Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

Published: December 1, 2018 doi: 10.3791/58582
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biochemistry and Biology, Cell Membrane Biophysics Group, University of Potsdam

Summary

Det här protokollet beskriver ett fluorescens fluktuation spektroskopi-baserat tillvägagångssätt för att undersöka interaktioner mellan proteiner medla cell-cell interaktioner, dvs proteiner lokaliserade i cell korsningar, direkt i levande celler. Vi tillhandahåller detaljerade riktlinjer på instrumentkalibrering, datainsamling och analys, inklusive korrigeringar till möjlig artefakt källor.

Abstract

En mängd biologiska processer innebär cell-cell interaktioner, typiskt medierad av proteiner som samverkar i gränssnittet mellan angränsande celler. Av intresse klarar bara några analyser av specifikt sondera sådana interaktioner direkt i levande celler. Här presenterar vi ett test för att mäta bindningen av proteiner som uttrycks på ytbehandlar av närliggande celler, på cell-cell kontakter. Denna analys består av två steg: blandning av celler som uttrycker proteinerna av intresse smält till olika fluorescerande proteiner, följt av fluorescens fluktuation spektroskopi mätningar vid cell-cell kontakter med hjälp av en confocal laser skanning Mikroskop. Vi demonstrera genomförbarheten av denna analys i ett biologiskt relevanta sammanhang genom att mäta interaktioner av proteinet amyloid prekursor-liknande 1 (APLP1) över cell cell korsningar. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll på dataförvärvet med fluorescens-baserade tekniker (Skanna fluorescens cross-korrelation spektroskopi, cross-korrelation nummer och ljusstyrka analys) och krävs instrument kalibreringar. Vidare diskuterar vi kritiska steg i dataanalys och hur att identifiera och korrigera externa, falska signal variationer, exempelvis på grund av fotoblekning eller cell rörelse.

I allmänhet presenterade analysen är tillämplig på alla homo- eller heterotypic protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter, mellan celler av samma eller olika typer och kan genomföras på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Ett viktigt krav är stabiliteten i systemet som måste vara tillräckligt sond diffus dynamics av proteinerna av intresse under flera minuter.

Introduction

Många biologiska processer inträffar på platser av cell-cell interaktioner, t.ex., cell-cell adhesion1,2,3, cell-cell fusion4 och cellulära erkännande5. Sådana händelser är särskilt viktigt under utvecklingen av flercelliga organismer och för cell-cell kommunikation, exempelvis under immunsvar. Dessa processer är typiskt medierad av proteiner som är lokaliserade på ytan, dvs på plasmamembranet (PM) på angränsande celler och genomgå särskilda interaktioner i cell cell kontakt som är tydligt reglerad i utrymme och tid. I många fall, dessa interaktioner är direkt homo- eller heterotypic protein-protein trans interaktioner, men kan också innebära joner eller ligander egenskap extracellulära linkers1. Även om det är av grundläggande betydelse, finns det brist på analyser sondera dessa specifika protein-protein interaktioner direkt i den ursprungliga miljön i levande celler. Många metoder antingen kräva cell störningar (t.ex. biokemiska analyser såsom co-immunoprecipitation6), fixering (t.ex. vissa super-upplösning optisk mikroskopi tekniker och elektronmikroskopi av cell-cell kontakter7), eller är icke-specifika, t.ex. aggregering / vidhäftning analyser8,9. För att lösa problemet, har fluorescens tekniker genomförts utifrån fluorescens resonans energi överföring (bandet)10 eller fluorescens komplettering11. Men för att uppnå tillräckligt små avstånd mellan fluorophores, kräver dessa metoder fluorescerande etiketterna på den extracellulära sidan av proteiner10, potentiellt störa trans interaktioner.

Här presenterar vi alternativa fluorescens-baserat test för protein-protein interaktioner på cell-cell kontakter. Denna strategi kombinerar fluorescens cross-korrelation strategier (skanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi (sFCCS), cross-korrelation nummer och ljusstyrka (ccN och B)) och blandning av celler som uttrycker en fusion konstruktion av proteinet av intresse, t.ex. en vidhäftning-receptorn. De undersökta receptorerna i två samverkande cellerna är märkta med två spektralt separerade fluorescerande proteiner (FPs), från den intracellulära (se figur 1A).

De sysselsatta metoderna baseras på den statistiska analysen av fluorescens fluktuationer inducerad av diffus rörelse av fluorescerande fusionsproteinerna genom fokal volymen av en confocal laser skanning Mikroskop. Mer i detalj sonder analysens samtidig diffusionen av proteinerna av intresse för båda angränsande PMs på cell-cell kontakter. Om proteinerna genomgå trans interaktioner, kommer dessa trans komplex bära fluorescerande proteiner avger i båda spektrala kanaler, orsakar korrelerade fluorescens fluktuationer i både utsläppsländerna. Däremot, om ingen bindning uppstår, blir de antal svängningarna av proteiner i inför PMs oberoende, orsakar inga korrelerade fluktuationer. Förvärv kan utföras på två sätt: 1) sFCCS är baserat på en rad-formade scan hela cell cell kontakten och effektivt sonder samspelet i en plats som ligger i regionen kontakt. Genom en temporal analys av fluorescens svängningar ger sFCCS också dynamics information, dvs Diffusionskoefficienterna av proteinkomplex; (2) ccN & B bygger på en pixel-wise analys av en sekvens av bilder som förvärvats på cell-cell kontakt regionerna. Den har förmåga att söka och karta interaktioner längs hela kontakta region (i ett fokalplan), men ger inte information om dynamics. Båda metoderna kan kombineras med en analys av molekylär ljusstyrka, dvs genomsnittliga fluorescens signal som avges i tidsenheten av enda diffuserande proteinkomplex och, således ge uppskattningar av stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter.

I denna artikel tillhandahåller vi detaljerade protokoll för provberedning, instrumentkalibrering, datainsamling och analys att utföra presenterade analysen på en kommersiell confocal laserscanning mikroskopet. Experimenten kan utföras på något instrument utrustat med photon counting eller analoga detektorer och ett mål med hög numeriska bländaröppningen. Vi har ytterligare diskutera kritiska steg i protokollet och ger korrigering system för flera processer som orsakar tingsliga signal fluktuationer, exempelvis detektor buller, fotoblekning eller cell rörelse. Utvecklades ursprungligen för att undersöka samspelet mellan vidhäftande celler, analysen kan ändras för suspension celler eller anpassad till modellen membransystem, t.ex. giant unilamellar blåsor (GUVs) eller giant plasma membranet blåsor (GPMVs), så att den kvantifiering av interaktioner i olika lipid miljöer eller i avsaknad av en organiserad cytoskelettet12,13.

Scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi är en modifierad version av fluorescens cross-korrelation spektroskopi14 och utformades sond långsam diffus dynamics i lipid membran15. Den är baserad på en linje scan förvärv vinkelrätt till PM som innehåller de fluorescerande proteinerna av intresse. För att undersöka samspelet mellan två olika märkta proteinet arter, utförs förvärvet i två spektrala kanaler med två laserlinjer och två upptäckt windows för spektralt separerade fluorophores. På grund av långsam diffusion dynamiken av proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2per sekund), en cross-talk-gratis mätning kan utföras av omväxlande excitation systemet från linje till linje15. Analysen börjar med: 1) en justering algoritm korrigera för laterala cell rörelse utifrån block-wise genomsnitt ~ 1000 rader, 2) bestämning av placerar med maximal fluorescens signaldvs PM position, i varje block och 3) skiftande av alla block till ett gemensamt ursprung12,15, separat i varje kanal. Ett automatiskt val av pixlar motsvarar PM utförs sedan genom att välja regionen centrala från en Gaussisk passform av summan av alla anpassade linjer (dvs center ± 2.5σ). Integration av signalera i varje rad ger membran fluorescens tidsserierna F(t) i varje kanal (g = grön kanal, r = röda kanalen). Observera att pixelstorlek måste vara liten nog, t.ex. < 200 nm, att rekonstruera formen på punkten sprida funktion och hitta dess centrerar, motsvarar positionen för PM. I närvaro av betydande fotoblekning, fluorescens tidsserierna i varje kanal kan modelleras med en dubbel-exponentialfunktionen och sedan korrigeras med följande formel:16

Equation 1.    (1)

Det är viktigt att notera att denna formel effektivt korrigerar både amplituder och diffusion gånger erhållits från korrelation analys av F(t)c, jämfört med parametern uppskattningar som skulle erhållas från den okorrigerade F(t). Sedan funktionerna auto - och cross-korrelation (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beräknas:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

där δFjag = Fjag(t) - Image 1 Fjag(t)Image 2 och jag = g, r.

En tvådimensionell diffusion modell monteras sedan alla korrelation funktioner (CFs):

Equation 4.   (4)

Här, betecknar N antalet fluorescerande proteiner i observation volym och τd diffusion tiden för varje kanal. Denna modell tar hänsyn att beskrivs i experimentell inställningen diffusion av proteiner i PM uppstår i x-z planet, i motsats till den vanliga konfigurationen av fluorescens korrelation spektroskopi (FCS) experiment på membran sondering diffusion i x-y-planet av confocal volym17. Midjan w0 och struktur faktor S, som beskriver töjning wz av fokal volymen i z, S = wz/w0, erhålls från en punkt FCS kalibrering mätning utförs med spektralt liknande färgämnen och samma optiska inställningar använder redan tillgängliga värden för den diffusionskoefficienten Dfärgämne:

Equation 5, (5).

där τd, färgämne är den uppmätta genomsnittliga diffusion tid av färgämne molekylerna, erhållits från passande modell för tredimensionellt diffusion till data, med hänsyn till konto övergångar av en bråkdel T alla N molekyler till en triplett stat med en tidskonstant ττ:

Equation 6.   (6)

Slutligen beräknas Diffusionskoefficienterna (D), molekylär ljusstyrkevärden (ε) och den relativa cross-korrelationen av sFCCS data (rel.cc.) enligt följande:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

där Gcross(0) är amplituden av funktionen cross-korrelation och Equation 14 är amplituden av autokorrelation funktion i jag-th kanal.

Denna definition av den relativa cross-korrelationen, dvs med max istället för menar i ekvation 9, tar hänsyn till att det maximala antalet komplex av två protein arter vid olika koncentrationer begränsas av den arter som finns i ett lägre nummer.

Cross-korrelation nummer och ljusstyrka är baserad på en stund analys av fluorescensintensiteten för varje pixel i en bildstapel förvärvade med tiden till en fast position i urvalet, vanligtvis bestående av ~ 100-200 ramar, med två spektrala kanaler () g = grön kanal, r = röda kanalen). Från temporal medelvärdet Image 1 jagImage 2jag och variansen Equation 16 , de molekylära ljusstyrka εi och nummer njag beräknas i varje pixel och spektrala kanal (jag = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Det är viktigt att Observera att de givna ekvationerna gäller för det ideala fallet av en sann fotonräknande detektor. För analoga detektionssystem tillämpas följande ekvationer19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Här, S är konverteringsfaktorn mellan upptäckta fotoner och inspelade digitala räkningarna, Equation 24 är utslaget buller och offset hänvisar till detektorn intensitet offset. Generellt, dessa kvantiteter bör kalibreras, för någon Detektortyp, baserat på mätning detektor variansen som en funktion av intensitet för jämn belysning19, t.ex. en reflekterande metallyta eller torkade dye lösning. Förskjutning kan bestämmas genom mätning räkna räntan för ett prov utan excitation ljus. Genom att utföra en linjär regression av detektor-associerade variansen Equation 25 kontra intensitet (jag) tomt, S och Equation 24 kan vara beslutsamt19:

Equation 14.   (14)

Slutligen, cross-korrelation ljusstyrkan beräknas i varje pixel och definieras i allmänhet som21

Equation 15, (15).

där Equation 29 är cross-variansen Equation 30 .

För att filtrera långlivat fluktuationer, utförs alla ccN & B beräkningar efter en boxcar filtrering, självständigt för varje pixel22. Kort, ni, εjag (jag = g, r) och Bcc beräknas i glidande segment av t.ex., 8-15 bildrutor. Erhållits på detta sätt kan vara då medelvärdet för att få den slutliga pixeln nummer och ljusstyrka värden.

Stökiometri analys
För att uppskatta stökiometri av proteinkomplex på cell-cell kontakter, kan molekylär ljusstyrkan analyseras separat för varje spektrala kanal för sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS erhålls ett intensitetsvärde per mätning i varje kanal. I ccN & B, ett ljusstyrka histogram över alla pixlar motsvarar den cell-cell kontakten erhålls och värdet genomsnitt (eller median) kan användas som representativa ljusstyrka för mätning. Genom att utföra samma analys på en monomer referens, kan alla ljusstyrkevärden normaliseras för att direkt få den genomsnittliga Oligomera delstaten de upptäckta proteinkomplex. Vid denna punkt, är det viktigt att korrigera för förekomst av icke-fluorescerande FPs som kan leda till en underskattning av Oligomera staten. Detta görs vanligtvis genom att mäta ljusstyrka en homo-dimeriskt referens protein23,24 använder en färg sFCS eller nummer och ljusstyrka (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. provberedning: Cell-Cell blandning Assay

Obs: Följande protokoll beskriver hur blandning vidhäftande celler. Det kan ändras för celler odlade i suspension.

  1. Kärna ur ett lämpligt antal celler på en 6-well platta, exempelvis 800 000 HEK 293T celler (räknat med en Neubauer räknar kammare), en dag innan transfection. Numret kan ändras beroende på vilken tid mellan sådd och transfection och justerat för andra celltyper. För att utföra en grundläggande experiment (dvs proteiner av intresse och negativ kontroll), förbereda minst 4 brunnar. Kultur celler vid 37 ° C, 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) medium, kompletterat med fetalt bovint serum (10%) och L-glutamin (1%).
  2. Transfect celler enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell för material).
    1. För att utföra en grundläggande experiment, transfect, i separata brunnar, plasmider för proteinet av intresse smält till en 'grönt' (t.ex. monomer förbättrade grönt fluorescerande protein (mEGFP), eller gula fluorescerande protein (mEYFP)) eller 'red' (t.ex. mCherry, eller mCardinal) fluorescerande protein.
      Obs: I detta protokoll fokuserar vi på APLP1-mEYFP och APLP1-mCardinal12, och motsvarande negativa kontroll, t.ex., myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) och -mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. Allmänhet, 200 ng - 1 µg av plasmid DNA är tillräckliga. Hög transfection effektivitet ökar chansen att hitta 'röd' och 'gröna' celler i kontakt. Ändra beloppet av plasmid och transfection reagens att optimera transfection effektivitet. Kritisk: Cell konfluens bör vara cirka 70% när transfecting cellerna. Om cellerna är alltför konfluenta, kommer att transfection effektivitet minska. Om cellerna inte konfluenta nog transfection och blandning kan framkalla stress och förhindra många celler från ordentlig fastsättning efter blandning.
  3. Utföra cell blandande ~4 ± 2 h efter transfection.
    1. Ta bort odlingsmedium och tvätta vart väl försiktigt med 1 mL PBS kompletteras med Mg2 + och Ca2 +. Ta sedan bort PBS. (Kritisk) Droppe PBS väl kant för att förhindra avlossning av celler vid tvätt.
    2. Lägg till ~ 50 µL trypsin etylendiamintetraättiksyra (EDTA) syralösning drop-wise till varje brunn för att underlätta avlossning av celler. Inkubera vid 37 ° C i 2 min. efteråt, långsamt skaka 6-väl plattan sidled för att lossa cellerna.
      Obs: Utökade inkubationstider kan krävas för vissa celltyper.
    3. Lägga till 950 µL av odlingsmedium i varje brunn och resuspendera cellerna genom pipettering några gånger upp och ner längs, därmed Lossa alla celler från väl botten. (Kritisk) Se till att celler resuspended ordentligt och fristående från varandra genom att visuellt kontrollera avsaknad av stora cell aggregat efter resuspension. Annars kommer många 'röd'-'röd' eller 'gröna'-'gröna' kontakter att erhållas efter blandning.
    4. Överför cell lösningen av en brunn (protein av intresse eller negativ kontroll) till den motsvarande väl, dvs 'red' (t.ex. APLP1-mCardinal transfekterade) 'grönt' (t.ex. APLP1-mEYFP transfekterade) celler. Blanda genom att försiktigt pipettering några gånger upp och ner. Då, seedade utsäde 35 mm glas botten rätter (1 mL blandad cell lösning per maträtt), plus 1 mL odlingsmedium och kultur blandade celler celler för en annan dag vid 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Figur 1 . Experimentella arbetsflöde och schematisk representation av avsökningen fluorescens cross-korrelation spektroskopi och cross-korrelation nummer och ljusstyrka analys på cell-cell kontakter. (A) stödordningen för provberedning: två cellpopulationer transfekterade med protein av intresse (t.ex. APLP1) smält till två spektralt distinkta fluorescerande proteiner (t.ex. mEYFP och mCardinal) är blandade efter transfection. Kontakter av olikt transfekterade celler är markerade i mikroskopi experiment. För att undvika störningar med extracellulära bindande domäner, bör fluorescerande proteinet vara smält till intracellulära slutstationen för proteinet av intresse. (B) Scanning S.K. (sFCCS) mätningarna är utförda vinkelrätt till den cell-cell kontakten i två spektrala kanaler (kanal 1, grön och kanal 2, röd). Skanningslinjer (representeras som kymographs) justeras och membran pixlar summeras. Sedan beräknas ACFs och CCFs från intensitet spår Fjag(t). ACFs representeras i rött och grönt. CCF representeras i blått. (C) Cross-korrelation N & B (ccN & B) förvärv resulterar i en tredimensionell bildstapel (x-y-tid). En ROI väljs runt cell cell kontakten. Sedan kanal och cross-korrelation ljusstyrka (ε1, ε2och Bcc) värden beräknas i varje cell cell kontakt pixel. Resultatet visualiseras sedan som histogram, samla alla markerade pixlar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

2. provberedning: Positiv kontroll för Cross-korrelation experiment och Homo-Dimer konstruera för ljusstyrka analys

  1. Utsäde 600.000 HEK 293T celler, räknade med en cell räknar kammare, 35 mm glas botten rätter en dag innan transfection. Odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 i komplett DMEM medium (se steg 1.1) för en annan dag.
  2. Transfect celler med ~ 250 ng av plasmid DNA enligt tillverkarens anvisningar. För cross-korrelationen positiv kontroll, Använd en plasmid kodning en membran-förankrade fluorescerande protein hetero-dimer, t.ex., myr-palm-mCherry-mEGFP eller myr-palm-mCardinal-mEYFP12 motsvarar FPs av proteinet av intresse. För ljusstyrka kalibrering, använda plasmider kodning både en membran-förankrade FP monomer och homo-dimer motsvarar FPs smält till proteinet av intresse, t.ex., myr-palm-mEYFP och myr-palm-mEYFP-mEYFP för att kalibrera ljusstyrka analysen av APLP1-mEYFP12.
  3. Kultur celler vid 37 ° C, 5% CO2 i komplett DMEM medium (se steg 1.1) för en annan dag.

3. confocal Laser Scanning mikroskopi: Setup och fokal volym kalibrering

Obs: Följande protokoll är skriven för experiment som utförs med mEGFP/mEYFP och mCherry/mCardinal på laser skanning confocal Mikroskop används i denna studie. Den optiska setup, Programvaruinställningar (laserlinjer, dikroiskt speglar, filter) och val av kalibrering färgämnen kan ändras för andra FPs och Mikroskop uppställningar.

  1. Slå på mikroskopet och lasrar minst en timme innan experimentet att säkerställa laser stabilitet och Jämviktstiden av temperatur.
  2. Förbereda 100-200 µL av lämpliga vattenlösliga fluorescerande färg lösningar (se Tabell av material för exempel) i vatten eller PBS att kalibrera den fokala volymen med koncentrationer i intervallet 10-50 nM.
  3. Placera de dye lösningarna på en ren 35-mm glas botten maträtt #1.5, dvs har en tjocklek av 0,16-0,19 mm.
    Obs: Använd helst rätter med högpresterande skyddsglaset att ha en låg tjocklek tolerans, exempelvis 0,170 ± 0,005 mm, så att en optimal krage ring korrigering (steg 3.6). Det är viktigt att använda samma typ av maträtt som används senare för följande experiment.
  4. Placera skålen som innehåller färgämnet lösningen direkt på målet (helst, nedsänkning i vatten, med NA 1.2) för att säkerställa fokus i lösningen. Alternativt placera skålen på provhållare och fokus i provet (t.ex. 10-20 µm ovan botten av skålen).
    Obs: Vi rekommenderar inte använder olja mål på grund av dålig signal erhålls när fokusera djupt in i vattenlösning prover.
  5. Ställa in sökvägen excitation och utsläpp, t.ex., välja 488 nm laser, en 488/561 nm dichroic spegel, upptäckt fönster 499-552 nm och en pinhole storlek 1 luftiga enhet (AU). Kontrollera att pinhole storlek är detsamma som det som kommer att användas i cross-korrelation mätningar.
  6. Justera pinhole position (pinhole justering) och objektiva krage ringen att maximera räkna ränta. I detta syfte Vrid krage ringen tills maximala antalet klassar detekteras.
    Obs: Krage ring korrigeringen står för specifika tjockleken på täckglaset används. Maximera andelen räkna, dvs., samla så många fotoner per molekyl som möjligt, är avgörande för att maximera det signal-brus-förhållandet (SNR) av mätningar.
  7. Utföra en serie av punkt FCS mätningar (t.ex. 6 mätningar på olika platser, vardera bestående av 15 repetitioner av 10 s, dvs 2,5 min total tid, provtas med 1 µs dröjtiden eller mindre) på samma laser kraft som används i cross-korrelation mätningar (typiskt ~ 1%, dvs ~ 1-2 µW).
  8. Passa ett tredimensionellt diffusion modell inklusive en triplett bidrag (ekvation 6) till data.
    Obs: De erhållna diffusion tiderna är oftast runt 30 µs och den struktur faktorn är runt 4-8.
  9. Beräkna midjan w0 från den uppmätta genomsnittliga diffusion tid och publicerade värden för diffusion friktionskoefficienten används färgämnet rumstemperatur25 enligt ekvation 5. Typiska värden är 200-250 nm.
  10. Upprepa rutinen kalibrering (steg 3,4-3,9) med olika fluorescerande färgämne för en andra upptäckt kanal om det behövs (t.ex. 561 nm excitation och upptäckt mellan 570 nm och 695 nm). Hålla pinhole position och storlek som det var satt till den första Upptäck kanalen.
  11. Beräkna den molekylära ljusstyrkan (ekvation 8) från kalibrering mätningarna och lagra de erhållna värdena.
    Typiska värden för den begagnade setup är ~8-10 kHz/molekyl (MOL) för 1,8 µW 488 nm excitation makt. Lägre än vanliga värden tyda på smuts på mål feljusteringen av installations- eller en minskad laser-utgång. Kontrollera och lagra laser output befogenheter på det mål som regelbundet använder en kraftmätare. För jämförelse av olika uppställningar är molekylär ljusstyrka normaliserade excitation laser kraft den mest meningsfulla parametern att bedöma Mikroskop prestanda.

4. Skanna fluorescens Cross-korrelation spektroskopi: förvärv

Obs: Följande protokoll är skriven för experiment som utförs med mEGFP/mEYFP ('grön') och mCherry/mCardinal ('röd') på mikroskopet laser scanning confocal används i denna studie. Den optiska setup och software settings (laserlinjer, dikroiskt speglar, filter) kan vara annorlunda för andra FPs eller Mikroskop uppställningar.

  1. Ställ in den optiska vägen, t.ex. 488 nm och 561 nm excitation och 488/561 nm dichroic spegel, pinhole på 1 AU för 488 nm excitation. För att undvika spektrala överhörning, Välj två separata spår att excitera och upptäcka mEGFP/mEYFP (488 nm excitation, gröna kanalen) och mCherry / mCardinal (561 nm excitation, röda kanalen) sekventiellt och välj Växla spår varje rad. För att upptäcka, Använd lämpliga filter för båda kanaler, t.ex. 499-552 nm i den gröna kanalen och 570-695 nm i den röda kanalen.
  2. Om varvas excitation inte är möjligt, använda lämpliga filterinställningar för den röda kanalen för att minimera spektrala överhörning (dvs upptäcka mCherry/mCardinal fluorescens inte under 600 nm). Detta kan minska mängden av fotoner som upptäckts i den röda kanalen och därmed minska SNR.
  3. Placera skålen som innehåller blandade celler på provhållaren. Vänta minst 10 minuter att säkerställa temperatur Jämviktstiden och minska fokus drift.
  4. Fokusera på de celler som använder överföring ljus i menyn hitta .
  5. Söka efter ett par en 'red' och en 'gröna' cell i kontakt med varandra. Ljusstyrka (se avsnitt 2), söka efter en isolerad cell avger fluorescens i både kanaler eller respektive homo-dimer signalen på PM den positiv cross-korrelation eller homo-dimer.
    Obs: (Kritisk) minimera prov exponering samtidigt söka efter celler att undvika före blekning, vilket kan minska den cross-korrelation26. Därför, skanna på snabbaste skanningshastighet och låga laser befogenheter. För att undvika detektor mättnad medan imaging starkt uttrycker celler, Sök i integration läge. Men för att minimera exponering, är skanning på lägre laser befogenheter möjligt i fotonen räkna läge.
  6. Välj en scan sökvägen vinkelrätt till cell-cell kontakt (eller PM i en cell för positiva cross-korrelation eller homo-dimer ljusstyrkeinställningen) använder knappen Beskär som skildras i siffror 1B och 2A.
    Obs: Vissa äldre Mikroskop tillåt inte godtyckliga scan riktningar. I det här fallet har cell-cell kontakter med en riktning som är vinkelrät mot scan ska placeras.
  7. Zooma för att uppnå en pixelstorlek på 50-200 nm och välj linje i Skanningsläge. Ange storlek 128 × 1 pixel.
    Obs: Typisk pixelstorlek är 160 nm, motsvarar en scan längd av cirka 20 µm.
  8. Ställa in Skanna hastighet till det högsta tillåtna värdet, t.ex. 472.73 µs per rad.
    Obs: Ett system för alternativa excitation, detta motsvarar till 954.45 µs söktiden, dvs ~ 1000 sökningar/s på inställningarna används. Skanningshastigheten kan justeras beroende på den diffusionskoefficienten av proteinet av intresse. För membran-förankrade proteiner, typiska diffusion tider är runt 10-20 ms. bildläsningstiden bör vara minst tio gånger mindre än tidens diffusion. Lägre scan hastigheter kan framkalla starkare fotoblekning och kräver lägre belysning befogenheter. Alternativt kan man införa en paus, t.ex. 5 ms, mellan varje skanning för mycket långsamt diffuserande komplex med intervall i undermenyn Tidsserier .
  9. Välj lämplig laser befogenheter, t.ex., ~ 1-2 µW för 488 nm och ~ 5-10 µW för 561 nm excitation.
    Obs: Högre laser befogenheter förbättra SNR, men öka fotoblekning. Laser befogenheter bör därför väljas så att fotoblekning är mindre än 50% av den ursprungliga räkningen.
  10. Inställt 100 000-500 000 cykler .
    Obs: Numrera av skanningar, dvs varaktighet av mätningen, kan variera: längre mättider förbättras SNR och kan vara lämpligare för långsamt sprida molekyler, men rörelse av celler och fotoblekning begränsa maximal mätning tid. Data som presenteras här förvärvades rutinmässigt för ~ 3-6 min, d.v.s. 200 000-400 000 line File.
  11. Ställ in detektorer på fotonen räkna läge. Tryck på Starta experimentet att starta förvärvet. Upprepa steg 4,5-4.11 att mäta en annan cell.
    Obs: Det rekommenderas att mäta 10-15 celler per prov på olika nivåer. (Kritisk) Undvika detektor mättnad på höga nivåer. Maximalt antal bör inte överstiga ~ 1 MHz.
  12. Om ljusstyrkan analys utförs för att bestämma Oligomera stater, utföra homo-dimer ljusstyrka kalibrering mätningar enligt modifierad steg 4.1-4.11: mäta varje fluorescerande protein homo-dimer separat (i isolerade celler, tillagade protokoll avsnitt 2) och utför mätningar endast i en spektral kanal.

5. skanning fluorescens Cross-korrelation spektroskopi: Dataanalys

Obs: Följande protokoll följer en implementering av analysförfarandet beskrivs i detalj i föregående artiklarna12,15. Programvaran finns tillgänglig på begäran till författarna.

  1. Exportera de rådata (t.ex. CZI) filerna till en RGB-TIFF-bild i raw-dataformat. Den här filen kommer att innehålla en kymograph med gröna och röda kanaldata, i kanalen kallas G och R av bilden, respektive.
  2. Importera TIFF-filen med lämplig analys programvara och fortsätt att utföra analysen.
    Obs: Följande steg (steg 5.3-5.7) tillämpas separat till varje kanal:
  3. Justera raderna genom att utföra ett segment-wise eller glidande medelvärde med block av 500-1000 linjer. Bestämma membran position, dvs pixel positionen med maximalt antal skattesatsen, i varje block. Flytta alla block samma lateral position. Detta förfarande korrigerar för sidledes förflyttning av cell-cell kontakten, t.ex. på grund av cellers rörelser.
  4. Summera alla anpassade linjer längs tidsaxeln och passar genomsnittliga intensiteten profil med en Gaussisk funktion. I närvaro av betydande intracellulära bakgrund, använda en Gaussisk plus en sigmoid funktion. Definiera de pixlar som motsvarar membranet som alla pixlar inom ±2.5σ membran ställning och summan upp intensiteten av dessa pixlar i varje rad, att erhålla en enda fluorescens signalvärdet för varje tidpunkt (dvs. för varje linjeavsökning).
  5. Om det behövs (t.ex. bakgrunden > 10% av membran signalen), tillämpa en bakgrundskorrektion genom att subtrahera genomsnittliga pixel intensiteten i cytoplasman multiplicerat med 2.5σ (i pixel enheter) från membran fluorescensen, i block om 1000 rader. Undvik ljusa intracellulära blåsor när du väljer bakgrundspixlar.
  6. Om fotoblekning observeras, tillämpa en blekning korrigering. Därför passar membran fluorescens tidsserierna med en dubbel-exponentialfunktionen och tillämpa lämplig korrigering formel, ekvation 116.
    Obs: Alternativt Fourier spektrum baserat korrigering system kan vara tillämpad27. (Kritisk) Om fotoblekning finns men inte korrigerat för CFs kan bli allvarligt förvrängd och parametern uppskattningar kan vara starkt partisk (t.ex., se figur 5E).
  7. Beräkna ACFs och CCFs enligt ekvationer 2 och 3 använder, t.ex. en multipel-tau algoritm28. Att förbättra tillförlitligheten i analysen och undvika artefakter, utföra beräkningar för 10-20 lika segment av den totala mätningen. Inspektera fluorescens tidsserier och CFs i varje segment och ta bort klart förvrängd segment (se exempel i figur 4A- 4 D). Genomsnittliga alla icke-snedvriden segment.
    Obs: Denna procedur kan automatiseras för att undvika en subjektiv bias till data29. För mycket instabil mätningar kan det vara bra att ha många korta segment. Längden på ett segment bör dock fortfarande minst tre tiopotenser ovan diffusion tid att undvika statistiska undersampling fel29,30,17.
  8. Passa en tvådimensionell diffusion modell, ekvation 4, att den erhållna CFs. Därför fixa struktur faktorn till det värde som erhålls i kalibrering mätning (Protocol avsnitt 3). Riktigheten av passformen kan förbättras genom att utföra en vägda passform med de statistiska vikterna för varje datapunkt som erhålls från flera tau algoritmen.
  9. Beräkna den diffusion koefficient med hjälp av kalibrerade midjan enligt ekvation 7.
  10. Beräkna den molekylära ljusstyrkan genom att dividera genomsnittliga fluorescensintensiteten i varje kanal med motsvarande antal partiklar, ekvation 8. Normalisera beslutsamma ljusstyrka värdet i varje kanal av motsvarande monomer hänvisningen till få Oligomera staten, med hänsyn till konto icke fluorescerande FPs23genomsnittliga ljusstyrka. I detta syfte fastställa genomsnittliga homo-dimer ljusstyrkevärden från en färg analys att beräkna andelen icke-fluorescerande FPs23.
  11. Beräkna den relativa cross-korrelationen enligt ekvation 9.

6. Cross-korrelation nummer och ljusstyrka: detektor kalibrering

Obs: Följande protokoll ger en allmän riktlinje om hur du kalibrerar för upptäckande. Detta förfarande är obligatoriskt för analoga system, men behövs inte strikt när sanna fotonen räkna detektorer används.

  1. Torka lämpliga vattenlösliga färgämnet lösningar (se Tabell av material för exempel) på en 35 mm glas botten maträtt. Ställer in den optiska vägen därefter, dvs 488 eller 561 nm excitation och upptäckt på 499-552 nm eller 570-695 nm, respektive.
    Obs: Alternativt en reflekterande metall yta kan användas istället för torkade dye lösningar genom att placera metallstycket direkt ovanpå målet.
  2. Utför en färg N & B mätningar i regioner med olika dye koncentrationer eller på olika laser befogenheter. Använd därför Zooma för att uppnå en pixelstorlek på 300 nm, scanningshastighet ange lämpliga pixel dröjtiden, exempelvis 25 µs och ange cykler till 100-200 ramar.
  3. Ange detektorer till fotonen räkna (eller analogt läge om mätningar utförs med analoga detection) och tryck på Starta experimentet att starta förvärvet. Utför mätning vid noll excitation makten att bestämma intensitet offset.
  4. Rita pixel variansen som en funktion av pixel intensitet för alla uppmätta pixlar och utföra en linjär passform av dessa data. Bestämma S som lutningen på den linjära passformen. Beräkna den avläsning bullret från y-skärningspunkten, med S och beslutsamma intensitet offset enligt ekvation 14.

7. Cross-korrelation nummer och ljusstyrka: förvärv

  1. Följ steg 4.1-4.4 i protokollet sFCCS förvärv.
  2. Använd gröda för att välja en ram av 512 × 128 pixlar runt en cell-cell-kontakt (eller isolerade PM för homo-dimer ljusstyrka) och Zooma för att uppnå en pixelstorlek på 50-100 nm.
  3. Använd scanningshastighet att ställa lämpliga pixel dröjtiden, t.ex. 6,3 µs.
    Obs: I N & B, pixel uppehållstiden bör vara mycket mindre än tid som diffusion av proteinet av intresse. Om ett system för alternativa magnetisering är valt, exempelvis byta spår varje rad, tiden mellan de två spåren bör vara mindre än tid som diffusion av proteinet av intresse. Annars minskas detekterbara cross-korrelationen.
  4. Ange cykler till 100-200 bildrutor.
    Obs: Ett högre bildrutenummer förbättras SNR, men cellers rörelser kan begränsa den totala mättiden. Scan tid per ram bör vara mycket högre än tid som diffusion av proteinet av intresse. Annars skenbar ljusstyrka reduceras, dvs. partiklar verkar vara orörlig. För mycket långsamt diffuserande komplex, införa en paus, t.ex., 2 s, mellan ramar med intervall i undermenyn Tidsserier .
  5. Ange laser befogenheter till lämpliga värden (typiska värden är ~ 1-2 µW för 488 nm och ~ 5-10 µW för 561 nm excitation).
    Obs: Högre lasereffekt leder till högre ljusstyrka och förbättrad SNR, men också förbättrad fotoblekning. Laser befogenheter bör vara tillräckligt hög för att uppnå en upptäckta ljusstyrka på minst ~ 1 kHz/MOL men hålls tillräckligt låg för att undvika mer än 10-20% fotoblekning. För mEGFP/mEYFP eller mCherry/mCardinal, mindre än 10% fotoblekning erhålls vanligen.
  6. Ställ in detektorer på fotonen räkna (eller analogt läge om mätningar utförs med analoga detection). Tryck på Starta experimentet att starta förvärvet.
  7. Utvärdera andelen fotonen räkna. Om räkningen i cell cell kontakt pixlar överstiga 1 MHz, minska lasereffekt eller Välj celler med lägre uttryck. Upprepa steg 7,2-7,7. att mäta nästa par av celler. Det är rekommenderat att mäta 10-15 celler per experiment på olika nivåer.
  8. Om ljusstyrkan analys utförs för att kvantifiera oligomerisering, utföra homo-dimer ljusstyrka kalibrering mätningar enligt modifierad steg 7,1-7,7: mäta varje fluorescerande protein homo-dimer separat (i isolerade celler, tillagade protokoll avsnitt 2) och utför mätningar endast i en spektral kanal.

8. Cross-korrelation nummer och ljusstyrka: dataanalys

Obs: Följande protokoll följer en tidigare beskrivna analys förfarande12,31. Programvaran finns tillgänglig från författarna på begäran.

  1. Importera raw-data (t.ex. CZI filer kan importeras med hjälp av Bioformats32 paketet). Genomsnitt alla ramar och välj en region av intresse (ROI) runt den cell-cell kontakten.
  2. Utföra en bild anpassning algoritm33, exempelvis genom att maximera rumsliga sambandet mellan ROIs i efterföljande bildrutor för godtyckliga laterala översättningar, i genomsnitt under båda kanalerna. Detta förfarande kommer att korrigera för laterala rörelse av cellerna.
  3. Applicera en boxcar filter22 minska ovidkommande långlivat svängningar, med ursprung från, exempelvis kvarstående cell rörelse eller bakgrunden blekning. Alternativt kan användas en detrending för att korrigera för fotoblekning34.
    Obs: Om ingen segment-wise analys eller detrending tillämpas, skenbar ljusstyrka kan vara i stort sett överskattade.
    1. Definiera skjutbara segment av, t.ex., 8 till 15 ramar (t.ex. ramar 1 till 8, 2 till 9 och så vidare) och beräkna kanal och cross-korrelation ljusstyrkevärden enligt ekvationer 10, 11 och 15 pixel-wise i varje segment. Om detektorer inte sant photon counting detektorer, beakta kalibrerad detektor parametrarna vid beräkning av ljusstyrkan, Använd dvs ekvationer 12 och 13 istället.
      Obs: Beräkning av ljusstyrkevärden i segment 8 till 15 bildrutor leder till en 10-20% underskattning av den absoluta ljusstyrkan och en 10-20% överskattning av partikeln numrerar. Dock påverkas ljusstyrka nyckeltal (t.ex. dimer till monomer ljusstyrka) inte, så länge segment längd hålls konstant under hela analysen (inga data anges). Den statistiska fel för ett givet segment längd kan bestämmas via simuleringar och därmed korrigerade för.
    2. Genomsnittliga erhållna ljusstyrkevärden pixel-wise över alla segment. I det här steget kan man bort den högsta och lägsta 5% av segmentet ljusstyrkevärden från genomsnittet eller utesluta segment som visar en tydlig snedvridning i intensitet, på grund av, t.ex. en intracellulär vesikel eller aggregat normalnivå närvarande i dessa pixlar.
  4. Rita pixel ljusstyrkevärden som en funktion av pixel intensiteten och välj antalet pixlar som motsvarar den cell-cell kontakten. Bakgrundspixlar har mycket låg intensitetsvärden. Vid denna punkt, omvärdera det maximala antalet priset. Utesluta pixlar med räkna priser över 1 MHz att förhindra pile-up effekter.
  5. Skapa kanal och cross-korrelation ljusstyrka histogrammen för markerad cell-cell kontakt pixlar och få ROI-genomsnitt ljusstyrkevärden. Normalisera genomsnittliga kanalen ljusstyrka värdet av motsvarande monomer hänvisningen till få Oligomera staten, med hänsyn till konto icke fluorescerande FPs23genomsnittliga ljusstyrka. Därför fastställa genomsnittliga homo-dimer ljusstyrkevärden från en färg analys att beräkna andelen icke-fluorescerande FPs23.
  6. För illustration, Rita kartor för kanal och cross-korrelation ljusstyrka.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett första test för protein-protein interaktioner analysen, d.v.s. blandning av celler som uttrycker spektralt distinkta fluorescerande proteiner följt av sFCCS/ccN & B mätningar (figur 1), bör utföras på proteiner som inte förväntas interagera i cell cell kontakt (dvs. en negativ kontroll). Därför HEK 293T celler som uttrycker myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal blandades och sFCCS utfördes över cell cell kontakten (figur 2A). I en idealisk fall fluorescens signalen i varje kanal är tänkt för att fluktuera runt en stabil medelvärde, till följd av diffus rörelse av proteiner i PM och statistiska variationer av antalet proteiner i focal volymen. Proteiner som inte interagerar, växlingarna i båda kanalerna är oberoende av varandra, och spektrala cross-korrelationen förväntas därmed, fluktuera runt noll. Faktiskt hos en relativ cross-korrelation nära noll typiska mätningar (figur 2C). ACFs Visa karakteristiska förfall-tider för ~ 10-20 ms (motsvarande till, i genomsnitt, Dmyr-palm = 1,3 ± 0,3 µm2/s (genomsnitt ± SD, n = 20 celler)), som förväntat för diffusion av myr-palm-mEYFP och -mCardinal i PM, t.ex. Dmyr-palm = 0,88 ± 0,11 µm2/s (medelvärde ± SEM) baserat på fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) experiment35. Bland annat tillåta dessa ganska långsam dynamics användning av en alternerande excitation-systemet, dvs, växla mellan endast gröna och endast röda excitation och upptäckt varje linje, orsakar en ~0.5 ms fördröjning mellan signaler i båda kanalerna men undertrycka spektral överhörning. I genomsnitt, en mycket låg genomsnittlig cross-korrelation på 0,08 ± 0,10 (genomsnitt ± SD, n = 17 celler) erhölls för den negativa kontrollen (figur 3E), som förväntat.

Nästa, cross-korrelationen positiv kontroll användes för att kalibrera högsta möjliga cross-korrelationen i optiska setup. Därför den membran-förankrade hetero-dimer myr-palm-mCardinal-mEYFP uttrycktes i HEK 293T celler och sFCCS mätningar utfördes på enstaka celler (figur 2B). De erhållna CCFs hade positiva amplituder och visade liknande decay gånger som ACFs, igen ~ 10-20 ms (bild 2D). I genomsnitt, en relativ cross-korrelation på 0,96 ± 0,18 (genomsnitt ± SD, n = 14 celler) mättes för den positiva kontrollen (figur 3E).

Figure 2
Figur 2 . Scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi kontrollmätningar. (A) representativa bilder av blandade HEK 293T celler uttrycker myr-palm-mEYFP /-mCardinal som negativ kontroll för trans interaktioner. Den gula pilen anger sFCCS Skanna sökväg. Skala barer är 5 µm. (B) representativa bilder av HEK 293T celler som uttrycker myr-palm-mCardinal-mEYFP hetero-dimer (vänster: grön kanal, höger: röda kanalen) som positiv cross-korrelation kontroll. Den gula pilen anger sFCCS Skanna sökväg. Skala barer är 5 µm. (C) representant CFs (grön: ACF i grön kanal (mEYFP), röd: ACF i röda kanalen (mCardinal), blå: CCF) erhålls i sFCCS mätningar för negativ kontroll. Heldragna linjer visar passar av en tvådimensionell diffusion modellen till den CFs. (D) representant CFs (grön: ACF i grön kanal (mEYFP), röd: ACF i röda kanalen (mCardinal), blå: CCF) erhålls i sFCCS mätning av den positiva kontrollen. Heldragna linjer visar passar av en tvådimensionell diffusion modellen till den CFs. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Lämpligheten av denna analys undersöktes sedan i ett biologiskt relevanta sammanhang genom att sondera de trans interaktioner av amyloid prekursor-liknande protein 1 (APLP1), en typ jag transmembrane protein som har föreslagits att agera som en neuronal vidhäftning receptorn. I detta syfte APLP1 smält till mEYFP eller mCardinal var uttryckt i HEK 293T celler. För att utesluta störningar med extracellulära bindande domäner, FPs fixerades till C-terminus av APLP1, dvs på den intracellulära domänen (se figur 1). Sedan utfördes sFCCS mätningar på cell-cell kontakter mellan APLP1-mEYFP och APLP1-mCardinal uttrycker celler (figur 3A), vilket resulterar i ACFs och CCFs (figur 3C) som ger information om APLP1 diffusion och interaktioner. En positiv relativ cross-korrelation av 0,45 ± 0,21 (genomsnitt ± SD, n = 17 celler) observerades, dvs ett värde som är betydligt större än den negativa kontrollen (figur 3E). Intressant, var den genomsnittliga relativa cross-korrelationen lägre än för positiv kontroll (figur 3E), som anger endast delvis trans bindande.

Slutligen användes analysen Visa att zink joner underlättar förbättrade APLP1 trans bindande12,31. SFCCS CFs erhållits från mätningar över APLP1 kluster på cell-cell kontakter (kännetecknas av en stark gemensam lokalisering av APLP1-mEYFP och APLP1-mCardinal och bildar snabbt i närvaro av zink joner, figur 3B) visade starkt minskad dynamik, som framgår från stora förfall gånger och svängningarna på stor eftersläpning gånger (figur 3D). Dock analysen av amplituderna på kort fördröjning gånger visade en signifikant ökning av den relativa cross-korrelationen till 0,8 ± 0,3 (genomsnitt ± SD, n = 17 celler), dvs ~ 80% av den kalibrerade maximalt (figur 3E). Det förväntas kan att sådan långsam dynamics inducera allvarliga snedvridningar av korrelation kurvor (se figur 3D) på grund av det begränsade antalet diffus händelser som kan upptäckas under den ändliga mättiden, förmå så kallade partikel buller30. För en exakt kvantifiering, bör maximal lagfasen vara minst 3 tiopotenser ovan diffusion tiden (se tidigare recensioner30,17 för ytterligare information).

Molekylär ljusstyrkan från sFCCS APLP1 data analyserades ytterligare, med myr-palm negativa kontrollen som monomer referens i varje kanal och korrigera för den icke-fluorescerande proteiner23. Vid zink ion tillsats, molekylär ljusstyrkan betydligt ökas från små oligomerer (~ dimerer) till större multimers bestående av ~ 10-50 monomerer på varje cell (figur 3F). Således, i genomsnitt upp till ~ 100 APLP1 monomerer är närvarande i ett kluster med hela protein över cell cell korsningen.

Figure 3
Figur 3 . Scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi mätningar av APLP1 interaktioner på cell-cell kontakter. (A, B) Representativa bilder av HEK 293T celler som uttrycker APLP1-mEYFP (grön) / APLP1-mCardinal (röd) innan (A) och 30 min efter zink ion behandling (B, olika celler). De gula pilarna indikerar sFCCS Skanna sökvägar. Skala barer är 5 µm. (C, D) representant CFs (grön: ACFs i grön kanal (mEYFP), röd: ACFs i röda kanalen (mCardinal), blå: CCFs) erhålls i sFCCS mätningar för (C) APLP1 innan zink ion behandling och (D) efter zink ion behandling. Heldragna linjer visar passar av en tvådimensionell diffusion modell till CFs. (E) Box tomterna relativa cross-korrelation erhålls från sFCCS analys av negativ kontroll (”negativa”), APLP1 i frånvaro och närvaro av zink joner och positiva Cross-korrelation kontroll (”positiva”). Tomter Visa medianvärden och morrhår allt från lägsta till högsta värden. (F) Box tomter av normaliserade molekylär ljusstyrka i gröna kanalen (mEYFP) erhålls från sFCCS analys av APLP1 på cell-cell kontakter i frånvaro och närvaro av zink joner. Ljusstyrkevärden korrigerades för icke-fluorescerande mEYFP baserat på sFCS mätningar av myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimerer uttryckt i HEK 293T celler, mätt enligt samma villkor23. Tomter Visa medianvärden och morrhår allt från lägsta till högsta värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Alla mätningar visat hittills har korrigerats för ytterligare, falska variationer som uppstår i de celler som, om inte beaktas, skulle göra sFCCS analysen utmanande. Exempelvis: för den negativa kontrollen, kan dessa orsaka ett falskt positivt cross-korrelation, om ingen korrigering system tillämpas. Två stora processer som kan allvarligt snedvrida CFs är: 1) instabilitet i den inspelade fluorescensen signal på grund av intracellulära blåsor som övergående ange volymen fokal eller långsam membran dynamics, exempelvis drift i z-riktningen och 2) fotoblekning. För att identifiera övergående instabilitet, rekommenderas det att dela upp de fullständiga mätningarna i 10-20 lika stora segment och att visuellt inspektera den intensitet tidsserier och CFs i varje segment. Förfarandet illustreras i figur 4, vilket ger ett exempel på tydligt förvrängd segment erhålls i analysen av en negativ kontrollmätning. Övergående instabilitet (figur 4A, intensitet spår av segment 1 och 2) kan resultera i en CCF har negativa värden (figur 4B, segment 1) eller en hög falskt positiva cross-korrelation (figur 4B, segment 2). Vanligtvis är sådan instabilitet synliga i intensitet serien som långsam signal variationer (figur 4A). Den motsvarande CFs vanligtvis avviker starkt från den CFs majoriteten av segment, visning, exempelvis högre amplitud och mycket långsammare förruttnelse gånger på den ~ andra skala (se figur 4B-4 D). Det rekommenderas att ta bort segment från analysen och för att beräkna den slutliga CFs av genomsnitt alla icke-snedvriden segment, dvs segment kännetecknas av CFs inte avviker från majoriteten av CFs. typiskt, detta görs i en grafisk gränssnittet genom att 1) iterativt undersöka segmenten, 2) att ta bort klart förvrängts segment från genomsnittet och 3) inspektera CFs återstående segment med avseende på den uppdaterade genomsnittliga CFs av segment som inte togs bort. Genom att tillämpa detta förfarande, delvis förvrängd lång mätningar (figur 5A), visar långsamt förfalla (skadad) CFs (figur 5B) korrigerades framgångsrikt och meningsfull korrelation kurvor var återvinnas (bild 5C). Generellt kan vara proceduren korrigering automatiserade29, undvika en okulärbesiktning av användaren, som kan vara benägna att subjektiva bias. I jämförelse med intensitet baserat filtrering metoder36, som små lådor av mätningen utvärderas baserat på deras intensitet jämfört med genomsnittliga intensiteten av fullständig mätning och bort om överstiger ett tröskelvärde parameter, den beskrivna proceduren är inte beroende av externa parametrar och är känslig även för mindre instabilitet.

För att kompensera fotoblekning, tillämpades beskrivs matematisk korrigeringen, ekvation 1. Typiskt, fotoblekning kan identifieras genom en exponentiell förfalla av fluorescens signalerna (figur 5D), dominerar CFs, som sedan visar en falsk-positiv cross-korrelation och förfalla gånger på den ~ min skala (se de typiska kurvform i figur 5E). Korrigeringsförfarandet återhämtade sig den icke-snedvriden CFs (figur 5F). Som redan nämnts, liknande intensitet kan variationer inom enskilda mätningar också orsakas av PM rörelse, exempelvis z-drift eller stora långsamt rörliga strukturer. Om liknande exponentiell sönderfaller visas i alla mätningar, kommer fotoblekning dock sannolikt källan. Generellt korrigering system kan kombineras, t.ex. intensitet filtrering, CF baserat filtrering och ytterligare metoder såsom Fourier transform baserade filtrering av långsam signal variationer i frekvens utrymme27.

Figure 4
Figur 4 . Segment-Wise analys av scanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi mätningar av cross-korrelation negativkontroll. (A) fluorescensintensiteten i grönt (F1) och röda kanalen (F2) i två olika segment (varje mätning analyserades i 20 segment av ~ 20 s varje), framställt av sFCCS mätning av negativ kontroll. (B) CCFs av varje av de 20 segment. CCFs för segment 1 och 2 är markerade i rött och orange, respektive. (C, D) ACFs av varje segment i grönt (C) och röd (D) kanal. ACFs för segment 1 och 2 är markerade i rött och orange, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Störningar i skanning fluorescens cross-korrelation spektroskopi mätningar vid cell-cell kontakter, exemplifieras för cross-korrelation negativkontroll. (A) Full fluorescens tidsserier för ett föredöme mätning i grönt (F1) och röda kanalen (F2). De fasta röda linjerna representerar ett dubbel-exponentiell anfall av tidsserierna i varje kanal. (B, C) CFs (grön: ACFs i grön kanal, röd: ACFs i röda kanalen, blå: CCFs) av fluorescens tidsserier visas i A, beräknas av (B) korrelera den hela mätningen eller (C) korrelerar 20 segment separat och i genomsnitt den minst förvrängd CFs ~ 80% (grön kanal) och ~ 50% (röd kanal) segment. Heldragna linjer representerar anfall av en tvådimensionell diffusion modell till data. (D) Full fluorescens tidsserier och dubbel-exponentiell passform (fast röda linjer) mätmetoder som kännetecknas av betydande blekning i grönt (F1) och röda kanalen (F2). (E, F) CFs (grön: ACFs i grön kanal, röd: ACFs i röda kanalen, blå: CCFs) av fluorescens tidsserier visas i D, beräknas av (E) korrelera den hela mätningen eller (F) tillämpa blekning korrigeringen, ekvation 1, korrelera 20 segment separat och genomsnitt den minst förvrängd CFs ~ 90% (båda kanaler) av segmenten. Heldragna linjer representerar anfall av en tvådimensionell diffusion modell till data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Som en kompletterande strategi för sFCCS, kan ccN & B (figur 1C) användas för att upptäcka protein-protein interaktioner efter cell blandning. I motsats till sFCCS, ccN & B ger ingen information om protein dynamics, men kan mäta trans interaktion längs hela cell-cell kontakten i ett fokalplan. Mätningar på APLP1 prover utfördes före och efter behandling med 50 µM ZnCl2, liksom på kontrollen negativa myr-palm. Dessa mätningar är känsliga för cell rörelser, särskilt för zink ion behandlade prover, som kräver långvarig anskaffningstid för långsamma dynamiken i APLP1 kluster. Därför genomfördes en bild anpassning algoritm för att korrigera för sidledes förflyttning av de celler33. Dessutom en boxcar filtrera22 (8 bilder box storlek, ~ 5 s) användes för att ta bort lågfrekventa svängningar av uppmätta signalerna. Proceduren är mycket lik andra filter som används i N & B analys som omfattar lokala genomsnitt37 eller detrending18,34, men behåller den ursprungliga data oförändrat, dvs pixlar behandlas självständigt och ingen genomsnitt eller subtraktion av signaler utförs. Detta förfarande dämpar effektivt långlivat fluktuationer på tidsskalor som är längre än den ruta storlek22. Efter sådan dataanalys jämfördes cross-korrelation ljusstyrkevärden för alla prover genom att samla alla cell-cell kontakt pixlar i en cross-korrelation ljusstyrka histogram. För APLP1 i avsaknad av zink joner (figur 6A och 6 D), en positiv genomsnitt Bcc 0,068 ± 0,004 (menar ± SEM, n = 18 celler) observerades. Efter zink ion tillsats (figur 6B och 6E), Bcc värdet ökat till 0.266 ± 0,006 (menar ± SEM, n = 19 celler). Den negativa kontrollen (figur 6C och 6F), upptäcktes en lägre genomsnittlig cross-korrelation ljusstyrka (Bcc = 0.022 ± 0,002, menar ± SEM, n = 26 celler). För att uppskatta stökiometri av APLP1 komplex på cell-cell kontakter, ljusstyrkan på APLP1-mEYFP var normaliserade med det genomsnittliga värdet som erhålls för myr-palm-mEYFP (dvs., den negativa kontrollen) och korrigerad för mängden icke-fluorescerande proteiner23. I samförstånd med sFCCS data, var ljusstyrka fördelningen centrerad kring ett värde motsvarande dimerer (figur 6G), i avsaknad av zink joner, vilket tyder på ett genomsnitt 2:2 stökiometri. Efter zink ion behandling, normaliserade ljusstyrkan starkt skiftat till större värden, alltifrån ~ 10 till ~ 60 (figur 6H), dvsstoichiometries av på minst 10:10 eller större, igen i bra avtal med sFCCS data.

Figure 6
Figur 6 . Cross-korrelation nummer och ljusstyrka mätningar av APLP1 interaktioner på cell-cell kontakter. (A-C) Representant ccN & B bild ramar av cell-cell kontakter mellan APLP1-mEYFP och APLP1-mCardinal uttrycker HEK 293T celler utan (A) och med zink joner (B) eller myr-palm-mEYFP och myr-palm-mCardinal uttrycker celler som negativ Cross-korrelation kontroll (C). Skala barer är 5 µm. (D-F) Cross-korrelation ljusstyrka (Bcc) histogram av alla undersökta pixlar och celler erhållits från ccN & B analys av cell-cell kontakter i APLP1 prov (D), zink-behandlade APLP1 prover () E) och prover som innehåller myr-palm-mEYFP och myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normaliserade ljusstyrka histogrammen för APLP1 prover (G: utan zink joner, H: med zink joner) för den gröna kanalen (mEYFP) som erhållits från ljusstyrka analys av samma celler och ROIs används för beräkning av Bcc. Infälld i G visar en förstoring i normaliserade ljusstyrkeintervallet-2 till 10. Ljusstyrkevärden korrigerades för icke-fluorescerande mEYFP baserat på N & B mätningar av myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimerer uttryckt i HEK 293T celler, mätt enligt samma villkor23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att kunna utföra det ccN & B analys, ska en noggrann kalibrering av detektorerna utföras. För den experimentella setup som används i denna studie, blev behovet av en sådan kalibrering uppenbart när molekylär ljusstyrkan analyserades i fasta prover (dvs. i avsaknad av antalet svängningar). I det här fallet förväntas molekylär ljusstyrkan vara noll enligt ekvation 10, eftersom avvikelsen ska endast komma från detektorn buller. När en ROI som innehåller endast (orörlig) bakgrundspixlar var analyserade (figur 7A och 7B), fastställdes dock en positiv ljusstyrka på ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Ett liknande värde erhölls utför N & B mätningar av HEK 293T celler som uttrycker glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, figur 7C) med varierande laser befogenheter och extrapolera uppmätta molekylär ljusstyrkan till noll lasereffekt. För att korrigera för denna effekt, utfört vi en systematisk kalibrering av detektorn, som tidigare rapporterats (se ekvation 12)19,20. Vi därför mätt variansen som en funktion av detektor räkna ränta på ett prov som består av en torkade fluorescerande färgämne lösning och beslutade parametrarna S, Equation 24 och mörka räkna ränta offset. Den senare erhölls från mäta intensiteten på noll lasereffekt och var, i vårt fall, försumbar. Från en linjär passform av variansen kontra intensitet tomt, vi beslutsamt, enligt ekvation 14, en lutning på S = 1,1 och en försumbar avläsning buller. De fastställda värdena (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) användes sedan för att korrekt beräkna molekylär ljusstyrka och antal enligt ekvationerna 12 och 1319. Alternativt kan ett mer empiriskt korrigering system tillämpas baseras på det faktum att en superpoissonian detektor brus, dvs ~ 10% större brus än Poissonian sköt brus, skulle också förklara observationen av en positiv molekylär ljusstyrka i pixlar utan antalet fluktuationer. Med detta antagande, kan beslutsamma ljusstyrkan av ~0.1 cts./(MOL x dwell time) i sådana pixlar anses som en konstant ljusstyrka offset och bör således dras från alla värden för ljusstyrka som beräknas med ekvation 10. Viktigast av allt, både beskrivs metoder leda till samma resultat vid beräkning av ljusstyrka nyckeltal, så länge som Equation 24 och offset är försumbar. Det är värt att nämna att bland olika Mikroskop av samma typ (samma leverantör, samma modell, GaAsP detektorer i fotonen räkna läge) olika S värden observerades, belyser nödvändigheten för en försiktig detektor kalibrering på varje individuell inställning.

En ytterligare viktig parameter som påverkar detektor prestanda i ljusstyrka mätningar är detektor dödtiden. Som det har tidigare visats, detektor dödtiden avsevärt kan minska upptäckta molekylär ljusstyrka, även på medellång räkna priser (över 102-103 kHz)38. För att undvika denna artefakt, ska mätningar antingen utföras vid lägre räkna priser eller dödtiden bör kalibreras utifrån utför N & B eller FCS i en utspädning serie, t.ex., andra i buffertlösning. Sedan kan uppmätta räkna priser korrigeras med hjälp av en kalibrerad dödtid38. För den installation som används i denna studie, sådan en kalibrering med N & B på utspädd färg lösningar visade stabil molekylär ljusstyrkevärden upp till räkna andelen ~0.5 MHz och en motsvarande dödtid ~ 6 ns (figur 7E). Minskningen på högre räkna således kan korrigeras med hjälp av en tidigare publicerade korrigering formeln38, vilket resulterar i en konstant ljusstyrka värdet av ~ 8 kHz/MOL.

Figure 7
Figur 7 . Detektorn kalibrering för nummer och ljusstyrka analys. (A) representativ bild från N & B mätningar av HEK 293T celler som uttrycker GPI-mCherry. En ROI (blå streckad rektangel) valdes i bakgrunden. (B) Pixel ljusstyrka histogram över alla pixlar motsvarar ROI visas i A. Genomsnittliga pixel ljusstyrka, erhållits från passande pixel ljusstyrka histogrammet med Gaussisk funktion, är ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Data har förvärvats på 25 µs pixel dröjtiden. (C) molekylär ljusstyrka erhålls från N & B analys av GPI-mCherry uttryckt i HEK 293T celler, mätt vid tre olika laser befogenheter (6 celler varje, 561 nm excitation, 25 µs pixel uppehållstid). Data visas som menar ± SD. En linjär regression (röd linje) ger ett offset-värde på 0,11 ± 0,02 cts./(MOL x dwell time). (D) handlingen i pixel variansen som en funktion av pixel intensitet från N & B mätningar av en torkade lösning av ett fluorescerande färgämne (upphetsad på 561 nm), poolade från alla pixlar från flera mätningar i olika regioner av provet. Den röda linjen visar en linjär passform av data, vilket resulterar i en lutning på 1.1, som tillhandahåller S faktorn för detektor kalibreringen. (E) molekylär ljusstyrkan som funktion av detektor räkna ränta, erhållits från N & B mätningar av utspädda fluorophore lösningar (upphetsad vid 488 nm). En tidigare publicerade korrigering systemet38 tillämpades med olika möjliga värden för detektor dödtiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den experimentella metod som beskrivs här kan utredningen av protein-protein trans interaktioner på cell-cell kontakter, anställa fluorescens fluktuation spektroskopi tekniker, nämligen sFCCS och ccN & B. Dessa metoder innebär en statistisk analys av fluorescens fluktuationer som avges av två spektralt separerade FPs smält till proteinernas sevärdheter på en kontakt med två angränsande celler, var och en uttrycker en eller den andra fusionsprotein. Förekomsten av trans komplex kvantifieras i sondera samtidig spridningen av proteiner i angränsande PMs. Förutom detaljerade protokoll på provberedning, datainsamling och analys ger denna artikel experimentella bevis för en framgångsrik tillämpning av analysen på neuronal vidhäftning proteinet APLP1. Vi visar att APLP1 genomgår specifika, homotypic trans interaktioner på cell-cell kontakter. Ytterligare, zink joner främja bildandet av APLP1 kluster på cell-cell kontakter som ger en multivalenta plattform för trans interaktioner och, således, framkalla förbättrade trans bindande.

I motsats till tidigare analyser att upptäcka sådana interaktioner baserat på störande biokemiska metoder6, kan den presenterade metoden utföras direkt på levande celler, utan behov för fixering eller isolering av proteinkomplex. Dessutom ger det molekylär specificitet och information genom påvisande av fluorescerande proteiner genetiskt smält till proteinet av intresse, i motsats till tidigare kvalitativa analyser8,9. Annorlunda från andra fluorescens baserade metoder såsom bandet10 och fluorescens komplettering11finns det inga krav för fluorescerande etiketter att vara lokaliserade på den extracellulära sidan (potentiellt störa protein-protein interaktioner). Det måste dock noteras att C-terminal FPs kan fortfarande ändra bindningen till intracellulära komponenter, exempelvis adapter proteiner som medla interaktioner med cytoskelettet. Särskilt, är analysen tillämpliga både homo- och heterotypic interaktioner.

Några krav för en framgångsrik tillämpning av presenterade analysen är värda att nämna. Utfört fluorescens fluktuation metoder baseras på tidsmässiga mätningar som kräver ljusa och fotostabilt monomer FPs, vilket är ett stort hinder för många röda FPs23. Även om presenterade scanning systemet är särskilt väl lämpad för utredning av transmembrana proteiner, som vanligtvis är inblandade i cell-cell interaktioner långsam dynamik, uppstå fortfarande kvarstående fotoblekning. Därför presenterar vi en detaljerad beskrivning av korrigering system, dvs en blekning korrigering för sFCCS och boxcar filter för ccN & B, vilket minimerar sådana störningar. Vidare, vi diskuterar numeriska justering algoritmer som effektivt korrigerar för andra systematiska störningar, såsom laterala rörelse av celler, och ger riktlinjer för att ta bort övergående instabilitet. En stor källa av sådan instabilitet är vesikulär transport, dvs intracellulära blåsor transporterar proteinet av intresse som anger övergående fokala volymen. Även om varierar från fall till fall, kan detta fenomen i allmänhet allvarligt störa datainsamling och analys. Dock förbättrar tillämpningen av korrigering algoritmer stabiliteten för förvärvet, möjliggör utökade mätning gånger som behövs för att probe särskilt långsam diffus dynamiken. Det har i detta avseende understrykas att förekomsten av diffus dynamics är ett nödvändigt villkor för metoden att arbeta. Exemplet med zink ion medierad APLP1 kluster visar ett drastiskt exempel på stora, mycket långsam proteinkomplex (D ≈ 0,001 µm2/s) som driva tekniken till sina gränser och förhindrar en exakt kvantifiering av underliggande dynamiken, på grund av stora buller induceras av den begränsa förvärv tid30,17.

I detta sammanhang senaste framstegen på kamning sFCS och super-upplösning metoder, t ex scanning stimulerad emission utarmning FCS (STED-FCS), kan vara fördelaktigt genom att tillhandahålla en mindre fokal volym och därmed mindre effektiva diffusion gånger39 ,40. Detta kan också bidra till att lösa protein kluster vid en inhomogena lokalisering av proteinet av intresse på cell-cell kontakter, som observerats för APLP1 i närvaro av zink. Tyvärr, en cross-korrelation genomförandet av scanning STED-FCS, dvs STED-S.K., som kan tillämpas direkt här, har inte varit framgångsrikt visat ännu på grund av svårigheten att hitta kompatibla färgämnen för två-färg STED-FCS. I fråga om tillräckligt snabbt dynamics (D ≥ ~0.05 µm2/s) tillåter sFCCS analys för att kvantifiera diffusionen av proteiner vid cell-cell kontakter eller i andra regioner av PM12.

Ytterligare, en ljusstyrka analys kan utföras för alla data (sFCCS och ccN & B), som ger en uppskattning av stökiometri för trans proteinkomplex. Det bör nämnas att riktigheten av stökiometri kvantifiering ökar med mängden proteiner som binder i trans (dvs om det finns endast några cis komplex som också kan påverka ljusstyrkan bestämning). Ljusstyrka analys tillåter inte att lösa blandningar av olika Oligomera stater, e.g.,cis monomerer och trans tetramers. Mer generellt, bör det noteras att N & B inte kan lösa blandningar av olika Oligomera homogent fördelade i ett urval. Om det finns flera arter inom en pixel kommer ett enda värde för ljusstyrka att mätas (dvs. ett vägt genomsnitt av ljusstyrkan för varje Oligomera art). Den statistiska fördelningen av de observerade ljusstyrka-värdena (t.ex. i olika pixlar) är inte direkt ansluten till den relativa mängden Oligomera arter. För att lösa sådana blandningar, andra metoder bör användas (t.ex. rumsliga intensitet distribution analys (SpIDA)41, photon counting histogram (PCH)42). Likaså, kvantifiering av spektral cross-korrelationen i sFCCS ger en exakt kvantifiering av fraktionen av bundna och obundna proteiner endast för enkla, känd stoichiometries, t.ex., 1:1. För en mer komplex stökiometri, ytterligare måste antaganden göras43. Sammantaget förblir ljusstyrka analys ett kraftfullt experimentella verktyg, om detektorn systemet och fraktionen av icke-fluorescerande FPs är kalibrerad23 som beskrivs i protokollen.

Även programmet presenteras här är inriktat på protein-protein interaktioner i vidhäftande celler, kan analysen tillämpas på ett bredare utbud av prover, t.ex., suspension celler. För sådana system, kan korrigering för laterala cell rörelse vara särskilt viktigt. Det dessutom kan enkelt appliceras på modell membransystem såsom GUVs eller GPMVs, möjliggör kvantifiering av molekylära interaktioner under väl kontrollerade förhållanden, t.ex. olika lipid kompositioner eller membran saknas ett organiserat cytoskelettet. När du utför sFCCS på sådana blåsor, vertikal rörelse kan orsaka ytterligare signal fluktuationer, men kan minimeras när man fokuserar på stora blåsor. I detta sammanhang flera kombinationer är lovande, t.ex., GUV- / GPMV-cell blandning12. I en ny publikation visas kan bildandet av immun synapser modelleras framgångsrikt av sådana system44. Presenterade analysen kommer således säkert vara till nytta för utredningen av ett stort utbud av cell-cell interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete var delvis stöds av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) bevilja 254850309. Författarna vill tacka Madlen Luckner för kritisk läsning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8 (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18 (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5 (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8 (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132 (4), (2018).

Tags

Biokemi fråga 142 Protein-protein interaktioner cell-cell interaktioner cell-cell adhesion fluorescens fluktuation spektroskopi fluorescens korrelation spektroskopi nummer och ljusstyrka N & B
En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunsing, V., Chiantia, S. A… More

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter