Biochemistry

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582

¹Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Abstract

Uma variedade de processos biológicos envolve interações célula-célula, normalmente mediadas por proteínas que interagem na interface entre células vizinhas. De interesse, apenas alguns ensaios são capazes de sondagem especificamente tais interações diretamente em células vivas. Aqui, apresentamos um ensaio para medir a ligação de proteínas expressado nas superfícies das células vizinhas, em contatos do celular. Este ensaio consiste em duas etapas: mistura de celulas que expressam as proteínas de interesse fundido a diferentes proteínas fluorescentes, seguido por medições de espectroscopia de flutuação de fluorescência em contatos de celular usando um laser confocal microscópio. Podemos demonstrar a viabilidade deste teste em um contexto biologicamente relevante medindo as interações da proteína amiloide precursora, como 1 (APLP1) através de junções célula-célula. Nós fornecemos protocolos detalhados sobre a aquisição de dados usando técnicas baseadas em fluorescência (varredura de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência, número de correlação cruzada e análise de brilho) e as calibrações de instrumentos necessários. Além disso, discutimos os passos críticos na análise dos dados e como identificar e corrigir as variações de sinal externo, espúrios, tais como as causadas por movimento fotobranqueamento ou célula.

Em geral, o ensaio apresentado é aplicável a qualquer homo - ou interação da proteína-proteína heterotypic em contatos de celular, entre as células dos tipos iguais ou diferentes e pode ser implementado em um comercial laser confocal microscópio. Um requisito importante é a estabilidade do sistema, que deve ser suficiente para sondar difusiva dinâmica das proteínas de interesse ao longo de vários minutos.

Introduction

Muitos processos biológicos ocorrem aos sítios de interações célula-célula, por exemplo, célula-célula adesão¹^,²^,³, celular fusão⁴ e reconhecimento celular⁵. Tais eventos são particularmente importantes durante o desenvolvimento de organismos multicelulares e para a comunicação célula-célula, por exemplo, durante as respostas imunes. Esses processos são normalmente mediados por proteínas que são localizadas na superfície, ou seja, na membrana plasmática (PM) de vizinhos células e passam por interações específicas no contato célula-célula que são precisamente regulamentados no espaço e no tempo. Em muitos casos, essas interações são homo direto - ou heterotypic-interações da proteína proteína trans , mas também podem envolver íons ou ligantes atuando como extracelular linkers¹. Apesar de fundamental importância, há uma falta de ensaios de sondagem essas interações proteína-proteína específica diretamente no ambiente nativo de células vivas. Muitos métodos exigem também o rompimento da pilha (por exemplo, ensaios bioquímicos como co-imunoprecipitação⁶), fixação (por exemplo, algumas das técnicas de microscopia óptica de super-resolução e microscopia eletrônica de célula-célula entra em contato com⁷), ou são não-específicos, por exemplo, agregação /⁸^,⁹ensaios de aderência. Para superar esse problema, técnicas de fluorescência foram implementadas com base na ressonância de fluorescência a energia transferência (FRET)¹⁰ ou fluorescência complementação¹¹. No entanto, para atingir suficientemente pequenas distâncias entre fluorophores, esses métodos exigem etiquetas fluorescentes no lado extracelular das proteínas¹⁰, potencialmente interferir com interações trans .

Aqui, apresentamos um ensaio alternativo baseado em fluorescência para interações da proteína-proteína em contatos do celular. Esta abordagem combina abordagens de correlação cruzada de fluorescência (espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência digitalização (sFCCS), número de correlação cruzada e brilho (ccN & B)) e a mistura de células expressando um construto de fusão da proteína de interesse, por exemplo, um receptor de adesão. Os receptores investigados nas duas células interagindo são rotulados com duas proteínas fluorescentes espectralmente separadas (FPs), do intracelular lateral (veja figura 1A).

Os métodos empregados são baseados na análise estatística das flutuações da fluorescência induzida pelo movimento difusiva de proteínas fluorescentes fusão através do volume focal de um laser confocal microscópio. Mais detalhadamente, o ensaio de sondas a difusão co das proteínas de interesse em ambos os PMs vizinhas em contatos do celular. Se as proteínas sofrem interações trans , estes complexos trans vão levar proteínas fluorescentes emitem em ambos os canais espectrais, causando a fluorescência correlacionados flutuações de ambos os emissores. Por outro lado, se nenhuma ligação ocorre, as flutuações números de proteínas para enfrentar a TPM será independentes, causando flutuações não correlacionadas. A aquisição pode ser realizada de duas maneiras: 1) sFCCS é baseado em uma varredura em forma de linha através do contato célula-célula e sondas efetivamente as interações em um ponto localizado na região de contato. Através de uma análise temporal das flutuações de fluorescência, sFCCS fornece também informação dinâmica, ou seja, os coeficientes de difusão de complexos de proteínas; 2) ccN & B baseia-se numa análise pixel-wise de uma sequência de imagens adquiridas nas regiões de contato célula-célula. Tem a capacidade de sondar e interações do mapa ao longo de toda a região (em um plano focal) entre em contato com, mas não fornece informações sobre a dinâmica. Ambos os métodos podem ser combinados com uma análise do brilho molecular, ou seja, o sinal de média fluorescência emitida na unidade de tempo por simples difusão complexos de proteínas e, assim, proporcionar estimativas a estequiometria de complexos de proteínas no contatos do celular.

Neste artigo, nós fornecemos protocolos detalhados para preparação de amostras, calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise realizar o ensaio apresentado em um comercial laser confocal microscópio. As experiências podem ser executadas em qualquer instrumento equipado com contagem de fótons ou detectores analógicos e um objectivo com abertura numérica elevada. Mais discutimos os passos críticos do protocolo e fornecem esquemas de correção para vários processos, causando flutuações artefactual sinal, por exemplo, de detector de ruído, movimento fotobranqueamento ou célula. Originalmente desenvolvida para sonda interações entre as células aderentes, o ensaio pode ser modificado para células de suspensão, ou adaptados para sistemas de membrana modelo, por exemplo, vesículas de gigante unilamellar (GUVs) ou plasma gigante vesículas de membrana (GPMVs), permitindo que o quantificação de interações em ambientes diferentes lipídios ou, na falta de um citoesqueleto organizado¹²^,¹³.

Espectroscopia de fluorescência correlação cruzada de digitalização é uma versão modificada da fluorescência espectroscopia de correlação cruzada¹⁴ e foi projetado especificamente para sondar a dinâmica difusiva lenta em lipídios membranas¹⁵. É baseado na aquisição de digitalizar linha perpendicular ao PM contendo as proteínas fluorescentes de interesse. Para sondar as interações de duas espécies de proteína rotulada de forma diferente, a aquisição é realizada em dois canais espectrais usando duas linhas de laser e duas janelas de deteção para fluorophores espectralmente separados. Devido a dinâmica de difusão lenta de proteínas no PM (D≤ ~ 1 µm²/s), uma cruz-conversa livre de medição pode ser realizada alternando-se o esquema de excitação de linha a linha¹⁵. A análise começa com: 1) é um algoritmo de alinhamento corrigindo para o movimento lateral da célula com base na block-wise uma média de ~ 1000 linhas, 2) determinação da posição com fluorescência máximo sinalou seja, a PM posição, em cada bloco e 3) deslocando de todos os blocos para uma comum origem¹²^,¹⁵, separadamente em cada canal. Em seguida, uma seleção automática de pixels correspondentes ao PM é executada selecionando a região central de um ajuste Gaussian da soma de todas as linhas alinhadas (i.e., centro ± 2.5σ). Integração do sinal em cada linha produz a série de tempo de fluorescência do membrana f (t) em cada canal (g = green channel, r = canal vermelho). Nota que o tamanho do pixel deve ser pequeno o suficiente, por exemplo, < 200 nm, para reconstruir a forma do ponto de espalhar a função e encontrar o seu centro, correspondente à posição da PM. Na presença de fotobranqueamento substancial, a série de tempo de fluorescência em cada canal pode ser modelada com uma função dupla-exponencial e então corrigida com a seguinte fórmula:¹⁶

Equation 1 . (1)

É importante notar que esta fórmula efetivamente corrige o amplitudes e tempos de difusão resultantes da análise de correlação de f (t)^c, em comparação com as estimativas do parâmetro que seria obtidas da não corrigida f (t). Então, as funções de autoe correlação cruzada (ACFs / CCFs) da fluorescência, calculam-se os sinais:

Equation 2 , (2).

Equation 3 , (3).

onde δF_eu = F_eu(t) - F_eu(t) e eu = g, r.

Um modelo de difusão bidimensional então é equipado para todas as funções de correlação (CFs):

Equation 4 . (4)

Aqui, N denota o número de proteínas fluorescentes no volume de observação e τ_d o tempo de difusão para cada canal. Este modelo leva em conta que no cenário experimental descrito, difusão de proteínas no PM ocorre no plano x-z, em contraste com a configuração comumente usada de correlação de fluorescência espectroscopia (FCS) experiências com membranas de sondagem difusão no plano x-y do confocal volume¹⁷. A cintura w₀ e o fator de estrutura S, descrevendo o alongamento w_z do volume focal em z, S = wz/w₀, são obtidos a partir de uma medição de calibração de ponto FCS realizada com corantes espectralmente similares e mesmas configurações ópticas usando valores já está disponíveis para o coeficiente de difusão D_tintura:

Equation 5 , (5).

onde τ_{d, a tintura} é o tempo medido difusão média das moléculas do corante, obtidos a partir da montagem de um modelo para difusão tridimensional para os dados, tendo em transições de conta de uma fração T de todas as moléculas de N para um Estado de trio com uma constante de tempo τ_τ:

Equation 6 . (6)

Finalmente, coeficientes de difusão (D), valores de brilho molecular (ε) e a correlação cruzada relativa dos dados de sFCCS (rel.cc.) são calculados como segue:

Equation 7 , (7).

Equation 8 , (8).

Equation 9 , (9).

onde G_Cruz(0) é a amplitude da função de correlação cruzada e Equation 14 é a amplitude da função de autocorrelação no canal eu-th.

Esta definição da relativa correlação cruzada, ou seja, usando o máximo em vez de dizer na equação 9, leva em conta que o número máximo de complexos de duas espécies de proteínas presentes em diferentes concentrações é limitado pelo espécies presentes em um número menor.

Brilho e número de correlação cruzada é baseado em uma análise do momento da intensidade da fluorescência para cada pixel de uma pilha de imagem adquirida ao longo do tempo em uma posição fixa na amostra, geralmente constituídos por ~ 100-200 quadros, com espectral dois canais ( g = verde canal, r = canal vermelho). Da média temporal eu_eu e a variância Equation 16 , o brilho molecular ε_i e número n são calculados em cada pixel e canal espectral (eu = g, r)¹⁸:

Equation 10 , (10).

Equation 11 . (11)

É importante notar que as equações determinadas se aplicam para o caso ideal de um verdadeiro detector de contagem de fótons. Para sistemas de detecção analógica, as equações seguintes aplicam-se a¹⁹^,²⁰:

Equation 12 , (12).

Equation 13 . (13)

Aqui, S é o fator de conversão entre fótons detectados e as contagens de Digitas gravadas, Equation 24 é o ruído de leitura e deslocamento refere-se ao deslocamento de intensidade do detector. Geralmente, essas quantidades devem ser calibradas, para qualquer tipo de detector, com base na variação do detector de medição em função da intensidade de iluminação constante¹⁹, por exemplo, uma superfície reflexiva de metal ou solução corante seco. O deslocamento pode ser determinada medindo-se a taxa de contagem para uma amostra sem luz de excitação. Realizando-se uma regressão linear da variância associada detector Equation 25 contra o enredo de intensidade (eu), S e Equation 24 pode ser determinado¹⁹:

Equation 14 . (14)

Finalmente, o brilho de correlação cruzada é calculado em cada pixel e é definido em geral como²¹

Equation 15 , (15).

onde Equation 29 é a Cruz-variância Equation 30 .

Para filtrar as flutuações long-lived, todos ccN & cálculos B são executados seguindo um vagão de filtragem, de forma independente para cada pixel de²². Brevemente, n_i, ε_eu (eu = g, r) e B_cc são calculados em deslizamento segmentos de , por exemplo, 8-15 frames. Assim obtidos podem ser então a média dos valores para obter o último pixel valores número e brilho.

Análise de estequiometria
A fim de estimar a estequiometria de complexos de proteínas em contatos do celular, o brilho molecular pode ser analisado separadamente em cada canal espectral para o sFCCS ou ccN & B dados. No sFCCS, um valor de brilho é obtido por medição em cada canal. Em ccN & B, um histograma de brilho de todos os pixels correspondentes para o contato célula-célula é obtido e o valor médio (ou mediano) pode ser usado como brilho representativo para a medição. Realizando a mesma análise em uma referência monomérica, todos os valores de brilho podem ser normalizados para obter diretamente o estado oligoméricos médio dos complexos proteína detectada. Neste ponto, é importante corrigir a presença de FPs não-fluorescente, que pode resultar em uma subestimação do estado oligoméricas. Isto normalmente é realizado medindo-se o brilho de uma proteína dimérica homo referência do²³^,²⁴ usando uma cor sFCS ou número e brilho (N & B).

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Protocol

1. amostra preparação: Celular ensaio de mistura

Nota: O seguinte protocolo descreve o procedimento de misturando de células aderentes. Pode ser modificado para células cultivadas em suspensão.

Sementes de um número adequado de células em uma placa de 6, por exemplo, 800.000 células HEK 293T (contadas com uma contagem câmara de Neubauer), um dia antes do transfection. O número pode ser modificado dependendo do tempo entre a semeadura e transfecção e ajustado para outros tipos de células. Para executar um experimento básico (ou seja, as proteínas de interesse e controle negativo), prepare pelo menos 4 poços. Células de cultura a 37 ° C, 5% CO₂ médio de Dulbecco e modificado águia médio (DMEM), suplementado com soro fetal bovino (10%) e L-glutamina (1%).
Transfect células de acordo com as instruções do fabricante (ver a Tabela de materiais).
1. Para executar um experimento básico, transfect, em separado wells, plasmídeos da proteína de interesse fundido a um 'verde' (por exemplo, monomérica avançada proteína verde fluorescente (mEGFP), ou proteína fluorescente amarela (mEYFP)) ou 'vermelho' (por exemplo, mCherry, ou mCardinal) proteína fluorescente.
  Nota: No presente protocolo, focamos em APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal¹²e o correspondente controlo negativo, por exemplo, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) e - mCardinal (myr-palm-mCardinal)¹². Geralmente, 200 ng - 1 µ g de DNA de plasmídeo são suficientes. Eficiência de transfeccao alta aumenta a chance de encontrar células 'vermelhas' e 'verdes' em contato. Modifica a quantidade de reagente do plasmídeo e do transfection para otimizar a eficiência do transfection. Crítica: Confluência de célula deve ser ao redor 70% quando transfecting as células. Se as células são excesso confluente, irá diminuir a eficiência do transfection. Se as células não são suficientemente confluentes, transfection e mistura podem induzir stress e prevenir muitas células de fixação adequada após a mistura.
Execute célula mistura ± ~4 2 h depois do transfection.
1. Retire o meio de crescimento e lave cada um bem delicadamente com 1 mL de PBS suplementado com Mg^{2 +} e Ca^{2 +}. Em seguida, remova a PBS. (Crítica) Largue o PBS na borda bem para evitar o desprendimento de células durante a lavagem.
2. Adicione ~ 50 µ l do trypsin ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) solução de ácido drop-wise a cada poço a fim de facilitar o desprendimento de células. Incubar a 37 ° C por 2 min. depois, lentamente, agitar a placa de 6 lateralmente para desprender as células.
  Nota: Tempos de incubação prolongado podem ser necessários para alguns tipos de células.
3. Adicione 950 µ l do meio de crescimento a cada poço e ressuspender as células pipetando algumas vezes e para baixo, destacando, assim, todas as células do fundo bem. (Crítica) Certifique-se que as células são resuspended corretamente e desanexadas do outro, verificando visualmente a ausência de agregados de células grandes após ressuspensão. Caso contrário 'vermelhos' contatos 'verdes'-'vermelhos' ou 'verdes' - serão obtidos após a mistura.
4. Transferir a solução de célula de um poço (proteína de interesse ou controlo negativo) para a correspondente, ou seja, 'vermelho' (por exemplo, APLP1-mCardinal transfectada) 'verde' (por exemplo, APLP1-mEYFP transfectada) células. Misture pipetando suavemente várias vezes para cima e para baixo. Então, semente as células mistas em pratos de fundo de vidro 35mm (1 mL da solução de mistura de células por prato), além de 1 mL de meio de crescimento e cultura semeado células para outro dia a 37 ° C, 5% de CO₂.

Figura 1 . Fluxo de trabalho experimental e representação esquemática de varredura de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência e análise de correlação cruzada número e brilho em contatos celular. (A) esquema de preparação da amostra: duas populações de células transfectadas com a proteína de interesse (por exemplo, APLP1) fundida a duas proteínas fluorescentes espectralmente distintas (por exemplo, mEYFP e mCardinal) são misturadas depois do transfection. Contatos de células transfectadas diferente são selecionados nas experiências de microscopia. Para evitar interferência com domínios de ligação extracelular, a proteína fluorescente deve ser fundida ao terminus intracelular da proteína de interesse. (B) medições de digitalização FCCS (sFCCS) são realizada perpendicular ao contato célula-célula em dois canais espectrais (canal 1, verde e canal 2, vermelho). Linhas de varredura (representadas como kymographs) são alinhadas e pixels de membrana somados. Em seguida, ACFs e CCFs são calculados a partir de vestígios de intensidade F_eu(t). ACFs são representados em vermelho e verde. CCF é representado em azul. (C) correlação cruzada N & B (ccN & B) aquisição resulta em uma pilha de imagem tridimensional (x-y-tempo). Um ROI é selecionado em torno do contato célula-célula. Em seguida, brilho de canal e correlação cruzada (ε₁, ε₂e B_cc) os valores são calculados em cada pixel de contato célula-célula. Em seguida, os resultados são visualizados como histogramas, reunindo todos os pixels selecionados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. amostra preparação: Controle positivo para experimentos de correlação cruzada e Homo-dímero construção para análise de brilho

Sementes de 600.000 células HEK 293T, contadas com uma célula contando a câmara, em pratos de fundo de vidro 35mm um dia antes do transfection. Cultura de células a 37 ° C, 5% de CO₂ em meio DMEM completo (consulte a etapa 1.1) para outro dia.
Transfect células com ~ 250 ng de DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Para o controlo positivo de correlação cruzada, use um plasmídeo codificação de um proteína fluorescente ancorado a membrana hétero-dímero, por exemplo, myr-palm-mCherry-mEGFP ou myr-palm-mCardinal-mEYFP¹² correspondente para o FPs da proteína de interesse. Para a calibração de brilho, use plasmídeos codificação uma membrana-ancorado monômero FP e homo-dímero correspondente para o FPs fundido à proteína de interesse, por exemplo, myr-palma-mEYFP e myr-palm-mEYFP-mEYFP para calibrar a análise de brilho da APLP1-mEYFP¹².
Cultura de células, a 37 ° C, 5% de CO₂ em meio DMEM completo (consulte a etapa 1.1) para outro dia.

3. confocal Laser microscopia de varredura: Configuração e calibração de Volume Focal

Nota: O seguinte protocolo escrito para experimentos realizados com mEGFP/mEYFP e mCherry/mCardinal do laser confocal microscópio utilizado neste estudo. A configuração óptica, as configurações de software (linhas de laser, espelhos dicroicos, filtros) e escolha de corantes de calibração podem ser modificados para outras configurações de FPs e microscópio.

Ligue o microscópio e lasers pelo menos uma hora antes do experimento para garantir a estabilidade do laser e o equilíbrio da temperatura.
Prepare 100-200 µ l de soluções tintura fluorescente hidrossolúvel apropriado (consulte a Tabela de materiais para obter exemplos) na água ou PBS para calibrar o volume focal, com concentrações na faixa de 10-50 nM.
Coloque as soluções do corante em um vidro limpo 35-mm inferior prato #1.5, ou seja, com uma espessura de 0,16 0,19 mm.
Nota: Idealmente, use pratos com vidro de tampa de alto desempenho com uma tolerância de baixa espessura, por exemplo, 0,170 ± 0,005 mm, permitindo uma correção do anel de colarinho ideal (passo 3.6). É importante usar o mesmo tipo de prato como usado mais tarde para os experimentos seguintes.
Coloque o prato que contém a solução de tintura diretamente sobre o objetivo (de preferência, imersão de água, com at 1.2) para garantir foco na solução. Como alternativa, coloque o prato no porta-amostras e foco para a amostra (por exemplo, 10-20 µm acima do fundo do prato).
Nota: Não recomendamos utilizar objectivos de óleo devido o pobre sinal obtido quando o foco profundo em amostras aquosas.
Configurar o caminho da excitação e emissão, por exemplo, escolher o 488 nm do laser, espelho dicroico 561/488 nm, deteção janela 499-552 nm e um tamanho de furo de 1 unidade arejado (AU). Certifique-se que o tamanho do furo de pino é o mesmo que aquele que será usado em medições de correlação cruzada.
Ajuste a posição do furo de pino (ajuste de pinhole) e o anel de coleira objetiva maximizar taxa de contagem. Para esse fim, rode o anel de coleira até taxa de contagem máxima é detectada.
Nota: A correção do anel colar representa a espessura específica do vidro tampa usado. Maximizar a taxa de contagem, i. e., coletando como muitos fótons por molécula quanto possível, é crucial para maximizar a relação sinal-ruído (SNR) das medições.
Realizar uma série de medições ponto FCS (por exemplo, 6 medições em locais diferentes, cada um composto por 15 repetições de 10 s, ou seja, 2,5 min tempo total, amostradas com tempo de interrupção de 1 µs ou menos) para a mesma potência do laser usado em correlação cruzada medições (tipicamente ~ 1%, ou seja, ~ 1-2 µW).
Ajuste um modelo tridimensional de difusão incluindo uma contribuição triplet (equação 6) para os dados.
Nota: Normalmente, os tempos de difusão obtidos são cerca de 30 µs e o fator de estrutura é em torno de 4-8.
Calcular a cintura w₀ do tempo de difusão média medido e publicado os valores para o coeficiente de difusão do corante usado em temperatura ambiente²⁵ de acordo com a equação 5. Valores típicos são 200-250 nm.
Repita a rotina de calibração (etapas 3.4-3,9) com uma tintura fluorescente diferente para um segundo canal de deteção, se necessário (por exemplo, 561-nm excitação e deteção entre 570 nm e 695 nm). Manter a posição de pinhole e tamanho como foi definido para o primeiro canal de deteção.
Calcular o brilho molecular (equação 8) das medidas de calibração e armazenar os valores obtidos.
Nota: Valores típicos para a configuração usado são ~8-10 kHz/molécula (MOL) para 1,8 potência de excitação nm 488 µW. Mais baixo do que o habituais valores podem indicar a sujeira sobre o objectivo, desalinhamento de configuração ou uma saída reduzida do laser. Verifique e armazenar poderes de saída do laser no objetivo regularmente usando um medidor de energia. Para comparação de configurações diferentes, brilho molecular normalizado pelo poder da excitação do laser é o parâmetro mais importante para avaliar o desempenho do microscópio.

4. espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência de digitalização: aquisição

Nota: O seguinte protocolo escrito para experimentos realizados com mEGFP/mEYFP ('verde') e mCherry/mCardinal ('vermelho') sobre o microscópio confocal digitalização laser utilizado neste estudo. A configuração óptica e os ajustes do software (linhas de laser, espelhos dicroicos, filtros) podem ser diferentes para outras configurações de FPs ou microscópio.

Configurar o caminho óptico, por exemplo, 488 nm e 561 excitação nm e um espelho dicroico nm 488/561, pinhole em 1 AU para 488 excitação nm. Para evitar conversas cruzadas-espectral, selecione duas faixas separadas para excitar e detectar mEGFP/mEYFP (488 nm de excitação, canal verde) e mCherry / mCardinal (561 nm de excitação, canal vermelho) sequencialmente e selecione interruptor controla cada linha. Para a deteção, use filtros adequados para ambos os canais, por exemplo, 499-552 nm no canal verde e 695-570 nm no canal vermelho.
Se excitação alternada não for possível, use as configurações de filtro apropriado para o canal vermelho para minimizar espectral-conversas cruzadas (ou seja, detectar a fluorescência de mCherry/mCardinal não abaixo de 600 nm). Isto pode reduzir a quantidade de fótons detectado no canal vermelho e assim reduzir o SNR.
Coloque o prato que contém as células mistas no porta-amostra. Espere pelo menos 10 min para garantir equilíbrio de temperatura e reduzir o desvio de foco.
Concentre-se nas células usando a transmissão de luz no menu Localizar .
Busca por um par de um 'vermelho' e uma 'verde' célula em contato com os outros. Para o Cruz-correlação positiva ou homo-dímero controle de brilho (ver secção 2), uma busca por uma célula isolada emitindo fluorescência em ambos os canais ou o sinal de homo-dímero respectivos para a PM.
Nota: (Crítica) minimizar amostra exposição enquanto busca de células evitar pre-branqueamento, que pode reduzir a correlação cruzada de²⁶. Portanto, digitalizar na mais rápida velocidade de digitalização e poderes do laser de baixa. Para evitar a saturação do detector enquanto imagem latente expressando fortemente as células, busca no modo de integração. No entanto, para minimizar a exposição, digitalização em baixas potências do laser é possível no modo de contagem de fótons .
Selecione uma perpendicular de caminho de varredura para contato célula-célula (ou PM de uma única célula para o controle de brilho de correlação cruzada ou homo-dímero positivo) usando o botão recortar conforme ilustrado nas Figuras 1B e 2A.
Nota: Alguns microscópios mais antigos não permitem digitalizar arbitrário direções. Neste caso, contatos do celular com uma orientação perpendicular à direção de varredura tem que ser localizado.
Zoom para atingir um tamanho de pixel de 50-200 nm e selecione linha no Modo de varredura. Definir o tamanho do quadro para 128 × 1 pixels.
Nota: O tamanho do pixel típico é 160 nm, correspondente a um comprimento de varredura de cerca de 20 µm.
Defina velocidade de digitalização para o valor máximo permitido, por exemplo, 472,73 µs por linha.
Nota: Para um regime alternativo de excitação, isto corresponde a 954,45 µs tempo de verificação, ou seja, ~ 1000 varreduras/s na configuração do usado. A velocidade de varredura pode ser ajustada dependendo do coeficiente de difusão da proteína de interesse. Para proteínas de membrana-ancorado, tempos típicos de difusão são em torno de 10-20 ms. O tempo de verificação deve ser pelo menos dez vezes menor do que os tempos de difusão. Baixas velocidades de varredura podem induzir fotobranqueamento mais forte e exigem mais baixo poder de iluminação. Alternativamente, um pode impor uma pausa, por exemplo, 5 ms, entre cada verificação para complexos de difusão muito lentamente usando intervalo no submenu de Séries temporais .
Escolha o poderes do laser adequado, por exemplo, ~ 1-2 µW para 488 nm e ~ 5-10 µW para a excitação de nm 561.
Nota: Maiores potências do laser melhorar SNR, mas aumentam fotobranqueamento. Por conseguinte, poderes do laser devem ser escolhidas fotobranqueamento é inferior a 50% da taxa inicial de contagem.
Conjunto de ciclos para 100.000-500, 000.
Nota: O número de exames, ou seja, a duração da medição, podem variar: tempos de medição mais melhorarão SNR e podem ser mais adequados para difundir lentamente moléculas, no entanto, o movimento das células e fotobranqueamento limitar a medida máxima está na hora. Os dados apresentados aqui foram rotineiramente adquiridos para ~ 3-6 min, ou seja, a linha de 200.000-400.000 varreduras.
Conjunto de detectores para modo de contagem de fótons . Pressione Iniciar o experimento para iniciar a aquisição. Repita os passos 4,5-4.11 para medir outra célula.
Nota: Recomenda-se medir de 10-15 células por amostra em níveis diferentes de expressão. (Crítica) Evite a saturação do detector em níveis de alta expressão. A taxa de contagem máxima não deve exceder ~ 1 MHz.
Se a análise de brilho é executada para determinar os Estados oligoméricos, realizar medições de calibração de brilho de homo-dímero de acordo com passos modificados 4.1-4.11: medir cada proteína fluorescente homo-dímero separadamente (em células isoladas, preparada com protocolo, seção 2) e realizar medições apenas em um canal espectral.

5. espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência digitalização: Análise de dados

Nota: O seguinte protocolo segue uma implementação do procedimento de análise descrito detalhadamente em anteriores artigos¹²^,¹⁵. O código do software está disponível mediante solicitação aos autores.

Exporte os arquivos de dados brutos (por exemplo, CZI) para uma imagem TIFF RGB no formato de dados brutos. Este arquivo irá conter um kymograph com o verde e dados de canal vermelho, no canal denominado G e R da imagem, respectivamente.
Importar o arquivo TIFF com o software de análise adequada e proceder para realizar a análise.
Nota: Os seguintes passos (5.3-5,7) são aplicados separadamente para cada canal:
Alinhe as linhas, realizando uma média de tempo de segment-wise ou em movimento com blocos de linhas 500-1000. Determine a posição de membrana, ou seja, a posição do pixel com a taxa máxima de contagem, em cada bloco. Deslocar todos os blocos para a mesma posição lateral. Este procedimento corrige para deslocamento lateral do contato célula-célula, por exemplo, devido ao movimento da célula.
Resumir todas as linhas alinhadas ao longo do eixo do tempo e se encaixa no perfil de intensidade média, usando uma função gaussiana. Na presença de fundo intracelular significativo, use um Gaussian mais uma função sigmoide. Defina os pixels correspondentes à membrana como todos os pixels dentro de ±2.5σ da posição de membrana e resumir a intensidade desses pixels em cada linha, obtendo um valor de sinal de fluorescência único para cada ponto de tempo (ou seja, para cada verificação de linha).
Se necessário (por exemplo, plano de fundo > 10% do sinal da membrana), aplicar uma correção de fundo, subtraindo-se a intensidade do pixel média no citoplasma multiplicado pelo 2.5σ (em unidades de pixel) de fluorescência da membrana, em blocos de 1000 linhas. Evite vesículas intracelulares brilhantes quando a seleção de pixels do fundo.
Se for observado fotobranqueamento, aplica uma correção de branqueamento. Portanto, cabe a série de tempo de fluorescência de membrana com uma função dupla-exponencial e aplicar a correção adequada fórmula, equação 1¹⁶.
Nota: Como alternativa, Fourier espectro com base em esquemas de correção podem ser aplicada²⁷. (Crítica) Se fotobranqueamento está presente mas não corrigido para, o CFs podem ser severamente distorcidos e as estimativas do parâmetro podem ser fortemente tendencioso (por exemplo, veja a Figura 5E).
Calcule o ACFs e CCFs de acordo com as equações 2 e 3 usando, por exemplo, um algoritmo de múltiplo-tau²⁸. Para melhorar a confiabilidade da análise e evitar artefatos, executar os cálculos para 10-20 segmentos iguais da medição total. Inspecione as séries temporais de fluorescência e CFs em cada segmento e remover segmentos claramente distorcidos (ver exemplos na Figura 4A- 4D). Média de todos os segmentos sem distorção.
Nota: Este procedimento pode ser automatizado para evitar um viés subjetivo para os dados de²⁹. Para medições muito instáveis, ter muitos segmentos curtos pode ser útil. No entanto, o comprimento de um segmento ainda deve estar a pelo menos três ordens de magnitude acima o tempo de difusão para evitar estatística undersampling erros²⁹^,³⁰^,¹⁷.
Ajuste um modelo de difusão bidimensional, equação 4, para o CFs obtidos. Portanto, corrigi o fator de estrutura para o valor obtido na medição da calibração (protocolo seção 3). A precisão do ajuste pode ser melhorada através da realização de um ajuste ponderado usando os pesos estatísticos de cada ponto de dados obtidos de algoritmo múltiplo de tau.
Calcule o coeficiente de difusão usando a cintura calibrada de acordo com a equação 7.
Calcule o brilho molecular, dividindo-se a intensidade de fluorescência média em cada canal pelo correspondente número de partículas, a equação 8. Normalize o valor determinado brilho em cada canal pelo brilho médio da referência monomérico correspondente para obter o estado oligoméricos, tendo em conta não-fluorescente FPs²³. Para este objectivo, determine os valores de brilho médio homo-dímero da análise de uma cor para calcular a fração de não-fluorescente FPs²³.
Calcule a correlação cruzada relativa de acordo com a equação 9.

6. correlação cruzada número e brilho: calibração do Detector

Nota: O seguinte protocolo fornece uma orientação geral sobre como calibrar o sistema de detecção. Este procedimento é obrigatório para os sistemas de deteção analógico, mas não é estritamente necessário quando são utilizados detectores de contagem de fótons verdadeiro.

Soluções de corante hidrossolúvel apropriado (consulte a Tabela de materiais para obter exemplos) em um prato fundo de vidro 35mm a seco. Definir o caminho óptico em conformidade, ou seja, 488 ou 561 nm excitação e deteção em 499-552 nm ou 695-570 nm, respectivamente.
Nota: Como alternativa, uma superfície reflexiva de metal pode ser usada em vez de soluções do corante seco colocando a peça de metal diretamente sobre o objetivo.
Realize medições de N & B de uma cor em regiões com concentrações diferentes de tintura ou poderes diferentes do laser. Portanto, use o Zoom para atingir um tamanho de pixel de 300 nm, velocidade de digitalização para definir o tempo de permanência de pixel apropriado, por exemplo, 25 µs e definir ciclos de 100-200 quadros.
Detectores para contagem de fótons (ou modo analógico se as medições são realizadas com deteção analógica) e pressionar o Experimento iniciar para iniciar a aquisição. Realize a medição no zero energia de excitação para determinar o deslocamento de intensidade.
Plotagem de variância pixel em função da intensidade de pixel para todos os pixels medidos e realizar um ajuste linear destes dados. Determinar S como a inclinação do ajuste linear. Calcule o ruído de leitura da intercepção de y, usando o S e o deslocamento de intensidade determinada de acordo com a equação 14.

7. correlação cruzada número e brilho: aquisição

Siga os passos 4,1-4,4 do protocolo de aquisição de sFCCS.
Use o Crop para selecionar um quadro de 512 × 128 pixels, ao redor de um contato célula-célula (ou PM isolado para controle de brilho de homo-dímero) e Zoom para atingir um tamanho de pixel de 50-100 nm.
Use a velocidade de digitalização para definir o tempo de permanência de pixel apropriado, por exemplo, 6,3 µs.
Nota: Em N & B, o tempo de permanência do pixel deve ser muito menor do que o tempo de difusão da proteína de interesse. Se for escolhido um regime alternativo de excitação, por exemplo, alternar faixas cada linha, o tempo entre as duas faixas deve ser menor do que o tempo de difusão da proteína de interesse. Caso contrário, a correlação cruzada detectável é reduzida.
Definir ciclos de 100-200 quadros.
Nota: Um número maior de quadro irá melhorar o SNR, no entanto, o movimento celular pode limitar o tempo de medição total. O tempo de verificação por quadro deveria ser muito maior do que o tempo de difusão da proteína de interesse. Caso contrário, o brilho aparente é reduzido, ou seja, as partículas parecem estar imóvel. Para complexos de difusão muito lentamente, impor uma pausa, por exemplo, 2 s, entre quadros usando o intervalo no submenu de Séries temporais .
Conjunto de poderes do laser com valores apropriados (valores típicos são ~ 1-2 µW para 488 nm e ~ 5-10 µW para 561 excitação nm).
Nota: Maior potência do laser leva à maior brilho e SNR melhorada, mas também fotobranqueamento reforçado. Poderes do laser devem ser altas o suficiente para alcançar um brilho detectado pelo menos ~ 1 kHz/MOL, mas mantido baixo o suficiente para evitar mais do que 10-20% fotobranqueamento. Para fotobranqueamento mEGFP/mEYFP ou mCherry/mCardinal, a menos de 10% são normalmente obtidos.
Como detectores de fóton contando (ou modo analógico se as medições são realizadas com deteção analógica). Pressione Iniciar o experimento para iniciar a aquisição.
Avalie a taxa de contagem de fótons. Se taxas de contagem em pixels contato célula-célula excederem 1 MHz, reduza a potência do laser ou selecione células com menores níveis de expressão. Repita as etapas de 7,2-7,7. para medir o próximo par de células. Recomenda-se medir de 10-15 células por experiência em níveis diferentes de expressão.
Se a análise de brilho é realizada para quantificar oligomerização, realizar medições de calibração de brilho de homo-dímero de acordo com passos modificados 7.1-7.7: medir cada proteína fluorescente homo-dímero separadamente (em células isoladas, preparada com protocolo, seção 2) e realizar medições apenas em um canal espectral.

8. correlação cruzada número e brilho: análise de dados

Nota: O seguinte protocolo segue um procedimento de análise descritas anteriormente¹²^,³¹. O código do software está disponível a partir dos autores mediante pedido.

Importar os dados crus (por exemplo, arquivos de CZI podem ser importados usando o pacote de³² Bioformats). Média de todos os quadros e selecione uma região de interesse (ROI) em torno do contato célula-célula.
Execute uma imagem alinhamento algoritmo³³, por exemplo, maximizando a correlação espacial entre ROIs em quadros subsequentes para traduções laterais arbitrários, em média, ambos os canais. Este procedimento irá corrigir para o movimento lateral das células.
Aplica um filtro de boxcar²² para reduzir flutuações long-lived estranhas, provenientes, por exemplo, movimento de célula residual ou fundo de clareamento. Alternativamente, pode ser aplicado um método detrending para corrigir para fotobranqueamento³⁴.
Nota: Se nenhuma análise segment-wise ou detrending é aplicado, o brilho aparente pode ser superestimado em grande parte.
1. Definir segmentos deslizantes de, por exemplo, 8 a 15 quadros (por exemplo, quadros 1 a 8, 2 a 9 e assim por diante) e calcular os valores de brilho de canal e correlação cruzada de acordo com as equações 10, 11 e 15 pixel-wise em cada segmento. Se detectores não são verdade fóton contando detectores, levar os parâmetros de detector calibrado em consideração ao calcular o brilho, ou seja, usar equações 12 e 13, em vez disso.
  Nota: Cálculo dos valores de brilho em segmentos de 8 a 15 quadros leva a uma subestimação de 10-20% do brilho absoluto e uma superestimação de 10-20% de números de partículas. Não obstante, rácios de brilho (por exemplo, dímero de brilho de monômero) não são afetados, enquanto o comprimento do segmento é mantido constante em toda a análise (dados não mostrados). O erro estatístico para um comprimento dado segmento pode ser determinado através de simulações e, portanto, corrigido para.
2. Os brilho obtidos os valores médios pixel-wise sobre todos os segmentos. Nesta etapa, pode-se remover a maior e menor de 5% dos valores de brilho do segmento a partir da média ou excluir segmentos que mostram uma clara distorção na intensidade, devido, por exemplo, uma vesícula intracelular ou agregado transitoriamente presente nestes pixéis.
Plotar os valores de brilho do pixel em função da intensidade do pixel e selecionar a população de pixels que corresponde ao contato célula-célula. Pixels do fundo terão valores de intensidade muito baixa. Neste ponto, re-avalie a taxa de contagem máxima. Exclua pixels com taxas de contagem acima de 1 MHz para evitar efeitos de engavetamento.
Criar canal e correlação cruzada histogramas de brilho de célula-célula selecionada contatos pixels e obter os valores de brilho ROI-média. Normalize o valor de brilho médio canal pelo brilho médio da referência monomérico correspondente para obter o estado oligoméricos, tendo em conta não-fluorescente FPs²³. Portanto, determine os valores de brilho médio homo-dímero da análise de uma cor para calcular a fração de não-fluorescente FPs²³.
Para ilustração, traça mapas de brilho de canal e correlação cruzada.

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Representative Results

Um primeiro teste para o ensaio de interação da proteína-proteína, ou seja, mistura de celulas que expressam proteínas fluorescentes espectralmente distintas, seguidas por sFCCS/ccN & B as medições (Figura 1), deve ser realizada em proteínas que não são esperadas para interagir no contato célula-célula (ou seja, um controle negativo). Portanto, misturavam-se células HEK 293T expressando myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) ou - mCardinal e sFCCS foi realizada através do contato célula-célula(Figura 2). Em um caso ideal, o sinal de fluorescência em cada canal é suposto para flutuar em torno de uma média estável, como consequência o movimento difusiva das proteínas na PM e as variações estatísticas do número de proteínas no volume focal. Para proteínas que não interagem, as flutuações em ambos os canais são independentes uns dos outros e, assim, a correlação cruzada espectral é esperada para flutuar em torno de zero. Com efeito, uma correlação cruzada relativa próximo de zero foi observada nas medições típicas (Figura 2C). Os ACFs mostram tempos de decadência característico de ~ 10-20 ms (correspondente, em média, D_myr-palm= 1,3 ± 0,3 µm²/s (média ± DP, n = 20 células)), conforme o esperado para a difusão de myr-palma-mEYFP e - mCardinal na PM, por exemplo, D_myr-palm= 0,88 ± 0,11 µm²/s (média ± SEM) baseados em recuperação de fluorescência após experiências de fotobranqueamento (FRAP)³⁵. Notavelmente, estas dinâmicas bastante lentas permitem o uso de um esquema de excitação alternada, ou seja, alternando entre apenas excitação vermelha verde e única e deteção cada linha, causando um atraso de ms ~0.5 entre sinais em ambos os canais, mas suprimindo conversas cruzadas espectral. Em média, uma baixíssima correlação cruzada média de 0,08 ± 0,10 (média ± DP, n = 17 células) foi obtido para o controle negativo (Figura 3E), conforme o esperado.

Em seguida, um controle positivo de correlação cruzada foi usado para calibrar a máxima possível correlação cruzada na configuração da óptica. Portanto, a membrana-ancorado hétero-dímero myr-palm-mCardinal-mEYFP foi expressa em células de 293T HEK e sFCCS medições foram feitas em células individuais (Figura 2B). Os CCFs obtidos teve amplitudes positivas e mostrou tempos de decadência similares como os ACFs, novamente ~ 10-20 ms (Figura 2D). Em média, uma correlação cruzada relativa de 0,96 ± 0,18 (média ± DP, n = 14 células) foi medido para o controlo positivo (Figura 3E).

Figura 2 . Verificação de medições de controle de correlação cruzada espectroscopia de fluorescência. (A) de imagens representativas de HEK misto 293T células expressando myr-palm-mEYFP /-mCardinal como controlo negativo para interações trans . A seta amarela indica que os sFCCS caminho de varredura. Barras de escala são 5 µm. (B) imagens representativas de células HEK 293T expressando hétero de myr-palm-mCardinal-mEYFP-dímero (esquerda: canal verde, razão: canal vermelho) como controle positivo de correlação cruzada. A seta amarela indica que os sFCCS caminho de varredura. Barras de escala são 5 µm. (C) representante CFs (verde: ACF no canal verde (mEYFP), vermelho: ACF no canal vermelho (mCardinal), azul: CCF) obtidos em medições de sFCCS para o controle negativo. Linhas sólidas mostram adapta-se de um modelo de difusão bidimensional para o CFs. (D) representante CFs (verde: ACF no canal verde (mEYFP), vermelho: ACF no canal vermelho (mCardinal), azul: CCF) obtidos na medição do sFCCS do controle positivo. Linhas sólidas mostram adapta-se de um modelo de difusão bidimensional para o CFs... por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A adequação deste teste então foi investigada em um contexto biologicamente relevante por trans interações entre a proteína amiloide precursora, como 1 (APLP1), um tipo de investigação proteína transmembrana que tem sido proposta para atuar como uma aderência neuronal receptor. Para este objectivo, APLP1 fundidos para mEYFP ou mCardinal foi expressa em células de 293T HEK. Para excluir a interferência com domínios de ligação extracelular, o FPs foram fundidos para o C-terminal da APLP1, ou seja, o domínio intracelular (consulte a Figura 1A). Em seguida, foram realizadas medidas de sFCCS em contatos de celular entre APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal, expressando as células(Figura 3), resultando em ACFs e CCFs (Figura 3C) que fornecem informações sobre difusão APLP1 e interações. Uma positiva correlação cruzada relativa de 0,45 ± 0,21 (média ± DP, n = 17 células) observou-se, ou seja, um valor significativamente maior do que o controlo negativo (Figura 3E). Curiosamente, a média relativa correlação cruzada foi menor do que o controlo positivo (Figura 3E), indicando a ligação parcial trans .

Finalmente, o ensaio foi usado para mostrar que íons zinco facilitam reforçada APLP1 trans ¹²^,³¹de vinculação. O sFCCS CFs obtidos de medições através de clusters de APLP1 nos contatos do celular (caracterizados por uma forte localização co de APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal e formando rapidamente na presença de íons de zinco, Figura 3B) mostrou-se fortemente dinâmica reduzida, como é evidente de decadência grandes times e as oscilações no grande defasagem vezes (Figura 3D). No entanto, a análise as amplitudes em períodos de defasagem curto revelaram um aumento significativo da Cruz-correlação relativo de 0,8 ± 0,3 (média ± DP, n = 17 células), ou seja, ~ 80% do máximo calibrado (Figura 3E). É de se esperar que tal dinâmica lenta induzir graves distorções das curvas de correlação (ver Figura 3D) devido ao número limitado de eventos difusiva que pode ser detectado durante o tempo de medição finito, induzindo assim chamada partícula ruído de³⁰. Para uma quantificação exacta, o tempo de retardo máximo deve ser pelo menos 3 ordens de magnitude acima o tempo de difusão (ver anterior clientes³⁰^,¹⁷ para maiores detalhes).

O brilho molecular da sFCCS APLP1 dados mais foi analisado, utilizando o controlo negativo de myr-palm como referência monomérica em cada canal e corrigindo para a quantidade de proteínas não-fluorescente²³. Após adição de íon zinco, aumentou significativamente o brilho molecular de oligômeros pequenos (~ dímeros) para maiores oriundas consistindo de ~ 10-50 monômeros em cada célula (Figura 3-F). Assim, em média, até APLP1 de ~ 100 monómeros estão presentes em um cluster de toda proteína através da junção de celular.

Figura 3 . Digitalização de medições de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência de interações APLP1 em contatos de celular. (, B) Imagens representativas de células HEK 293T expressando (verde) APLP1-mEYFP / APLP1-mCardinal (vermelho) antes de (A) e 30 min após o tratamento (B, células diferentes) de íon de zinco. As setas amarelas indicam que as sFCCS varredura caminhos. Barras de escala são 5 µm. (C, D) representante CFs (verde: ACFs no canal verde (mEYFP), vermelho: ACFs no canal vermelho (mCardinal), azul: CCFs) obtidos em medições de sFCCS para APLP1 (C) antes do tratamento de íon zinco e (D) após tratamento de íons de zinco. Linhas sólidas mostram adapta-se de um modelo de difusão bidimensional para as parcelas de CFs. (E) caixa de correlação cruzada relativa obtido do sFCCS análise de controlo negativo ("negativo"), APLP1 na ausência e presença de íons de zinco e positivo controle de correlação cruzada ("positivo"). Parcelas mostram valores medianos e bigodes que variam de mínimo para valores máximos. Caixa (F) parcelas de brilho molecular normalizado, no canal verde (mEYFP), resultantes da análise de sFCCS de APLP1 em contatos do celular na ausência e presença de íons de zinco. Valores de brilho foram corrigidos para mEYFP não-fluorescente com base em medições de sFCS de myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dímeros expressados nas células de 293T HEK, medidos sob as mesmas condições²³. Parcelas mostram valores medianos e bigodes que variam de mínimo para valores máximos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todas as medidas mostradas até agora foram corrigidas para flutuações espúrias, adicionais ocorrem nas células que, se não tidos em conta, gostaria de fazer a análise de sFCCS desafiador. Para o controle negativo, por exemplo, estas podem causar uma falso-positivo correlação cruzada, se não há esquemas de correção são aplicadas. Dois principais processos que podem severamente distorcer o CFs são: 1) instabilidades na fluorescência gravada sinal devido a vesículas intracelulares que transitoriamente Insira o volume focal ou retardar a dinâmica da membrana, por exemplo, drift na direção-z e 2) fotobranqueamento. Para identificar a instabilidades transitórias, é recomendável dividir as medições completa em segmentos igualmente tamanhos 10-20 e inspecionar visualmente as séries temporais de intensidade e CFs em cada segmento. Este procedimento é ilustrado na Figura 4, que dá um exemplo de segmentos claramente distorcidos, obtidos na análise de uma medida de controlo negativo. Instabilidades transitórias (Figura 4A, vestígios de intensidade dos segmentos 1 e 2) podem resultar em um CCF tendo valores negativos (Figura 4-B, segmento 1) ou uma alta falso-positivo correlação cruzada (Figura 4B, segmento 2). Normalmente, tais instabilidades são visíveis na série de intensidade como variações de sinal lento(Figura 4). O CFs correspondente normalmente desviam fortemente o CFs da maioria dos segmentos, exibindo, por exemplo, de maior amplitude e tempos de decadência muito mais lentos na ~ segunda escala (ver Figura 4B-4 D). É recomendável remover tais segmentos a partir da análise e calcular o final CFs por uma média de todos os segmentos sem distorção, ou seja, segmentos caracterizada por CFs não desviar-se da maioria dos CFs. normalmente, isso é feito em uma gráfica remoção de interface 1) iterativamente examinando os segmentos, 2) claramente distorcida segmentos a partir da média e 3) inspecionar o CFs dos restantes segmentos com relação a CFs média atualizada dos segmentos que não foram removidos. Aplicando este procedimento, medições de longas parcialmente distorcidos (Figura 5A), mostrando lentamente em decomposição (corrompido) CFs (Figura 5B) foram corrigidos com êxito e curvas de correlação significativa foram recuperado (Figura 5-C). Geralmente, este procedimento de correção pode ser automatizado²⁹, evitando uma inspeção visual pelo usuário, que pode ser propenso a viés subjetivo. Em comparação com intensidade baseado filtragem métodos³⁶, em que pequenas caixas de medição são avaliadas com base em sua intensidade, em comparação com a intensidade média da medição completa e removido se superior a um parâmetro de limiar, o descrito procedimento não depende de parâmetros externos e é sensível também às instabilidades menores.

Para compensar o fotobranqueamento, a correção matemática descrita, equação 1, foi aplicada. Normalmente, fotobranqueamento pode ser identificado por um decaimento exponencial dos sinais de fluorescência (Figura 5-D), dominando o CFs, que então mostrar um falso-positivo de correlação cruzada e decadência vezes na ~ escala mínima (ver a forma da curva típica na Figura 5E). O procedimento de correção recuperou o CFs sem distorção (Figura 5-F). Como já mencionada, semelhante intensidade variações dentro medidas simples também podem ser causadas por PM movimento, por exemplo, z-drift ou grandes estruturas lentamente em movimento. No entanto, se deteriora exponencial semelhantes aparece em todas as medições, fotobranqueamento será a fonte mais provável. Em geral, esquemas de correção podem ser combinadas, por exemplo, intensidade de filtragem, filtragem de CF com base e mais métodos tais como Fourier transform baseado filtragem do sinal lento as variações na frequência espaço²⁷.

Figura 4 . Segment-Wise análise de medições de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência do controlo negativo de correlação cruzada de digitalização. (A) intensidade de fluorescência verde (F₁) e o canal vermelho (F₂) de dois segmentos de tempo diferentes (cada medição foi analisada em 20 segmentos de ~ 20 s cada), obtidos a partir da medição de sFCCS de controle negativo. (B) CCFs de cada um dos 20 segmentos. Os CCFs para segmentos 1 e 2 são destacadas em vermelho e laranja, respectivamente. (C, D) ACFs de cada segmento em verde (C) e o canal vermelho (D). Os ACFs para segmentos 1 e 2 são destacadas em vermelho e laranja, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 . Perturbações na digitalização de medições de espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência em contatos de celular, exemplificados por controlo negativo de correlação cruzada. (A) série temporal de fluorescência completo para uma medição exemplar em verde (F₁) e o canal vermelho (F.₂). As linhas vermelhas sólidas representam um ataque duplo-exponencial da série tempo em cada canal. (B, C) CFs (verde: ACFs em canal verde, vermelho: ACFs no canal vermelho, azul: CCFs) da fluorescência tempo série mostrada na, calculada por (B) correlacionando a toda medida ou (C) correlacionando 20 segmentos separadamente e em média a menos distorcida CFs de ~ 80% (canal verde) e ~ 50% (canal vermelho) dos segmentos. Linhas sólidas representam o ajuste de um modelo de difusão bidimensional para os dados. Série de tempo de fluorescência completo (D) e ajuste duplo-exponencial (linhas vermelhas sólidas) de medição caracterizada por branqueamento substancial em verde (F₁) e o canal vermelho (F.₂). (E, F) CFs (verde: ACFs em canal verde, vermelho: ACFs no canal vermelho, azul: CCFs) da fluorescência tempo série mostrada em D, calculado por (E) correlacionando a toda medida ou (F) aplicando a correção de branqueamento, equação 1, correlacionando 20 segmentos separadamente, e em média o CFs menos distorcida de ~ 90% (os dois canais) dos segmentos. Linhas sólidas representam o ajuste de um modelo de difusão bidimensional para os dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como uma abordagem complementar ao sFCCS, ccN & B (Figura 1C) podem ser usado para detectar interações da proteína-proteína após a mistura de célula. Em contraste com sFCCS, ccN & B não fornece nenhuma informação sobre a dinâmica da proteína, mas permite a medição trans interações ao longo do contato célula-célula inteira em um plano focal. Medições em amostras de APLP1 foram realizadas antes e após o tratamento com 50 µM ZnCl₂, bem como do controlo negativo myr-palm. Estas medições são sensíveis ao movimento de célula, especialmente para amostras de íon Tratado de zinco, que exigem tempos de aquisição prolongada para dar conta da dinâmica lenta de clusters APLP1. Portanto, um algoritmo de alinhamento de imagem foi implementado para corrigir para o movimento lateral do células³³. Além disso, um vagão de carga do filtro²² (8 quadros caixa tamanho, ~ 5 s) foi aplicado para remover as flutuações de baixa frequência dos sinais medidos. Este procedimento é muito semelhante a outros filtros utilizados em N & B análise envolvendo uma média de³⁷ locais ou detrending¹⁸^,³⁴, mas mantém os dados originais inalterados, ou seja, pixels são tratados de forma independente e não é realizada uma média ou subtração dos sinais. Esse procedimento efetivamente suprime long-lived flutuações em escalas de tempo mais longos do que a caixa tamanho²². Após essa análise de dados, os valores de brilho de correlação cruzada para todas as amostras foram comparados pelo pool de todos os pixels de contato célula-célula em um histograma de brilho de correlação cruzada. Para APLP1 na ausência de íons zinco (figura 6A e 6D), uma média positiva B_cc de 0,068 ± 0,004 (quer dizer SEM ±, n = 18 células) foi observada. Após adição de íon zinco (Figura 6B e 6E), o valor de_cc B aumentou para 0.266 ± 0,006 (quer dizer SEM ±, n = 19 células). Para o controle negativo (Figura 6C e 6F), foi detectado um brilho médio inferior de correlação cruzada (B_cc = 0.022 ± 0,002, quer dizer SEM ±, n = 26 células). Para estimar a estequiometria de APLP1 complexos em contatos do celular, o brilho de APLP1-mEYFP foi normalizado usando o valor médio obtido para myr-palm-mEYFP (i. e., o controle negativo) e corrigida para a quantidade de não-fluorescente proteínas,²³. De acordo com dados do sFCCS, a distribuição de brilho foi centrada em torno de um valor correspondente a dímeros (Figura 6G), na ausência de íons zinco, sugerindo uma média de 2:2 estequiometria. Após o tratamento de íons de zinco, o brilho normalizado fortemente deslocado para valores maiores, variando de 10 ~ a ~ 60 (Figura 6H), ou seja, stoichiometries no mínimo 10:10 ou maior, novamente em boa concordância com os dados sFCCS.

Figura 6 . Medições de número e brilho de correlação cruzada de interações APLP1 em contatos celular. (-C) Representante ccN & B quadros de contatos do celular entre as células HEK 293T expressando APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal sem (A) de imagem e com zinco íons (B) ou expressar myr-palma-mEYFP e myr-palm-mCardinal células como negativa controle de correlação cruzada (C). Barras de escala são 5 µm. (D-F) histogramas de brilho (B_cc) correlação cruzada de pixels todos examinados e células obtidas da ccN & B análise de contatos do celular em amostras de APLP1 (D), tratados com zinco APLP1 amostras ( E) e as amostras que contêm myr-palma-mEYFP e myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normalizado de histogramas de brilho de APLP1 amostras (G: sem íons zinco, H: com íons de zinco) para o canal verde (mEYFP), obtido a partir da análise de brilho das mesmas células e ROIs utilizadas para o cálculo de B_cc. Baixo-relevo em G mostra uma ampliação no intervalo de -2 a 10 brilho normalizado. Valores de brilho foram corrigidos para mEYFP não-fluorescente com base em medições N & B de myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dímeros expressados nas células de 293T HEK, medidos sob as mesmas condições²³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para executar o ccN & B análise, deve ser realizada uma calibração cuidadosa dos detectores de. Para a instalação experimental utilizada neste estudo, a necessidade para tal uma calibração tornou-se aparente quando o brilho molecular foi analisado em amostras fixas (ou seja, na ausência de flutuações números). Neste caso, o brilho molecular deverá ser zero de acordo com a equação 10, desde que a variação deve-se originam apenas de ruído detector. No entanto, quando um ROI que contém somente pixels de fundo (imóvel) foi analisada (Figura 7A e 7B), foi determinado um brilho positivo de ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Um valor semelhante foi obtido realizando N & medições B das células de 293T HEK expressando glicosilfostidilinosiol-mCherry (GPI-mCherry, Figura 7C) com diferentes laser poderes e extrapolando o brilho molecular medido para zero poder do laser. Para corrigir, para este efeito, realizamos uma sistemática calibração do detector, como relatado anteriormente (ver equação 12)¹⁹^,²⁰. Nós, portanto, a variância em função da taxa de contagem detector em uma amostra composta de uma solução de tintura fluorescente secas e determina os parâmetros S, Equation 24 e o deslocamento de taxa de contagem escuro. Este último foi obtido medindo a intensidade no zero poder do laser e foi, no nosso caso, insignificante. A partir de um ajuste linear da variância contra enredo de intensidade, determinamos, de acordo com equação 14, uma ladeira de S = 1.1 e um ruído de leitura insignificante. Os valores determinados (S = 1,1, Equation 24 = 0, offset = 0) foram então usados para calcular corretamente o brilho molecular e número de acordo com as equações 12 e 13¹⁹. Alternativamente, um esquema de correção mais empírico pode ser aplicado com base no fato de que um barulho de detector de superpoissonian, ou seja, ruído de ~ 10% maior do que Poissonian ruído, tiro também explicaria a observação de um brilho molecular positivo em pixels sem números flutuações. Usando essa suposição, o determinado brilho de ~0.1 cts./(MOL x dwell time) em tais pixels pode ser considerado como um brilho constante deslocamento e, portanto, deve ser subtraído de todos os valores de brilho, calculados com a equação 10. Mais importante ainda, ambos descritos chumbo de abordagens para os mesmos resultados ao calcular rácios de brilho, contanto que Equation 24 e deslocamento são insignificantes. Vale ressaltar que entre diferentes microscópios do mesmo tipo (mesmo fornecedor, mesmo modelo, detectores de GaAsP em modo de contagem de fótons) diferentes valores de S foram observados, destacando a necessidade de uma calibração do detector cuidado em cada instalação individual.

Um parâmetro mais importante afetando o desempenho do detector em medições de brilho é o tempo morto do detector. Como foi demonstrado anteriormente, o tempo morto do detector pode reduzir substancialmente o brilho molecular detectado, mesmo em taxas de contagem média (acima de²-10 10³ kHz)³⁸. Para evitar este artefacto, medições também devem ser realizadas em menores taxas de contagem, ou o tempo de morte deve ser calibrado com base no desempenho N & B ou FCS em uma série de diluição de, por exemplo, EGFP em solução tampão. Então, taxas de contagem medido podem ser corrigidas usando um tempo morto calibrado³⁸. Para a configuração utilizada neste estudo, tal uma calibração usando N & B em soluções diluídas tintura revelou valores de brilho molecular estável até taxas de contagem de ~0.5 MHz e um correspondente tempo morto de ~ 6 ns (Figura 7E). A diminuição a taxas mais elevadas de contagem pode ser corrigida, assim, por meio de uma correção publicado anteriormente fórmula³⁸, resultando em um valor de brilho constante de ~ 8 kHz/MOL.

Figura 7 . Calibração do detector para análise de número e o brilho. (A) imagem representativa da N & B medições de células HEK 293T expressando GPI-mCherry. Um ROI (retângulo tracejado azul) foi selecionado no fundo. (B) histograma de brilho do Pixel de todos os pixels correspondentes para o ROI apresentado na . O brilho do pixel média, obtido de encaixe o histograma de brilho do pixel com uma função gaussiana, é ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Dados foram adquiridos no tempo de permanência de pixel 25 µs. (C) brilho Molecular obtido de N & B análise de GPI-mCherry expresso em células HEK 293T, medido em três poderes diferentes do laser (6 células cada, 561 nm de excitação, tempo de permanência de pixel 25 µs). Os dados são exibidos como média ± SD Uma regressão linear (linha vermelha) fornece um valor de deslocamento de 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) parcela da variância de pixel em função da intensidade do pixel de N & B medições da solução seca de uma tintura fluorescente (animado em 561 nm), em pool de todos os pixels das várias medições em diferentes regiões da amostra. A linha vermelha sólida mostra um ajuste linear dos dados, resultando em um declive de 1.1, fornecendo o fator S de calibração do detector. (E) brilho Molecular em função da taxa de contagem do detector, obtidos de medições N & B de soluções diluídas de fluoróforo (animado em 488 nm). Um esquema de correção publicado anteriormente³⁸ foi aplicado usando diferentes valores possíveis para o tempo morto do detector. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O procedimento experimental descrito aqui permite a investigação da proteína-proteína trans interações em contatos de celular, empregando técnicas de espectroscopia de flutuação de fluorescência, ou seja, sFCCS e ccN & B. Esses métodos envolvem uma análise estatística das flutuações de fluorescência emitida por dois espectralmente separados FPs fundido para as somáticas de interesse em um contato de duas células vizinhas, cada uma expressando uma ou a outra proteína de fusão. A presença de complexos de trans é quantificada por sondar o grau de difusão co de proteínas em PMs vizinhas. Além de protocolos detalhados na preparação das amostras, aquisição de dados e análise, este artigo fornece evidência experimental da aplicação bem sucedida do ensaio sobre a proteína de adesão neuronal APLP1. Mostramos que a APLP1 sofre específicos, homotypic trans interações em contatos do celular. Promovem a formação de clusters de APLP1 nos contatos de celular que fornecem uma plataforma polivalente para interações trans e, assim, induzem a ligação reforçada trans , íons de zinco.

Em contraste com o anteriores ensaios para detectar tais interações com base em métodos bioquímicos interrupções⁶, a abordagem apresentada pode ser executada diretamente em células vivas, sem necessidade de fixação ou isolamento de complexos de proteínas. Além disso, fornece informações e especificidade molecular pela detecção de proteínas fluorescentes geneticamente fundida à proteína de interesse, em contraste com o anterior ensaios qualitativos⁸^,⁹. Diferentemente de outras abordagens de fluorescência baseada como traste¹⁰ e fluorescência complementação¹¹, não há nenhuma exigência para as etiquetas fluorescentes a serem localizados no lado extracelular (potencialmente interferir com interações da proteína-proteína). No entanto, deve notar-se que o C-terminal FPs ainda pode alterar a ligação de componentes intracelulares, por exemplo, proteínas de adaptador que medeiam as interações com o citoesqueleto. Notavelmente, o ensaio é aplicável aos homo - e interações heterotypic.

Alguns requisitos para uma aplicação bem sucedida do ensaio apresentado são dignos de menção. Os métodos de flutuação de fluorescência realizados são baseados em medições temporais que exigem brilhante e fotoestável monomérico FPs, que é uma restrição importante para muitos vermelho FPs²³. Mesmo que o regime de exploração apresentado é particularmente adequado para a investigação da dinâmica lenta de proteínas transmembranares, que normalmente estão envolvidas em interações célula-célula, fotobranqueamento residual ainda pode ocorrer. Portanto, apresentamos uma descrição detalhada dos regimes de correção, ou seja, uma correção de branqueamento para filtro sFCCS e boxcar ccN & B, que minimizar tais perturbações. Além disso, discutimos algoritmos numéricos alinhamento que efetivamente correta para outras perturbações sistemáticas, tais como o movimento lateral das células e fornecer orientações para remover instabilidades transitórias. Das principais fontes de tais instabilidades é transporte vesicular, ou seja, intracelulares vesículas carregando a proteína do interesse que transitoriamente, insira o volume focal. Embora variando de caso para caso, este fenômeno pode em geral severamente perturbar análise e aquisição de dados. No entanto, a aplicação de algoritmos de correção melhora a estabilidade da aquisição, permitindo a medição estendida vezes que são necessários para sondar a especialmente dinâmica difusiva lenta. A este respeito, deve sublinhar-se que a presença da dinâmica difusiva é condição essencial para o método de trabalho. O exemplo do íon zinco mediada APLP1 cluster mostra um exemplo drástico de complexos de proteínas grandes, muito lento (D ≈ 0,001 µm²/s) que empurra a técnica aos seus limites e evitar uma quantificação precisa da dinâmica subjacente, devido ao grande barulho induzida pela aquisição limitado tempo³⁰^,¹⁷.

Neste contexto, os avanços recentes em pentear sFCS e abordagens, por exemplo, digitalização emissão estimulada depleção FCS (STED-FCS), podem ser benéficas, proporcionando um menor volume de focal e, portanto, menor difusão eficaz de super-resolução vezes³⁹ ^,⁴⁰. Isso também poderia ajudar a resolver aglomerados de proteína, no caso de uma localização não-homogênea da proteína de interesse para os contatos do celular, como observado por APLP1 na presença de zinco. Infelizmente, uma implementação de correlação cruzada de digitalização STED-FCS, ou seja, STED-FCCS, que pode diretamente ser aplicada aqui, não foi com sucesso demonstrada ainda devido à dificuldade de encontrar corantes compatíveis para duas cores STED-FCS. No caso de dinâmica suficientemente rápida (D ≥ ~0.05 µm²/s), sFCCS análise permite quantificar a difusão das proteínas em contatos do celular ou em outras regiões do PM¹².

Além disso, uma análise de brilho pode ser realizada para todos os dados (sFCCS e ccN & B), fornecendo uma estimativa da estequiometria da trans complexos da proteína. Deve ser mencionado que a precisão da quantificação estequiometria aumenta com a quantidade de proteínas que se ligam em trans (ou seja, se houver apenas alguns focos de cis que também poderiam afetar a determinação de brilho). Análise de brilho não permite a resolução de misturas de diferentes Estados oligoméricos, monômeros e.g.,cis e trans tetrâmeros. Mais em geral, note-se que a N & B não é possível resolver misturas de diferentes espécies oligoméricas homogeneamente distribuídas em uma amostra. Se múltiplas espécies estão presentes dentro de um pixel, um único valor do brilho será medido (ou seja, uma média ponderada do brilho de cada espécie oligoméricas). A distribuição estatística dos valores de brilho observadas (por exemplo, em diferentes pixels) não está diretamente ligada às quantidades relativas das espécies oligoméricas. Para resolver essas misturas, devem ser utilizados outros métodos (por exemplo, intensidade espaciais distribuição análise (SpIDA)⁴¹, fóton contando histograma (PCH)⁴²). Da mesma forma, a quantificação da Cruz-correlação espectral em sFCCS fornece uma quantificação exacta da fração de proteínas acopladas e desacopladas somente para simples, conhecidos stoichiometries, por exemplo, 1:1. Para uma mais complexa estequiometria, mais suposições precisam ser feita⁴³. Em geral, análise de brilho continua a ser uma poderosa ferramenta experimental, se o sistema do detector e a fração de não-fluorescente FPs são calibrados²³ conforme descrito nos protocolos.

Embora a aplicação apresentada aqui é focada em interações da proteína-proteína em células aderentes, o ensaio pode ser aplicado a uma ampla gama de amostras, por exemplo, células de suspensão. Para tais sistemas, correção para o movimento lateral da célula pode ser particularmente crucial. Além disso, pode ser facilmente aplicado a sistemas de membrana modelo tais como GUVs ou GPMVs, permitindo a quantificação de interações moleculares em condições bem controladas, por exemplo, lipídios diferentes composições ou membranas falta organizado citoesqueleto. Ao executar o sFCCS em tais vesículas, movimento vertical pode causar flutuações de sinal adicional, mas pode ser minimizado quando enfocando grandes vesículas. Neste contexto, estão prometendo várias combinações, por exemplo, GUV- / GPMV-célula mistura¹². Como mostrado em uma publicação recente, a formação de sinapses imunes pode ser modelada com sucesso por tais sistemas⁴⁴. Assim, o ensaio apresentado certamente será útil para a investigação de uma grande variedade de interações célula-célula.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) conceder 254850309. Os autores agradecer Madlen Luckner leitura crítica do manuscrito.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110

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References

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Biochemistry

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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