Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

Этот протокол описывает флуоресценции колебания спектроскопии-подход на основе для изучения взаимодействия белков, посредничество ячеек взаимодействия, т.е. белки локализованы в ячейке развязок, непосредственно в живых клетках. Мы предоставляем подробные руководящие принципы по калибровке, сбора и анализа данных, включая исправления возможных артефакт источникам.

Abstract

Целый ряд биологических процессов предполагает взаимодействие ячеек, обычно при посредничестве белки, которые взаимодействуют на уровне интерфейса между соседними ячейками. Интерес только несколько анализов способны конкретно зондирующего такого взаимодействия непосредственно в живых клетках. Здесь мы представляем assay измерить связывания белков, выраженных на поверхности соседние клетки, в ячейке контактов. Этот assay состоит из двух этапов: Микширование клеток, выражая протеинов интереса, сливается с различными флуоресцентных белков, следуют флуоресценции колебания спектроскопии измерений в ячейке контактов с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Мы продемонстрировать возможности этот assay в биологически соответствующий контекст путем измерения взаимодействия белков амилоида прекурсоров как 1 (APLP1) через узлы ячеек. Мы предоставляем подробные протоколы на сбор данных, используя методы, основанные на флуоресцирования (сканирование флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции, номер кросс корреляции и анализа яркости) и требуемый инструмент калибровки. Кроме того мы обсуждаем важнейшие шаги в анализ данных и как определить и исправить внешний, ложный сигнал вариации, например, те из-за Фотообесцвечивание или ячейки движения.

В целом представленные применима к любому гомо - или гетеротипичной протеин взаимодействия в ячейке контактов, между ячейками в одной или разных типов и могут быть реализованы на коммерческой конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Важным требованием является стабильность системы, которая должна быть достаточной для зонда диффузионное динамики протеинов интереса в течение нескольких минут.

Introduction

Многие биологические процессы происходят на объектах ячеек взаимодействий, например, ячеек адгезии1,2,3, слияние ячеек4 и клеточных признание5. Такие мероприятия особенно важны во время развития многоклеточных организмов и для связи ячеек, например, во время иммунных реакций. Эти процессы обычно опосредовано белки, которые локализованы на поверхности, то есть, на плазматической мембраны (PM) соседних клеток и проходят специфических взаимодействий в контакт ячеек, которые точно регулируется в пространстве и времени. Во многих случаях эти взаимодействия прямого гомо - или гетеротипичной белок белковых взаимодействий транс , но может также включать ионов или лигандов, действуя как внеклеточного линкеры1. Несмотря на основополагающее значение, отсутствует анализов зондирующего эти конкретные белок белковых взаимодействий непосредственно в родной среде живых клеток. Многие методы либо требуют разрушения клеток (например, биохимических анализов как co иммунопреципитация6), фиксация (например, некоторые методы оптической микроскопии суперразрешением и электронной микроскопии ячеек Контакты7), или являются неспецифическими, например, агрегации / сцепления assays8,9. Для преодоления этой проблемы, были выполнены флуоресценции методы, основанные на флуоресценции резонансные энергии передачи (ЛАДА)10 или флуоресценции дополнения11. Однако чтобы добиться достаточно небольших расстояниях между флуорофоров, эти методы требуют флуоресцентные метки на стороне внеклеточных белков10, потенциально мешать транс взаимодействий.

Здесь мы представляем альтернативной основе флуоресценции assay для взаимодействий протеин протеина в ячейке контактов. Этот подход сочетает в себе флуоресценции кросс корреляции подходы (сканирование флуоресценции кросс корреляции спектроскопии (sFCCS), кросс корреляции номер и яркость (ccN & B)) и смешивания клеток, выражая конструкцию синтеза белка интерес, например, рецептор адгезии. Исследованы рецепторов в двух взаимодействующих клеток помечены с двумя спектрально разлученных флуоресцентных белков (FPs), от внутриклеточного стороне (см. рис. 1A).

Занятых методы основаны на статистическом анализе флуоресценции колебаний, вызванных диффузионного движения флуоресцентные синтез белков через фокуса тома конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Более подробно, assay зонды совместное распространение протеинов интереса в обеих соседних PMs в ячейке контактов. Если белки проходят транс взаимодействий, эти комплексы транс будет нести флуоресцентных белков в обоих спектральных каналов, вызывая колебания коррелированных флуоресценции обоих излучателей. С другой стороны если привязка не происходит, число колебаний белков сталкивается ПМС будет независимым, вызывая не коррелированные колебания. Приобретение может быть выполнена двумя способами: 1) sFCCS основана на линии образный сканирования через контакт клеток и эффективно зонды взаимодействий в месте, расположенная в регионе контакта. Через временной анализ колебаний флуоресценции sFCCS обеспечивает также динамика информацию, т.е. коэффициенты диффузии белковых комплексов; 2) ccN b & B на основе pixel-wise анализа последовательности изображений, приобретенных в регионах контактных ячеек. Он имеет возможность зонда и карта взаимодействия вдоль всего связаться региона (в одной фокальной плоскости), но не предоставляет информацию о динамике. Оба метода могут быть объединены с анализ молекулярных яркость, т.е. средняя флуоресценции сигнал излучаемый одного диффундирующих белковых комплексов в единицу времени и, таким образом, дают оценки стехиометрии белковых комплексов в Контакты ячеек.

В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для пробоподготовки, поверки, сбора и анализа данных для выполнения представленных пробу на коммерческих конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Эксперименты могут выполняться на любом инструменте, оснащенных Фотон подсчета или аналоговые датчики и объективным с высоким числовая апертура. Мы далее обсудить важнейшие шаги протокола и обеспечивают коррекцию схемы для нескольких процессов, вызывая колебания артефакта сигнала, например, детектор шум, Фотообесцвечивание или ячейки движения. Первоначально разработанный прозондирует область взаимодействия между адэрентных клеток, assay может быть изменена для подвески клетки, или адаптированы к модели мембранных систем, например, гигантский однослойных везикул (GUVs) или гигантский плазменный мембрана везикулы (GPMVs), что позволяет количественное определение взаимодействий в средах различных липидов или в отсутствие организованной цитоскелета12,13.

Сканирование на страницу отдела Флуоресценция кросс корреляции представляет собой модифицированную версию флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции14 и была специально разработана для зонда медленно диффузионное динамика в липидных мембран15. Он основан на линии сканирования приобретение перпендикулярно вечера, содержащий флуоресцентные белки интерес. Прозондирует область взаимодействия двух видов по-разному помечены белка, приобретение осуществляется в двух спектральных каналов, с помощью двух лазерных линий и два окна обнаружения для спектрально разлученных флуорофоров. Из-за медленного распространения динамики белков в ТЧ (D≤ ~ 1 мкм2/s), кросс talk свободные измерения могут быть выполнены путем чередования схемы возбуждения от линии к линии15. Анализ начинается с: 1) выравнивания алгоритм исправления для боковых клеточного движения на основе block-wise в среднем ~ 1000 линий, 2) определение положения с максимальной флуоресценции сигналато есть, вечера позиции, в каждом блоке и 3) Ветра из всех блоков для общего происхождения12,15, отдельно в каждом канале. Затем автоматический выбор пикселов, соответствующих вечера выполняется, выбрав Центральный регион от Гаусса fit суммы все выровненные линии (т.е., центр ± 2.5σ). Интеграция сигнала в каждой строке дает мембраны флуоресценции рядов F(t) в каждом канале (g = зеленый канал, r = красный канал). Обратите внимание, что размер пикселя должна быть небольшой достаточно, например, < 200 Нм, чтобы восстановить форму точки распространения функция и найти свой центр, соответствующие положения пп. При наличии существенных Фотообесцвечивание, флуоресценции временных рядов в каждом канале может быть смоделированы с двойной экспоненциальная функция и затем исправлены с помощью следующей формулы:16

Equation 1.    (1)

Важно отметить, что эта формула эффективно исправляет амплитуд и диффузии раз, полученные из корреляционного анализа F(t)c, по сравнению с оценки параметров, которые будут получены от нескорректированной F(t). Затем, функции auto - и кросс корреляции (ACFs / РСС) флуоресценции сигналы рассчитываются:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

где δF,я = F,я(t) - Image 1 F,я(t)Image 2 и я = g, r.

Двумерный диффузионная модель после этого приспособлена для всех корреляционных функций (CFs):

Equation 4.   (4)

Здесь N обозначает количество флуоресцентных белков объема наблюдения и τd диффузии время для каждого канала. Эта модель принимает во внимание, что в параметре описанных экспериментальных, диффузии белков в Личку происходит в плоскости x-z, в отличие от часто используемые конфигурации флуоресценции корреляции спектроскопии (FCS) экспериментов на мембраны зондирование Диффузия в плоскости x-y конфокальный объем17. Талии w0 и структура фактора S, описывая удлинение wz фокуса тома в z, S = wz/w0, полученные из измерения Калибровка точки FCS, выступал с спектрально аналогичные красители и оптических параметров используя уже имеющиеся значения для коэффициента диффузии Dкраска:

Equation 5, (5).

где τd, краска это измеренное среднее диффузии время краситель молекулы, полученные из установки модели для трехмерных распространения данных, принимая во внимание переходы дроби T всех N молекул в триплет государство с константой времени ττ:

Equation 6.   (6)

Наконец коэффициенты диффузии (D), значения молекулярных яркости (ε) и относительной кросс корреляции данных sFCCS (rel.cc.) рассчитываются следующим образом:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

где Gкрест(0) является амплитуда функции кросс корреляции и Equation 14 – амплитуда автокорреляционной функции в i-й канал.

Это определение относительной кросс-корреляции, т.е. вместо Макс означает в уравнение 9, принимает во внимание, что максимальное количество комплексов двух видов белка в различных концентрациях ограничен в меньшее число видов.

Кросс корреляции номер и яркость основан на момент анализа интенсивности флуоресценции для каждого пикселя стека изображений приобрели со временем в фиксированном положении в образце, обычно состоящая из ~ 100-200 фоторамки, с двумя спектральных каналов () g = зеленый канал, r = красный канал). От височной среднего Image 1 яImage 2я и дисперсией Equation 16 , молекулярный яркость εi и число n,я рассчитываются каждый пиксель и спектральных каналов (я = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Важно отметить, что данного уравнения применяются в идеальном случае истинный Фотон подсчет детектора. Для обнаружения аналоговых систем следующие уравнения применяются19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Здесь, S является коэффициент пересчета между обнаруженные фотоны и записи цифровых отсчетов, Equation 24 это шум считывания и смещение ссылается на смещение интенсивности детектор. Как правило эти количества должны калиброванные, для любого типа детектора, основанный на измерении детектор дисперсии в зависимости от интенсивности для постоянного освещения19, например, отражающей поверхности металла или сушеные краситель решение. Смещение может быть определена путем измерения скорость счета для образца без возбуждения света. Выполнив линейную регрессию детектор связанные дисперсии Equation 25 против интенсивности (я) сюжет, S и Equation 24 могут быть определены19:

Equation 14.   (14)

Наконец яркость кросс корреляции вычисляется в каждом пикселе и определяется в целом как21

Equation 15, (15).

где Equation 29 является кросс дисперсии Equation 30 .

Чтобы отфильтровать долгоживущих колебания, все ccN & B расчеты выполняются после крытые вагоны, фильтрация, независимо для каждого пикселя22. Вкратце, ni, ε,я (я = g, r) и Bcc рассчитываются в скольжения сегментов например, 8-15 кадров. Таким образом полученные значения можно затем усредняются для получения последней точки номер и яркости.

Стехиометрия анализ
Для того чтобы оценить стехиометрии белковых комплексов в ячейке контактов, молекулярные яркости могут анализироваться отдельно в каждом спектральных канала для sFCCS или ccN & B данных. В sFCCS одно значение яркости получается за измерения в каждом канале. В ccN b & B гистограмма яркости всех пикселей, соответствующий контакт ячеек получается и значение средняя (или средний) может использоваться как представитель яркость для измерения. Выполняя такой же анализ на мономерных ссылку, все значения яркости могут быть нормированы непосредственно получить средний олигомерных состояние обнаруженного белковых комплексов. На данный момент важно исправить на наличие не флуоресцентные FPs, что может привести к недооценке олигомерных государства. Обычно это выполняется путем измерения яркости гомо димерной ссылкой белка23,-24 с помощью одно цвет sFCS или номер и яркость (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Пробоподготовка: Ячеек смешивания Assay

Примечание: Следующий протокол описывает перемешивания для адэрентных клеток. Он может быть изменен для клетки культивировали в подвеска.

  1. Семя соответствующее количество клеток на тарелке 6-Ну, например, 800000 ГЭС 293T клетки (подсчитано с Нойбауэр, считая камеры), за день до transfection. Число может изменяться в зависимости от времени между посевом и transfection и приспособлены для других типов клеток. Для выполнения основной эксперимент (то есть, белки интерес и отрицательный контроль), подготовьте по крайней мере 4 скважины. Культура клеток при 37 ° C, 5% CO2 в среде Дульбекко изменение средних орла (DMEM), дополнены плода бычьим сывороточным (10%) и L-глютамин (1%).
  2. Transfect клетки согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
    1. Для выполнения основной эксперимент, transfect, в отдельных скважинах, плазмиды для протеина интереса, сливается в «зеленый» (например, мономерных расширенной зеленого флуоресцентного белка (mEGFP), или желтый флуоресцентный белок (mEYFP)) или «красный» (например, mCherry, или mCardinal) флуоресцентный белок.
      Примечание: В настоящем Протоколе, мы сосредоточены на APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal12и соответствующие отрицательного контроля, например, myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr ладонь mEYFP) и - mCardinal (myr ладонь mCardinal)12. Как правило, 200 ng - 1 мкг плазмидной ДНК достаточно. Высокая трансфекции эффективность увеличивает шанс найти «красный» и «green» клеток в контакте. Измените количество плазмиды и трансфекции реагент оптимизировать эффективность трансфекции. Критические: Confluency клетки должен быть около 70%, когда transfecting клетки. Если клетки чрезмерного притока, эффективность трансфекции будет уменьшаться. Если клетки не достаточно вырожденная, transfection и смешивания может вызвать стресс и предотвратить многие клетки от правильное вложение после смешивания.
  3. Выполните смешивания ~4 ± 2 ч после transfection клетки.
    1. Удалите средство роста и мыть каждый хорошо нежно с 1 мл PBS, дополненная мг2 + и Ca2 +. Затем удалите PBS. (Критический) Падение PBS на хорошо края для предотвращения отряд клеток во время стирки.
    2. Добавьте ~ 50 мкл трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) решение каплям в каждой скважине для облегчения отряд клеток. После инкубации при 37 ° C на 2 мин, медленно встряхнуть пластину 6-ну сбоку, чтобы отсоединить клетки.
      Примечание: Расширенный инкубации раз может быть необходимо для некоторых типов клеток.
    3. 950 мкл роста среднего для каждой скважины и Ресуспензируйте клетки, закупорить несколько раз вверх и вниз, тем самым отсоединение всех клеток хорошо снизу. (Критический) Убедитесь, что клетки высокомобильна должным образом и разделенные друг от друга визуально проверка на отсутствие больших клеток агрегатов после взмучивания. В противном случае многие «красный»-«красный» или «зеленый»-«зеленых» контакты будут получены после смешивания.
    4. Передать соответствующие хорошо, т.е., «красный» (например, APLP1-mCardinal transfected) «зеленый» (например, APLP1-mEYFP transfected) клеток решение одной скважины (протеин интереса или отрицательный контроль) клетки. Смешайте нежно закупорить вверх и вниз несколько раз. Затем семя смешанные клетки на дно блюда 35-мм стекла (1 мл раствора смешанных клеток на блюдо), плюс 1 мл среднего роста и культуры семенами клетки на другой день при 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Рисунок 1 . Экспериментальный процесс и схематическое изображение сканирования флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции и анализ числа и яркость кросс корреляции в ячейке контактов. (A) схема пробоподготовка: после трансфекции смешиваются две популяции клеток transfected с протеином интереса (например, APLP1) сливается с двумя спектрально собственный флуоресцентных белков (например, mEYFP и mCardinal). Контакты по-разному transfected клеток выбираются в экспериментах микроскопии. Чтобы избежать интерференции с внеклеточного связывания доменов, флуоресцентный белок следует сливается с внутриклеточной конечной протеина интереса. (B) сканирование FCCS (sFCCS) измерения являются осуществляется перпендикулярно контакт ячеек в двух спектральных каналов (канал 1, зеленый и канал 2, красный). Выровнены линии сканирования (в виде kymographs) и мембраны пикселей суммируются. Затем ACFs и СРС рассчитываются от следов интенсивности Fя(t). ACFs представлены в красный и зеленый. CCF представлена синим цветом. Приобретение (.C) кросс корреляции N & B (ccN & B) приводит в стеке трехмерного изображения (x-y время). ROI выбран вокруг ячеек контакт. Затем канал и кросс корреляции яркость (ε1, ε2и Bcc) рассчитываются значения в каждой ячейке контакт пикселей. Затем результаты визуализируются как гистограммы, объединение всех выделенных пикселов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

2. Пробоподготовка: Положительный контроль для кросс корреляции экспериментов и Homo димера конструкции для анализа яркости

  1. Семя 600.000 ГЭС 293T клетки, подсчитано с ячейкой подсчета палаты, на 35-мм стекла дно блюда за один день до transfection. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2 в полной среде DMEM (см. шаг 1.1) на другой день.
  2. Transfect клетки с ~ 250 нг плазмидной ДНК согласно инструкциям производителя. Для позитивного управления кросс корреляции используйте плазмида кодирования мембраны якорь флуоресцентный белок гетеро димер, например, myr ладонь mCherry-mEGFP или myr ладонь mCardinal-mEYFP12 соответствующих FPs протеина интереса. Для калибровки яркость используйте плазмид, кодирования и мембраны якорь FP мономера и гомо димера соответствующий FPs, сливается с протеин интереса, например, myr ладонь mEYFP и myr ладонь mEYFP-mEYFP для калибровки яркость анализ APLP1-mEYFP12.
  3. Культура клеток при 37 ° C, 5% CO2 в полной среде DMEM (см. шаг 1.1) на другой день.

3. Конфокальная лазерная микроскопия сканирования: Установка и калибровка фокуса тома

Примечание: Следующий протокол написан для экспериментов с mEGFP/mEYFP и mCherry/mCardinal на лазерное сканирование конфокального микроскопа, используемые в данном исследовании. Оптические установки, настройки программного обеспечения (лазерные линии, дихроичных зеркала, фильтры) и выбор калибровки красители могут быть изменены для настройки другие FPs и Микроскоп.

  1. Включите микроскоп и лазеры по крайней мере за час до эксперимента для обеспечения стабильности лазерного и уравновешивания температуры.
  2. Подготовка 100-200 мкл соответствующего водорастворимый Люминесцентную краску решений (см. Таблицу материалов для примеров) в воду или PBS для калибровки фокуса тома, с концентрациями в диапазоне 10-50 Нм.
  3. Место Красильные Растворы на блюдо чистой 35-мм стекла дно #1.5, т.е., толщиной 0,16-0,19 мм.
    Примечание: В идеале, используйте посуду с покровным стеклом высокой производительности с низкой толщины терпимости, например, 0.170 ± 0,005 мм, позволяя оптимальным воротник кольцо коррекции (шаг 3,6). Важно использовать тот же тип блюдо как позже используется для следующих экспериментов.
  4. Поместите блюдо, содержащий краситель решение непосредственно на цели (желательно, погружения в воду, с NA 1.2) обеспечить сосредоточение внимания в раствор. Кроме того Поместите блюдо на держатель образца и сосредоточиться в образце (например, 10-20 мкм выше нижней части блюдо).
    Примечание: Мы не рекомендуем использовать масла целей из-за плохой сигнал, полученные при фокусировке глубоко в водный образцы.
  5. Настройка пути возбуждения и выбросов, например, выбрать 488 нм лазер, 488/561 Нм дихроичное зеркало, обнаружения окна 499-552 Нм и отверстие размером 1 блок Эйри (АС). Убедитесь, что отверстие размер является таким же, как тот, который будет использоваться в кросс корреляции измерений.
  6. Отрегулируйте обскуры положении (Регулировка обскуры) и объективных воротник кольцо, чтобы максимизировать скорость счета. С этой целью поверните кольцо воротника до максимум скорость обнаружения.
    Примечание: Коррекция кольцо воротник приходится конкретные толщина покрытия стекла используется. Максимальной скорости счета, т.е., собирая столько фотонов на молекулу максимально, имеет решающее значение для максимизации отношение сигнал шум (SNR) измерений.
  7. Выполните серию FCS точки измерения (например, 6 измерения в разных местах, состоящих из 15 повторений 10 s, т.е. 2,5 мин общее время, пробы с 1 µs продолжительность или меньше) на ту же мощность лазера используется в кросс корреляции измерения (обычно ~ 1%, т.е., ~ 1-2 мкВт).
  8. Соответствуют модели трехмерных диффузии, включая вклад триплет (уравнение 6) к данным.
    Примечание: Как правило, полученные диффузии раз являются около 30 МКС и фактором структуры составляет около 4-8.
  9. Рассчитать талии w0 от времени измеренное среднее диффузии и опубликованных значений для коэффициент диффузии используется краска на комнатной температуре25 согласно уравнение 5. Типичные значения — 200-250 Нм.
  10. Повторите процедуру калибровки (шаги 3.4-3.9) с различными Люминесцентную краску для второго канала обнаружения при необходимости (например, 561 Нм возбуждения и обнаружения между 570 Нм и 695 нм). Держите обскуры положение и размер, как он был установлен для первого канала обнаружения.
  11. Вычислить молекулярный яркость (уравнение 8) от калибровки измерений и хранить полученные значения.
    Примечание: Стандартные значения для установки используется, ~8-10 кГц/молекулы (MOL) для 1.8 мкВт 488 нм мощности возбуждения. Ниже, чем обычные значения могут указывать на грязь на цель, рассогласование установки или сокращение лазер вывода. Проверить и сохранить выходной мощности лазера на цель, регулярно с помощью измерителя мощности. Для сравнения различных установок молекулярные яркость, нормализуется путем возбуждения мощность лазера является наиболее значимых параметров для оценки производительности микроскопа.

4. сканирование кросс корреляции отдела Флуоресценция: приобретение

Примечание: Следующий протокол написан для экспериментов с mEGFP/mEYFP («зеленый») и mCherry/mCardinal («красный») на лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп используемые в данном исследовании. Оптические установки и настройки программного обеспечения (лазерные линии, дихроичных зеркала, фильтры) может отличаться для других FPs или Микроскоп установок.

  1. Установка оптического пути, например, 488 нм и 561 Нм возбуждения и 488/561 Нм дихроичное зеркало, обскуры 1 АС для возбуждения 488 нм. Чтобы избежать спектральные помехи, выберите два отдельных треков для возбуждения и обнаружить mEGFP/mEYFP (488 нм возбуждения, зеленый канал) и mCherry / mCardinal (561 Нм возбуждения, красный канал) последовательно и выберите переключатель отслеживает каждую строку. Для обнаружения используйте соответствующие фильтры для каналов, например, 499-552 Нм в зелёном канале и 570-695 нм в красный канал.
  2. Если чередовались возбуждения не является возможным, используйте настройки соответствующего фильтра для красного канала для сведения к минимуму спектральные помехи (т.е. обнаружить флуоресценции mCherry/mCardinal не ниже 600 Нм). Это может уменьшить количество фотонов, обнаруженных в красный канал и тем самым уменьшить SNR.
  3. Поместите блюдо, содержащих смешанные клетки на держателя образца. Подождите, по крайней мере 10 мин для обеспечения температуры уравновешивания и уменьшить фокус дрейфа.
  4. Сосредоточиться на клетки, с помощью передачи света в меню Поиск .
  5. Поиск пары «красный» и «green» клеток контакт друг с другом. Для положительных кросс корреляции или гомо димера регулировки яркости (см. раздел 2), поиск для изолированных клеток, испуская флуоресценции в каналы или соответствующих гомо димера сигнала в PM.
    Примечание: (Критический) свернуть пример воздействия при поиске клетки, чтобы избежать предварительного отбеливания, который может уменьшить кросс корреляции26. Таким образом проверка на самую высокую скорость сканирования и низкие лазерной полномочий. Чтобы избежать детектор насыщенность во время визуализации, решительно выражая клетки, поиск в режиме интеграции. Однако чтобы свести к минимуму воздействие, сканирование на нижней лазерной полномочий возможна в Фотон подсчитывая режиме.
  6. Выберите перпендикулярно пути проверки ячеек контакт (или вечера одну ячейку для положительный контроль яркости кросс корреляции или гомо димер) с помощью кнопки Обрезка как изображены фигуры 1B и 2A.
    Примечание: Некоторые старые Микроскопы не позволяют произвольного сканирования направления. В этом случае ячеек контактов с ориентацией перпендикулярно оси сканирования должны быть расположены.
  7. Увеличить для достижения размер пикселя 50-200 Нм и выберите строку в Режим сканирования. Задать Размер кадра до 128 × 1 пикселей.
    Примечание: Типичный размер составляет 160 Нм, соответствующий сканирования длиной около 20 мкм.
  8. Установите скорость сканирования максимальное разрешенное значение, например, 472.73 МКС в строке.
    Примечание: Для схемы альтернативного возбуждения, это соответствует 954.45 МКС время сканирования, т.е. ~ 1000 сканирует/s на установки используется. Скорость сканирования может быть скорректирована в зависимости от коэффициента диффузии протеина интереса. Для якорь мембранных белков, типичный диффузии раз являются около 10-20 г-жа время сканирования должно быть по крайней мере в десять раз меньше, чем время диффузии. Снижение скорости сканирования может побудить сильнее Фотообесцвечивание и требуют Нижняя подсветка держав. Кроме того один можно вводить паузу, например, 5 мс, между каждого сканирования для очень медленно диффундирующих комплексов, используя интервал в подменю Временных рядов .
  9. Выберите соответствующий лазерный полномочия, например, ~ 1-2 мкВт на 488 нм и ~ 5-10 мкВт для 561 Нм возбуждения.
    Примечание: Выше лазерной державы улучшить SNR, но увеличить Фотообесцвечивание. Таким образом лазерная державы должны выбираться таким образом, что Фотообесцвечивание является менее 50% стоимости начальное число.
  10. Значение 100 000-500 000 циклов .
    Примечание: Число сканов, т.е. длительность измерения, может варьироваться: измерение времени будет улучшить SNR и может быть более подходящим для медленно диффундирующих молекул, однако, движение клеток и Фотообесцвечивание ограничить максимальное измерение время. Данные, представленные здесь регулярно приобретались для ~ 3-6 мин, то есть, 200000-400000 линии сканирует.
  11. Установите детекторы Фотон подсчет режим. Нажмите Начать эксперимент , чтобы начать приобретение. Повторите шаги 4.5-4.11 для измерения другую ячейку.
    Примечание: Рекомендуется для измерения 10-15 клеток на сэмпл на уровнях различные выражения. (Критический) Избегайте детектор насыщенность на уровнях высокого выражение. Максимальное количество ставка не должна превышать ~ 1 МГц.
  12. Если яркость анализ проводится для определения олигомерных государства, выполнять гомо димера яркость калибровки измерений согласно изменение шаги 4.1-4.11: измерить каждый флуоресцентный белок гомо димера отдельно (в изолированных клеток, подготовлен с использованием Протокол раздел 2) и выполнять измерения только в одном спектральных каналов.

5. сканирование кросс корреляции отдела Флуоресценция: Анализ данных

Примечание: Следующий протокол следует реализацию процедуры анализа, подробно описаны в предыдущих статьях12,15. Код программного обеспечения по запросу авторов.

  1. Экспорт необработанных данных (например, РАКОЦИ) файлы RGB TIFF изображения в формате необработанных данных. Этот файл будет содержать кимограф с зеленый и красный канал данных в канале называют G и R изображения, соответственно.
  2. Импорт файла TIFF с программным обеспечением надлежащего анализа и действовать для выполнения анализа.
    Примечание: Следующие шаги (шаги 5.3-5,7) применяются отдельно для каждого канала:
  3. Выровняйте линии, выполняя segment-wise или движущихся время среднее с блоками 500-1000 линий. Определите положение мембраны, т.е. положение пикселя с максимальным показателем, в каждом блоке. Перенести все блоки на той же боковой позиции. Эта процедура исправляет боковое смещение ячеек контакта, например, из-за движения клеток.
  4. Суммировать все выровненные линии по оси времени и подходят средняя интенсивность профиля, используя функцию Гаусса. При наличии значительных внутриклеточных фона используйте Гаусса плюс функцию сигмовидной кишки. Определяют точки, соответствующие мембраны как все пиксели внутри ±2.5σ мембраны позиции и суммировать интенсивность этих пикселей в каждой строке, получение значения сигнала одного флуоресценции для каждой точки времени (то есть, для каждой линии сканирования).
  5. При необходимости (например, фон > 10% сигнала мембраны), применить коррекцию фона путем вычитания интенсивность средняя пиксель в цитоплазме, умноженное на 2.5σ (в пиксельных единицах) от мембраны флуоресценции в блоках 1000 строк. Избегайте яркие внутриклеточных везикулы при выборе пикселами фона.
  6. Если наблюдается Фотообесцвечивание, примените отбеливание коррекции. Таким образом подходят мембраны флуоресценции временных рядов с двойной экспоненциальная функция и применять соответствующие коррекции формулы, уравнения 116.
    Примечание: в качестве альтернативы, Фурье спектра на основе коррекции схемы могут быть прикладной27. (Критический) Если присутствует, но не исправлены для Фотообесцвечивание, CFs может сильно искажены и оценки параметров может быть сильно предвзятым (например, см. Рисунок 5E).
  7. Рассчитайте ACFs и СРС согласно уравнений 2 и 3, используя, например, несколько Тау алгоритм28. Чтобы повысить надежность анализа и избежать артефактов, выполнения расчетов для 10-20 равных сегментов всего измерения. Осмотрите флуоресценции временных рядов и CFs в каждом сегменте и удалить явно искаженная сегментов (см. примеры в рисунке 4A- 4 D). Среднее всех неискаженного сегментов.
    Примечание: Эта процедура может быть автоматизирован избежать субъективного уклоном к данных29. Для очень неустойчивы измерений имея много коротких сегментов может быть полезным. Однако, длина сегмента должна быть по крайней мере трех порядков выше диффузии время, чтобы избежать статистических undersampling ошибки29,30,17.
  8. Установите модель двумерной диффузии, 4 уравнение, полученное КВПБ. Таким образом устранить фактор структуры для значение, полученное в калибровки измерений (протокол раздел 3). Точность fit можно повысить, выполнив взвешенной пригонка, с использованием статистических весов каждой точки данных, полученных из нескольких Тау алгоритм.
  9. Вычислите коэффициент диффузии, используя калиброванный талии согласно 7 уравнение.
  10. Вычислить молекулярный яркость путем деления на соответствующее количество частиц, уравнение 8 интенсивность средняя флуоресценции в каждом канале. Нормализовать значение определяется яркости в каждом канале, средняя яркость соответствующего мономерных ссылки для получения олигомерных государства, принимая во внимание non люминесцентные FPs23. С этой целью определите средний гомо димера значения яркости от одноцветных анализа рассчитать долю не люминесцентные FPs23.
  11. Вычислите относительную кросс корреляции по данным уравнением 9.

6. кросс корреляции номер и яркость: калибровки детектора

Примечание: Следующий протокол обеспечивает общее руководство о том, как для калибровки системы обнаружения. Эта процедура является обязательной для аналоговых систем, но не является строго необходимой, когда правда Фотон подсчета детекторы используются.

  1. Химчистка решения соответствующие водорастворимый краситель (см. Таблицу материалы для примера) на 35-мм стекла блюдо дно. Установите оптический путь соответственно, т.е. 488 или 561 Нм возбуждения и обнаружения в 499-552 Нм или 570-695 нм, соответственно.
    Примечание: в качестве альтернативы, отражающей поверхности металла может использоваться вместо сушеные Красильные Растворы, поместив металлической части непосредственно поверх цель.
  2. Выполните одно цвет N & B измерений в регионах с концентрациями различных красителей или на полномочия различных лазерных. Таким образом, использовать зум для достижения размер пикселя 300 Нм, скорость сканирования для задать время нахождения соответствующих пикселей, например, 25 µs и задания циклов до 100-200 кадров.
  3. Установите детекторы для подсчета Фотон (или аналоговый режим если измерения проводятся с использованием аналоговых обнаружения) и нажмите Начать эксперимент , чтобы начать приобретение. Выполните измерение на нулевой мощности возбуждения для определения интенсивности смещение.
  4. Участок дисперсия пикселей в зависимости от интенсивности пикселей для всех измеренных точек и выполнять линейные посадки этих данных. Определить как наклон линейной fit. Вычислите шум считывания из y пересечение, используя S и смещение определяется интенсивность согласно уравнение 14.

7. кросс корреляции номер и яркость: приобретение

  1. Выполните шаги 4.1-4.4 sFCCS приобретения протокола.
  2. Используйте культур , чтобы выбрать кадр 512 × 128 пикселей вокруг ячеек контакт (или изолированные вечера для регулировки яркости гомо димер) и увеличить для достижения размер пикселя 50-100 Нм.
  3. Используйте скорость сканирования , чтобы задать время нахождения соответствующих пикселей, например, 6.3 МКС.
    Примечание: В N & B, пиксель время задержки должно быть гораздо меньше, чем время диффузии протеина интереса. Если выбран альтернативный возбуждения схемы, например, переключение отслеживает каждую линию, время между двумя треками должна быть меньше чем диффузии время протеина интереса. В противном случае уменьшается обнаружению кросс корреляции.
  4. Установите циклов до 100-200 кадров.
    Примечание: Более высокий номер кадра будет улучшить SNR, однако, движение клеток может ограничить время, общее измерение. Время сканирования каждого кадра должны быть намного выше, чем диффузии время протеина интереса. В противном случае явно яркость уменьшается, т.е. частицы, как представляется, неподвижной. Для очень медленно диффундирующих комплексов навязать пауза, например, 2 s, между кадры, используя интервал в подменю Временных рядов .
  5. Установить соответствующие значения лазерной полномочий (типичные значения — ~ 1-2 мкВт на 488 нм и ~ 5-10 мкВт для возбуждения 561 Нм).
    Примечание: Выше мощность лазера приводит к более высокой яркостью и улучшение SNR, но и расширение Фотообесцвечивание. Лазерная полномочия должны быть достаточно высокими, чтобы достичь обнаруженных яркость по крайней мере ~ 1 кГц/MOL но хранится достаточно низко, чтобы избежать более чем 10-20% Фотообесцвечивание. Для mEGFP/mEYFP или mCherry/mCardinal, менее чем в 10% Фотообесцвечивание обычно получаются.
  6. Установите детекторы для подсчета Фотон (или аналоговый режим если измерения проводятся с использованием аналоговых обнаружения). Нажмите Начать эксперимент , чтобы начать приобретение.
  7. Оцените уровень количество фотонов. Если количество ставок в ячейке контактных точек превышает 1 МГц, уменьшите мощность лазера или выберите ячейки с более низкими уровнями выражение. Повторите шаги с 7.2-7,7. для измерения следующую пару клеток. Рекомендуется для измерения 10-15 ячеек на эксперимент на уровнях различные выражения.
  8. Если яркость анализ выполняется для количественного определения олигомеризации, выполняют гомо димера яркость калибровки измерений согласно изменение шаги 7.1-7.7: измерить каждый флуоресцентный белок гомо димера отдельно (в изолированных клеток, подготовлен с использованием Протокол раздел 2) и выполнять измерения только в одном спектральных каналов.

8. кросс корреляции номер и яркость: анализ данных

Примечание: Следующий протокол следует анализ ранее описанные процедуры12,31. От авторов по запросу доступен код программного обеспечения.

  1. Импорт необработанных данных (например, РАКОЦИ файлы могут быть импортированы с помощью пакета32 Bioformats). Среднее всех фреймов и вокруг ячеек контакт, выберите регион интерес (ROI).
  2. Выполните изображения выравнивание алгоритм33, например, путем максимального пространственной корреляции между ROIs в последующих кадрах для произвольного боковых переводов, усредненное по обоим каналам. Эта процедура будет исправить на боковое движение клеток.
  3. Применить фильтр Бокскар22 уменьшить посторонние долгоживущих колебания, возникая от, например, остаточное клеточного движения или фон отбеливания. Кроме того detrending метод может применяться для устранения Фотообесцвечивание34.
    Примечание: Если анализ не segment-wise или detrending применяется, явно яркость может быть значительной степени завышены.
    1. Определяют раздвижные сегментов, например, 8-15 кадры (например, 1-8, 2, 9 и так далее) и рассчитать значения яркости канала и кросс корреляции согласно уравнений 10, 11 и 15 pixel-wise в каждом сегменте. Если детекторы не верно Фотон подсчета детекторы, учитывать параметры калибровки детекторов при расчете яркость, то есть, вместо этого используйте уравнения 12 и 13.
      Примечание: Вычисление значений яркости в сегментах 8 до 15 фреймов приводит к 10-20% недооценка абсолютную яркость и 10-20% завышение числа частиц. Тем не менее яркость соотношения (например, димер на мономера яркость) не влияет, поскольку длина сегмента остается неизменной на протяжении всего анализ (данные не показаны). Статистическая ошибка для данного сегмента длиной можно определяется посредством моделирования и таким образом исправления для.
    2. Средние значения яркости полученных pixel-wise над все сегменты. В этот шаг один может удалить 5% высоких и низких значений яркости сегмент из среднего или исключить сегменты, которые показывают ясно искажения в интенсивности, вследствие, например, внутриклеточный везикул или совокупности временно присутствующих в этих пикселей.
  4. Участок значения яркости пикселов в зависимости от интенсивности пикселей и выберите населения пикселей, соответствующий контакт ячеек. Пикселами фона будет иметь очень низкой интенсивности значения. На данный момент пересмотреть уровень максимальное количество. Исключите пикселей с фото цены выше 1 МГц для предотвращения скопления эффектов.
  5. Создайте канал и кросс корреляции гистограммы яркости выбранной ячейке контактных точек и получить значения ROI в среднем яркости. Нормализации средняя канала яркости значение средней яркостью соответствующего мономерных ссылки для получения олигомерных государства, принимая во внимание non люминесцентные FPs23. Таким образом определите значения яркости средняя гомо димер от одноцветных анализа рассчитать долю не люминесцентные FPs23.
  6. Для иллюстрации участок карты яркости канала и кросс корреляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первый тест для assay взаимодействия протеин протеина, т.е. смешивание клеток, выражая спектрально собственный флуоресцентных белков, следуют sFCCS/ccN & B измерений (рис. 1), должна быть выполнена на белки, которые не ожидается взаимодействие в ячейке контакт (т.е. отрицательный контроль). Таким образом были неоднозначными ГЭС 293T клетки, выражая myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr ладонь mEYFP) или - mCardinal и sFCCS была выполнена через контакт клеток (рисA). Предполагается, что в идеальном случае, флуоресценции сигнала в каждом канале колебаться вокруг стабильной означает, вследствие диффузионного движение белков в ТЧ и статистические вариации количество белков в фокуса тома. Для белков, которые не взаимодействуют колебания в обоих каналах независимы друг от друга, и, таким образом, спектральные кросс корреляции, как ожидается, будут колебаться вокруг нуля. Действительно в типичные измерения (рис. 2C) наблюдалось относительное кросс корреляции близок к нулю. ACFs Показать характерные распада раз ~ 10-20 мс (соответствующее, в среднем, Dmyr ладони = 1,3 ± 0,3 мкм2/s (означает ± SD, n = 20 ячеек)), как ожидается для диффузии myr ладонь mEYFP и - mCardinal в Личку, например, Dmyr ладони = 0,88 ± 0,11 мкм2/s (среднее ± SEM) на основании флуоресценции восстановления после того, как Фотообесцвечивание (FRAP) экспериментов35. В частности эти довольно медленной динамики позволяют использовать чередуя схемы возбуждения, т.е. переключение между только зеленый и только красный возбуждения и обнаружения каждую строку, вызывая ~0.5 мс задержки между сигналами в обоих каналах, но подавление спектральные помехи. В среднем, очень низкий средний кросс корреляции ± 0.08 0.10 (означает ± SD, n = 17 клетки) был получен для отрицательного контроля (рис. 3E), как ожидалось.

Далее положительный контроль кросс корреляции был использован для калибровки максимально возможной кросс корреляции в оптические установки. Таким образом мембрана якорь гетеро димера myr ладонь mCardinal-mEYFP была выражена в клетках 293T ГЭС и sFCCS измерения проводились на единичных клеток (рис. 2B). Полученные СРС позитивные амплитуд и показали аналогичные распада раз как ACFs, снова ~ 10-20 мс (Рисунок 2D). В среднем, относительной кросс корреляции 0.96 ± 0,18 (означает ± SD, n = 14 клетки) был измерен для позитивного управления (рис. 3E).

Figure 2
Рисунок 2 . Сканирование флуоресцентной спектроскопии кросс корреляции контрольных измерений. (A) представитель изображения смешанных ГЭС 293T клетки выражая myr ладонь mEYFP /-mCardinal как отрицательный контроль для транс взаимодействий. Желтая стрелка указывает, что sFCCS сканирования путь. Масштаб бары находятся 5 мкм. (B) представитель изображений ГЭС 293T клеток, выражая myr ладонь mCardinal-mEYFP гетеро димер (слева: зеленый канал, справа: красный канал) как позитивного управления кросс корреляции. Желтая стрелка указывает, что sFCCS сканирования путь. Масштаб гистограммы являются 5 мкм. (C) представитель CFs (зеленый: ACF в зелёном канале (mEYFP), красный: ACF в красном канале (mCardinal), синий: СРС) получил в sFCCS измерения для отрицательного контроля. Сплошные линии показывают подходит модель двумерной диффузии в КВПБ. (D) представитель CFs (зеленый: ACF в зелёном канале (mEYFP), красный: ACF в красном канале (mCardinal), синий: СРС) получил в sFCCS измерении позитивных элемента управления. Сплошные линии показывают подходит модель двумерной диффузии в КВПБ. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пригодность этого анализа затем было расследовано в биологически соответствующий контекст путем прощупывания транс взаимодействия белка амилоида прекурсоров как 1 (APLP1), тип я трансмембранный белок, который было предложено действовать в качестве нейронов адгезии рецептор. С этой целью APLP1 сливается с mEYFP или mCardinal была выражена в клетках 293T ГЭС. Чтобы исключить вмешательство с внеклеточного связывания доменов, FPs были слиты в C-конечная APLP1, т.е. на внутриклеточный домен (см. рис. 1А). Затем sFCCS измерения проводились на ячейке контактов между APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal, выражая клеток (рис. 3А), что приводит к ACFs и РСС (рис. 3C), которые предоставляют информацию о APLP1 диффузии и взаимодействия. Положительный относительный кросс корреляции 0,45 ± 0.21 (означает ± SD, n = 17 клетки) было отмечено, т.е. значительно больше, чем негативных управления (рис. 3E) значение. Интересно, что средняя относительная кросс корреляции был ниже, чем у положительных управления (рис. 3E), указанием только частичное транс привязки.

Наконец assay был использован чтобы показать, что ионы цинка облегчить расширение APLP1 транс привязки3112,. SFCCS CFs, полученных в результате измерений через APLP1 кластеров в ячейке контактов (характеризуется сильным Сопредседатель локализация APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal и быстро формировать в присутствии ионов цинка, Рисунок 3B) показал сильно снижение динамики, как видно из больших распада раз и колебания на большое отставание раз (рис.D). Тем не менее, анализ амплитуд в короткие задержки раз показал значительное увеличение относительного кросс-корреляции 0,8 ± 0,3 (означает ± SD, n = 17 клетки), т.е. ~ 80% калиброван максимум (рис. 3E). Это следует ожидать, что такой медленной динамики вызвать серьезные искажения корреляции кривых (см. Рисунок 3D) за ограниченное количество диффузно событий, которые могут быть обнаружены во время конечных измерения, вызывая так называемые частицы шум30. Для точной количественной оценки время максимальной задержки должно быть по крайней мере 3 порядков выше диффузии время (см. предыдущие обзоры17 30,для получения более подробной информации).

Молекулярные яркость от sFCCS APLP1 данных далее было проанализировано, используя myr ладони отрицательный контроль как мономерных ссылка в каждом канале и исправление на сумму23номера флуоресцентные белки. После добавления Ион цинка, молекулярные яркость значительно увеличилась с небольшой олигомеров (~ димеры) для больших мультимеры, состоящий из ~ 10-50 мономеров на каждую ячейку (рис. 3F). Таким образом в среднем, до ~ 100 APLP1 мономеров присутствуют в кластере общий белок на стыке ячеек.

Figure 3
Рисунок 3 . Сканирование измерений флуоресценции кросс корреляции спектроскопии APLP1 взаимодействий в ячейке контактов. (A, B) Представитель изображения ГЭС 293T клеток, выражая APLP1-mEYFP (зеленый) / APLP1-mCardinal (красный) до (A) и 30 мин после Цинк лечение Ион (B, различные клетки). Желтые стрелки показывают, sFCCS сканирование пути. Масштаб гистограммы являются (5 мкмC, D). Представитель CFs (зеленый: ACFs в зелёном канале (mEYFP), красный: ACFs в красном канале (mCardinal), синий: СРС) получил в sFCCS измерения (C) APLP1 перед началом лечения Ион цинка и (D) после лечение Ион цинка. Сплошные линии показывают подходит двумерных диффузии модели CFs. (E) Box участки относительного кросс-корреляции, полученные из sFCCS анализ негативного контроля («негативный»), APLP1 в отсутствие и наличие ионов цинка и позитивные кросс корреляции управления («позитив»). Земельные участки Показать медианных значений и усы, начиная от минимального до максимального значения. (F) Box участков нормализованных молекулярной яркости в зеленый канал (mEYFP) получил от sFCCS анализа APLP1 в ячейке контактов в отсутствие и наличие ионов цинка. Для не люминесцентные mEYFP, основанный на инструментальных замерах sFCS myr ладонь mEYFP-mEYFP гомо-димеров выражена в клетках 293T ГЭС, измеренной же условиях23были исправлены значения яркости. Земельные участки Показать медианных значений и усы, начиная от минимального до максимального значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Все измерения, показанных были исправлены для дополнительных, паразитные колебания происходят в клетках, которые, если не принимать во внимание, будет сделать sFCCS анализа сложной. Для отрицательного контроля например, это может привести к ложно положительных кросс корреляции, если нет коррекции схемы применяются. Два основных процессов, которые могут серьезно исказить КВПБ являются: 1) неустойчивостей в записанных флуоресценции сигнала благодаря внутриклеточных пузырьки, которые временно ввести фокуса тома или замедлить мембраны динамика, например, дрейф в z направлении и 2) Фотообесцвечивание. Для определения переходных неустойчивостей, рекомендуется разделить полную измерений в 10-20 одинаково размера сегментов и осмотрите интенсивности временных рядов и CFs в каждом сегменте. Эта процедура показана на рис. 4, который дает пример явно искаженная сегменты, полученные при анализе отрицательный контроль измерения. Переходных нестабильность (рис. 4A, интенсивности следы сегментов 1 и 2) может привести к СРС, имеющих отрицательные значения (Рисунок 4B, сегмент 1) или высокой ложно положительных кросс корреляции (Рисунок 4B, сегмент 2). Как правило такая нестабильность видны в интенсивности серии как медленный сигнал вариации (рис. 4A). Соответствующие CFs обычно сильно отклоняться от КВПБ большинства сегментов, отображения, например, выше амплитуды и гораздо медленнее распада раз на ~ второй шкалы (см. Рисунок 4B-4 D). Рекомендуется удалить такие сегменты из анализа и для расчета окончательного КВПБ путем усреднения всех неискаженного сегментов, то есть, сегменты характеризуется CFs, не отступая от большинства КВПБ. как правило, это делается в графический Удаление интерфейса 1) последовательно изучая сегментов, 2) четко искажает сегменты из среднего и 3) проверка КВПБ оставшихся сегменты отношении Обновлено среднем КВПБ сегментов, которые не были удалены. Применяя эту процедуру, частично искаженные длинные измерений (рис. 5A), показаны медленно распадаться (поврежден) CFs (рис. 5B) были успешно исправлены и значимые корреляции кривые были Восстановленные (рис. 5C). Как правило эта процедура коррекции может быть автоматизированным29, избегая визуального осмотра пользователем, которые могут быть подвержены субъективным предвзятости. По сравнению с интенсивностью на основе фильтрации методы36, в котором малые контейнеры измерения оцениваются на основании их интенсивности по сравнению с средней интенсивности полное измерение и удалены, если превышение порогового значения параметров, описанных процедура не полагаться на внешние параметры и также учитывать незначительные нестабильность.

Для того, чтобы компенсировать Фотообесцвечивание, описаны математические коррекции, уравнение 1, был применен. Как правило, Фотообесцвечивание может быть идентифицирован экспоненциального распада флуоресценции сигналов (рис. 5D), преобладая CFs, который затем показать ложно положительных кросс корреляции и распада раз на ~ мин шкалы (см. форму типичная кривая в 5 рисунокE). Процедура коррекции восстановлены неискаженного CFs (Рисунок 5F). Как уже упоминалось, аналогичные интенсивности вариации в пределах одного измерения может также вызываться PM движения, например, z дрейф или большой медленно движущихся структур. Однако если подобный экспоненциальный распады всех измерений, Фотообесцвечивание будет наиболее вероятным источником. Как правило схемы коррекции можно комбинировать, например, интенсивность фильтрации, фильтрации на основе CF и далее методы такие, как преобразование Фурье на основе фильтрации медленный сигнал различий в частоте пространства27.

Figure 4
Рисунок 4 . Segment-Wise анализ сканирования флуоресценции кросс корреляции спектроскопии измерения отрицательных управления кросс корреляции. (A) интенсивности флуоресценции в зеленый (F1) и красный канал (F-2) два различных времени сегментов (каждое измерение было проанализировано 20 сегментах ~ 20 s каждый), полученных от sFCCS измерение отрицательного контроля. (B) СРС каждого из 20 сегментов. СРС для этапов 1 и 2, выделены красным и оранжевым, соответственно. (C, D) ACFs каждого сегмента в Грин (C) и (D) красный канал. ACFs для этапов 1 и 2, выделены красным и оранжевым, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Возмущений в сканирование флуоресценции кросс корреляции спектроскопии измерений в ячейке контактов, примером для отрицательного контроля кросс корреляции. (A) полный флуоресценции временных рядов для измерения образцового в Грин (F1) и красный канал (F-2). Твердые красные линии представляют двойной экспоненциальный fit временных рядов в каждом канале. (B, C) CFs (зеленый: ACFs в зеленый канал, красный: ACFs в красном канале, синий: СРС) флуоресценции временных рядов в A, определяется (B) сопоставление всей измерения или (C) корреляция 20 сегментов, отдельно и в среднем не менее искаженной CFs ~ 80% (зеленый канал) и ~ 50% (красный канал) сегментов. Жирные линии обозначают соответствия модели двухмерные диффузии к данным. (D) полный флуоресценции временных рядов и двойной экспоненциальный fit (твердые красные линии) измерения характерны существенные отбеливания в Грин (F1) и красный канал (F-2). (E, F) CFs (зеленый: ACFs в зеленый канал, красный: ACFs в красном канале, синий: СРС) флуоресценции временных рядов в D, вычисляемая (E) сопоставление всей измерения или (F) применение отбеливающих коррекции, уравнение 1, соотнося 20 сегментов, отдельно и в среднем не менее искаженной CFs ~ 90% (оба канала) сегментов. Жирные линии обозначают соответствия модели двухмерные диффузии к данным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Как дополнительный подход к sFCCS ccN b & B (рис. 1C) может использоваться для обнаружения белок белковых взаимодействий после смешивания клеток. В отличие от sFCCS ccN b & B предоставляет никакой информации о динамике белка, но позволяет измерения взаимодействий транс вдоль всей ячейке контакт в одной фокальной плоскости. Измерения на образцах APLP1 были выполнены до и после лечения с 50 мкм ZnCl2, а также на пульте управления негативные myr ладони. Эти измерения чувствительны к ячейке движений, особенно для цинка Ион лечение образцов, требующих длительного приобретение раз отчитаться за медленной динамики APLP1 кластеров. Таким образом исправить для боковое движение клетки33был реализован алгоритм выравнивание изображения. Кроме того, крытые вагоны фильтр22 (8 кадров поле Размер, ~ 5 s) был применен к удалить колебания низкой частоты измеренных сигналов. Эта процедура очень похожа на другие фильтры, используемые в N & B анализа с участием местных усреднения37 или detrending18,34, но сохраняет исходные данные без изменений, т.е., пикселы обрабатываются независимо и не усреднение или вычитания сигналов производится. Эта процедура эффективно подавляет долгоживущих колебания на масштабах времени больше, чем в поле размер22. После анализа таких данных значения яркости кросс корреляции для всех образцов были сопоставлены путем объединения всех ячеек контакт пикселов гистограмма яркости кросс корреляции. Для APLP1 в отсутствие ионов цинка (рис. 6A и 6 D) положительный среднем Bcc 0,068 ± 0,004 (означает ± SEM, n = 18 клетки) было отмечено. После добавления Ион цинка (Рисунок 6B и 6E), значениеcc B увеличилось до 0,266 ± 0,006 (означает ± SEM, n = 19 клетки). Для отрицательного контроля (рис. 6C и 6F), было обнаружено ниже средняя яркость кросс корреляции (Bcc = 0.022 ± 0,002, означает ± SEM, n = 26 клетки). Для оценки стехиометрии APLP1 комплексов в ячейке контактов, яркость APLP1-mEYFP нормализовалось, используя среднее значение, полученное за myr ладонь mEYFP (т.е., отрицательный контроль) и исправлениями на сумму не люминесцентные белки23. По согласованию с sFCCS данных распределение яркости был сосредоточен вокруг значение, соответствующее димеров (рис. 6G), в отсутствие ионов цинка, предложив в среднем стехиометрии 2:2. После лечения Ион цинка, нормализованных яркость сильно смещается в больших значений, начиная от ~ 10-~ 60 (рис. 6H), т.е., stoichiometries из по крайней мере 10:10 или больше, снова в хорошем согласии с данными sFCCS.

Figure 6
Рисунок 6 . Кросс корреляции номер и яркость измерения APLP1 взаимодействий в ячейке контактов. (A-C) Представитель ccN & B изображение рамки ячеек контактов между APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal выражая ГЭС 293T клетки без (A) и с цинком ионов (B) или выражая myr ладонь mEYFP и myr ладонь mCardinal клетки как отрицательный Управление кросс корреляции (C). Масштаб гистограммы являются 5 мкм. (D-F) гистограммы яркости (Bcc) кросс корреляции всех обследованных пикселей и клетки, полученные из ccN & B анализ ячеек контактов в APLP1 образцах (D), цинка лечение APLP1 образцы () E) и образцы, содержащие myr ладонь mEYFP и myr ладонь mCardinal (F). (G, H) Нормированный гистограммы яркости APLP1 образцов (G: без ионов цинка, H: ионами цинка) для зеленого канала (mEYFP), полученные из анализа яркости же клеток и трансформирования, используемые для расчета Bcc. Врезные в G показывает увеличение в нормализованной яркостного диапазона от -2 до 10. Для не люминесцентных mEYFP на основе измерений N & B myr ладонь mEYFP-mEYFP гомо-димеров выражена в клетках 293T ГЭС, измеренной же условиях23были исправлены значения яркости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы выполнить ccN & B анализа, должны быть выполнены тщательной калибровки детекторов. Для экспериментальной установки, используемые в данном исследовании стала очевидной необходимость такой калибровки, когда молекулярная яркость была проанализирована в фиксированных выборок (т.е. в отсутствие число колебаний). В этом случае молекулярные яркость ожидается нулю согласно уравнения 10, поскольку разница должна исходить только из детектор шума. Однако когда ROI, который содержит только (неподвижные) фон пикселях анализируемого (Рисунок 7A и 7B), было определено положительное яркость ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Аналогичные значения был получен исполняющие N & B измерения ячеек 293T ГЭС, выражая glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, рис. 7C) с различной лазерные полномочия и экстраполяции измеренная молекулярная яркость нулевой мощности лазера. Для исправления этого эффекта, мы провели систематический калибровки детектора, как сообщалось ранее (см. уравнение 12)19,20. Поэтому мы измерить отклонение как функцию скорости отсчётов детектор на основе выборки, состоящей из сушеных Люминесцентную краску решения и определены параметры S, Equation 24 и смещение курс темные игр. Последний был получен от измерения интенсивности на нулевой мощности лазера и было, в нашем случае, незначительным. С линейной нужным дисперсии против сюжет интенсивности мы определили, согласно уравнению 14, склоне S = 1.1 и незначительной индикации шума. Определены значения (S = 1.1, Equation 24 = 0, смещение = 0) были использованы для правильно вычислить молекулярный яркости и номер согласно уравнений 12 и 1319. Кроме того более эмпирические схема коррекции может применяться с тем, что superpoissonian детектор шум, т.е., ~ 10% больше чем реализуется выстрел шум, также будет объяснить наблюдения положительных молекулярной яркости в пикселей без число колебаний. Используя это предположение, определяется яркость ~0.1 cts./(MOL x dwell time) в таких точках можно рассматривать как постоянную яркость смещение и таким образом должны быть вычтены из всех значений яркости, рассчитывается с уравнением 10. Самое главное, оба описанные подходы приводят к те же результаты при расчете соотношения яркости, как Equation 24 и смещение незначительны. Стоит отметить, что среди различных Микроскопы одного и того же типа (того же производителя, же модель, ХААСП детекторы в Фотон подсчитывая режиме) различные значения S наблюдались, подчеркнув необходимость тщательного детектор калибровки на каждой индивидуальной настройки.

Дальнейшее важный параметр влияет на производительность детектор в измерения яркости это мертвое время детектор. Как ранее было показано, Мертвое время детектор может существенно уменьшить обнаруженных молекулярной яркость, даже на средних количество ставок (выше 102-103 кГц)38. Чтобы избежать этого артефакта, измерения следует выполнять либо по более низким ставкам фото, или мертвого времени должен быть откалиброван, основанные на выполнении N & B или FCS в разведении серии, например, EGFP в буферном растворе. Затем измеренной количество ставок могут быть исправлены с помощью калиброванного Мертвое время38. Для установки, используемые в данном исследовании, калибровки, используя N & B на разреженных Красильные Растворы показал стабильную молекулярную яркости значений до количество ставок ~0.5 МГц и соответствующее Мертвое время ~ 6 НС (7 РисунокE). Снижение по более высоким ставкам игр могут быть исправлены таким образом, с помощью опубликованных ранее коррекции формула38, что приводит к постоянной яркости ~ 8 кГц/МОЛЬ.

Figure 7
Рисунок 7 . Калибровки детектора для анализа числа и яркость. (A) представитель изображение из N & B измерений ГЭС 293T клеток, выражая GPI-mCherry. ROI (синий пунктирный прямоугольник) был выбран в фоновом режиме. (B) гистограммы яркости пикселей всех пикселей, соответствующий ROI, показано в. Средняя пикселей Яркость, полученные от установки гистограммы яркости пикселей с функцией Гаусса, является ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Данные были приобретены на время нахождения 25 µs пикселей. (C) молекулярной яркость, полученные из N & B анализа GPI-mCherry, выраженные в ГЭС 293T клеток, измеряется в трех различных лазерных держав (6 клетки, 561 Нм возбуждения, время нахождения пикселей 25 µs). Данные отображаются как означает ± SD. Линейная регрессия (красная линия) обеспечивает значение смещения 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) участок дисперсии пикселей как функция интенсивности пикселей от N & B измерений сушеные раствора Люминесцентную краску (возбужденных на 561 Нм), объединенный со всех точек нескольких измерений в различных регионах образца. Сплошная красная линия показывает линейной аппроксимации данных, приводит в склоне 1.1, обеспечивая коэффициент S калибровки детектора. Молекулярные яркость (E) как функцию скорости отсчётов детектор, полученные из N & B измерения разреженных Флюорофор растворов (возбужденных на 488 нм). Ранее опубликованные коррекции схема38 был применен, используя различные возможные значения для детектора мертвого времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Экспериментальная процедура, описанная здесь позволяет расследование протеин транс взаимодействий в ячейке контактов, флуоресценции колебания спектроскопии методы, а именно sFCCS и ccN & B. Эти методы включают статистический анализ флуоресценции колебаний, излучаемых два спектрально разлученных FPs, сливается с белки интерес на контакт двух соседних клеток, каждое выражение один или другой синтез белка. Присутствие транс комплексов количественно путем прощупывания степень распространения совместного белков в соседних PMs. Помимо подробных протоколов о подготовки, сбора данных и анализа эта статья содержит экспериментальные доказательства успешное применение assay нейрональных адгезии белка APLP1. Мы покажем, что APLP1 проходит специфический, homotypic транс взаимодействий в ячейке контактов. Кроме того ионов цинка способствуют формированию APLP1 кластеров в ячейке контактов, которые обеспечивают многовалентных платформу для взаимодействия транс и, таким образом, стимулировать расширение trans привязки.

В отличие от предыдущих анализов для выявления такого взаимодействия, основанные на подрывной биохимические методы6представленный подход может выполняться непосредственно на живые клетки, без необходимости фиксации или изоляции белковых комплексов. Кроме того она обеспечивает молекулярной специфичность и информации путем обнаружения флуоресцентных белков, генетически сливается с протеина интереса, в отличие от предыдущих качественных анализов8,9. По-разному от других флуоресцирования на основе подходов, таких как ладу10 и флуоресценции дополнения11, существует никаких требований для флуоресцентных меток локализовано на стороне внеклеточно (потенциально мешать белок белковых взаимодействий). Тем не менее стоит отметить, что C-терминала FPs все еще могут изменить привязку к внутриклеточных компонентов, например, адаптер белки, которые взаимодействие с цитоскелета. В частности assay применима к гомо - и гетеротипичной взаимодействия.

Стоит упомянуть несколько требований для успешного применения представленных assay. Выполненных флуоресценции колебания методы основаны на временных измерений, которые требуют яркие и фотостабилен мономерные FPs, который является основным препятствием для многих красный FPs23. Несмотря на то, что представленные сканирования схемы особенно хорошо подходит для исследования динамики медленно трансмембранных белков, которые обычно участвуют в ячейке взаимодействий, остаточная Фотообесцвечивание еще может произойти. Таким образом мы представляем подробное описание схемы коррекции, т.е., отбеливание коррекции для sFCCS и крытые вагоны фильтра ccN b & B, которые свести к минимуму такие возмущения. Кроме того мы обсуждаем выравнивание численных алгоритмов, которые эффективно исправить другие систематические возмущений, таких как боковое движение клеток и обеспечить руководящие принципы для удаления временных нестабильности. Основным источником такой нестабильности является везикулярный транспорт, т.е., внутриклеточный везикулы перевозящих протеина интереса которые временно ввести фокуса тома. Хотя варьируется от случая к случаю, это явление можно в целом серьезно беспокоить сбора и анализа данных. Однако применение алгоритмов коррекции улучшает стабильность приобретения, позволяя расширенные измерения времени, которые необходимы для зонд особенно медленно диффузионное динамику. В этой связи он должен быть подчеркнул, что присутствие диффузионное динамики является необходимым условием для работы метода. Пример иона цинка опосредовано APLP1 кластеризации показывает ярким примером больших, очень медленно белковых комплексов (D ≈ 0,001 µm2/s), которые толчок технику к своим пределам и предотвратить точную количественную оценку основной динамики, из-за большого шума вызванные ограниченной приобретение время30,17.

В этом контексте недавние достижения на расчесывание sFCS и супер-резолюции, подходы, например, сканирование FCS истощения простимулированное излучение (интереса-FCS), может быть полезным, предоставляя меньшие фокуса тома и таким образом меньше эффективного распространения раз39 ,40. Это могло бы также помочь решить белка кластеров в случае неоднородной локализация протеина интереса в ячейке контактов, как для APLP1 в присутствии цинка. К сожалению осуществление кросс корреляции сканирования интереса-FCS, т.е., STED-FCCS, которые могли бы непосредственно применяться здесь, не была продемонстрирована успешно еще из-за трудности поиска совместимых красители для двухцветных интереса-FCS. В случае достаточно быстрая динамика (D ≥ ~0.05 µm2/s) sFCCS анализ позволяет количественно диффузии белков в ячейке контактов или в других регионах PM12.

Кроме того, анализ яркости может выполняться для всех данных (sFCCS и ccN & B), обеспечивая оценку стехиометрии транс белковых комплексов. Следует отметить, что точность количественной оценки стехиометрии увеличивается с количество белков, которые связывают в транс (то есть, если есть только несколько комплексов СНГ , которые также могут влиять на определение яркость). Анализ яркость не позволяют решать смеси различных олигомерных государств, e.g.,cis мономеров и тетрамера транс . Больше в целом, следует отметить, что N & B не удается разрешить смеси разных видов олигомерных, равномерно распределенных в образце. Если несколько видов присутствуют в пиксель, одно точное значение яркости будет измеренных (т.е., средневзвешенное значение яркости каждого олигомерных видов). Статистическое распределение яркости наблюдаемых значений (например, в разных точках) не подключен непосредственно к относительное количество олигомерных видов. Для устранения таких смесей, другие методы должны быть использованы (например, распределения пространственных интенсивности анализа (SpIDA)41, фотон, считая гистограммы (PCH)42). Аналогичным образом количественная оценка спектральных кросс корреляции в sFCCS обеспечивает точную количественную оценку фракции протеинов связанные и несвязанные только для простых, известный stoichiometries, например, 1:1. Для более сложных стехиометрии дальнейшие предположения должны направляться43. В целом анализ яркость остается мощным экспериментальный инструмент, если системе детектора и фракция не флуоресцентные FPs калиброванные23 как описано в протоколах.

Хотя приложения, представленные здесь сосредоточено на белок белковых взаимодействий в адэрентных клеток, assay может применяться для широкого круга образцов, например, подвеска клетки. Для таких систем коррекция для боковых клеточного движения может быть особенно важное значение. Кроме того его можно легко применить к модели мембранных систем таких как GUVs или GPMVs, позволяя количественное определение молекулярных взаимодействий в хорошо контролируемых условиях, например, различные липидной композиции или мембраны, отсутствие организованной цитоскелета. При выполнении sFCCS на такой везикулы, вертикальное движение может вызвать дополнительный сигнал колебания, но может быть сведено к минимуму, при фокусировке на большие пузырьки. В этом контексте, многообещающим несколько комбинаций, например, GUV- / GPMV-клеток смешивания12. Как показано в недавней публикации, формирование иммунной синапсы могут успешно моделируется таких систем44. Таким образом представленные assay, безусловно, будет полезным для расследования большое разнообразие взаимодействий ячеек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддерживается, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Грант 254850309. Авторы благодарят Мадлен Luckner для критических чтении рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Tags

Биохимии выпуск 142 белок белковых взаимодействий ячеек взаимодействия клетки клеточной адгезии флуоресцентной спектроскопии колебания флуоресцентной спектроскопии корреляции номер и яркость N & B
Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunsing, V., Chiantia, S. A… More

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter