørende for at maksimere signal / støj-forhold (SNR) af målingerne.
  7. Udføre en række punkt FCS målinger (fx 6 målinger på forskellige steder, hver bestående af 15 gentagelser af 10 s, dvs. 2,5 min samlede tid, stikprøven med 1 µs hviletid eller mindre) på den samme laser power som anvendt i Kors-sammenhæng målinger (typisk ~ 1%, dvs., ~ 1-2 µW).
  8. Passe til en tre-dimensionel diffusion model herunder en triplet bidrag (ligning 6) til data.
    Bemærk: Typisk opnået diffusion gange er omkring 30 µs og struktur faktor er omkring 4-8.
  9. Beregne taljen w0 fra den målte gennemsnitlige diffusion tid og publicerede værdier for diffusion koefficient for den anvendte farvestof ved stuetemperatur25 ifølge ligning 5. Typiske værdier er 200-250 nm.
  10. Gentag kalibrering rutine (trin 3,4-3,9) med en forskellige fluorescerende farvestof for en anden opdagelse kanal, hvis det er nødvendigt (f.eks. 561 nm excitation og påvisning mellem 570 nm og 695 nm). Holde pinhole placering og størrelse, som det var sat for den første opdagelse kanal.
  11. Beregne den molekylære lysstyrke (ligning 8) fra kalibrering målinger, og gemme de opnåede værdier.
    Bemærk: Typiske værdier for den anvendte opsætning er ~8-10 kHz/molekyle (MOL) for 1,8 µW 488 nm excitation magt. Lavere end den normale værdier kan indikere snavs på målet, forskydning af opsætningen eller en reduceret laser output. Kontrollere og gemme laser output beføjelser på målet jævnligt bruger en energimåler. Til sammenligning af forskellige opsætninger er Molekylær lysstyrke normaliseret af excitation laser power det mest meningsfyldte parameter at vurdere mikroskop ydeevne.

4. scanne fluorescens Cross-korrelations-spektroskopi: erhvervelse

Bemærk: Følgende protokol er skrevet for eksperimenter udført med mEGFP/mEYFP ('grøn') og mCherry/mCardinal (røde) på laser scanning Konfokal mikroskop bruges i denne undersøgelse. Opsætningen af optiske og programindstillinger (laser linjer, dichroic spejle, filtre) kan være anderledes for andre FPs eller mikroskop opsætninger.

  1. Opsætning af den optiske transmissionslængde, fx, 488 nm og 561 nm excitation og en 488/561 nm dichroic spejl, pinhole på 1 AU for 488 nm excitation. For at undgå spektrale cross-talk, Vælg to separate spor til at ophidse og afsløre mEGFP/mEYFP (488 nm excitation, grønne kanal) og mCherry / mCardinal (561 nm excitation, rød kanal) sekventielt, og vælg switch spor hver linje. Til påvisning, skal du bruge passende filtre til begge kanaler, fx 499-552 nm i den grønne kanal og 570-695 nm i den røde kanal.
  2. Hvis vekslede excitation ikke er muligt, bruge passende filterindstillinger for den røde kanal til at minimere spektrale cross-talk (dvs. opdage mCherry/mCardinal fluorescens ikke under 600 nm). Dette kan reducere mængden af fotoner opdaget i den røde kanal og dermed reducere SNR.
  3. Placer fadet med de blandede celler på prøveholderen. Vent mindst 10 min at sikre temperatur ækvilibrering og reducere fokus drift.
  4. Fokusere på celler ved hjælp af transmission lys i menuen Find .
  5. Søge efter et par en 'rød' og en 'grøn' celle i kontakt med hinanden. Positiv cross-sammenhæng eller homo-dimer lysstyrkekontrol (Se afsnit 2), søge efter en isoleret celle udsender fluorescens i både kanaler eller den respektive homo-dimer signal den kl.
    Bemærk: (Kritisk) Minimer prøve eksponering, mens du søger celler at undgå pre blegning, som kan reducere cross-korrelation26. Derfor, scanne på den hurtigste scanning hastighed og lave laser beføjelser. For at undgå detektor mætning mens imaging giver kraftigt udtryk for celler, Søg i integrationstilstand. Men for at minimere eksponering, scanning på lavere laser beføjelser er muligt i photon optælling mode.
  6. Vælge en scan sti vinkelret til celle-celle kontakt (eller PM af en enkelt celle til positiv cross-korrelation eller homo-dimer lysstyrkekontrol) ved hjælp af knappen Beskær som afbildet i tal 1B og 2A.
    Bemærk: Nogle ældre mikroskoper tillader ikke vilkårlige scan retninger. I dette tilfælde, nødt celle-celle kontakter med en orientering vinkelret scan til at være placeret.
  7. Zoom til at opnå en pixelstørrelse på 50-200 nm og vælg linje i Scanningstilstand. Indstil rammestørrelse til 128 × 1 pixel.
    Bemærk: Typisk pixelstørrelse er 160 nm, svarende til en scanning længde på omkring 20 µm.
  8. Indstil Skan hastighed til den maksimale tilladte værdi, f.eks. 472.73 µs pr. linje.
    Bemærk: For en ordning for alternative excitation, dette svarer til 954.45 µs scan tid, nemlig ~ 1000 scanninger/s på opsætningen brugt. Scanning hastighed kan justeres afhængigt af diffusion koefficient af protein af interesse. For membran-forankrede proteiner, typisk diffusion tidspunkter er omkring 10-20 ms. scan tid bør være mindst 10 gange mindre end diffusion gange. Lavere scanningshastighed kan fremkalde stærkere photobleaching og kræver lavere belysning beføjelser. Alternativt kan man pålægge en pause, fx 5 ms, i mellem hver scanning for meget langsomt spreder komplekser ved hjælp af Interval i undermenuen Tidsserier .
  9. Vælg den passende laser beføjelser, f.eks., ~ 1-2 µW for 488 nm og ~ 5-10 µW for 561 nm excitation.
    Bemærk: Højere laser beføjelser forbedre SNR, men øge photobleaching. Laser beføjelser bør derfor vælges således, at photobleaching er mindre end 50% af den oprindelige tæller sats.
  10. Indstille cykler til 100.000-500, 000.
    Bemærk: Antallet af scanninger, dvs., varigheden af måling, kan variere: længere måling gange vil forbedre SNR og kan være mere hensigtsmæssigt for langsomt spreder molekyler, men bevægelse af celler og photobleaching begrænse den maksimal måling tid. Data præsenteres her blev rutinemæssigt erhvervet for ~ 3-6 min, dvs, 200.000-400.000 line scanner.
  11. Indstil detektorer til foton optælling mode. Tryk på Start eksperiment at starte erhvervelse. Gentag trin 4.5-4.11 at måle en anden celle.
    Bemærk: Det anbefales at måle 10-15 celler pr. sample på forskellige udtryk niveauer. (Kritisk) Undgå detektor mætning på høj udtryk niveauer. Maksimalt antal bør ikke overstige ~ 1 MHz.
  12. Hvis lysstyrken analyse udføres for at bestemme oligomere stater, udføre homo-dimer lysstyrke kalibrering målinger efter modificerede trin 4.1-4.11: måle hver fluorescerende proteiner homo-dimer separat (i isolerede celler, udarbejdet ved hjælp af protokollen afsnit 2) og udføre målingerne kun i én spektrale kanal.

5. scanning fluorescens Cross-korrelations-spektroskopi: Dataanalyse

Bemærk: Følgende protokol følger en implementering af den analyse procedure beskrevet detaljeret i forrige artikel12,15. Softwarekode er tilgængelig på anmodning til forfatterne.

  1. Eksportere rå (f.eks. CZI) datafiler til et RGB TIFF-billede i raw-dataformat. Denne fil vil indeholde en kymograph med grønne og røde kanaldata, i kanalen kaldes G og R af billedet, henholdsvis.
  2. Importere TIFF-filen med relevant analyse software og gå videre til at udføre analysen.
    Bemærk: Følgende trin (trin 5.3-5.7) anvendes separat til hver kanal:
  3. Centrerer linjerne ved at udføre en segment-wise eller bevægelige gennemsnit med blokke af 500-1000 linjer. Bestemme membran position, dvs, pixel position med den maksimale antal sats, i hver blok. Skift alle blokke til de samme sideleje. Denne procedure korrigerer for sideforskydning af celle-celle kontakt, fx på grund af celle bevægelse.
  4. Opsummere alle justerede linjer langs tidsaksen og passe den gennemsnitlige intensitet profil ved hjælp af en Gaussisk funktion. Ved tilstedeværelse af betydelige intracellulære baggrund, bruge en Gaussisk plus en sigmoid funktion. Definere de pixel, svarende til membranen som alle pixel inden for ±2.5σ af membran holdning og opsummere intensiteten af disse pixel i hver linje, at opnå en enkelt fluorescens signalværdi for hvert tidspunkt (dvs. for hver linje scanning).
  5. Hvis det er nødvendigt (f.eks. baggrund > 10% af membran signal), anvende et baggrundskorrektion ved at fratrække den gennemsnitlige pixel intensitet i cytoplasmaet ganget med 2.5σ (i pixelenheder) fra membran-fluorescens i blokke af 1000 linjer. Undgå lyse intracellulære vesikler, når du vælger baggrundspixel.
  6. Hvis photobleaching er observeret, anvende en blegning korrektion. Derfor passer membran fluorescens tidsserie med en dobbelt-eksponentiel funktion og anvende passende korrektion formel, ligning 116.
    Bemærk: Alternativt Fourier spektrum baseret korrektion ordninger kan være anvendt27. (Kritisk) Hvis photobleaching er til stede men ikke korrigeret for, at CFs kan være alvorligt forvredet og parameteren skøn kan være stærkt forudindtaget (f.eks., se figur 5E).
  7. Beregne ACFs og CCFs ifølge ligningerne 2 og 3 ved hjælp af fx en multiple-tau algoritme28. Til at forbedre pålideligheden af analysen og undgå artefakter, udføre beregningerne for 10-20 lige segmenter af den samlede måling. Inspicere fluorescens tidsserier og CFs i hvert segment og fjerne klart forvrænget segmenter (se eksempler i figur 4A- 4 D). Gennemsnittet af alle ikke-fordrejet segmenter.
    Bemærk: Denne procedure kan automatiseres for at undgå en subjektiv bias til data29. For meget ustabile målinger kan har mange korte segmenter være nyttige. Længden af et segment bør dog stadig være mindst tre størrelsesordener over diffusion tid til at undgå statistiske undersampling fejl29,30,17.
  8. Passe en todimensional diffusion model, ligning 4, at den opnåede CFs. Derfor fastsætte struktur faktoren til værdien opnået i kalibrering måling (protokollen afsnit 3). Nøjagtighed af fit kan forbedres ved at udføre en vægtet pasform ved hjælp af de statistiske vægte af hvert datapunkt, der er fremstillet af flere tau algoritmen.
  9. Beregne diffusion koefficienten ved hjælp af kalibreret taljen ifølge ligning 7.
  10. Beregne den molekylære lysstyrke ved at dividere den gennemsnitlige fluorescens intensitet i hver kanal med det tilsvarende antal partikler, ligning 8. Normalisere bestemt lysstyrkeværdien i hver kanal af den gennemsnitlige lysstyrke af tilsvarende monomere henvisningen til få oligomere staten, idet der tages hensyn ikke-fluorescerende FPs23. Til dette formål, bestemme gennemsnitlige homo-dimer lysstyrken værdier fra en-farve analyse til at beregne brøkdel af ikke-fluorescerende FPs23.
  11. Beregne den relative cross-korrelation ifølge ligning 9.

6. Cross-korrelation antallet og lysstyrke: detektor kalibrering

Bemærk: Følgende protokol giver en generel retningslinje om, hvordan man kalibrere detektionssystemets. Denne procedure er obligatorisk for analog detektionssystemer, men er ikke strengt nødvendigt når sande photon tælle detektorer anvendes.

  1. Tørre passende vandopløseligt farvestof løsninger (Se Tabel af materialer for eksempler) på en 35 mm glas bund fad. Indstille den optiske vej i overensstemmelse hermed, dvs, 488 eller 561 nm excitation og registrering på 499-552 nm eller 570-695 nm, henholdsvis.
    Bemærk: Alternativt en reflekterende metaloverflade kan bruges i stedet for tørret farvestof løsninger ved at placere metal stykke direkte på målet.
  2. Udfør en farve N & B målinger i regioner med forskellige farvestof koncentrationer eller på forskellige laser beføjelser. Derfor, bruge Zoom til at opnå en pixelstørrelse på 300 nm, Skan hastighed til indstille passende pixel hviletid, fx 25 µs og indstiller cykler til 100-200 billeder.
  3. Detektorer til foton tælle (eller analog tilstand Hvis målingerne udføres med analog detektion), og tryk på Start eksperiment at starte erhvervelse. Udføre måling på nul excitation magt til at bestemme intensitet forskydning.
  4. Plot pixel afvigelse som funktion af pixel intensitet for alle målte pixel og udføre en lineær pasform af disse data. Bestemme S som hældningen af den lineære pasform. Beregne udlæsning støj fra y-skæringspunkt, ved hjælp af S og beslutsom intensitet forskydningen efter ligning 14.

7. Cross-korrelation antallet og lysstyrke: erhvervelse

  1. Følg trin 4.1-4.4 sFCCS erhvervelse protokol.
  2. Brug afgrøde til at vælge en ramme af 512 × 128 pixel omkring en celle-celle kontakt (eller isolerede PM for homo-dimer lysstyrkekontrol) og Zoom til at opnå en pixelstørrelse på 50-100 nm.
  3. Brug Skan hastighed til at indstille passende pixel hviletid, fx 6,3 µs.
    Bemærk: I N & B, bør pixel hviletid være meget mindre end diffusion tidspunktet for protein af interesse. Hvis en alternativ excitation ordningen er valgt, fx skifte spor hver linje, tiden mellem de to spor skal være mindre end diffusion tidspunktet for protein af interesse. Ellers er kan påvises cross-korrelationen reduceret.
  4. Indstiller cykler til 100-200 billeder.
    Bemærk: En højere billednummer vil forbedre SNR, celle bevægelse kan imidlertid begrænse det samlede måleperioden. Scan tid pr. ramme bør være meget højere end diffusion tidspunktet for protein af interesse. Ellers tilsyneladende lysstyrke er reduceret, dvs partikler synes at være immobile. For meget langsomt spreder komplekser, indføre en pause, f.eks., 2 s, i mellem rammer ved hjælp af Interval i undermenuen Tidsserier .
  5. Indstille laser beføjelser til passende værdier (typiske værdier er ~ 1-2 µW for 488 nm og ~ 5-10 µW for 561 nm excitation).
    Bemærk: Højere laser power fører til højere lysstyrke og bedre SNR, men også forbedret photobleaching. Laser beføjelser bør være stor nok til at opnå en opdaget lysstyrke på mindst ~ 1 kHz/MOL men holdt lav nok til at undgå mere end 10-20% photobleaching. For mEGFP/mEYFP eller mCherry/mCardinal, mindre end 10% photobleaching er normalt fremstillet.
  6. Sæt detektorer til foton tælle (eller analog tilstand Hvis målingerne udføres med analog detektion). Tryk på Start eksperiment at starte erhvervelse.
  7. Evaluere foton count sats. Hvis de tæller satser i celle-celle kontakt pixel overstiger 1 MHz, reducere laser power eller marker celler med lavere udtryk niveauer. Gentag trin 7.2-7.7. til at måle de næste par af celler. Det anbefales at måle 10-15 celler pr. eksperiment på forskellige udtryk niveauer.
  8. Hvis lysstyrken analyse udføres for at kvantificere oligomerisering, udføre homo-dimer lysstyrke kalibrering målinger efter modificerede trin 7.1-7.7: måle hver fluorescerende proteiner homo-dimer separat (i isolerede celler, udarbejdet ved hjælp af protokollen afsnit 2) og udføre målingerne kun i én spektrale kanal.

8. Cross-korrelation antallet og lysstyrke: dataanalyse

Bemærk: Følgende protokol følger en tidligere beskrevne analyse procedure12,31. Softwarekode er ledige fra forfattere efter anmodning.

  1. Importere de rå data (f.eks. CZI filer kan importeres ved hjælp af pakken Bioformats32 ). Gennemsnit alle rammer og vælg en region af interesse (ROI) i nærheden af celle-celle-kontakt.
  2. Udføre en billede justering algoritme33, fx ved at maksimere den rumlige korrelationen mellem ROIs i efterfølgende rammer for vilkårlige laterale oversættelser, gennemsnit over begge kanaler. Denne procedure vil korrigere for sideværts bevægelse af celler.
  3. Anvende en boxcar filter22 for at begrænse uvedkommende langlivede udsving, stammer fra, fx resterende celle bevægelse eller baggrunden blegning. Alternativt, en detrending metode kan anvendes til at korrigere for photobleaching34.
    Bemærk: Hvis nogen segment-wise analyse eller detrending er anvendt, den tilsyneladende lysstyrke kan være i høj grad overvurderet.
    1. Definere glidende segmenter af fx 8-15 frames (f.eks. billeder 1 til 8, 2 til 9 og så videre) og beregne kanal og cross-korrelation lysstyrkeværdierne ifølge ligninger 10, 11 og 15 pixel-wise i hvert segment. Hvis detektorer ikke er sandt photon tælle detektorer, kalibreret detektor parametre, tages i betragtning ved beregningen af lysstyrken dvs. bruge ligninger 12 og 13 i stedet.
      Bemærk: Beregning af lysstyrkeværdierne i segmenter af 8 til 15 rammer fører til et 10-20% undervurdering af den absolut lysstyrke og en 10-20% overvurdering af partikel numre. Lysstyrke nøgletal (fx dimer til monomere lysstyrke) påvirkes dog ikke, så længe segment længde holdes konstant i hele analyse (data ikke vist). Den statistiske fejl for en given segment længde kan bestemmes via simuleringer og dermed korrigeret for.
    2. Gennemsnitlige opnåede lysstyrkeværdierne pixel-wise over alle segmenter. I dette trin, kan man fjerne den højeste og den laveste 5% af målgruppen lysstyrkeværdierne fra gennemsnittet eller udelukke segmenter, som viser en klar forvridning i intensitet, skyldes f.eks., en intracellulær vesikel eller samlet forbigående stede i disse pixel.
  4. Plot lysstyrke pixelværdier som en funktion af pixel intensitet og vælg befolkningen af pixels, der svarer til celle-celle-kontakt. Baggrundspixel har meget lav intensitetsværdier. På dette tidspunkt, revurdere den maksimale antal sats. Udelukke pixels med Grev priser over 1 MHz til at forhindre harmonikasammenstød virkninger.
  5. Opret kanal og cross-korrelation lysstyrke histogrammer af markerede celle-celle kontakt pixels og opnå ROI-gennemsnit lysstyrkeværdierne. Normalisere gennemsnitlige kanal lysstyrkeværdi af de gennemsnitlige lysstyrke af tilsvarende monomere henvisningen til få oligomere staten, idet der tages hensyn ikke-fluorescerende FPs23. Derfor, bestemme gennemsnitlige homo-dimer lysstyrken værdier fra en-farve analyse til at beregne brøkdel af ikke-fluorescerende FPs23.
  6. For illustration, plot kanal og cross-korrelation lysstyrke kort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En første test for protein-protein interaktion assay, dvs, blanding af celler, der udtrykker spektralt forskellige fluorescerende proteiner efterfulgt af sFCCS/ccN & B målinger (figur 1), bør udføres på proteiner, der ikke forventes at interagere på celle-celle kontakt (dvs. en negativ kontrol). Derfor HEK 293T celler, der udtrykker myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal var blandede, og sFCCS blev udført på tværs af celle-celle kontakt (figur 2A). I sag ideel fluorescens signalet i hver kanal formodes for at svinge omkring en stabil middelværdi, som følge af diffuserende bevægelse af proteiner i PM og de statistiske variationer af antallet af proteiner i den fokale volumen. For proteiner, der ikke arbejder sammen, svingningerne i begge kanaler er uafhængige af hinanden, og således den spektrale cross-korrelation forventes at svinge omkring nul. Faktisk, en relativ Kors-sammenhæng tæt på nul blev observeret i typiske målinger (figur 2C). ACFs viser karakteristiske henfald gange af ~ 10-20 ms (svarende til, gennemsnitligt Dmyr-palm = 1,3 ± 0,3 µm2/s (mener ± SD, n = 20 celler)), som forventes til udbredelse af myr-palm-mEYFP og -mCardinal i PM, fx Dmyr-palm = 0,88 ± 0,11 µm2/s (gennemsnit ± SEM) baseret på fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) eksperimenter35. Især tillade disse temmelig langsom dynamics brug af en vekslende excitation ordningen, dvs., skifte mellem kun grøn og kun røde excitation og registrering af hver linje, forårsager en ~0.5 ms forsinkelse mellem signaler i begge kanaler men undertrykke spektrale cross-talk. I gennemsnit, en meget lav gennemsnitlig tværs-korrelation på 0,08 ± 0,10 (betyde ± SD, n = 17 celler) blev opnået for den negative kontrol (figur 3E), som forventet.

Næste, en positiv cross-korrelation kontrol blev brugt til at kalibrere den maksimale mulige cross-korrelation i opsætningen af optisk. Derfor, den membran-forankrede hetero-dimer myr-palm-mCardinal-mEYFP var udtrykt i HEK 293T celler og sFCCS målinger blev udført på enkelte celler (figur 2B). De fremkomne CCFs havde positive amplituder og viste lignende forfald gange som ACFs, igen ~ 10-20 ms (figur 2D). På gennemsnitligt en relativ cross-korrelation på 0,96 ± 0,18 (betyde ± SD, n = 14 celler) blev målt for den positive kontrol (figur 3E).

Figure 2
Figur 2 . Scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi kontrol målinger. (A) repræsentative billeder af blandet HEK 293T celler udtrykker myr-palm-mEYFP /-mCardinal som negativ kontrol for trans interaktioner. Den gule pil angiver sFCCS Skan sti. Skala barer er 5 µm. (B) repræsentative billeder af HEK 293T celler, der udtrykker myr-palm-mCardinal-mEYFP hetero-dimer (venstre: grøn kanal, højre: røde kanal) som positiv cross-korrelation kontrol. Den gule pil angiver sFCCS Skan sti. Skala barer er 5 µm. (C) repræsentant CFs (grøn: ACF i grøn kanal (mEYFP), rød: ACF i røde kanal (mCardinal), blå: CCF) er fremstillet i sFCCS målinger for negativ kontrol. Solid linjer viser anfald af en todimensional diffusion model til CFs. (D) repræsentant CFs (grøn: ACF i grøn kanal (mEYFP), rød: ACF i røde kanal (mCardinal), blå: CCF) er fremstillet i sFCCS måling af den positive kontrol. Solid linjer viser anfald af en todimensional diffusion model til CFs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Egnetheden af denne analyse blev derefter undersøgt i forbindelse med biologisk relevante af sondering trans interaktioner af amyloid forløber-lignende protein 1 (APLP1), en type jeg transmembrane protein, der er blevet foreslået til at fungere som en neuronal vedhæftning receptor. Til dette formål, APLP1 sammenvokset til mEYFP eller mCardinal blev udtrykt i HEK 293T celler. For at udelukke forstyrrelser med ekstracellulære bindende domæner, FPs var smeltet til C-terminus af APLP1, dvs., på den intracellulære domæne (Se figur 1A). Derefter, sFCCS målinger blev udført på celle-celle kontakter mellem APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal udtrykker celler (fig. 3A), hvilket resulterer i ACFs og CCFs (figur 3C), der indeholder oplysninger om APLP1 udbredelse og interaktioner. En positiv relative cross-korrelation på 0,45 ± 0,21 (betyde ± SD, n = 17 celler) blev observeret, dvs, en værdi, der er betydeligt større end den negative kontrol (figur 3E). Interessant, var den gennemsnitlige relative Kors-sammenhæng lavere end for den positive kontrol (figur 3E), der angiver kun delvis trans bindende.

Endelig vil blev analysen brugt til at vise, at zink-ioner lette forbedrede APLP1 trans bindende12,31. SFCCS CFs fremstillet af målinger over APLP1 klynger på celle-celle kontakter (karakteriseret ved en stærk fælles lokalisering af APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal og danner hurtigt i overværelse af zink-ioner, figur 3B) viste kraftigt reduceret dynamics, som fremgår af store forfald gange og svingninger på store forsinkelse gange (figur 3D). Ikke desto mindre analyse af amplituder på korte forsinkelse gange viste en betydelig stigning i den relative cross-korrelation til 0,8 ± 0,3 (betyde ± SD, n = 17 celler), dvs., ~ 80% af maksimumsbeløbet, kalibreret (figur 3E). Det kan forventes, at sådanne langsom dynamics fremkalde alvorlige forvridninger af korrelation kurver (Se figur 3D) skyldes det begrænsede antal diffuserende begivenheder, der kan påvises under finite måleperioden, inducerende såkaldte partikel støj30. For en nøjagtig kvantificering, skal den maksimale ventetid være mindst 3 størrelsesordener ovenstående diffusion tid (Se tidligere anmeldelser30,17 for yderligere oplysninger).

Den molekylære lysstyrke fra sFCCS APLP1 data blev yderligere analyseres, ved hjælp af kontrolelementet myr-palm negative som monomere reference i hver kanal og korrigere for den ikke-fluorescerende proteiner23. På zink ion tilsætning, steg den molekylære lysstyrke betydeligt fra små oligomerer (~ dimerer) til større multimerer, bestående af ~ 10-50 monomerer på hver celle (figur 3F). Således i gennemsnit er op til ~ 100 APLP1 monomerer til stede i en hele protein klynge på tværs af celle-celle krydset.

Figure 3
Figur 3 . Scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi målinger af APLP1 interaktioner på celle-celle kontakter. (A, B) Repræsentative billeder af HEK 293T celler, der udtrykker APLP1-mEYFP (grøn) / APLP1-mCardinal (rød) før (A) og 30 min efter zink ion behandling (B, forskellige celler). De gule pile angiver sFCCS Skan stier. Skala barer er 5 µm. (C, D) repræsentant CFs (grøn: ACFs i grøn kanal (mEYFP), rød: ACFs i røde kanal (mCardinal), blå: CCFs) fremstillet i sFCCS målinger for (C) APLP1 før zink ion behandling og (D) efter zink ion behandling. Solid linjer viser anfald af en todimensional diffusion model til CFs. (E) boks parceller af relative cross-korrelation fremstillet af sFCCS analyse af negativ kontrol ("negative"), APLP1 i fravær og tilstedeværelsen af zink-ioner og positiv Cross-korrelation kontrol ("positive"). Parceller Vis median værdier og whiskers spænder fra minimum til maksimum værdier. (F) boks parceller af normaliserede molekylære lysstyrke i grøn kanal (mEYFP) fremstillet af sFCCS analyse af APLP1 på celle-celle kontakter i fravær og tilstedeværelsen af zink-ioner. Lysstyrkeværdierne blev korrigeret for ikke-fluorescerende mEYFP baseret på sFCS måling af myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimerer udtrykt i HEK 293T celler, målt under samme betingelser23. Parceller Vis median værdier og whiskers spænder fra minimum til maksimum værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Alle målinger vist hidtil blev korrigeret for yderligere, falske udsving forekommer i de celler, hvis ikke tages i betragtning, ville gøre sFCCS analysen udfordrende. For den negative kontrol, for eksempel, kan disse forårsage en falsk-positive Kors-sammenhæng, hvis ingen korrektion ordninger anvendes. To store processer, der kan alvorligt fordreje CFs er: 1) ustabilitet i den registrerede fluorescens signal på grund af intracellulære blærer, der forbigående Angiv den fokale volumen eller langsom membran dynamics, f.eks., afdrift i z-retning og 2) photobleaching. For at identificere forbigående ustabilitet, anbefales det at opdele de fulde målinger i 10-20 lige store segmenter og at visuelt inspicere intensitet tidsserier og CFs i hvert segment. Denne procedure er illustreret i figur 4, som giver et eksempel på klart forvrænget segmenter fremstillet i analysen af en negativ kontrol måling. Forbigående ustabilitet (figur 4A, intensitet spor af segmenterne 1 og 2) kan resultere i en CCF har negative værdier (fig. 4B, segment 1) eller en høj falsk-positive Kors-sammenhæng (figur 4B, segment 2). Typisk, denne ustabilitet er synlige i intensitet serier som langsomt signal variationer (figur 4A). Den tilsvarende CFs typisk afviger stærkt fra CFs størstedelen af segmenter, viser f.eks., højere amplitude og meget langsommere henfald gange på den ~ anden skala (Se figur 4B-4 D). Det anbefales at fjerne disse segmenter fra analyse og til at beregne den endelige CFs af gennemsnit alle ikke-fordrejet segmenter, dvs., segmenter karakteriseret ved CFs ikke afviger fra fleste af CFs. typisk, dette sker i en grafisk grænseflade 1) iterativt undersøge segmenter, 2) at fjerne klart forvrænget segmenter fra gennemsnittet og 3) inspektion CFs resterende segmenter med hensyn til den opdaterede gennemsnitlige CFs af segmenter, der ikke blev fjernet. Ved at anvende denne procedure, delvist forvrænget lang målinger (figur 5A), viser langsomt rådnende (beskadiget) CFs (figur 5B) blev med held korrigeret og meningsfuld sammenhæng kurver var genvundet (figur 5C). Generelt kan dette korrektionsproceduren være automatiseret29, at undgå en visuel inspektion af brugeren, som kan være udsat for subjektiv bias. I forhold til intensiteten baseret filtrering metoder36, hvor små placeringer af måling er evalueret baseret på deres intensitet i forhold til den gennemsnitlige intensiteten af fuld måling og fjernet hvis overstiger en tærskel parameter, den beskrevne proceduren stole ikke på eksterne parametre og er følsomme også til mindre ustabilitet.

For at kompensere for photobleaching, blev beskrives matematisk korrektionen, ligning 1, anvendt. Typisk, photobleaching kan identificeres ved en eksponentiel henfald af fluorescens signaler (fig. 5D), dominerer CFs, som derefter viser en falsk-positiv cross-sammenhæng og henfald gange på den ~ min skala (se figuren typiske kurve i figur 5E). Korrektionsproceduren genoprettet ikke-fordrejet CFs (figur 5F). Som allerede nævnt, lignende intensitet kan variationer inden for enkelt målinger også være forårsaget af PM bevægelse, fx z-drift eller store langsomt bevæger sig strukturer. Men, hvis lignende eksponentiel henfald vises i alle målinger, photobleaching vil være den mest sandsynlige kilde. Generelt, korrektion ordninger kan kombineres, f.eks., intensitet filtrering, CF baseret filtrering og yderligere metoder såsom Fourier transform baseret filtrering af langsomt signal variationer i hyppighed plads27.

Figure 4
Figur 4 . Segment-Wise analyse af scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi målinger af negative cross-korrelation kontrol. (A) Fluorescens intensitet i grøn (F1) og røde kanal (F2) af to forskellige tid segmenter (hver måling blev analyseret i 20 segmenter af ~ 20 s hver), fremstillet af sFCCS måling af negativ kontrol. (B) CCFs af hver af de 20 segmenter. CCFs for segmenter 1 og 2 er fremhævet med rødt og orange, henholdsvis. (C, D) ACFs af hvert segment i grøn (C) og rød (D) kanal. ACFs for segmenter 1 og 2 er fremhævet med rødt og orange, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Perturbationer i scanning fluorescens cross-korrelations-spektroskopi målinger på celle-celle kontakter, eksemplificeret for negativ cross-korrelation kontrol. (A) fuld fluorescens tidsserier for et exemplar måling i grøn (F1) og røde kanal (F2). De faste røde linjer repræsenterer en dobbelt-eksponentiel pasform af tidsserier i hver kanal. (B, C) CFs (grøn: ACFs i grøn kanal, rød: ACFs i røde kanal, blå: CCFs) af fluorescens tidsserien vist i A, beregnet ved (B) korrelerede hele måling eller (C) korrelerede 20 segmenter separat og i gennemsnit de mindste forvrænget CFs ~ 80% (grøn kanal) og ~ 50% (røde kanal) af segmenterne. Solid linjer repræsenterer pasform af en todimensional diffusion model til data. (D) fuld fluorescens tidsserier og dobbelt-eksponentiel fit (røde streger) af måling kendetegnet ved betydelig blegning i grøn (F1) og røde kanal (F2). (E, F) CFs (grøn: ACFs i grøn kanal, rød: ACFs i røde kanal, blå: CCFs) af fluorescens tidsserien vist i D, beregnet af (E) korrelerede hele måling eller (F) de blegning korrektion, ligning 1, korrelerede 20 segmenter separat og i gennemsnit de mindste forvrænget CFs ~ 90% (begge kanaler) af segmenterne. Solid linjer repræsenterer pasform af en todimensional diffusion model til data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Som en supplerende tilgang til sFCCS, kan ccN & B (figur 1C) bruges til at registrere protein-protein interaktioner efter celle blanding. I modsætning til sFCCS, ccN & B giver ingen oplysninger om protein dynamik, men giver mulighed for måling af trans interaktioner langs hele celle-celle-kontakt i en fokalplan. Målinger på APLP1 prøver blev udført før og efter behandling med 50 µM ZnCl2, samt om negative myr-palm kontrol. Disse målinger er følsomme over for celle bevægelser, især for zink ion behandlet prøver, som kræver langvarig erhvervelse gange at tage højde for den langsomme dynamikken i APLP1 klynger. Derfor blev et billede justering algoritme implementeret for at korrigere for sideværts bevægelse af celler33. Også, en boxcar filter22 (8 rammer boksen størrelse, ~ 5 s) blev anvendt til at fjerne lavfrekvente svingninger af de målte signaler. Denne procedure er meget lig andre filtre anvendes i N & B analyse involverer lokale gennemsnit37 eller detrending18,34, men holder den oprindelige data uændret, dvs, pixel behandles selvstændigt og ingen gennemsnit eller subtraktion af signaler er udført. Denne procedure undertrykker effektivt langlivede udsving på tidsskalaer længere end boksen størrelse22. Efter sådanne dataanalyse, cross-korrelation lysstyrkeværdierne for alle prøver blev sammenlignet ved at samle alle celle-celle kontakt pixels i et cross-korrelation lysstyrke histogram. For APLP1 i mangel af zink-ioner (figur 6A og 6 D), en positiv gennemsnit Bcc 0.068 ± 0,004 (betyde ± SEM, n = 18 celler) blev observeret. Efter zink ion tilsætning (figur 6B og 6E), Bcc værdi steget til 0.266 ± 0.006 (betyde ± SEM, n = 19 celler). For den negative kontrol (figur 6C og 6F), en lavere gennemsnitlig tværs-korrelation lysstyrke blev fundet (Bcc = 0,022 ± 0,002, mener ± SEM, n = 26 celler). For at vurdere støkiometrisk af APLP1 komplekser på celle-celle kontakter, lysstyrken af APLP1-mEYFP var normaliseret ved hjælp af den gennemsnitlige værdi for myr-palm-mEYFP (dvs., den negative kontrol) og korrigeret for den ikke-fluorescerende proteiner23. Efter aftale med sFCCS data, var lysstyrke fordelingen centreret omkring en værdi svarende til dimerer (figur 6G), i mangel af zink-ioner, hvilket tyder på en gennemsnitlig 2:2 støkiometrisk. Efter zink ion behandling, den normaliserede lysstyrke kraftigt flyttet til større værdier, lige fra ~ 10 til ~ 60 (figur 6H), dvs., stoichiometries af på mindst 10:10 eller større, igen i god aftale med sFCCS data.

Figure 6
Figur 6 . Kors-sammenhæng antallet og lysstyrke målinger af APLP1 interaktioner på celle-celle kontakter. (A-C) Repræsentant ccN & B image rammer af celle-celle kontakter mellem APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal udtrykker HEK 293T celler uden (A) og med zink-ioner (B) eller myr-palm-mEYFP og myr-palm-mCardinal udtryk for celler som negativ Cross-korrelation kontrol (C). Skala barer er 5 µm. (D-F) Kors-sammenhæng lysstyrke (Bcc) histogrammer af alle undersøgte pixels og celler fremstillet af ccN & B analyse af celle-celle kontakter i APLP1 prøver (D), zink-behandlede APLP1 prøver () E) og prøver indeholdende myr-palm-mEYFP og myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normaliseret lysstyrke histogrammer af APLP1 prøver (G: uden zink ioner, H: med zink ioner) til den grønne kanal (mEYFP) fremstillet af lysstyrke analyse af de samme celler og ROIs bruges til beregning af Bcc. Indsatser i G viser en forstørrelse i den normaliserede lysstyrke række -2 til 10. Lysstyrkeværdierne blev korrigeret for ikke-fluorescerende mEYFP baseret på N & B målinger af myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimerer udtrykt i HEK 293T celler, målt under samme betingelser23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

For at udføre ccN & B analyse, skal en omhyggelig kalibrering af detektorerne, der udføres. For den eksperimentelle opsætning bruges i denne undersøgelse, blev behovet for sådan en kalibrering tilsyneladende når den molekylære lysstyrke blev analyseret i faste prøver (dvs. i mangel af antal svingninger). I dette tilfælde forventes den molekylære lysstyrke at være nul ifølge ligning 10, da afvigelsen bør kun stammer fra detektor støj. Men når en ROI, der indeholder kun (immobile) baggrundspixel blev analyseret (figur 7A og 7B), en positiv lysstyrke af ~0.1 cts./(MOL x dwell time) blev fastsat. En lignende værdi blev opnået udfører N & B målinger af HEK 293T celler, der udtrykker glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, figur 7C) med varierende laser beføjelser og ekstrapolering af den målte molekylære lysstyrke til nul laser power. For at korrigere for denne effekt, udført vi en systematisk kalibrering af detektor, som tidligere rapporteret (Se ligning 12)19,20. Vi derfor målt afvigelsen som en funktion af detektor count sats på en stikprøve bestående af tørrede fluorescerende farvestof opløsning og bestemmes parametre S, Equation 24 og mørke count sats forskydning. Sidstnævnte blev indhentet fra måling af intensiteten på nul laser power og var, i vores tilfælde, ubetydelig. Fra en lineær anfald af variansen versus intensitet plot, vi bestemt, efter ligning 14, en skråning af S = 1.1, og en ubetydelig udlæsning støj. De beslutsomme værdier (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) blev derefter brugt til korrekt beregne molekylære lysstyrke og nummer ifølge ligninger 12 og 1319. Alternativt, en mere empirisk korrektion ordning kan anvendes, at en superpoissonian detektor støj, dvs., ~ 10% større støj end Poissonian skudt støj, ville også forklare observation af en positiv molekylære lysstyrke i pixel uden nummer udsving. Ved hjælp af denne antagelse, kan beslutsom lysstyrken af ~0.1 cts./(MOL x dwell time) i sådanne pixels blive betragtet som en konstant lysstyrke offset og således blive fratrukket alle lysstyrken værdier beregnes med ligningen 10. Vigtigst af alt, både beskrevet metoder fører til de samme resultater ved beregning af lysstyrke nøgletal, så længe Equation 24 og forskydning er ubetydelig. Det er værd at nævne, at blandt forskellige mikroskoper af samme type (samme sælger, samme model, GaAsP detektorer i photon optælling mode) forskellige S værdier blev observeret, fremhæve nødvendigheden af en omhyggelig detektor kalibrering på hver individ setup.

En yderligere vigtig parameter påvirker detektor ydeevne i lysstyrke målinger er detektor døde tid. Som det har været tidligere vist, detektor dødtiden væsentligt kan reducere den detekterede molekylære lysstyrke, selv på mellemlang tæller satser (over 102-103 kHz)38. For at undgå denne artefakt, målinger skal enten udføres på lavere tæller satser, eller dødtiden bør kalibreres baseret på udfører N & B eller FCS i en fortyndingsrække af fx EGFP i stødpudeopløsning. Derefter, målte tæller satser kan korrigeres ved hjælp af en kalibreret dødtiden38. For opsætningen brugt i denne undersøgelse, sådan en kalibrering ved hjælp af N & B på fortyndet farvestof løsninger afsløret stabil molekylære lysstyrkeværdierne tæller satser på ~0.5 MHz og en tilsvarende dødtiden ~ 6 ns (figur 7E). Fald på højere tæller satser kan korrigeres således ved hjælp af en tidligere offentliggjorte korrektion formel38, hvilket resulterer i en konstant lysstyrkeværdi af ~ 8 kHz/MOL.

Figure 7
Figur 7 . Detektor kalibrering for antallet og lysstyrke analyse. (A) repræsentative billede fra N & B målinger af HEK 293T celler, der udtrykker GPI-mCherry. En ROI (blå stiplet rektangel) blev valgt i baggrunden. (B) Pixel lysstyrke histogram af alle pixels svarer til Investeringsafkastet vist i A. Den gennemsnitlige pixel lysstyrke, fremstillet af montering pixel lysstyrke histogrammet med en Gaussisk funktion, er ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Data blev erhvervet ved 25 µs pixel hviletid. (C) molekylære lysstyrke fra N & B analyse af GPI-mCherry udtrykt i HEK 293T celler, målt på tre forskellige laser beføjelser (6 celler, 561 nm excitation, 25 µs pixel hviletid). Data vises som betyder ± SD. En lineær regression (rød linje) giver en forskydningsværdi af 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) Plot af pixel afvigelse som funktion af pixel intensitet fra N & B målinger af tørrede opløsning af et fluorescerende farvestof (ophidset på 561 nm), samlet fra alle pixel i flere målinger i forskellige regioner af prøven. Den røde streg viser en lineær fit af data, hvilket resulterer i en skråning af 1.1, giver S faktor af detektor kalibrering. (E) molekylære lysstyrke som en funktion af detektor count sats, opnået fra N & B målinger af fortyndet fluorophore løsninger (ophidset på 488 nm). En tidligere udgivne korrektion ordningen38 blev anvendt ved hjælp af forskellige mulige værdier for detektor dødtiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentelle proceduren beskrevet her tillader undersøgelse af protein-protein trans interaktioner på celle-celle kontakter, beskæftiger fluorescens udsving spektroskopi teknikker, nemlig sFCCS og ccN & B. Disse metoder indebærer en statistisk analyse af fluorescens udsving udsendes af to spektralt adskilt FPs sammensmeltet til de(n) af interesse for en kontakt mellem to tilstødende celler, hver udtrykker én eller anden fusion protein. Tilstedeværelsen af trans komplekser er kvantificeret ved sondering graden af co diffusion af proteiner i nærliggende PMs. Ud over detaljerede protokoller på prøveforberedelse, dataopsamling og analyse indeholder denne artikel eksperimentelle bevismateriale af vellykket anvendelse af analysen om neuronal vedhæftning protein APLP1. Vi viser, at APLP1 gennemgår særlige, Homotypiske trans interaktioner på celle-celle kontakter. Yderligere, at zink-ioner fremme dannelsen af APLP1 klynger på celle-celle kontakter, der leverer en multivalent platform for trans interaktioner og dermed fremkalde øget trans bindende.

I modsætning til tidligere assays til at registrere sådanne interaktioner baseret på forstyrrende biokemiske metoder6, kan de præsenteres tilgang udføres direkte på levende celler, uden behov for fiksering eller isolation af proteinkomplekser. Derudover giver det molekylære specificitet og oplysninger ved påvisning af fluorescerende proteiner genetisk smeltet til protein af interesse, i modsætning til tidligere kvalitative assays8,9. Forskelligt fra andre fluorescens baserede tilgange såsom FRET10 og fluorescens komplementering11er der ingen krav til fluorescerende etiketterne skal være lokaliseret på den ekstracellulære side (potentielt forstyrre protein-protein interaktioner). Det har imidlertid bemærkes, at C-terminale FPs stadig kan ændre bindingen til intracellulære komponenter, fx adapter proteiner, der mægle samspillet med cytoskeleton. Især kan analysen anvendes til både homo- og Heterotypiske interaktioner.

Et par kravene til en vellykket anvendelse af præsenteres analysen er værd at nævne. Udført fluorescens udsving metoder er baseret på tidsmæssige målinger, der kræver lys og photostable monomere FPs, hvilket er en stor hindring for mange røde FPs23. Selv om ordningen præsenteres scanning er især velegnet til undersøgelse af langsom dynamikken i transmembrane proteiner, der typisk er involveret i celle-celle interaktioner, kan resterende photobleaching stadig forekomme. Derfor præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af korrektion ordninger, dvs, en blegning korrektion for sFCCS og boxcar filter til ccN & B, som minimerer sådanne forstyrrelser. Yderligere, vi diskuterer numeriske justering algoritmer, der effektivt Korriger for andre systematiske forstyrrelser, såsom lateral bevægelse af celler, og give retningslinjer for at fjerne forbigående ustabilitet. En vigtig kilde til sådanne ustabilitet er vesikulære transport, dvs, intracellulære vesikler regnskabsmæssige protein af interesse, forbigående angiver den fokale volumen. Selv om varierende fra sag til sag, kan dette fænomen generelt alvorligt forstyrre dataopsamling og analyse. Men anvendelsen af korrektion algoritmer forbedrer stabiliteten i anskaffelse, giver mulighed for udvidede måling gange der er nødvendig for at sonde især langsom diffuserende dynamikken. Det har i denne forbindelse understreges, at tilstedeværelsen af diffuserende dynamics er en vigtig forudsætning for metoden til at arbejde. Eksempel på zinkion medieret APLP1 klyngedannelse viser en drastisk eksempel på store, meget langsom proteinkomplekser (D ≈ 0,001 µm2/s) at presse teknikken til sine grænser og forhindre en nøjagtig kvantificering af den underliggende dynamik, på grund af store støj induceret af begrænset erhvervelse tid30,17.

I denne sammenhæng, de seneste fremskridt på kæmning sFCS og super-opløsning tilgange, fx scanning stimuleret emission udtynding FCS (STED-FCS), kan være gavnlig ved at give en mindre fokale volumen og dermed mindre effektiv diffusion gange39 ,40. Dette kunne også bidrage til at løse protein klynger i tilfælde af en inhomogene lokalisering af protein af interesse på celle-celle kontakter, som observeres for APLP1 i nærværelse af zink. Desværre, en cross-korrelation gennemførelse af scanning STED-FCS, dvs, STED-FCCS, som kunne blive direkte anvendt her, er ikke korrekt påvist endnu på grund af vanskeligheden ved at finde kompatible farvestoffer for to-farve STED-FCS. Ved tilstrækkelig hurtig dynamics (D ≥ ~0.05 µm2/s), sFCCS analyse gør det muligt for at kvantificere diffusion af proteiner på celle-celle kontakter eller i andre regioner af PM12.

Yderligere, en lysstyrke analyse kan udføres for alle data (sFCCS og ccN & B), at give et skøn over støkiometrisk af trans proteinkomplekser. Det bør nævnes, at nøjagtigheden af støkiometrisk kvantificering stiger med mængden af proteiner, der binder i trans (dvs., hvis der er kun få cis komplekser, der indvirker også på lysstyrke bestemmelse). Lysstyrke analyse tillader ikke løse blandinger af forskellige oligomere stater, e.g.,cis monomerer og trans tetramers. Mere generelt skal det bemærkes at N & B ikke kan løse blandinger af forskellige oligomere arter ensartet fordelt i en prøve. Hvis flere arter er til stede i en pixel, være én enkelt værdi af lysstyrke målt (dvs. et vægtet gennemsnit af lysstyrken i hver oligomere arter). Den statistiske fordeling af observerede lysstyrkeværdierne (f.eks. i forskellige pixel) er ikke direkte forbundet til de relative mængder af oligomere arter. For at løse sådanne blandinger, der skal anvendes andre metoder (fx rumlige intensitet distribution analyse (SpIDA)41, foton tælle histogram (PCH)42). På samme måde, kvantificering af den spektrale cross-korrelationen i sFCCS giver en nøjagtig kvantificering af brøkdel af bundne og ubundne proteiner kun for enkel, kendt stoichiometries, fx 1:1. For en mere kompleks støkiometrisk, yderligere skal forudsætninger gøres43. Samlet set stadig lysstyrke analyse et stærkt eksperimenterende værktøj, hvis detektor system og fraktion af ikke-fluorescerende FPs er kalibreret23 som beskrevet i protokollerne.

Selv om programmet præsenteres her er fokuseret på protein-protein interaktioner i vedhængende celler, kan analysen anvendes til en bredere vifte af prøver, fx suspension celler. For sådanne systemer, kan korrektion for laterale celle bevægelse være særligt afgørende. Derudover kan det let anvendes til model membran systemer såsom GUVs eller GPMVs, giver mulighed for kvantificering af molekylære interaktioner under velkontrollerede omstændigheder, fx forskellige lipid kompositioner eller membraner mangler en organiseret cytoskelet. Når du udfører sFCCS på sådanne vesikler, lodrette bevægelse kan forårsage yderligere signal udsving, men kan minimeres, når der fokuseres på store vesikler. I forbindelse flere kombinationer lovende, fx GUV- / GPMV-celle blanding12. Som vist i en nylig publikation, kan dannelsen af immun synapser modelleres med held af sådanne systemer44. Således vil præsenteres analysen helt sikkert være nyttige for efterforskningen af en lang række celle-celle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) give 254850309. Forfatterne takke Madlen Luckner for kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Tags

Biokemi sag 142 Protein-protein interaktioner celle-celle interaktioner celle-celle vedhæftning fluorescens udsving spektroskopi fluorescens-korrelations-spektroskopi antal og lysstyrke N & B
Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunsing, V., Chiantia, S. A… More

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter