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Neuroscience

निस्र्पक घावों के लिए एक माइक्रो-सीटी आधारित विधि और छोटे जानवर दिमाग में इलेक्ट्रोड का पता लगाने

Published: November 8, 2018 doi: 10.3791/58585
Automatic Translation
1,2, 2, 2,3, 1,2, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Center for Brain Science, Harvard University, 3Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 4Institute of Science and Technology Austria

Summary

यह लेख सूक्ष्म सीटी इमेजिंग, जिसमें घावों quantified और इलेक्ट्रोड पूरे मस्तिष्क के संदर्भ में उच्च परिशुद्धता के साथ स्थित किया जा सकता है के लिए छोटे जानवर दिमाग तैयार करने के लिए एक सीधी विधि का वर्णन करता है ।

Abstract

घाव और इलेक्ट्रोड स्थान सत्यापन परंपरागत रूप से दाग मस्तिष्क स्लाइस, एक समय लेने वाली प्रक्रिया है कि मैनुअल आकलन की आवश्यकता है की ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के माध्यम से किया जाता है । यहाँ, हम घावों को बढ़ाता है और मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए एक सरल, सीधी विधि का वर्णन है कि कम श्रमसाध्य है और अधिक विस्तृत परिणाम पैदावार. पूरे दिमाग आज़मियम tetroxide के साथ दाग, राल में एंबेडेड हैं, और एक माइक्रो सीटी स्कैनर के साथ छवि । संकल्प और आभासी धारा के साथ दिमाग के 3 डी डिजिटल संस्करणों में स्कैन परिणाम नमूना आकार पर निर्भर मोटाई (12-15 और 5-6 चूहे और ज़ेबरा फिंच दिमाग के लिए voxel प्रति µm, क्रमशः) । सतह और गहरे घावों विशेषता हो सकता है, और एकल tetrodes, tetrode arrays, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों, और सिलिकॉन जांच भी स्थानीयकृत किया जा सकता है । नि: शुल्क और मालिकाना सॉफ्टवेयर प्रयोगकर्ता किसी भी विमान से नमूना मात्रा की जांच करने के लिए और खंड मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से खंड की अनुमति देता है । इस विधि पूरे मस्तिष्क की मात्रा उत्पन्न करता है, क्योंकि घावों और इलेक्ट्रोड वर्तमान विधियों में से एक बहुत अधिक डिग्री करने के लिए quantified जा सकता है, जो भीतर और पढ़ाई के पार की तुलना मानकीकरण में मदद मिलेगी.

Introduction

Neuroscientists एक लंबे समय के लिए घावों पर भरोसा किया है ताकि मस्तिष्क में समारोह और स्थान के बीच संबंध को समझने के लिए । उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस की हमारी समझ सीखने और स्मृति और आवेग नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण होने के रूप में ललाट प्रांतस्था की के लिए अपरिहार्य होने के रूप में दोनों मनुष्यों में serendipitous घावों के उत्पादों रहे थे1,2. पशु मॉडलों के उपयोग, तथापि, neuroscientists नसीब से परे जा रहा द्वारा घावों की शक्ति का दोहन करने की अनुमति दी है, और अनगिनत मस्तिष्क क्षेत्रों के समारोह संरचना के माध्यम से समारोह संबंधों के व्यवस्थित अध्ययन के माध्यम से आविर्भाव किया गया है घावों3,4।

सही ढंग से एक संरचना के लिए समारोह असाइन करने के लिए, तथापि, घाव अध्ययन सटीक ठहराव प्रक्रियाओं, जो कि एक क्षेत्र में कमी आई है की आवश्यकता है । घावों को बढ़ाता है के लिए वर्तमान सोने के मानक खंड, पर्वत, और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ छवि दिमाग के लिए है । imaged स्लाइस फिर एक एटलस पर निकटतम वर्गों के लिए मिलान कर रहे हैं, और विषय भर में घावों के अनुमानित निर्देशांक परोक्ष रूप से सूचित कर रहे हैं, अक्सर कैमरा ल्युसिडा छवियों या उदाहरण ऊतकवैज्ञानिक स्लाइस3,4 के उपयोग के माध्यम से ,5,6,7,8,9,10.

वर्तमान घावों ठहराव प्रक्रियाओं की अस्पष्टता से परे, इन तकनीकों समय लेने वाली और विफलता के लिए प्रवण हैं । मस्तिष्क कठोरता में छोटे परिवर्तन, ब्लेड तेज, और तापमान कच्ची, विकृत, या फटे वर्गों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । वर्गों को भी असमान दाग कर सकते है और क्योंकि बढ़ते माध्यम में बुलबुले के अनुचित छवि । महत्वपूर्ण बात, अनुभाग पर, मस्तिष्क में घाव के स्थान के तीन आयामी संदर्भ खो दिया है, मस्तिष्क चुनौतीपूर्ण में घाव के सटीक 3d पुनर्निर्माण कर रही है ।

घावों के लिए एक और आम आवेदन मस्तिष्क में एकल और कई इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के स्थान का निर्धारण करने के लिए किया गया है. अंतिम रिकॉर्डिंग सत्र के अंत में, शोधकर्ताओं इलेक्ट्रोड टिप पर छोटे इलेक्ट्रोलाइटिक घावों को प्रेरित और मस्तिष्क histologically प्रक्रिया के रूप में एक पारंपरिक घावों का प्रयोग11में किया. यह तकनीक ऊपर वर्णित एक ही कमियां से ग्रस्त है, अतिरिक्त समस्याओं के साथ किया जा रहा है कि इलेक्ट्रोलाइटिक घावों आमतौर पर उन्हें बनाने के लिए इस्तेमाल किया इलेक्ट्रोड से बड़ा कर रहे हैं, लेकिन आम तौर पर काफी छोटे हैं कि वे histologically खोजने के लिए चुनौती दे रहे हैं. जब एकाधिक इलेक्ट्रोड सम्मिलित किए जाते हैं, एक tetrode सरणी के मामले में के रूप में, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों के माध्यम से सत्यापन और भी चुनौतीपूर्ण है. इलेक्ट्रोलाइटिक घावों के लिए एक विकल्प इलेक्ट्रोड पर एक डाई के बाद histologically12सत्यापित करने के लिए उपयोग है, लेकिन इस तकनीक को एक ही कमियां है कि पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ आने से ग्रस्त है ।

यहाँ, हम में गहराई से वर्णन एक हाल ही में वर्णित विधि13 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) और एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) में धुंधला तकनीक पर आधारित है कि quantifies घावों और छोटे जानवर दिमाग में इलेक्ट्रोड रेखांकित वर्तमान से बेहतर विधियों. माइक्रो-सीटी एक इमेजिंग तकनीक है जिसमें एक्स-रे एक नमूना है कि ३६० ° घुमाया जाता है पर गोली मार दी जाती है, जबकि एक उपजिल्हाधिकारी ने नमूना द्वारा मोड़ा नहीं एक्स-रे इकट्ठा । परिणाम नमूना है कि किसी भी अभिविंयास में visualized किया जा सकता है और ठीक quantified के एक उच्च संकल्प डिजिटल 3 डी पुनर्निर्माण है । कई शैक्षणिक संस्थानों में माइक्रो-सीटी स्कैनर है, जो व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं ।

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Protocol

सभी देखभाल और पशुओं के प्रायोगिक हेरफेर की समीक्षा की और हार्वर्ड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । छिड़काव यहां वर्णित चूहों के लिए विशिष्ट है, लेकिन प्रक्रिया छोटे या इसी तरह के आकार के दिमाग के साथ किसी भी जानवरों के लिए लागू है ।

1. छिड़काव

  1. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) तैयार करते हैं । एक चूहे के लिए (उम्र: 0.5-1.5 साल, वजन: 250 – 600 ग्राम), 800 – 1000 मिलीलीटर पर्याप्त होना चाहिए । पशु perfuse करने के लिए ४०० मिलीलीटर का उपयोग करें और निर्धारण को पतला करने के लिए एक अतिरिक्त ४०० मिलीलीटर ।
  2. 2% (w/v) paraformaldehyde (पीएफए) और २.५% (w/v) glutaraldehyde (GA) 1x पंजाबियों में शामिल कर निर्धारण तैयार करें । एक चूहे के लिए ४०० मिलीलीटर पर्याप्त है । छिड़काव के बाद मस्तिष्क के पद निर्धारण के लिए एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ५० मिलीलीटर सहेजें ।
  3. Anesthetize चूहे के साथ 4-5% isoflurane गैस (पर ०.८ एल/मिनट ओ2 पर १.० बार में 21 डिग्री सेल्सियस) के लिए 15 मिनट ।
  4. सोडियम pentobarbital intraperitoneally की एक घातक खुराक सुई (१८० मिलीग्राम/
  5. एक पैर की अंगुली चुटकी पलटा परीक्षा आयोजित करके पशु में पलटा नुकसान के लिए टेस्ट । जब तक पशु अपनी पलटा प्रतिक्रिया खो दिया है छिड़काव शुरू करने के लिए रुको ।
  6. पहले वर्णित intracardial छिड़काव और मस्तिष्क निष्कर्षण प्रोटोकॉल14 निम्न समाधानों के साथ का पालन करें: perfuse १२५ मिमी पारा पर 1x पंजाबियों के ४०० मिलीलीटर के साथ पशु खून निकालने के लिए । एक बार सभी रक्त हटा दिया गया है और 1x पंजाबियों के साथ प्रतिस्थापित, 2% पीएफए और २.५% १२५ मिमी पारा पर 1x पंजाब में भंग GA के एक समाधान के ४०० मिलीलीटर के साथ perfusing शुरू करते हैं ।
    नोट: यदि प्रक्रिया एक जानवर है कि एक चूहा नहीं है में आयोजित किया जा रहा है, छिड़काव प्रक्रिया का एकमात्र महत्वपूर्ण घटक 1x पंजाबियों और 2% पीएफए, 1x पंजाब में २.५% GA का उपयोग कर रहे हैं । प्रजातियों के अनुसार समाधान खंड और छिड़काव दबाव समायोजित किया जा सकता है ।

2. पद निर्धारण

  1. 2% पीएफए में निकाले मस्तिष्क प्लेस, 1x पंजाब समाधान में २.५% GA (वही समाधान पहले जानवर perfuse के लिए इस्तेमाल किया) । सुनिश्चित करें कि समाधान की मात्रा मस्तिष्क की मात्रा में 10x कम है । चूहों के लिए, समाधान के ५० मिलीलीटर के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मस्तिष्क प्लेस । 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्के से मिलाते हुए, 2-3 दिनों के लिए पोस्ट-निर्धारण में नमूना संग्रहीत करें ।
    नोट: यदि नमूना एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में है, यह क्षैतिज एक कक्षीय शेखर पर रखकर सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करेगा ।
  2. नमूने के बाद काफी समय के लिए तय किया गया है, दोहरे आसुत जल (ddH2o), de-जल (दिः2हे), या ultrapure पानी ( सामग्री की तालिकादेखें) में नमूना धो निंनलिखित अवधि के लिए चार बार: 1, 1, 1, और 15 मिनट ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, ddH2हे, दिः2हे, या ultrapure पानी विनिमेय होना चाहिए । सादगी के लिए, ddH2ओ से शुद्ध पानी का उल्लेख किया जाएगा ।

3. धुंधला

चेतावनी: इस कदम के लिए, एक डाकू के तहत सभी समाधान तैयारियां आचरण जबकि दस्ताने का उपयोग कर ।

  1. धुंधला समाधान के मस्तिष्क की मात्रा 10x कम से तैयार । चूहे दिमाग के लिए, 2% की ५० मिलीलीटर तैयार (डब्ल्यू/वी) आज़मियम tetroxide (OsO4) ddH2हे में शेयर के 25 मिलीलीटर के संयोजन से 4% OsO4 समाधान और 25 मिलीलीटर की ddH2हे ।
    चेतावनी: आज़मियम tetroxide अस्थिर है और अस्थाई अंधापन और सांस की समस्याओं का कारण हो सकता है अगर उचित नहीं संभाला । एक द्वितीयक कंटेनर के भीतर एक उपयुक्त रासायनिक ख़तरा कंटेनर में आज़मियम tetroxide से संपर्क सभी सामग्री छोड़ें ।
  2. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब में मस्तिष्क प्लेस और OsO4 समाधान जोड़ें । मस्तिष्क के रूप में भूरे रंग बारी शुरू करना चाहिए4 OsO ऊतकों में लिपिड के साथ प्रतिक्रिया करता है ।
  3. ट्यूब बंद करो और यह तेल फिल्म के साथ अच्छी तरह से सील ( सामग्री की तालिकादेखें) सुनिश्चित करें कि यह मशीन के दौरान रिसाव नहीं करता है ।
    नोट: आज़मियम अस्थिर है और ट्यूब के प्लास्टिक के साथ हल्के से प्रतिक्रिया होगी, तो ट्यूब सील ठीक से बहुत महत्वपूर्ण है । ट्यूब जोड़ा सुरक्षा के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटा जा सकता है ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर सील ट्यूब की दुकान, 2 सप्ताह के लिए ५० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर हल्के झटकों । सबसे अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए क्षैतिज ट्यूब प्लेस । यह सुनिश्चित करें कि नमूना मिलाते समय समाधान में पूरी तरह से जलमग्न है ।
    नोट: यदि आज़मियम लगातार प्रसारित करने के लिए अनुमति नहीं है, यह पूरी तरह से नमूना घुसना नहीं हो सकता है, तो शेखर पर क्षैतिज नियुक्ति बहुत महत्वपूर्ण है.

4. एंबेडिंग

  1. नमूने के बाद 2 सप्ताह के लिए4 OsO में किया गया है, यह ddH2ओ 5 बार के साथ धो निंनलिखित अवधि के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में: 1, 1, 1, 15, और ६० मिनट के सभी असीम OsO4 नमूने में हटाने के लिए ।
    नोट: पिछले ६० मिनट के आदान प्रदान सहित कई बाजारों, संचार प्रणाली में सभी आज़मियम बाहर फैलाना करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक हैं ।
  2. 4 ° c पर 30 मिनट के लिए ddH2O के साथ नमूना धो लें ।
    नोट: आज़मियम नमूना से बाहर फैलाना करने के लिए जारी रख सकते हैं, लेकिन इसकी मात्रा पिछले चरण से बहुत कम होना चाहिए ।
  3. अंततः यह राल के साथ घुसपैठ करने के लिए इथेनॉल के साथ नमूना निर्जलीकरण । निर्जलीकरण के लिए, ddH2ओ के साथ बदलें 10 – 20 निंनलिखित इथेनॉल कमजोर पड़ने के मिलीलीटर (30 मिनट के लिए प्रत्येक में 4 ° c): 20% (v/v) इथेनॉल और ८०% (v/v) ddH2हे; ५०% (v/v) इथेनॉल और ५०% (v/v) ddH2O; ७०% (v/v) इथेनॉल और 30% (v/v) ddH2O; ९०% (v/v) इथेनॉल और 10% (v/v) ddH2O; १००% इथेनॉल ।
  4. एसीटोन/राल कमजोर पड़ने के रूप में इस प्रकार तैयार करें ।
    1. ( सामग्री की तालिकादेखें) embedding के लिए राल के १०० मिलीलीटर तैयार निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।
    2. ३३% (v/v) राल-६७% एसीटोन समाधान बनाने के लिए, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में राल के 15 मिलीलीटर डालना और १००% कांच के 30 मिलीलीटर-आसुत एसीटोन जोड़ें ।
    3. ५०% (v/v) राल-५०% एसीटोन बनाने के लिए, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में राल की २२.५ मिलीलीटर डालो और २२.५% ग्लास-आसुत एसीटोन की १०० मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. ६७% (v/v) राल-३३% एसीटोन समाधान बनाने के लिए, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 30 मिलीलीटर राल की डाल और १००% कांच के 15 मिलीलीटर-आसुत एसीटोन जोड़ें ।
    5. नीचे १००% राल का पहला समाधान के रूप में राल के शेष ३२.५ मिलीलीटर का प्रयोग करें ।
  5. निम्नलिखित एसीटोन और एसीटोन/राल कमजोर पड़ने के 10-20 मिलीलीटर के माध्यम से नमूना ले जाकर राल घुसपैठ की प्रक्रिया शुरू: 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १००% एसीटोन; 4 ° c में 30 मिनट के लिए १००% एसीटोन; और कमरे के तापमान (आरटी) में 30 मिनट के लिए १००% एसीटोन ।
    नोट: घुसपैठ की प्रक्रिया के बाकी आरटी में जगह ले जाएगा ।
  6. ३३% (v/v) राल ६७% एसीटोन में आरटी पर 3 ज के लिए नमूना विसर्जित कर दिया, फिर ५०% (v/v) राल-५०% एसीटोन rt पर 3 ज के लिए, ६७% (v/v) राल ३३% एसीटोन आरटी पर 3 ज के लिए, और 12 ज आरटी पर के लिए १००% राल ।
  7. बोतल पर निर्देशों का पालन राल के एक ताजा ५० मिलीलीटर बैच बनाओ । नमूना कंटेनर जिसमें यह ठीक हो जाएगा करने के लिए स्थानांतरण (उदाहरणके लिए, सामग्री की तालिकामें वर्णित डिस्पोजेबल molds) । आरटी पर 4 घंटे के लिए ताजा १००% राल के साथ नमूने को अस्वीकार
    नोट: यदि ताजा राल का उपयोग नहीं किया जाता है, राल पिछले दिन बनाया समय से पहले कठोर करने के लिए शुरू हो जाएगा, और नमूना हेरफेर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा.
  8. ४५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक वैक्यूम ओवन में नमूना Degas ।
    नोट: यह कदम नमूने के भीतर किसी भी फंस हवा बुलबुले को दूर करने में मदद मिलेगी, लेकिन यह गैर-आवश्यक है और डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करेगा ।
  9. अंत में, ६० डिग्री सेल्सियस पर ४८ घंटे के लिए एक ओवन में नमूना इलाज ।

5. माइक्रो-सीटी

  1. एक बार जब नमूना ठीक हो गया है, डिस्पोजेबल मोल्ड छील और यह माइक्रो सीटी मशीन के साथ स्कैन ।
    नोट: इस्तेमाल मशीन पर निर्भर करता है, सेटिंग्स अलग हो जाएगा । सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध लेखकों द्वारा उपयोग किया गया स्कैनर के लिए, अनुशंसित सेटिंग्स १३० केवी, १३५ µA एक ०.१ मिमी तांबे फिल्टर और एक मोलिब्डेनम स्रोत, एक 1-सेकंड प्रदर्शन, और प्रक्षेपण के प्रति 4 तख्ते के एक औसत के साथ कर रहे हैं । कई कारकों एक विशेष सत्र के दौरान इष्टतम सेटिंग्स को प्रभावित करेगा के रूप में हालांकि, प्रयोगकर्ता स्कैनर व्यक्तिगत रूप से जांचना चाहिए ।
  2. एक बार स्कैन पूरा हो गया है, स्कैनर सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर पर प्रयोगकर्ता स्कैनर/सॉफ्टवेयर संयोजन के लिए अनुशंसित मापदंडों के साथ नमूना पुनर्निर्माण ।
  3. अंत में, कल्पना और पसंद के प्रयोगकर्ता सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खंगाला डिजिटल मात्रा का विश्लेषण (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।

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Representative Results

परंपरागत रूप से, दिमाग और खोदी है क्रम में घावों को बढ़ाता है और इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए, लेकिन इस विधि त्रुटि प्रवण, श्रम गहन है, और आम तौर पर परिणामों के आकलन की आवश्यकता है । माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए पूरे दिमाग तैयार करके, नमूनों को नुकसान पहुँचाए की संभावना बहुत कम है, ब्याज की सुविधाओं के पूरे मस्तिष्क के संदर्भ में विश्लेषण किया जा सकता है, और विधि ही कई नमूनों के समानांतर प्रसंस्करण के लिए उधार देता है, काफी नमूना तैयारी की गति.

विधि चार प्रमुख कदम शामिल हैं: (1) आज़मियम tetroxide के साथ एक perfused मस्तिष्क धुंधला, (2) राल में मस्तिष्क embedding, (3) एक माइक्रो सीटी स्कैनर के साथ मस्तिष्क इमेजिंग, और (4) जिसके परिणामस्वरूप डिजिटल मात्रा (चित्रा 1) का विश्लेषण । इस आलेख में, केवल चरण 1 – 3 वर्णित हैं, के रूप में 4 (विश्लेषण) प्रोजेक्ट की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर काफी भिंन होगा ।

जबकि पारंपरिक अनुभाग में जिसमें एक अनुभाग अभिविंयास पहले से चुना जाना चाहिए, इस विधि से परिणामी डिजिटल मात्रा तीन आयामों में हेरफेर किया जा सकता है और वस्तुतः किसी भी अभिविंयास (चित्रा 2a-बी) में कटा हुआ । उपयोगकर्ता एक उच्च संकल्प पर नमूना के एक उपधारा भी स्कैन कर सकते हैं अगर वांछित, जैसे कि एक चूहे मस्तिष्क के घ्राण बल्ब, जहां तंत्रिका तंतुओं और व्यक्तिगत glomeruli दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 2सी). विधि भी मोटे तौर पर छोटे जानवर दिमाग पर लागू होता है । इस सत्यापित करने के लिए, एक ज़ेबरा फिंच मस्तिष्क चूहे दिमाग के लिए इस्तेमाल किया और एक सफल डिजिटल मात्रा (चित्रा 2ई) के परिणामस्वरूप एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किया गया था । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के लिए तैयार एक नमूना माइक्रो-सीटी की पुष्टि की है कि ऊतक को क्षतिग्रस्त नहीं किया गया था करने के लिए एक आदेश से परे परिमाण के संकल्प में माइक्रो सीटी के संकल्प (चित्रा 2डी). तथापि, यह है कि वहां काफी ultrastructural क्षति, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के लिए अनुपयुक्त इस तकनीक बनाने ध्यान दिया जाना चाहिए ।

तकनीक का इस्तेमाल सतह के घावों (चित्रा 3) और मस्तिष्क के भीतर गहरे घावों (चित्रा 4) को खोजने के लिए किया जा सकता है । यह तकनीक सीटू में सिंगल tetrodes, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों , पर्याप्त व्यास की इलेक्ट्रोड पटरियों, सीटू में tetrode arrays, और सीटू में सिलिकॉन जांच (चित्रा 5) का पता लगाने की अनुमति भी देती है ।

असफल तैयारी ऊतक, जो भी हो सकता है अगर गलत बफ़र्स (चित्रा 6) का उपयोग किया जाता है की अपूर्ण mineralization शामिल होगा । हालांकि, अगर केवल सतह सुविधाओं के लिए आवश्यक हैं, उदाहरण के लिए, तो नमूना की सतह केवल दाग प्रयोगकर्ता के लिए पर्याप्त हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : विधि सिंहावलोकन । तैयार है और माइक्रो सीटी इमेजिंग का उपयोग कर एक पूरे मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक चरणों का अवलोकन । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : सूक्ष्म सीटी इमेजिंग के माध्यम से घाव लक्षण वर्णन की क्षमताओं । (क) जोड़ तोड़ 3 डी मात्रा और (ख) आभासी स्लाइसें (१३.९ µm voxels) एक माइक्रो-सीटी एक लंबी इवांस चूहे के स्कैन से मनमाना झुकाव पर । (ग) उच्च रिज़ॉल्यूशन पर घ्राण बल्ब स्कैन (४.९ µm voxels) glomeruli (वाइट arrowhead) और वैयक्तिक तंत्रिका तंतुओं (blue arrowhead) का खुलासा. (घ) माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए तैयार किए गए एक चूहे मस्तिष्क के दृश्य प्रांतस्था की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) इमेज (10 एनएम/ (ङ) ज़ेबरा फिंच (Taeniopygia guttata) मस्तिष्क माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए तैयार; 3 डी मात्रा और 2d स्लाइस (५.६ µm voxels) में राज्याभिषेक, क्षैतिज, और sagittal विमानों । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : दृश्य प्रांतस्था घाव माइक्रो सीटी का उपयोग लक्षण वर्णन । (एक) एक चूहे मस्तिष्क quinolinic एसिड के साथ दृश्य प्रांतस्था में क्षतिग्रस्त के 3 डी दृश्य । बाएँ पैनल मस्तिष्क के संदर्भ में घाव की मात्रा से पता चलता है (मस्तिष्क घावों को दृश्य पहुँच की अनुमति देने के लिए थोड़ा पारदर्शी बनाया). दाहिने पैनल अलग घावों की मात्रा दिखाता है । (ख) राज्याभिषेक, क्षैतिज, और sagittal विमानों (१२.८ µm voxels) में घाव के 2d स्लाइस । शीर्ष 3 पैनलों unsegmented वर्गों को दिखाने के लिए, और नीचे 3 पैनलों मढ़ा घाव एनोटेशन के साथ वर्गों दिखाओ । इस घावों को मैंयुअल रूप से राज्याभिषेक अभिविंयास हर 2 स्लाइस में व्याख्या की गई थी । इसके बाद इसकी मात्रा को इंटरपोल के माध्यम से बनाया गया । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: माइक्रो सीटी और प्रोटोकॉल का उपयोग dorso पार्श्व striatum घाव लक्षण वर्णन की तुलना. (क) Sagittal, क्षैतिज, और "ब्रेन 1" माइक्रो सीटी इमेजिंग (१३.५ µm voxels) के लिए संसाधित की बाईं आधा के राज्याभिषेक विचार । शीर्ष 3 पैनलों unsegmented वर्गों को दिखाने के लिए, और नीचे 3 पैनलों एक ही वर्गों पर व्याख्या घाव दिखाते हैं । घाव मैन्युअल रूप से हर 2 वर्गों और बाद में दुओं sagittal विमान में विभाजित किया गया था. (ख) प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए "मस्तिष्क 1" संसाधित histologically के ठीक आधे के निकटतम मिलान राज्याभिषेक अनुभाग । पैनलों (सी, डी) (ए, बी) के समान हैं, लेकिन "मस्तिष्क 2" के अनुरूप हैं । मस्तिष्क 2 घावों को मैन्युअल रूप से हर 8 वर्गों में राज्याभिषेक विमान में विभाजित किया गया था । (ङ) प्रोटोकॉल के घाव का लक्षण वर्णन-1 दिमाग के ठीक हिस्सों (डार्क ग्रे) और 2 (प्रकाश ग्रे) । पैनल के नीचे (बी, डी, ई) में संख्या bregma के सापेक्ष पदों के अनुरूप है । (च) सूक्ष्म सीटी के लिए संसाधित 1 मस्तिष्क के बाईं आधा के घाव लक्षण वर्णन । पहले पैनल अलग घावों को दर्शाता है । दूसरे और तीसरे पैनलों दो दृष्टिकोण से मस्तिष्क के संदर्भ में घाव दिखाते हैं । (छ) के रूप में ही (च), लेकिन मस्तिष्क 2 से संबंधित । (एच) में घावों के एक ओवरले (एफ, जी) डिजिटल मस्तिष्क की मात्रा के साथ घाव लक्षण वर्णन की तुलना के लिए क्षमता illustrating । (f) में घाव (g) में घाव के लिए पंजीकृत किया गया था, और दोनों मस्तिष्क 2 के बाईं आधा के संदर्भ में दिखाए जाते हैं । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : इलेक्ट्रोड माइक्रो-सीटी इमेजिंग के माध्यम से स्थानीयकरण । (क) सीटू में छोड़े गए एकल tetrode (१४.० µm voxels). शीर्ष बाएँ पैनल: आभासी राज्याभिषेक वर्गों के अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एक चूहे की महासंयोजिका में दृश्य प्रांतस्था के माध्यम से यात्रा tetrode एक nichrome के स्थान दिखा; ऊपर दाएं: क्लोज़ अप (एक) (सफेद आयत) के शीर्ष बाएँ पैनल में दिखाया गया एक छवि के ऊपर. नीचे बाएं: sagittal; नीचे दाईं ओर: प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के क्षैतिज दृश्य (सफ़ेद तीर tetrode के स्थान को इंगित करता है). (ख) एक चूहे मस्तिष्क के पूर्वकाल क्षेत्र में इलेक्ट्रोलाइटिक घाव और इलेक्ट्रोड ट्रैक (१३.९ µm voxels). शीर्ष वाम: इलेक्ट्रोलाइटिक घावों के साथ एक मस्तिष्क के 3 डी प्रतिपादन (बैंगनी घाव का संकेत सफेद तीर) बाहर विभाजित; ऊपर सही: राज्याभिषेक । नीचे बाएं: sagittal; नीचे सही: एक ७५ µm व्यास टंगस्टन इलेक्ट्रोड के साथ उत्पादित इलेक्ट्रोलाइटिक घावों (सफेद तीर) का संकेत क्षैतिज वर्गों । इसके अलावा, कुछ धातु retraction पर इलेक्ट्रोड द्वारा जमा sagittal दृश्य (सफेद ऐरोहेड) में ट्रैक के साथ दिखाई दे रहा है । (ग) 16-tetrode प्रत्यारोपण एक चूहे के मस्तिष्क के पूर्वकाल प्रांतस्था में सीटू में छोड़ दिया है । शीर्ष वाम: एक 16-tetrode सरणी प्रत्यारोपित छोड़ दिया के साथ एक पूरे मस्तिष्क के 3 डी प्रतिपादन; ऊपर सही: राज्याभिषेक । नीचे बाएं: sagittal; नीचे दाएं: क्षैतिज एक 16-tetrode प्रत्यारोपण (८.९ µm voxels) का संकेत वर्गों । (घ) सिलिकॉन जांच (10 मिमी टांग, ३२ साइटें) पीछे प्रांतस्था, हिप्पोकैम्पस, और subcortical संरचनाओं (१३.९ µm voxels) के माध्यम से यात्रा सीटू में छोड़ दिया । शीर्ष वाम: एक पूरे मस्तिष्क के 3 डी प्रतिपादन एक खंड सिलिकॉन जांच (सफेद हरे रंग की जांच का संकेत तीर); ऊपर सही: राज्याभिषेक । नीचे बाएं: sagittal; नीचे दाएं: मस्तिष्क में एक सिलिकॉन जांच के क्षैतिज विचार । इसके अतिरिक्त, सिलिकॉन जांच पर संदर्भ साइट राज्याभिषेक और sagittal वर्गों (सफेद तीर की नोक) में दिखाई दे रहा है । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : आज़मियम प्रवेश पर आज़मियम tetroxide विलायक का प्रभाव । (क) बाएं पैनल: चूहा मस्तिष्क ddH2में आज़मियम tetroxide में मशीन 1 सप्ताह के लिए हे । सही पैनल: चूहा मस्तिष्क 2 सप्ताह के लिए ddH2हे में आज़मियम tetroxide में मशीन । (ख) दो चूहे दिमाग आज़मियम tetroxide में सोडियम cacodylate बफर में 6 सप्ताह के लिए मशीन । 13लेखकों से अनुमति के साथ प्रयोग किया जाता आंकड़ा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

निंनलिखित प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: पहला, पीएफए और GA के संयोजन का उपयोग करने के लिए पशु perfuse और बाद में मस्तिष्क को ठीक करने के बाद ऊतक के अनुरूप पूर्ण आज़मियम प्रवेश को प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि था । हालांकि हम यह स्पष्ट रूप से परीक्षण नहीं किया, एक प्रशंसनीय विवरण है कि पीएफए निर्धारण15प्रतिवर्ती है, जबकि गा निर्धारण16,17प्रतिवर्ती नहीं है । क्योंकि आज़मियम tetroxide में एक दो सप्ताह की मशीन ऊतक के पूर्ण घुसपैठ के लिए आवश्यक है, यह संभव है कि मस्तिष्क के इंटीरियर में पीएफए बाहर फैलाना और दाग के दौरान ऊतक नीचा । । । आज़मियम इस प्रकार आंतरिक संरचनाओं को संरक्षित नहीं कर सकते ।

जलीय आज़मियम का उपयोग, के रूप में एक बफर में भंग आज़मियम का विरोध किया (यानी, सोडियम cacodylate), बिल्कुल के लिए आज़मियम द्वारा पूर्ण ऊतक पैठ सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक था । यहां तक कि एक 6 सप्ताह की मशीन के बाद, आज़मियम सोडियम cacodylate में भंग ऊतक पूरी तरह से घुसपैठ नहीं किया और एक प्रसार बाधा (चित्रा 6) मुठभेड़ दिखाई दिया । आज़मियम अत्यंत लिपिड को प्रतिक्रियाशील है और कोशिका झिल्ली18,19,20में उन बांध सोचा । यदि ऊतक पर्याप्त permeabilized नहीं है, के रूप में सोडियम cacodylate की तरह एक सौंय बफर के साथ मामला हो सकता है, यह संभव है कि कोशिका झिल्ली आज़मियम और sterically ऊतक में फैलाना से अधिक आज़मियम को रोकने के साथ संतृप्त हो सकता है । हम परिकल्पना, तथापि, आज़मियम के लिए एक विलायक के रूप में है कि पानी के एक हल्के डिटर्जेंट के रूप में कार्य करता है और ऊतक permeabilizes पर्याप्त ऊतकों में गहरी प्रसार की अनुमति है ।

यदि experimenters एक छोटे मस्तिष्क, जैसे कि एक माउस की तैयारी कर रहे हैं, आज़मियम में मशीन समय की संभावना कम हो सकती है । इसी तरह, मशीन समय बड़े नमूनों में वृद्धि की जरूरत है । यह एक चूहे की तुलना में आकार में अलग है कि एक मस्तिष्क में लगातार धुंधला के लिए न्यूनतम समय निर्धारित करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है. experimenters पूर्ण आज़मियम घुसपैठ के साथ समस्याओं का सामना करते हैं, संभावना समस्याओं छिड़काव और बाद निर्धारण के दौरान दोनों पीएफए और GA का उपयोग नहीं कर रहे हैं, आज़मियम के लिए विलायक के रूप में पानी का उपयोग नहीं (जैसा कि ऊपर चर्चा), और आज़मियम के दौरान अपर्याप्त आंदोलन ऊष्मायन. हमने पाया, उदाहरण के लिए, कि जब ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में मशीनिंग, उनकी ओर ट्यूबों बिछाने (के रूप में एक धारक पर खड़ी करने का विरोध), उंहें दाग के साथ भरने, और उंहें ५० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर रखकर पूरे मशीन अवधि के लिए उचित सुनिश्चित घुसपैठ.

यह विधि कई मायनों में सीमित है । सबसे पहले, तैयारी ultrastructure बहुत अच्छी तरह से संरक्षित नहीं है, तो यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । इस विधि को किसी भी आगे प्रोटोकॉल या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ संयोजित नहीं किया जा सकता । डिजिटल मात्रा के संकल्प नमूने के आकार से निर्धारित होता है (छोटे नमूने उच्च संकल्प पर स्कैन किया जा सकता है) और यह ज्यामितीय आवर्धन पर निर्भर करता है, तो स्कैनर की ज्यामिति, द्वारा; हालांकि, नमूने के उपधारा उच्च संकल्प पर स्कैन किया जा सकता है, यदि वांछित ।

एक नई विधि के संयोजन से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी-शैली ऊतक उपचार सूक्ष्म सीटी इमेजिंग के साथ घावों को बढ़ाता है और स्थानीय इलेक्ट्रोड छोटे जानवर दिमाग में के लिए प्रस्तुत किया गया है । इस विधि यकीनन कम श्रमसाध्य है, कम विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और पैदावार quantifiable और एक मस्तिष्क धुंधला के लिए वर्तमान सोने के मानक से अधिक आसानी से परिणाम । पहले, वैज्ञानिकों माउस दिमाग है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी21,22के लिए ultrastructure के संरक्षण का मतलब है में भी आज़मियम पैठ के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । हालांकि, यह प्रोटोकॉल काफी जटिल है । इस अध्ययन में लेखकों ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के बजाय माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए ज्यादा सरल विधि विकसित करने का लक्ष्य रखा । वहां अंय विभिंन प्रयोजनों के लिए इमेजिंग दिमाग को माइक्रो सीटी लगाने के अध्ययन किया गया है । खरगोशों और चूहों में एक पिछले जांच माइक्रो सीटी का इस्तेमाल ट्यूमर और अन्य विषमताओं23खोजने के लिए. इस जांच मालिकाना एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों का उपयोग किया है, लेकिन शोधकर्ताओं ने सूक्ष्म है सीटी घाव के अध्ययन में संभावित उपयोगिता की भविष्यवाणी की । एक दवा स्क्रीन के लिए सकल रूपात्मक मतभेदों को खोजने के उद्देश्य से चूहों में एक और अध्ययन खोपड़ी में आयोडीन के साथ माउस दिमाग के दाग शामिल है, लेकिन लेखकों असमान ऊतक संकोचन का सामना करना पड़ा और एक hydrogel24में ऊतक एंबेड करने के लिए चुना । चूहों में अन्य अध्ययनों से सेरेब्रल गुफा के विकृतियों, असामान्य रूप से बड़े और अनियमित केशिकाओं के एक विकार को खोजने के उद्देश्य से है, और दाग के रूप में आज़मियम tetroxide और जलीय आयोडीन का उपयोग किया है; हालांकि, इन बहुत छोटे नमूनों में प्रदर्शन किया गया (अलग माउस hindbrains) से यहां वर्णित25,26,27। 3 डी मस्तिष्क की मात्रा पैदा करने के लिए वैकल्पिक तरीकों µ एमआरआई28 और उच्च संकल्प episcopic माइक्रोस्कोपी31रहे हैं । µ एमआरआई के संकल्प गरीब (~ 25 µm voxels के लिए इसी तरह के नमूने28), और तकनीक और अधिक महंगा है23,30। उच्च संकल्प episcopic माइक्रोस्कोपी भी चुनौतियों का सामना: कि यह एक विनाशकारी तकनीक है, और एक ब्लॉक-चेहरा तंत्र की अनुमति पूरे मस्तिष्क अनुभाग का उत्पादन किया जा करने की आवश्यकता होगी । यहां प्रस्तुत काम भी पिछले प्रयासों X-किरणों३२,३३,३४ दोनों इलेक्ट्रोड और आसपास के ऊतकों पर कब्जा करने से मस्तिष्क में इलेक्ट्रोड का पता लगाने के लिए प्रदान करता है । इसके अलावा, तकनीक एकल इलेक्ट्रोड, tetrode arrays, इलेक्ट्रोलाइटिक घावों, इलेक्ट्रोड पटरियों, और सिलिकॉन जांच का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।

एक मूल्यवान भविष्य की दिशा एक "औसत मस्तिष्क" एटलस जो घाव अध्ययन सह हो सकता है के निर्माण के लिए मानकीकरण घाव स्थान और आकार ठहराव के रूप में पंजीकृत किया जाएगा । इस विधि अंय मॉडल और गैर मॉडल जीवों के लिए भी विस्तार किया जा सकता है, ज़ेबरा फिंच मस्तिष्क (चित्रा 2) के लिए अपने तत्काल आवेदन द्वारा उदाहरण के रूप में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ग्रेग लिन और आर्थर McClelland के साथ अपनी विशेषज्ञता के लिए धंयवाद माइक्रो सीटी मशीन, डेविड रिचमंड और शिकारी इलियट छवि और डेटा विश्लेषण कोर (IDAC) में हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में उनकी छवि प्रसंस्करण सलाह के लिए, और विलियम Liberti बोस्टन में कृपा से एक ज़ेबरा फिंच मस्तिष्क प्रदान करने के लिए विश्वविद्यालय । यह काम नेनो सिस्टम के लिए केंद्र (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो समंवित अवसंरचना नेटवर्क (NNCI), जो NSF पुरस्कार no १५४१९५९ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य में भाग में प्रदर्शन किया गया । सीएनएस हार्वर्ड यूनिवर्सिटी का एक हिस्सा है । यह काम रिचर्ड और सुसान स्मिथ परिवार फाउंडेशन और IARPA (अनुबंध #D16PC00002) द्वारा समर्थित किया गया था । S.B.E.W. मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (HFSP से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; LT000514/2014) और यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान संगठन (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. को नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम (GRFP) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences (EMS) 15710 2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA) EMS 16220 2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4 EMS 19190 Work in fume hood
Ethanol Decon Labs Koptec 140, 190, 200 proof
Acetone EMS 10015 Glass-distilled
Durcupan ACM resin Sigma-Aldrich 44610 A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds Ted Pella 27114 Suggested
milliQ water (ultrapure water) Millipore Sigma QGARD00R1 (or related purifier) Suggested
Parafilm (paraffin film) Millipore Sigma P7793 Suggested paraffin film
Micro-CT scanner Nikon Metrology Ltd., Tring, UK X-Tek HMS ST 225 Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume Graphics VG Studio Max Used by authors
FEI / Thermo Scientific Avizo Used by authors
FEI / Thermo Scientific Amira Similar to Avizo
Mark Sutton & Russell Garwood Spiers Free, http://spiers-software.org/
Pixmeo Sarl Osirix Lite Free, https://www.osirix-viewer.com/
Open Source FIJI Free, https://fiji.sc/
Adobe Photoshop Good for analyzing one slice at a time

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References

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Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B.… More

Masis, J., Mankus, D., Wolff, S. B. E., Guitchounts, G., Joesch, M., Cox, D. D. A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains. J. Vis. Exp. (141), e58585, doi:10.3791/58585 (2018).

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