Summary
Bu makalede küçük hayvan beyin mikro-CT görüntüleme, hangi lezyonlar sayılabilir ve tüm beyin bağlamında yüksek hassasiyetle yer alan elektrotlar hazırlamak için basit bir yöntem.
Abstract
Lezyon ve elektrot konumu doğrulama geleneksel yolu ile histolojik inceleme lekeli Beyin dilimleri, el ile tahmini gerektirir zaman alıcı bir işlem yapılır. Burada, lezyonlar miktarının ve elektrotlar daha az zahmetli ve daha ayrıntılı sonuçlar verir beyin bulmak için basit, kolay bir yöntemi açıklanmaktadır. Bütün beyin osmiyum tetroxide ile lekeli, reçine gömülü ve mikro-CT tarayıcı ile görüntüsü. 3D dijital birimleri kararları ve sanal bölüm kalınlıkları örnek boyutu üzerinde bağımlı ile beyin taramaları sonucunda (voxel sıçan ve zebra finch için başına 12-15 ve 5-6 µm beyin, sırasıyla). Yüzey ve derin lezyonlar ile karakterize ve tek tetrodes, tetrot diziler, elektrolitik lezyonlar ve silikon sondalar de yerelleştirilmiş olabilir. Özgür ve özel mülk yazılım Denemecileri el ile veya otomatik olarak herhangi bir uçak ve segment birim numune hacmi incelemek izin verir. Bu yöntem tüm beyin hacmi oluşturduğu için lezyonlar ve elektrotlar karşılaştırmaları içinde ve çalışmalar arasında standart hale getirmek yardımcı olacaktır geçerli yöntemleri çok daha yüksek derecede sayısal.
Introduction
Nörologlar lezyonlar uzun süre üzerinde işlev ve beyin konumda arasındaki ilişkiyi anlamak için güveniyorlar. Örneğin, öğrenme ve hafıza için vazgeçilmez olarak hipokampus ve dürtü kontrol için anahtar olarak prefrontal korteks anladığımız kadarıyla her iki ürün insanlar1,2serendipitous lezyonların edildi. Ancak, hayvan modelleri kullanımını nörologlar lezyonlar serendipity ötesine giderek yararlanmak izin verdi ve sayısız beyin bölgeleri fonksiyonu yapı-fonksiyon ilişkilerin sistematik çalışmalar aracılığıyla aydınlatılmamıştır lezyonlar3,4.
Doğru işlevi için bir yapı atamak için ancak, eksik bir alandır kesin miktar yordamlar lezyon çalışmaları gerektirir. Bölüm, bağlama, bir ışık mikroskobu ile görüntü beyin lezyonlar miktarının geçerli altın standart etmektir. Görüntülü dilimleri sonra bir atlas en yakın bölümleri için eşleştirilir ve konular arasında lezyonların yaklaşık koordinatları dolaylı olarak, genelde kamera lucida görüntüleri veya örnek histolojik dilimler3,4 kullanılarak raporlanır ,5,6,7,8,9,10.
Tutarsızlık mevcut lezyon miktar yordamlar, bu teknikleri zaman alan ve hata eğilimli. Küçük değişiklikler beyin sertlik, bıçak netlik ve sıcaklık berbat, çarpık ya da bozuk bölümleri için yol açabilir. Bölümleri de düzensiz leke olabilir ve yanlış montaj orta kabarcıkları nedeniyle yansıması. Önemlisi, kesit üzerine, beyin konumda lezyon'ın üç boyutlu bağlamında, beyin zorlu lezyon kesin 3D yeniden yapım kaybolur.
Lezyonlar için başka bir ortak uygulama tek ve birden çok elektrot kayıtları beyindeki konumunu belirlemek için olmuştur. Son kayıt oturumu sonunda, araştırmacılar küçük elektrolitik lezyonlar elektrot uç teşvik ve beyin histolojik olarak bir geleneksel lezyon deneme11' olarak işlemek. Bu teknik elektrolitik lezyonlar genellikle onları yapmak için kullanılan elektrotlar büyüktür ama genellikle küçük varlık ki ek sorunları yukarıda açıklanan aynı dezavantajları bu histolojik olarak bulmak için meydan uğrar. Birden çok elektrotlar eklendiğinde tetrot dizi durumunda olduğu gibi doğrulama elektrolitik lezyon üzerinden bile daha zordur. Daha sonra histolojik olarak12doğrulamak için elektrot üzerine boya kullanımı elektrolitik lezyonlar için bir diğer seçenek olmakla bu tekniği ile geleneksel Histoloji gel aynı sakıncaları çekiyor.
Burada, biz ayrıntılı tarif elektron mikroskobu (EM) ve x-ışını teknikleri boyama dayalı bir son zamanlarda açıklanan yöntemi13 bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) lezyonlar quantifies ve akım daha iyi küçük hayvan beyinlerinde elektrot bulur yöntemleri. Mikro-CT içinde bir scintillator tarafından örnek olamaz değil röntgen toplarken 360 ° döndürülmüş bir örnek x-ışınları ateş bir görüntüleme tekniğidir. Herhangi bir yönde görüntülenir ve tam sayısal örnek bir yüksek çözünürlüklü dijital 3D yeniden yapılanma sonucudur. Birçok akademik kurum are da elde edilebilir ticari olarak mikro-CT tarayıcıları var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm bakım ve deneysel hayvan manipülasyon gözden geçirilmiş ve Harvard kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış. Burada açıklanan perfüzyon sıçanlara özgüdür, ancak yordamı herhangi bir hayvan daha küçük veya benzer şekilde ölçekli akıllı için geçerlidir.
1. perfüzyon
- 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hazırlamak. Bir fare için (Yaş: 0.5-1.5 yaşında, ağırlık: 250-600 g), 800-1000 mL-meli var olmak yeterli. 400 mL hayvan ve sabitleştirici sulandırmak için ek bir 400 mL sıvı için kullanın.
- %2 (w/v) paraformaldehyde (PFA) ve % 2.5 (w/v) oxazolidin (GA) 1 x PBS oluşan sabitleştirici hazırlayın. Bir fare için 400 mL yeterli olur. 50 mL 50 mL konik tüp beyin perfüzyon sonra sonrası fiksasyonu için kaydedin.
- 15 dakika (0, 8 L/dk O2 21 ° c 1,0 bar), 4 – %5 isoflurane gaz fareyle anestezi.
- İntraperitoneally sodyum Fentobarbital öldürücü bir doz enjekte (180 mg/kg).
- Hayvan refleks kaybı bir ayak parmağı-çimdik refleks sınav yaparak sınayın. Hayvan onun refleks yanıt kaybedene kadar perfüzyon başlamasını bekleyin.
- Yukarıda açıklanan intracardial perfüzyon ve beyin ayıklama Protokolü14 aşağıdaki çözümleri ile izleyin: 400 mL 1 x PBS 125 mm Hg kan kaldırmak için hayvanla sıvı. Bir kez tüm kan kaldırılır ve 1 x PBS ile değiştirilir, İngiltere'de yılın ve 1 x PBS 125 mm Hg içinde çözünmüş % 2.5 GA ile 400 mL % 2 lik ventriküler başlar.
Not: yordamı bir sıçan değil bir hayvan içinde yürütülmektedir, perfüzyon yordamı yalnızca önemli bileşenleri 1 x PBS ve % 2 kullanımı vardır PFA, 1 x PBS % 2.5 GA. Çözüm birimleri ve perfüzyon basıncı türler göre ayarlanabilir.
2. sonrası fiksasyon
- Ayıklanan beyin % 2 yer PFA, 1 PBS çözüm (hayvan daha önce sıvı için kullanılan aynı çözüm) x % 2.5 GA. Çözüm birimin en az 10 beyin hacmi x olduğundan emin olun. Fareler için bir 50 mL konik tüp 50 mL çözeltisi ile beyin yerleştirin. Örnek 2-3 gün, 4 ° C'de hafifçe sallayarak sonrası fiksasyon saklayın
Not: örnek bir 50 mL konik tüp içinde ise, yatay bir orbital çalkalayıcı yerleştirerek en iyi sonuçları garanti eder. - Örnek uzun süre yeterli sonrası sabit olmuştur sonra örnek çift distile su (GKD2O), de-iyonize su (diH2O) veya Ultrasaf Su yıkama ( Tablo malzemelerigörmek) dört kez aşağıdaki süreler için: 1, 1, 1 ve 15 dak.
Not: Bu iletişim kuralı için GKD2O, diH2O veya Ultrasaf Su değiştirilebilir olmalıdır. Kolaylık olması için GKD2O arıtılmış su için bundan böyle başvurmak için kullanılır.
3. boyama
Dikkat: Bu adımda, eldiven kullanırken bir başlık altında tüm çözüm hazırlıklarını yaparlar.
- En az 10 çözüm boyama beyin hacmi x hazırlamak. Sıçan beyin yerine %2 (w/v) osmiyum tetroxide (OsO4) 50 mL GKD2içinde O 25 mL hisse senedi % 4 OsO4 çözeltisi ve 25 mL GKD2O. birleştirerek hazırlamak
Dikkat: osmiyum tetroxide uçucu ve geçici körlük ve solunum sorunlarına neden olabilir eğer değil gerektiği gibi. Osmiyum tetroxide ikincil bir kapsayıcı içindeki bir uygun kimyasal tehlike kapsayıcıda başvurun tüm malzemeleri atmak. - Beyin bir yeni 50 mL konik tüp içinde yerleştirin ve OsO4 çözüm ekleyin. Beyin dokusunda lipidler ile4 tepki OsO olarak kahverengi açmak başlamalıdır.
- Tüp kapatın ve iyice parafin ile mühür kuluçka sırasında kaçak değil emin olmak için (bkz. Tablo reçetesi) film.
Not: Osmiyum kırılgandır ve tüp düzgün mühürleme çok önemlidir bu yüzden hafif Tüp, plastik ile tepki olacaktır. Ek koruma için alüminyum folyo ile tüp kaydırılmış olabilir. - Kapalı tüp hafifçe bir orbital çalkalayıcı 50 RPM 2 hafta boyunca sallayarak 4 ° C'de depolayın. Yatay olarak en iyi karıştırma sağlamak için tüp yerleştirin. Örnek tamamen sallayarak süre çözümde batık emin olun.
Not: osmiyum sürekli dolaşmaya izin verilmiyorsa, shaker yatay yerleşim çok önemlidir bu yüzden bunu tam olarak örnek zorlayarak elde değil.
4. katıştırma
- Örnek 2 hafta boyunca OsO4 ' te inkübe sonra GKD2O 5 kat, oda sıcaklığında (RT) ile aşağıdaki süreler için temizleyin: 1, 1, 1, 15 ve 60 dk tüm ilişkisiz OsO4 örnek kaldırmak için.
Not: son 60 dk değişimi dahil birden çok değişim tüm osmiyum dolaşım sisteminin dışarı diffüz izin vermek gereklidir. - GKD2O 30 dk için örnekle 4 ° C'de yıkama
Not: Osmiyum örnek dışında diffüz devam edebilir, ancak onun miktarı büyük ölçüde önceki adımından azaltılmalıdır. - Sonunda reçine ile sızmak için etanol ile örnek kurutmak. Kurutmak için aşağıdaki etanol dilutions (30 min için her 4 ° C'de) 10-20 mL GKD2O değiştirin: % 20 (v/v) etanol ve %80 (v/v) GKD2O; % 50 (v/v) etanol ve % 50 (v/v) GKD2O; % 70 (v/v) etanol ve %30 (v/v) GKD2O; % 90'ı (v/v) etanol ve % 10 (v/v) GKD2O; % 100 etanol.
- Aseton/reçine dilutions aşağıdaki gibi hazırlayın.
- Reçine 100 mL ( Tablo malzemelerigörmek) gömmek için üreticinin talimatina hazırlayın.
- % 33 (v/v) reçine - %67 aseton çözüm yapmak, reçine 15 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 30 mL ekleyin.
- % 50 (v/v) reçine - %50 aseton yapmak, reçine 22,5 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 22,5 mL ekleyin.
- %67 (v/v) reçine-% 33 aseton çözüm yapmak, reçine 30 mL 50 mL konik tüp içine dökün ve % 100 cam distile aseton 15 mL ekleyin.
- Reçine kalan 32,5 mL % 100 reçine aşağıdaki ilk çözüm olarak kullanın.
- Örnek 10-20 mL aşağıdaki aseton ve aseton/reçine dilutions ile hareket ettirerek reçine infiltrasyon işlemine başlamak: % 100 aseton 30 dk 4 ° c; 4 ° C'de 30 dk için % 100 aseton; ve % 100 aseton (RT) Oda sıcaklığında 30 dakika.
Not: İnfiltrasyon işlemi geri kalanı RT. yer alacak - Örnek % 33 (v/v) reçine % 67 aseton RT, 3 h için o zaman % 50 (v/v) reçine - %50 aseton, RT, %67 (v/v) reçine % 33 aseton RT, 3 h için ve % 100 reçine için RT. 12 h 3 h için bırakın
- Tabi belgili tanımlık öğretim şişesinde reçine bir taze 50 mL toplu iş yapmak. Örnek içinde bu tedavi edilebilir kaba transfer (Örn., Malzemeler tabloiçinde açıklanan tek kullanımlık kalıpları). Örnek 4 saat RT. taze % 100 reçine ile demlemek
Not: taze reçine kullanılırsa, önceki gün yapılan reçine zamanından önce sertleşmesine başlar ve örnek işlemek zor olacak. - Degas örnek bir vakum fırında 45 ° C'de 15 dakika
Not: Bu adım herhangi bir kapana kısılmış hava kabarcıkları örnek içinde kaldırmak yardımcı olacaktır, ama gerekli olmayan ve verilerin kalitesini etkilemez. - Son olarak, örnek bir fırın 60 ° C'de 48 h için tedavi
5. mikro-CT
- Bir kez tedavi örnek tek kullanımlık kalıp soyma ve mikro-CT makine ile tarayın.
Not: kullanılan makine bağlı olarak ayarları farklı olacaktır. Malzemeleri tablodalistelenen yazarlar tarafından kullanılan tarayıcı için önerilen ayarları 130 olan kV, 135 µA 0,1 mm bakır filtre ve molibden kaynak, 1 saniye pozlama ve ortalama bir projeksiyon 4 kare ile. Birçok faktör optimum ayarlar belirli bir oturum sırasında etkileyecek gibi ancak, Denemecileri tarayıcı ayrı ayrı ayarlamak. - Tarama tamamlandığında, tarayıcı yazılımı ile bir bilgisayarda deneyci'nın tarayıcı/yazılım birleşimi için önerilen parametrelerle örnek yeniden.
- Son olarak, görselleştirmek ve deneyci'nın yazılım kullanarak yeniden oluşturulan dijital ses analiz (örnekler için bkz: Tablo malzeme ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geleneksel olarak, beyin kesitli ve lezyonlar ölçmek ve elektrotlar bulmak için lekeli, ancak bu yöntem hataya, emek yoğun ve genellikle tahmin sonuçları gerektirir. Bütün beyin mikro-CT görüntüleme için hazırlanıyor tarafından örnekleri zarar verme olasılığını önemli ölçüde azalır, ilgilendiğiniz olanakları tüm beyin bağlamında analiz edilebilir ve Yöntem birçok örnekleri, paralel işleme için önemli ölçüde ödünç vermek kendisi numune hazırlama hız.
Dört büyük adım yöntem içerir: (1) boyama osmiyum tetroxide perfused bir beyinle, gömme (2) beyin reçine, Imaging (3) beyin mikro-CT tarayıcı ile ve analiz (4) elde edilen dijital ses (Şekil 1). Adım 4 (Analiz) önemli ölçüde belirli proje gereksinimlerine bağlı olarak değişir gibi bu makalede, yalnızca 1-3 adımları, açıklanmıştır.
Oysa geleneksel içinde bir parça yön gerekir seçilmiş önceden kesit içinde bu yöntem elde edilen dijital birimden olabilir üç boyutlu olarak manipüle ve hemen hemen herhangi bir yönde dilimlenmiş (Şekil 2a-2b). Kullanıcı ayrıca bir alt bölümüne örnek isterseniz, sinir lifleri ve bireysel glomeruli görünür (Şekil 2c) nerede bir sıçan beyin olfaktör ampul gibi daha yüksek bir çözünürlükte tarama. Yöntemi ayrıca geniş küçük hayvan beyin için geçerlidir. Bunu doğrulamak için bir zebra finch beyin sıçan beyin yerine kullanılan ve başarılı bir dijital ses (Şekil 2e) içinde sonuçlandı aynı protokolü kullanılarak hazırlanmıştır. Elektron mikroskobu (SEM) mikro-CT için hazırlanan örneği tarama doku kadar bir büyüklük çözünürlükte mikro tomografi çözünürlük (Şekil 2d) ötesinde zarar gördüğünü değil doğruladı. Ancak, bu teknik elektron mikroskobu (EM) için uygun olmayan hale önemli ultrastructural hasar olduğunu belirtmek gerekir.
Teknik yüzey lezyonlar (Şekil 3) bulmak için kullanılabilir ve beyin (Şekil 4) içinde derin lezyonlar. Tekniği de bulma tek tetrodes in situ, elektrolitik lezyonlar, elektrot parça yeterli çapının verir, tetrot diziler içinde in situ ve silikon sondalar in situ (Şekil 5).
Başarısız hazırlıklar dokusunun yanlış arabellekleri kullanıldığında da oluşabilir, eksik Qafqaz oluşturan (Şekil 6). Yüzey özellikleri gerekli olan yalnızca, ancak, örneğin, o zaman sadece yüzey boyama örneği deneyci için yeterli olabilir.
Resim 1 : Yöntemi genel bakış. Hazırlamak ve bir bütün beyin mikro-CT görüntüleme kullanarak çözümlemek için gereken adımlara genel bakış. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Lezyon karakterizasyonu aracılığıyla mikro-CT görüntüleme yeteneklerini. (bir) Manipulatable 3D ses ve (b) sanal dilimleri (13,9 µm voxels) uzun-Evans ispiyoncu mikro tomografi gelen rasgele yönelimleri de. (c) olfaktör ampul glomeruli (beyaz ok ucu) ve bireysel sinir lifleri (mavi ok ucu) açığa daha yüksek çözünürlükte (4.9 µm voxels) inceden inceye gözden geçirmek. (d) taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntü (10 nm/piksel) mikro-CT görüntüleme için hazırlanan bir sıçan beyin görsel korteksin. (e) Zebra finch (Taeniopygia guttata) beyin mikro-CT görüntüleme hazırlanan; 3B cildi ve 2D (5.6 µm voxels) Koronal, yatay ve sagittal uçaklar dilimler. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Görsel korteksin lezyon karakterizasyonu mikro-CT kullanarak (bir) 3D görselleştirme bir sıçan beyin görsel kortekste quinolinic asit ile lesioned. Sol panelde lezyon cilt beyin (beyin lezyon görsel erişmesine izin vermek için biraz şeffaf yapılmış) bağlamında gösterir. Doğru kapı aynası izole lezyon cilt gösterir. (b) Koronal, yatay ve sagittal uçaklar (12,8 µm voxels) lezyon 2D dilim. En iyi 3 panelleri unsegmented bölümleri göster ve alt 3 panelleri bölümleri ile overlaid lezyon ek açıklama göster. Bu lezyon el ile yapıldı her 2 dilim koronal yönde açıklamalı. Birimin sonra enterpolasyon oluşturulmuştur. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: mikro-CT ve histoloji kullanarak dorso-lateral striatum lezyon karakterizasyonu karşılaştırılması. "beyin 1" yarısı için mikro-CT (13.5 µm voxels) görüntüleme işlenen sol (bir) Sagittal, yatay ve koronal sayısı. En iyi 3 panelleri unsegmented bölümleri göster ve alt 3 panelleri açıklamalı lezyon aynı bölümleri göster. Lezyon el ile yapıldı sagittal düzlemde her 2 bölüm bölümlenmiş ve daha sonra değiştirilmiş. (b) "beyin 1" yarısı histolojik olarak ışık mikroskobu için işlenen hakkının en yakın eşleşen koronal bölüm. Paneller (c, d) (a, b) benzeyen ancak "beyin 2" karşılık gelir. Beyin 2 lezyon el ile koronal düzlemde her 8 bölüm bölümlenmiş. (e) lezyon karakterizasyonu yarısının Histoloji tedavi sağ beyin 1 (koyu gri) ve 2 (açık gri). (B, d, e) sayılar paneller altında konumlara göre bregma karşılık gelir. (f) beyin 1 yarısı mikro-CT için işlenen sola lezyon karakterizasyonu İlk paneli izole lezyon gösterir. İkinci ve üçüncü panelleri lezyon iki bakış açıları beyinden bağlamında gösterir. (g) (f) olarak aynı ama beyin 2 için karşılık gelen. (h) bir bindirme lezyonlarin içinde (f, g) lezyon karakterizasyonu dijital beyin birimleri ile karşılaştırılması için özelliği gösteren. Lezyon (f) (g) lezyon için tescil edilmiştir ve her ikisi de beyin 2 sol yarısında bağlamında gösterilir. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Mikro-CT görüntüleme aracılığıyla elektrot yerelleştirme. (bir) tek tetrot sol in situ (14,0 µm voxels). Üst sol panel: max-yoğunluk projeksiyon görsel korteksin ispiyoncu; corpus callosum seyahat Nikrom tetrot yerini gösteren sanal koronal bölümleri sağ üst: (a) (beyaz dikdörtgen) üst sol panel gösterilen görüntünün yakın çekim. Alt sol: sagittal; sağ alt: yatay yerleştirilmiş elektrot görünümlerini (beyaz ok tetrot konumunu gösterir). (b) elektrolitik lezyon ve elektrot bir sıçan beyin (13,9 µm voxels) ön bölgede izleyin. «Ana sayfa» sol: bir beyin elektrolitik lezyon ile 3D render (mor lezyon gösteren beyaz ok) bölümlenmiş; sağ üst: koronal. Alt sol: sagittal; sağ alt: yatay bölümler elektrolitik lezyon (beyaz ok) gösteren bir 75 µm çapı tungsten elektrot ile üretilen. Buna ek olarak, bazı metal elektrot geri çekilmesi üzerine tarafından yatırılan sagittal görünümü (beyaz ok uçları) parça boyunca görülür. (c) 16-tetrot implant situ içinde bir sıçan beyin ön korteks yaptı. «Ana sayfa» sol: bütün beyin sol implante; 16-tetrot dizi ile 3D render sağ üst: koronal. Alt sol: sagittal; sağ alt: 16-tetrot implant (8,9 µm voxels) gösteren yatay bölümler. (d) Silikon sonda (10 mm şaft, 32 siteleri) posterior korteks, hipokampus ve subcortical yapıları (13,9 µm voxels) seyahat in situ yaptı. «Ana sayfa» sol: 3D render tüm beyinle kesimli silikon sonda (beyaz ok gösteren yeşil sonda); sağ üst: koronal. Alt sol: sagittal; sağ alt: yatay sayısı bir silikon sonda beyinde. Ayrıca, silikon sonda başvuru ücreti koronal ve sagittal bölümlerine (beyaz ok ucu) görülür. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Osmiyum penetrasyon osmiyum tetroxide çözücü etkisi. (bir) sol panel: sıçan beyin inkübe GKD2O osmiyum tetroxide içinde 1 hafta için. Doğru kapı aynası: sıçan beyin inkübe osmiyum tetroxide GKD2O içinde 2 hafta boyunca. (b) iki sıçan beyin osmiyum tetroxide içinde sodyum cacodylate tampon 6 hafta boyunca inkübe. Yazarlar13izniyle kullanılan rakam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol için önemli adımlar şunlardır: ilk olarak, İngiltere'de yılın ve GA hayvan sıvı ve daha sonra beyin sonrası düzeltmek için bir arada kullanımı tutarlı tam osmiyum penetrasyon dokusunun ulaşmak için her şeyden. Her ne kadar biz bu açıkça did değil sınav, GA fiksasyon değil tersinir16,17ise makul bir açıklama PFA fiksasyon tersinir15, olmasıdır. Bir iki haftalık kuluçka osmiyum tetroxide içinde tam doku infiltrasyonu için gerekli olduğundan, beyin iç PFA dışarı yayılır ve boyama sırasında doku alçaltır mümkündür. Osmiyum böylece iç yapıları saklayamaz.
Osmiyum karşı sulu osmiyum kullanımı bir arabellekte çözünmüş (yani, sodyum cacodylate), tam doku penetrasyon tarafından osmiyum sağlamak için kesinlikle gerekli olduğunu. Düz-den sonra 6 hafta kuluçka sodyum cacodylate içinde çözünmüş osmiyum doku tamamen sızmak değil ve bir difüzyon engel (Şekil 6) karşılaşmaya çıktı. Osmiyum lipidler için son derece reaktif ve bu hücre zarlarında18,19,20bağlamak düşündüm. Doku yeterince permeabilized değil, olarak sodyum cacodylate gibi nazik bir arabellek olduğu, hücre zarlarında osmiyum ile doyurmak ve sterically daha fazla osmiyum dokusuna difüzyon önlemek mümkündür. Biz, ancak, bu su osmiyum için bir çözücü olarak hafif bir deterjan davranır ve yeterince doku içine derin difüzyon izin vermek için doku permeabilizes öngörmekteyiz.
Bu bir fare gibi daha küçük bir beyin Denemecileri hazırlıyorsanız osmiyum kuluçka zamanında büyük olasılıkla azaltılabilir. Benzer şekilde, kuluçka süresi daha büyük örnekleri artırılması gerekiyor. Bu tutarlı boyama boyutunda bir sıçan farklıdır bir beyin için en az zaman belirlemek için test edilecek. Denemecileri tam osmiyum infiltrasyon ilgili sorun yaşarsanız, olası sorunları PFA ve su çözücü olarak (yukarıda anlatıldığı gibi) osmiyum ve osmiyum sırasında yetersiz ajitasyon kullanmayan GA perfüzyon ve sonrası fiksasyon, sırasında kullanmıyorsanız Kuluçka dönemiydi. Örneğin, ne zaman 50 mL konik tüplerde kuluçka tüpler onların tarafında (dikey bir tutucu aksine gibi) döşeme, onları leke ile doldurma ve tüm Kuluçka dönemi uygun sağlanması için bir orbital çalkalayıcı 50 RPM üzerinde yerleştirerek bulduk infiltrasyon.
Bu yöntem çeşitli şekillerde sınırlıdır. Elektron mikroskopi için kullanılmamalıdır yüzden ilk, hazırlık ultrastructure çok iyi korumaz. Bu yöntem, herhangi bir daha fazla Histoloji veya ayirt ile birleştirilemez. Dijital ses çözünürlük örnek boyutu tarafından belirlenir (daha küçük örnekleri inceden inceye gözden geçirmek daha yüksek çözünürlüklerde) ve geometri geometrik büyütme üzerinde; bağlı ise tarayıcının tarafından Ancak, örnek alt bölümler daha yüksek çözünürlüklerde, istenirse taranabilir.
Elektron mikroskobu tarzı doku tedavisi sayısal lezyonlar için mikro-CT görüntüleme ve küçük hayvan beynindeki elektrotlar yerelleştirme ile birleştirerek yeni bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem belki daha az zahmetli, daha az uzmanlık gerektirir ve kesit ve bir beyin boyama için geçerli altın standart daha kolay ölçülebilir sonuçlar verir. Daha önce bilim adamları ultrastructure elektron mikroskobu21,22korumak içindir bile osmiyum penetrasyon fare beynindeki bir protokol anlatmıştık. Bu iletişim kuralı, ancak, oldukça karmaşıktır. Bu çalışmada yazarlar elektron mikroskobu yerine mikro-CT görüntüleme için daha basit bir yöntem geliştirmek amaçlanmıştır. Çeşitli amaçlar için beyin görüntüleme için mikro-CT uygulama diğer çalışma yapılmıştır. Tavşan ve fareler önceki bir araştırmada mikro-CT tümörleri ve diğer anormallikler23bulmak için kullanılır. Bu soruşturma yapılan kullanımı özel Mr kontrast ajanlar, ancak araştırmacılar lezyon çalışmalarda mikro-tomografi potansiyel yararlılığı tahmin. Farelerde başka bir çalışmada fare beyni kafatasının iyot ile boyama brüt morfolojik farklılıklar bir uyuşturucu testi için yer, ama yazarlar düzensiz doku büzülme karşı karşıya ve doku bir hidrojel24saat içinde katıştırmak için tercih bulmayı amaçlayan. Diğer çalışmalar farelerde serebral derin malformasyon, bir bozukluk anormal derecede büyük ve düzensiz kapiller, bulmak ve yaptığınız için nişan osmiyum tetroxide ve sulu iyot lekeleri; olarak kullanımı Ancak, bunlar burada açıklanan25,26,27daha çok daha küçük örnekleri (müstakil fare hindbrains) gerçekleştirilmiştir. 3D beyin birimler oluşturmak için alternatif µMRI28 ve yüksek çözünürlüklü episcopic mikroskobu31yöntemlerdir. µMRI çözünürlüğü yoksul (~ 25 µm voxels benzer örnekleri28) ve teknik daha pahalı23,30. Yüksek çözünürlüklü episcopic mikroskobu da sorunları yüzler: yıkıcı bir tekniktir ve bütün beyin kesit sağlayan bir blok suratlı aparatı üretilmesi gerekir. Burada sunulan iş de her iki elektrot yakalama ve doku çevreleyen röntgen32,33,34 ile beyin elektrotlar bulmak için önceki çabaları uzatır. Ayrıca, teknik tek elektrotlar, tetrot diziler, elektrolitik lezyonlar, elektrot parça ve silikon sondalar bulmak için sağlar.
Değerli bir gelecekteki yönünü için lezyon çalışmalar lezyon konumu ve boyutu miktar standartlaştırmak için ortak kayıtlı olabilir bir "ortalama beyin" atlas oluşturulmasını istiyorsunuz. Bu yöntem aynı zamanda diğer modeli ve zebra finch beyin (Şekil 2) hemen onun uygulama örneği olarak sigara model organizmalar için genişletilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Greg Lin ve Arthur McClelland kendi uzmanlık için mikro-CT makine, David Richmond ve Hunter Elliott, görüntü ve veri analizi çekirdek (IDAC), Harvard Tıp Okulu tavsiye işleme görüntü için ve William Liberti, Boston ile teşekkür ederiz Üniversite nezaketle zebra finch beyin sağlamak için. Bu eser için nano sistemleri (CNS), bir üye, Ulusal Nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi'nin bir parçasıdır. Bu eser Richard ve Susan Smith Aile Vakfı ve IARPA (sözleşme #D16PC00002) tarafından desteklenmiştir. S.B.E.W. insan sınır bilim programı (HFSP; dan arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir LT000514/2014) ve Avrupa Moleküler Biyoloji organizasyon (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. Ulusal Bilim Vakfı (NSF) yüksek lisans araştırma bursu programı (GRFP tarafından) destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | 2% (w/v/) in 1X PBS |
| Glutaraldehyde (GA) | EMS | 16220 | 2.5% (w/v) GA in 1x PBS |
| OsO4 | EMS | 19190 | Work in fume hood |
| Ethanol | Decon Labs | Koptec | 140, 190, 200 proof |
| Acetone | EMS | 10015 | Glass-distilled |
| Durcupan ACM resin | Sigma-Aldrich | 44610 | A, B, C and D components, resin for embedding |
| Disposable molds | Ted Pella | 27114 | Suggested |
| milliQ water (ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | Suggested |
| Parafilm (paraffin film) | Millipore Sigma | P7793 | Suggested paraffin film |
| Micro-CT scanner | Nikon Metrology Ltd., Tring, UK | X-Tek HMS ST 225 | Used by authors |
| Software for visualizing and analyzing micro-CT scans: | |||
| Volume Graphics | VG Studio Max | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Avizo | Used by authors | |
| FEI / Thermo Scientific | Amira | Similar to Avizo | |
| Mark Sutton & Russell Garwood | Spiers | Free, http://spiers-software.org/ | |
| Pixmeo Sarl | Osirix Lite | Free, https://www.osirix-viewer.com/ | |
| Open Source | FIJI | Free, https://fiji.sc/ | |
| Adobe | Photoshop | Good for analyzing one slice at a time |
References
- Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
- Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
- Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
- Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
- Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
- Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
- Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
- Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
- Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
- Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
- Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
- Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
- Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
- Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
- Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
- Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
- Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
- Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
- Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
- Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
- Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
- Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
- Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
- Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
- Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
- Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
- Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
- Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
- Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
- Fu, T. -M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).
