Analyse der Actomyosin-Dynamik bei lokalen Zellstoff- und Gewebeskalen mit Zeitraffer-Filmen von kultivierten Drosophila-Eierkammern

Summary

Dieses Protokoll bietet eine Fidschi-basierte, benutzerfreundliche Methodik zusammen mit einfachen Anweisungen, die erklären, wie das Verhalten von Actomyosin in einzelnen Zellen und gekrümmten Epithelgeweben zuverlässig analysiert werden kann. Es sind keine Programmierkenntnisse erforderlich, um dem Tutorial zu folgen; Alle Schritte werden halbinteraktiv über die grafische Benutzeroberfläche von Fidschi und die zugehörigen Plugins durchgeführt.

Abstract

Drosophila unreife Eier werden Eierkammern genannt, und ihre Struktur ähnelt primitiven Organen, die morphologische Veränderungen von einer runden zu einer ellipsoiden Form während der Entwicklung erfahren. Dieser Entwicklungsprozess wird Oogenese genannt und ist entscheidend für die Erzeugung funktioneller reifer Eier, um die nächste Fliegengeneration zu sichern. Aus diesen Gründen dienten Eierkammern als ideales und relevantes Modell, um die Entwicklung von Tierorganen zu verstehen.

Es wurden mehrere In-vitro-Culturing-Protokolle entwickelt, aber es gibt mehrere Nachteile dieser Protokolle. Zum einen werden verschiedene Abdeckungen aufgebracht, die einen künstlichen Druck auf die abgebildeten Eikammern ausüben, um sie zu immobilisieren und die abgebildete Erfassungsebene der Umfangsfläche der analysierten Eikammern zu erhöhen. Ein solcher Ansatz kann das Verhalten der dünnen Actomyosin-Maschinerie negativ beeinflussen, die die Kraft erzeugt, Eierkammern um ihre längere Achse zu drehen.

Um diese Einschränkung zu überwinden, kultiieren wir daher Drosophila-Eikammern frei in den Medien, um Actomyosin-Maschinen entlang des Umfangs von Eikammern zuverlässig zu analysieren. Im ersten Teil des Protokolls bieten wir eine manuelle Detaillierung, wie die Actomyosin-Maschinerie in einer begrenzten Erfassungsebene auf lokaler Zellskala (bis zu 15 Zellen) analysiert wird. Im zweiten Teil des Protokolls stellen wir den Benutzern ein neues Fidschi-basiertes Plugin zur Verfügung, das die einfache Extraktion einer definierten dünnen Schicht der Umfangsfläche der Eierkammern ermöglicht. Das folgende Protokoll beschreibt dann, wie Actomyosin-Signale auf der Gewebeskala (>50 Zellen) analysiert werden. Schließlich ermitteln wir die Grenzen dieser Ansätze sowohl auf der lokalen Zell- als auch auf Gewebewaage und diskutieren deren mögliche zukünftige Entwicklung und mögliche Anwendungen.

Introduction

Die kontinuierliche Entwicklung neuartiger Bildgebungs- und Softwaretechnologien mit Anwendungen in den Biowissenschaften hat einen enormen Einfluss auf das Verständnis der Grundprinzipien des Lebens gehabt. Eine der größten Herausforderungen ist die zuverlässige Visualisierung von Entwicklungsprozessen in Kombination mit deren Live-Bildgebung in verschiedenen Geweben. Gewebe sind Teile von Organen und Körpern, und als solche sind die meisten für die Bildgebung nicht leicht zugänglich. Daher wurden Protokolle entwickelt, die ihre Zerlegung und In-vitro-Kultivierung erlauben, um biologische Ereignisse zu visualisieren, die die In-vivo-Situation innerhalb eines lebenden Körpers ausreichend widerspiegeln.

In den letzten Jahrzehnten hat die Kultivierung und Live-Bildgebung von Drosophila-Eikammern, acinarartigen Strukturen, die primitiven Organen ähneln, immens zum Verständnis der Grundprinzipien der primitiven Organentwicklung beigetragen^{1 , 2 , 3}. Derzeit stehen mehrere Kultivierungsprotokolle zur Verfügung, deren Verwendung von der Erfassungszeit, dem zu bildendem Zelltyp und ihrer Zugänglichkeit (z. B. innere Keimbahn vs. äußere somatische Linie)^{abhängt 4}.

Ein gemeinsames Merkmal in all diesen Kultivierungsprotokollen ist die Notwendigkeit der Immobilisierung analysierter Eierkammern, die eine hohe kontraktile Aktivität in flüssigen Medien aufweisen. Die kontraktile Aktivität der Eierkammern wird hauptsächlich durch das Muskelblatt verursacht, das eine lange Schnur von verbundenen Eierkammern^5,6,7bedeckt. Daher wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um eine ordnungsgemäße Immobilisierung junger Eierkammern zu erreichen, wobei Eikammern mit Abdeckungen^6,8,9 oder flexible Decken^{4, 10} oder einbetten sie in Niedrigschmelzpunkt-Agarose^3,11. Diese Ansätze sind beliebt, da sie aufgrund der subtilen Abflachung der Umfangsfläche der Eikammern auch die Bildgebung einer größeren visuellen Ebene ermöglichen.

In jüngster Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass sich junge Eikammern (Stufe 1-8) um ihre vordere-hintere Achse⁶ drehen und dass diese Gewebebewegung von einem feinen Actomyosin-Netzwerk in der Nähe der Umfangsfläche dieser jungen Eikammern ^{angetrieben wird. 12}. Daher kann eine künstliche Veränderung der zellulären Oberfläche, die durch eine subtile Abflachung dieses Gewebes verursacht wird, einen negativen Einfluss auf das Verhalten der krafterzeugenden Actomyosin-Maschinerie haben. Der Kontrapunkt ist, dass, wenn das Eikammergewebe nicht abgeflacht wird, die mikroskopische Bildgebung von Proteinen an der Umfangsfläche von Eikammern durch die verminderte Größe der Erfassungsebene noch eingeschränkter wird.

Daher haben wir Protokolle von Prasad et al.⁹ und dem Labor von Celeste Berg^4,10 kombiniert und weiter modifiziert, so dass bei der entwickelten Methode kein Decksch-/flexible Decke/Agarose verwendet wird. Drosophila-Eikammern sind in den Medien frei kultiviert und das hier vorgestellte Protokoll gilt nur invertiert. Das Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil konzentriert sich auf die Analyse von Actomyosin-Signalen auf der lokalen Zellskala (bis zu 15 Zellen) in Eikammern. Im zweiten Teil konzentrieren wir uns auf die Überwindung der Einschränkungen, die mit einer kleinen Ankaufsebene verbunden sind, die durch die freie Kultivierung von Eierkammern verursacht wird. In dieser Hinsicht haben wir eine neuartige Fidschi-basierte Berechnungsmethode mit einer semi-interaktiven grafischen Benutzeroberfläche entwickelt, die selektiv definierte Schichten einer umlaufenden Gewebeoberfläche extrahiert und entfaltet. Es folgt ein Protokoll, das beschreibt, wie Actomyosin auf der Gewebeskala analysiert wird (d. h. >50 Zellen). Da die selektive Extraktion einer definierten dünnen Schicht gekrümmter Epithelgewebe mit einer klassischen Z-Stack-Projektion (Abbildung 1) nicht einfach möglich war, dient diese einfach zu bedienende Methode als wichtige Voraussetzung, um die Verhalten eines dünnen Actomyosin-Netzwerks auf der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern.

Darüber hinaus bieten wir zur Erleichterung des Protokolls Beispiel-Zeitrafferfilme (TLMs) und Beispieldateien mit fluoreszierend markiertem konventionellem Myosin-II-Verhalten (siehe Ergänzende Datei 3). Myosin II ist ein motorisch eskoproteinist und stellt den aktiven kontraktilen Teil der Actomyosin-Maschinerie dar. Um myosin II abzubilden, verwenden wir transgene Drosophila-Linien, die eine modifizierte regulatorische Lichtkette von Myosin II namens MRLC::GFP (siehe Tabelle der Materialien für Details)^12,13enthalten. Um Zellmembranen zu visualisieren, basiert das Protokoll auf kommerziellen Farbstoffen (siehe Tabelle der Materialien). Dieses Protokoll eignet sich nicht nur für die Analyse kleiner subzellulärer MRLC::GFP-Signale^12, sondern auch für alle subzellulären Partikel ähnlicher Größe um 300 M, wie sie mit Life-Act::GFP^12,14beobachtet wurden.

Obwohl beide Protokolle mit in vitro kultivierten Drosophila-Eikammern präsentiert werden, kann die Erfassung von Actomyosin-Signalen auch mit anderen Geweben bei der Optimierung der Kultivierungsmedien und je nach Verfügbarkeit durchgeführt werden. von fluoreszierend markierten Proteinen mit entsprechenden kommerziellen Farbstoffen oder beispielsweise mRNA-Mikroinjektionen, um transiente Genexpressionsprofile zu erhalten. In ähnlicher Weise kann das Fidschi-basierte Protokoll zur Extraktion einer dünnen Schicht von einer Umfangsoberfläche allgemeiner auf ellipsoide und organähnliche Gewebe angewendet werden.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Analyse von Actomyosin an der lokalen Zellzelle und der Gewebeskala in Drosophila-Eikammern. Der ansatzauf lokaler Ebene ermöglicht es Benutzern, detailliertes Actomyosinverhalten in bis zu 15 Zellen pro Eikammer zu analysieren und erfordert die Erfassung von TLMs für einen kurzen Zeitraum (5–10 min) mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildgebung und einem invertierten konfokalen Mikroskop. Im Gegensatz dazu liefert die Gewebeskala den Anwendern Actomyosin-Informationen in 50–100 Zellen und erfordert die Erfassung von TLMs für einen langen Zeitraum (ca. 30 min) durch Low-Speed-Bildgebung und ein invertiertes Spinnscheibenmikroskop (siehe Abbildung 2 und empfohlene Parameter in jedem Maßstab in Tabelle 1). Die Entscheidung, in welchem Maßstab actomyosin Signale zu analysieren, hängt vollständig von der wissenschaftlichen Frage des Benutzers ab. Begleitete Test-TLMs sollten helfen, diese Entscheidung zu treffen.

1. Lokale Mobilfunkskala (LCS)

HINWEIS: Um in vitro kultivierte Drosophila-Eikammern zu sezieren und abzubilden, befolgen Sie das Protokoll, das in DerErgänzungsdatei 1beschrieben ist. Um erworbene TLMs zu analysieren, fahren Sie mit dem folgenden Protokoll fort. Links zu den begleitenden Testdateien von TLMs finden Sie in der Zusatzdatei 3.

1. Datenverarbeitung von TLMs auf lokaler Mobilfunkskala (LCS)
   1. Bleichkorrektur von TLMs zum Ausgleich des Intensitätszerfalls von Fluoreszenzetiketten
      1. Stellen Sie sicher, dass eine aktuelle Fidschi-Anwendung auf dem Computer installiert ist, der verwendet wird, indem Sie die folgenden Anweisungen befolgen: Fidschi > TlM öffnen (z. B. TestMovie1.tif aus der Zusatzdatei 3).
      2. Teilen Sie die Farbkanäle auf, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken.
      3. Führen Sie eine Bleichkorrektur auf beiden Kanälen mit Bild > Anpassen > Bleichkorrektur > Einfaches Verhältnis > Hintergrundintensität 0.0.
         HINWEIS: Wenn unbefriedigende Ergebnisse erzielt werden, untersuchen Sie, welche Korrekturmethoden in diesem Plugin am besten passen (z. B. Verwenden Sie Histogram Matching anstelle eines Simple Ratio).
   2. Zellsegmentierung zum Generieren einer Zellmaske für TLMs
      1. Wenn Fidschi noch nicht geöffnet ist, öffnen Sie es erneut (und stellen Sie sicher, dass es auf dem neuesten Stand ist) nach Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK.
      2. Wenn dies noch nicht geschehen ist, laden Sie das Makro TissueCellSegmentMovie.ijm (von http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm herunter. Ziehen Sie dieses Skript nach Fidschi.
      3. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM .tiff-Datei (siehe Abschnitt 1.1.1). Teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei mit Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      4. Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten TLM aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Stellen Sie die Gaußsche Unschärfe auf 2.500 und die Empfindlichkeit der Zellerkennung auf -1 ein, und klicken Sie auf OK. Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, ändern Sie diese Parameter oben nicht. Legen Sie die geschätzte Rauschtoleranz zwischen 10 und 20 für TLMs fest, die mit dem 63x-Ziel erworben wurden, und klicken Sie auf OK.
         HINWEIS: Für andere Ziele können unterschiedliche Parameter erforderlich sein. Je sauberer der Hintergrund in einem TLM, desto geringer ist die geschätzte Geräuschtoleranz.
      5. Eine generierte Zellmaske wird im analysierten TLM und auch in einem neuen Fenster namens ParticleStack (G)angezeigt, und außerdem wird ein kleines Fenster namens Aktion erforderlich angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske auf dem TLM nur auf Zellen in der Mitte des TLM, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Gliederungen im gesamten TLM bereitstellen können.
      6. Wenn ausgewählte Zellen künstliche/zusätzliche Zellumrisse enthalten, verwenden Sie das Zusammenführungswerkzeugfenster mit dem Namen Aktion Erforderlich im TLM. Befolgen Sie für letztere die Anweisungen im Fenster.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Zellumrisse gut definiert sind und realen Zellmembranen in einem TLM entsprechen, da jede Ungenauigkeit nachfolgende Analysen beeinflussen kann. Zusätzliche Optimierungen und Änderungen, wie z. B. das Entfernen unerwünschter Zellen, können später mit dem Surface-Manager-Tool (beschrieben in Abschnitt 1.1.3) durchgeführt werden.
      7. Wenn die ausgewählten Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie ParticleStack als .tiff-Datei nach Datei > Speichern unter > Tiff.
   3. Laden der generierten Zellmaske in surface manager
      1. Installieren Sie Surface Manager Plugin¹⁵ in das verwendete Fidschi-Setup. Folgen Sie den Anweisungen von Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Öffnen Sie Surface Manager mit Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D).
         HINWEIS: Im Fenster Oberflächen-Manager werden auf der rechten Seite mehrere Aktionsschaltflächen und links ein leeres Fenster angezeigt. Um alle Aktionsschaltflächen anzuzeigen, kann es erforderlich sein, das Fenster in seiner Höhe/Breite zu dehnen. Beachten Sie, dass Zeitrahmen als Z-Slices angezeigt werden.
      3. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack .tiff-Datei in Surface Manager, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken und das zu öffnende Bild auswählen (z. B. ParticlesStack1.tif).
      4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jacquard-Index auf 60 % fest.
         HINWEIS: Das Laden der Datei ParticlesStack1.tif kann je nach Rechenleistung des Computers bis zu mehrere Minuten dauern.
      5. Nach dem Laden wird jede Zelle mit einer S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Fensters Surface-Manager angezeigt.
         HINWEIS: Um Umrisse und Zellennamen für alle Zellen anzuzeigen, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen anzeigen am unteren Rand des Fensters Oberflächen-Manager. Es wird empfohlen, diese Funktion zu verwenden, sobald die Zellennummern auf ihre Richtigkeit überprüft wurden.
      6. Klicken Sie auf die erste S-Nummer; die importierte Zellumrisslinie aus ParticlesStack1.tif wird auf dem TLM angezeigt. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf Die Zellenumrissqualität im gesamten TLM, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Markieren Sie dazu die Zellumrisslinie und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.
         HINWEIS: Es ist auch möglich, ungenaue Zellumrisse zu korrigieren und neue Zellumrisse hinzuzufügen. Dies wird im Diskussionsabschnitt beschrieben.
      7. Speichern Sie alle korrigierten Zellen als RoiSet.zip-Datei, indem Sie die Schaltfläche Auf Festplatte speichern drücken.
         HINWEIS: Wenn die Sitzung unterbrochen werden muss, ist es möglich, die RoiSet-Datei später in den Surface-Manager zu laden: Öffnen Sie eine TLM in Fidschi (Datei > Öffnen) und wählen Sie eine TLM aus. Öffnen Sie Surface Manager über Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D). Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip-Datei, indem Sie auf die Schaltfläche Von Disc laden klicken und die entsprechende RoiSet.zip-Datei auswählen. Überprüfen Sie, ob die geladenen Zellenmasken dem geladenen TLM entsprechen.
   4. Korrektur für Gewebedrift in TLMs
      HINWEIS: Während der Erfassungszeit von TLMs können Drifteffekte aufgrund einer Epithelrotation oder einer unerwünschten Bewegung beobachtet werden. In beiden Fällen empfehlen wir, jede Drift zu korrigieren, um die manuelle Actomyosin-Analyse später zu vereinfachen. Die Driftkorrektur ist nur für die manuelle Actomyosin-Analyse erforderlich. Dieses Tutorial erfordert aktuelle Fidschi-Software mit dem MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installiert.
      1. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi über Datei > Öffnen und wählen Sie die bleichkorrigierte Datei, die mit dem oben erwähnten Tutorial erstellt wurde.
      2. Teilen Sie die Kanäle auf, und wählen Sie die Kanäle aus, die die Zellmembranen über Bild > Farbe > Kanäle teilenidentifiziert.
      3. Verwenden Sie das folgende Protokoll, wenn die Zellumrisse nicht sichtbar glatt sind: Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe. Legen Sie es für ein 63-faches Ziel auf 1–2 fest, und klicken Sie auf OK und dann auf Ja. Klicken Sie auf Prozess > Binär > Konvertieren in Maske mit den Standardeinstellungen; Klicken Sie dann auf OK.
      4. Laden Sie das MultiStackReg Plugin nach Plugins > Registrierung > MultiStackReg.
      5. Stellen Sie sicher, dass Stapel 1 auf den Zellmembrankanal, Aktion 1 auf Ausrichtung und Transformation auf Übersetzung festgelegt ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Transformationsdatei speichern, und klicken Sie dann auf OK.
      6. Öffnen Sie das ausgewählte TLM, das MultiStackReg-Plugin und die gespeicherte Transformationsdatei mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen TLM aus. Teilen Sie die Farbkanäle mit Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      7. Laden Sie das MultiStackReg Plugin, indem Sie auf Plugins > Registrierung > MultiStackRegklicken. Wählen Sie Transformationsdatei als Aktion 1 laden aus.
      8. Lassen Sie Transformation als starren Körper und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die zuvor gespeicherte Transformationsdatei aus, und klicken Sie erneut auf OK.
      9. Führen Sie die Bildkanäle zusammen, und speichern Sie den registrierten TLM als .tiff-Datei nach Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen. Speichern Sie die Datei, indem Sie auf Datei > Speichern unter > Tiffklicken.
         HINWEIS: Es gibt alternative Möglichkeiten, eine Gewebedrift in Fidschi zu korrigieren, nämlich über Plugins > Registrierung > StackReg/Correct 3D drift.
2. Analyse von Actomyosin-Impulsen im Surface Manager bei LCS
   HINWEIS: Dieser Protokollschritt ermöglicht es Wissenschaftlern, zu identifizieren, ob Actomyosinpulse im analysierten Gewebe vorhanden sind, und das detaillierte Verhalten sowie die Richtung von Actomyosin-Signalen zu verstehen.
   1. Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass eine TLM und die entsprechende Zellenmaske im Surface-Manager geöffnet ist.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Fidschi installiert und auf dem neuesten Stand ist und das Surface Manager Plugin installiert ist (Schritt 1.1.3.1).
   2. Öffnen Sie einen TLM mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen tlM zum Öffnen aus (z. B. TestMovie1_bleach.tif). Laden Sie das Surface Manager Plugin über Plugins > Segmentierung > Surface manager(3D). Laden Sie die im Tutorial erstellte gespeicherte Zellmaske (z. B. ParticlesStack1.tif) über Datei > Öffnen und wählen Sie eine Zellmaske (z. B. ParticlesStack1.tif). Laden Sie den entsprechenden Interessenbereich (ROI, z.B. TestMovie1_RoiSet.zip). Siehe Abbildung 3A.
   3. Wechseln Sie zum Kanal des Interesses in der ausgewählten TLM.
      HINWEIS: Um die Kanäle zu unterscheiden, folgen Sie dem Farbcode, der um das TLM angegeben ist.
   4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnittlicher Grauwert Slice by Slice (Abbildung3B) abzuerhalten. Beachten Sie, dass die mittleren/medianen Intensitätswerte von Actomyosin-Signalen in einem bestimmten analysierten Kanal innerhalb der definierten Zellumrisse im Laufe der Zeit sowie andere Parameter im Zusammenhang mit dem Zellbereich und der Zellform angezeigt werden.
      HINWEIS: Die Intensitätswerte sind in Arbitraty Units (A.U.); Der Zellbereich ist in Pixeln und muss in quadratische Mikrometer umgewandelt werden.
   5. Speichern Sie die erhaltenen Werte als Tabellenkalkulationsdatei. Klicken Sie auf das Statistikfenster, Datei > Speichern unter.
      HINWEIS: Es ist möglich, die erhaltenen statistischen Werte später wie folgt zu überprüfen: Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi und öffnen Sie den Surface-Manager. Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip in die TLM, indem Sie die Schaltfläche Laden von der Festplatte drücken und die Datei öffnen. Die gespeicherte Maske mit Zellumrissen wird hochgeladen, und die Namen der Zellen werden im linken Fenster des Oberflächen-Managers angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik für statistische Werte.
3. Manuelle Analyse einzelner subzellulärer Actomyosinsignale bei LCS
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die größte Konzentration und ist zeitaufwändig. Im Allgemeinen kann ein erworbenes TLM bequem innerhalb von 1 Tag analysiert werden. Dies schließt keine Zeit für die Flugvorbereitung vor der Entesse, der Sezierung selbst und der Bildaufnahme ein.
   1. Öffnen Sie eine ausgewählte, bleichkorrigierte und registrierte (driftkorrigierte) TLM in einer aktuellen Fidschi-Anwendung. Verwenden Sie als Testbeispiel einen bleichkorrigierten und driftkorrigierten TLM (z. B. TestMovie1_bleach_reg.tif).
   2. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um die einzelnen Actomyosin-Signale mit Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastzu sehen.
   3. Richten Sie TLMs in der gleichen Richtung relativ zur Gewebe-/Körperachse aus. Richten Sie bei Eikammern die vordere Seite der Eikammern vor der Analyse immer links vom Bild/Submovie/TLM aus.
   4. Teilen Sie den ausgewählten Film in kurze 30 s Submovies auf und projizieren Sie jeweils jeweils Zeitprojekt. Speichern Sie nicht zeit- und zeitprojizierte Teilfilme mit entsprechenden Namen. Bewahren Sie die ursprüngliche Quelle auf.
      HINWEIS: Submovies können aus originalen TLMs erstellt werden, indem zuerst unerwünschte Frames über Image > Stacks > Slice Removergelöscht werden. Definieren Sie die zu entfernenden Slices, und legen Sie Inkrement fest. Transformieren Sie in RGB, bevor Sie den Slice-Entferner verwenden, wenn Inkrement = 1. Um einen 30s-Unterfilm zeitzuproduzieren, klicken Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt > Max. Intensität für die definierten Frames (Slices) und dann auf OK. Überspringen Sie jeden zweiten 30 s Submovie, um zu vermeiden, dass actomyosin Signale 2x in zwei nachfolgenden 30 s Submovies gezählt werden.
   5. Platzieren Sie ein zeitprojiziertes Bild neben dem entsprechenden 30 s-Unterfilm (Abbildung 4A,B). Identifizieren Sie die Signalleitung im zeitprojizierten Unterfilm. Identifizieren Sie die Richtung der Actomyosin-Signalbewegung (0°–360°) entlang dieser Linie im ursprünglichen Submovie, indem Sie den Submovie manuell wiedergeben. Verwenden Sie das Werkzeug Winkel (in der Fidschi-Leiste), um die Richtung der Signalbewegung relativ zur definierten Gewebeachse oder einem ähnlichen verfügbaren Werkzeug manuell zu messen.
      HINWEIS: Fidschi arbeitet nur auf einer Skala von 0°–180° (Abbildung 4C), und eine Neuberechnung der erhaltenen Werte auf einer Skala von 0°–360° ist erforderlich. Eine Signalleitung entspricht der Flugbahn einer Actomyosin-Signalbewegung im Laufe der Zeit.
   6. Um Doppelarbeit bei der Analyse von Actomyosin-Signalen zu vermeiden, markieren Sie die analysierten Signallinien innerhalb von Zellen im zeitprojizierten Submovie (Abbildung 4B,D).
   7. Analysieren Sie alle ausgewählten Zellen im 30 s-Unterfilm, und speichern Sie die erhaltenen Winkel.
      HINWEIS: Analysieren Sie nur subzelluläre zytoplasmatische Actomyosinsignale in Zellen mit genau definierten Zellumrissen in einem TLM. Schließen Sie einzelne Zellen mit weniger als 15–20 erkannten Signalen im gesamten TLM aus. Ignorieren Sie Actomyosin-Signale, die sich aufgrund ihres unbekannten Ursprungs über Zellen bewegen. Ein Beispiel für die Signalanzahl für eine analysierte Zelle im 30 s Submovie ist in Abbildung 4Ddargestellt.
   8. Fahren Sie fort, bis alle 30 s-langen Submovies eines TLM analysiert werden, und speichern Sie alle gemessenen Winkel von Actomyosin-Signalen eines TLM in einer Tabellenkalkulationsdatei.
   9. Summiert alle gemessenen Winkel über die relevante Anzahl von TLMs (abhängig vom Experiment). Zeichnen Sie den Prozentsatz der Richtung der analysierten Actomyosin-Signale, z.B. als Rosendiagramm mit einem Bereich von 0° bis 360° mit einer bevorzugten Software.
      HINWEIS: Um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, werden fünf bis zehn unabhängige Eikammern jeder Eikammerstufe empfohlen, um analysiert zu werden.

2. Gewebeskala

HINWEIS: Um in vitro kultivierte Drosophila-Eikammern zu sezieren und abzubilden, folgen Sie dem Protokoll in DerErgänzungsdatei 2. Um erworbene TLMs zu analysieren, fahren Sie mit dem folgenden Protokoll fort. Begleitete Testdateien von TLMs werden in der Zusatzdatei 3abgelegt.

1. Selektive Oberflächenextraktion von gekrümmten Epithelgeweben
   notiz:Dieses Protokoll ermöglicht es Benutzern, selektiv eine dünne Schicht von Actomyosin in einem gekrümmten Epithelgewebe im Laufe der Zeit zu extrahieren. Dieser Protokollschritt ist benutzerfreundlich und basiert auf einer intuitiven grafischen Oberfläche. Es ist möglich, mehrere TLMs bequem zu analysieren (Auszugsfläche). Verwenden Sie TestMovie2.czi (aus demErgänzende Datei 3) als Test-TLM-Beispiel.
   1. Öffnen Sie eine aktuelle Fidschi-Anwendung (Fidschi > Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK).
   2. Stellen Sie sicher, dass das Ellipsoid Surface Projection Plugin¹⁵ installiert ist. Viktorinova et al. ¹⁶.
   3. Öffnen Sie ein TLM und exportieren Sie es als XML/HDF5-Datei, indem Sie auf Plugins > BigDataViewer > Aktuelles Bild als XML/HDF5-Dateiexportieren klicken.
      HINWEIS: Es ist erforderlich, einen Exportpfad zu definieren. Die Speicherung selbst kann mehrere Minuten dauern und hängt von der TLM-Länge ab.
   4. Öffnen Sie die exportierte Datei in Ellipsoid Surface Projection, indem Sie auf Plugins > BigDataViewer > Ellipsoid Surface Projection > XML-Datei auswählenklicken.
      HINWEIS: Es wird ein neues Fenster mit sagittalen Ansichten der Eikammer und einem Dialog angezeigt, der den Benutzer durch die Verarbeitung führt. Details zum Navigieren in der Slice-Ansicht finden Sie unter https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. Das Dialogfenster mit dem Namen Ovarprojektion hat mehrere Registerkarten. Definieren Sie in der ersten Dialog-Registerkarte mit dem Namen Begrenzungsrahmen die x- und y-Ränder einer Eikammer im TLM zusammen mit der z-Breite des Begrenzungsrahmens (d. h. die Tiefe einer Z-Stack/Ei-Kammer) und drücken Sie den Satz ( Abbildung5A).
   6. Um Rahmen zu definieren, ziehen Sie die Schaltflächen neben x, y und z, oder definieren Sie die Zahlenkoordinaten in den Feldern x, y und z. Stellen Sie sicher, dass die Ränder großzügig genug sind, um den Teil der Eikammer, der von Interesse ist, in die Oberflächenextraktion zu bringen. Die ausgewählten Teile der Eierkammer sind rosa hervorgehoben.
   7. Wechseln Sie zur Registerkarte "Blobs suchen" im Fenster Ovarienprojektion. Definieren Sie das Sigma und den minimalen Spitzenwert; Drücken Sie dann die Berechnung, um die Actomyosin-Signale zu identifizieren (Abbildung 5B), die als grüne Blobs angezeigt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit verschiedenen Parametern, bis genügend Flecken (ca. 100) gefunden werden.
      HINWEIS: Sigma 1-u20123 mit minimalem Spitzenwert 20-u2012100 funktioniert am besten, um Actomyosin-Signale der Stufe-6 bis -8-Ei-Kammern zu identifizieren. Die Identifizierung von Actomyosin-Signalen ist ein entscheidender Schritt und hängt von der Signalqualität und ihrer Größe ab. Es ist wichtig, die korrekte Größe der vorhandenen Blobs zu bestätigen. Keine sichtbaren grünen Flecken/Blobs im Bild bedeutet, dass der nächste Schritt nicht funktioniert. Durchsuchen Sie die ausgewählten Z-Ebenen, um Blobs anzuzeigen.
   8. Um das Ellipsoid zu entwerfen, fahren Sie mit der Registerkarte "Ellipsoidanpassen" fort. Legen Sie Zufallsstichproben auf 10.000, Außen-/Innenschnittentfernung auf 1-u201210 fest, und klicken Sie dann auf Berechnen (Abbildung 5C).
      HINWEIS: Je geringer der Abstand, desto genauer ist das gewünschte Ellipsoid. Danach wird die Registerkarte "Projektion" automatisch geöffnet und ermöglicht die Definition der Oberflächenextraktion. Die Einstellungen müssen optimiert werden.
   9. Fahren Sie mit der Registerkarte Projektion (Abbildung 5D) fort. Richten Sie einen minimalen und maximalen Projektionsabstand ein (d. h. die Breite des gewünschten Ellipsoids). Es ist erforderlich, einen minimalen und maximalen Projektionsabstand festzulegen, so dass der rosa definierte Ellipsoidbereich die gesamte Außenschicht der Eikammer umfasst. Definieren Sie den Slice-Abstand (1 wird empfohlen).
      HINWEIS: Beispiele für eine falsche und optimale Ellipsoidpassung, die zu falschen und optimalen Projektionsparametern führt, sind in Abbildung 6A,Cdargestellt. Die dünne Umfangsschicht des Interesses kann später definiert werden. Stellen Sie sicher, dass der rosa Bereich des Ellipsoids mit der definierten Breite auf der Eikammer sichtbar ist, bevor Sie die Berechnung drücken. Es ist wichtig, dass das gewünschte Ellipsoid (rosa Single Line) gut auf die Ellipsoidoberfläche einer Eikammer passt, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Wenn die Ellipsoidpassung nicht gut ist, ordnen Sie verschiedene Einstellungen an, bis die gewünschte Oberflächenextraktion erreicht ist.
      1. Legen Sie eine Ausgabebreite (ca. 800) und eine Höhe (ca. 400) des Ellipsoids fest. Legen Sie fest, ab welchem Zeitpunkt die Oberflächenextraktion erstellt werden soll (d. h. definieren Sie die Länge der TLM-Extraktion). Wählen Sie entweder eine kugelförmige oder eine zylindrische Projektion aus. Flip Z und Y bei Bedarf ausrichten.
      2. Drücken Sie die Berechnung, um eine Oberflächenextraktion für beide Kanäle in neuen Fenstern namens Imagezu erhalten. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast der erhaltenen Bildfenster an, um die projizierten Actomyosin-Signale sehen zu können, indem Sie auf Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast klicken.
         HINWEIS: Ein Beispielvergleich einer Projektion, die aus einer falschen und optimalen Ellipsoidpassung resultiert, ist in Abbildung 6B,Ddargestellt.
   10. Wenn die Oberflächenextraktion gut aussieht, speichern Sie die Bilder (beide Kanäle separat) als .tiff. Speichern Sie außerdem die Log-Fensterdatei, um zu künftig darauf hinzuweisen, wie die Oberfläche dieser bestimmten Eikammer extrahiert wurde.
       HINWEIS: Dies ist eine besonders wichtige Information, wenn die extrahierte dünne Schicht in ihre ursprüngliche entfaltete Form zurückversetzt werden soll (nur für Entwickler).
   11. Führen Sie die Kanäle mit einem bevorzugten Farbcode in Fidschi zusammen.
       HINWEIS: Projizieren Sie bei Bedarf ausgewählte Z-Stack-Layer mit Actomyosin-Signalen. Die Projektion ausgewählter Z-Stack-Layer ist erforderlich, wenn sich der Erfassungsfokus im Laufe der Zeit in einem TLM leicht ändert. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, projizieren Sie höchstens ein bis zwei Z-Stack-Layer.
   12. Speichern Sie die Ergebnisse als .tiff-Dateien.
       HINWEIS: Repräsentative Beispiele für dünne Schichten (selektive Basal- und Apikaloberfläche), die das Myosin II (MRLC::GFP) Signal aus dem Follikelepithel der Kontroll- und Fett2-mutierten Eikammern darstellen, finden sich in Abbildung 8.
2. Datenverarbeitung einer selektiv extrahierten Gewebeoberfläche
   1. Bleach-korrektur die TLMs, um den Intensitätszerfall der Fluoreszenzetiketten auszugleichen.
      1. Öffnen Sie Fidschi. Öffnen Sie einen TLM (z. B. TestMovie2_extraction.tif aus der Zusatzdatei 3) mit Datei > Öffnen. Wählen Sie das Bild aus, um es zu öffnen.
      2. Teilen Sie die Farbkanäle auf und konvertieren Sie sie ggf. in 16-Bit-Bilder, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken. Konvertieren Sie die Kanäle in 16-Bit-Bilder (aus 32-Bit-Bildern) mit Bild > Typ > 16-Bit.
      3. Führen Sie eine Bleichkorrektur auf beiden Kanälen mit Bild > Anpassen > Bleichkorrektur > Einfaches Verhältnis > Hintergrundintensität 0.0.
         HINWEIS: Wenn unbefriedigende Ergebnisse erzielt werden, ist es erforderlich zu untersuchen, welche Korrekturmethoden in diesem Plugin am besten passen (z. B. Verwenden Sie Histogram Matching anstelle eines Simple Ratio).
      4. Führen Sie die Kanäle aus den beiden bleichkorrigierten Bildern zusammen, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführenklicken. Speichern Sie das zusammengeführte Bild als .tiff-Datei, indem Sie auf Datei > Speichern unter > Tiffklicken.
         HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf den Kontrast und die Helligkeit der Kanäle an.
   2. Zellsegmentierung zum Generieren einer Zellmaske für TLMs
      1. Wenn Fidschi noch nicht geöffnet ist, öffnen Sie es erneut (und stellen Sie sicher, dass es auf dem neuesten Stand ist, indem Sie auf Hilfe > Aktualisieren > Änderungen anwenden > OK) klicken.
      2. Wenn dies noch nicht der Fall ist, laden Sie das Makro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm) herunter.
      3. Ziehen Sie dieses Skript nach Fidschi. Öffnen Sie die bleichkorrigierte Datei (z. B. TestMovie2_bleach.tif aus der Zusatzdatei 3, siehe auch 2.2.1).
      4. Teilen Sie die Kanäle der bleichkorrigierten Datei auf, indem Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilenklicken. Passen Sie den Membrankanal an, um klare Zellumrisse zu gewährleisten, indem Sie auf Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastklicken.
      5. Führen Sie das hochgeladene Skript auf dem aktiven Zellmembrankanal des ausgewählten TLM aus, indem Sie das Symbol Ausführen im geöffneten Skript drücken. Setzen Sie Gaußsche Unschärfe auf 1.500. Legen Sie die Empfindlichkeit für die Zellerkennung auf -1 fest, und klicken Sie auf OK. Legen Sie die geschätzte Rauschtoleranz für TLMs, die mit dem 40-fachen Ziel erworben wurden, auf 8 € fest, und klicken Sie auf OK.
         HINWEIS: Um eine schöne Zellmaske zu erhalten, ändern Sie diese Parameter oben nicht. Für andere Ziele können unterschiedliche Parameter erforderlich sein. Je sauberer der Hintergrund in einem TLM, desto geringer ist die geschätzte Geräuschtoleranz.
      6. Eine generierte Zellmaske erscheint im analysierten TLM und auch in einem neuen Fenster namens ParticleStack (G). Darüber hinaus wird ein kleines Fenster mit dem Namen Aktion erforderlich angezeigt. Konzentrieren Sie sich in der Zellenmaske auf dem TLM nur auf Zellen in der Mitte des TLM, und wählen Sie diejenigen aus, die vollständige und klar definierte Gliederungen im gesamten TLM bereitstellen können.
      7. Wenn ausgewählte Zellen künstliche/zusätzliche Zellumrisse enthalten, verwenden Sie das Zusammenführungswerkzeugfenster mit dem Namen Aktion erforderlich im TLM. Befolgen Sie für letztere die Anweisungen im Fenster.
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Zellumrisse gut definiert sind und realen Zellmembranen in einem TLM entsprechen, da jede Ungenauigkeit nachfolgende Analysen beeinflussen kann. Zusätzliche Optimierungen und Änderungen, wie z. B. das Entfernen unerwünschter Zellen, können später mit dem Surface-Manager-Tool (im Tutorial unten beschrieben) durchgeführt werden.
      8. Wenn ausgewählte Zellen in der Mitte gut den echten Zellmembranen entsprechen, speichern Sie den ParticleStack als .tiff-Datei nach Datei > Speichern unter > Tiff. Führen Sie das Laden der generierten Zellmaske und die Actomyosin-Analyse in Surface Manager wie zuvor in den Abschnitten 1.1.3 und 1.2 (auch in den Abschnitten 2.2.3 und 2.3) beschrieben.
   3. Laden der generierten Zellmaske in surface manager
      1. Wenn das Surface Manager Plugin bereits im verwendeten Fidschi-Setup installiert ist, fahren Sie mit Schritt 2 fort. Wenn nicht, folgen Sie Viktorinova et al.¹⁶. Für Entwickler ist nur der Quellcode auch¹⁵verfügbar.
      2. Öffnen Sie Surface Manager, indem Sie auf Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D)klicken.
         HINWEIS: Im Fenster Oberflächen-Manager werden auf der rechten Seite mehrere Aktionsschaltflächen und links ein leeres Fenster angezeigt. Um alle Aktionsschaltflächen anzuzeigen, kann es erforderlich sein, das Fenster in seiner Höhe/Breite zu dehnen. Beachten Sie, dass Zeitrahmen als Z-Slices angezeigt werden.
      3. Öffnen Sie die entsprechende ParticleStack.tif-Datei in Surface Manager über Datei > Öffnen und wählen Sie das zu öffnende Bild aus (z. B. ParticleStack2.tif aus der Zusatzdatei 3).
      4. Klicken Sie in Surface Manager auf die Schaltfläche Umrissbild lesen, und legen Sie den Jacquard-Index auf 60 % fest.
         HINWEIS: Das Laden einer ParticleStack.tif-Datei kann je nach Computerleistung bis zu mehrere Minuten dauern.
      5. Nach dem Laden wird jede Zelle mit einer S-Nummer zugewiesen und im linken Teil des Surface-Manager-Fensters angezeigt (Abbildung 7A).
         HINWEIS: Um Umrisse und Zellennamen für alle Zellen anzuzeigen, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen anzeigen am unteren Rand des Fensters Oberflächen-Manager. Es wird empfohlen, diese Funktion zu verwenden, sobald die Zellennummern auf ihre Richtigkeit überprüft wurden.
      6. Klicken Sie auf die erste S-Nummer; Die importierte Zellumrisslinie aus ParticleStack.tif wird auf dem TLM angezeigt. Überprüfen Sie jede importierte S-Nummer auf Die Zellenumrissqualität im gesamten TLM, und entfernen Sie unerwünschte Zellen, die falsche Zellumrisse anzeigen. Markieren Sie dazu die Zellumrisslinie und klicken Sie auf die Schaltfläche Löschen.
         HINWEIS: Es ist auch möglich, ungenaue Zellumrisse zu korrigieren und neue Zellumrisse hinzuzufügen. Dies wird im Diskussionsabschnitt beschrieben.
      7. Speichern Sie alle korrigierten Zellen als RoiSet.zip-Datei, indem Sie die Schaltfläche Auf Festplatte speichern drücken.
         HINWEIS: Wenn die Sitzung unterbrochen werden muss, ist es möglich, die RoiSet.zip-Datei später in den Surface-Manager zu laden: Öffnen Sie eine TLM in Fidschi über Datei > Öffnen und wählen Sie eine TLM. Öffnen Sie Surface Manager wie folgt: Plugins > Segmentierung > Surface Manager(3D). Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip, indem Sie auf die Schaltfläche Von Disc laden klicken und die entsprechende RoiSet.zip-Datei auswählen (z. B. TestMovie2_RoiSet.zip). Überprüfen Sie, ob die geladenen Zellenmasken dem geladenen TLM entsprechen.
3. Analyse von Actomyosin-Impulsen im Surface Manager
   HINWEIS: Öffnen Sie Fidschi, und stellen Sie sicher, dass eine TLM und die entsprechende Zellenmaske im Surface-Manager geöffnet ist. Stellen Sie sicher, dass Fidschi installiert und auf dem neuesten Stand ist und das Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) installiert ist.
   1. Öffnen Sie einen TLM mit Datei > Öffnen und wählen Sie einen tlM zum Öffnen aus (z. B. TestMovie2_bleach.tif). Laden Sie das Surface Manager Plugin über Plugins > Segmentierung > Surface manager(3D). Laden Sie die im Tutorial erstellte gespeicherte Zellmaske (z. B. ParticlesStack2.tif) über Datei > Öffnen und wählen Sie eine Zellmaske (z. B. ParticlesStack2.tif). Laden Sie den entsprechenden ROI (z. B. TestMovie2_RoiSet.zip).
   2. Wechseln Sie zum Kanal des Interesses in der ausgewählten TLM.
      HINWEIS: Um zwischen den Kanälen zu unterscheiden, folgen Sie dem Farbcode, der um das TLM angegeben ist.
   3. Klicken Sie im Oberflächen-Manager auf die Schaltfläche Statistik, um das Fenster mit dem Namen Durchschnittlicher Grauwert Slice by Slice (Abbildung7B )zu erhalten. Beachten Sie, dass die mittleren/medianen Intensitätswerte von Actomyosin-Signalen in einem bestimmten analysierten Kanal innerhalb der definierten Zellumrisse im Laufe der Zeit sowie andere Parameter im Zusammenhang mit dem Zellbereich und der Zellform angezeigt werden.
      HINWEIS: Die Intensitätswerte sind in A.U.; Der Zellbereich ist in Pixeln und muss in quadratische Mikrometer umgewandelt werden.
   4. Speichern Sie die erhaltenen Werte als Tabellenkalkulationsdatei: Klicken Sie auf das Statistikfenster, Datei > Speichern unter.
      HINWEIS: Es ist möglich, die erhaltenen statistischen Werte später wie folgt zu überprüfen. Öffnen Sie die bleichkorrigierte TLM in Fidschi. Öffnen Sie den Surface-Manager. Laden Sie die entsprechende RoiSet.zip in die TLM, indem Sie die Schaltfläche Laden von der Festplatte drücken und die Datei öffnen. Die gespeicherte Maske mit Zellumrissen wird hochgeladen, und die Namen der Zellen werden im linken Fenster des Oberflächen-Managers angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik für statistische Werte.
      HINWEIS: In Bezug auf eine manuelle Analyse einzelner subzellulärer Actomyosinsignaleist es nicht möglich, eine manuelle Analyse subzellulärer Actomyosinsignale auf der Gewebeskala durchzuführen. Für die Analyse einzelner Actomyosinsignale auf der Halbgewebeskala ist eine Optimierung erforderlich, wie im Diskussionsteil hervorgehoben.

Representative Results

Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, das Verhalten von Actomyosin-Netzwerken in Epithelgeweben zu untersuchen. Dies ist nur möglich, wenn eine detaillierte Analyse des Actomyosin-Verhaltens auf der lokalen Zellskala (einige Zellen) mit einer ähnlichen Analyse auf der Gewebeskala (viele Zellen) kombiniert wird. Epithelgewebe sind jedoch oft gekrümmt und die Extraktion einer dünnen Schicht dieser Gewebe war bisher nicht leicht möglich, wie in Drosophila-Eikammern (Abbildung 1) gezeigt wird. Das hier vorgestellte Protokoll bietet Benutzern einfache Anweisungen, wie das Verhalten von Actomyosin in beiden Maßstäben analysiert wird (Abbildung 2).

Der erste Teil dieses Protokolls konzentriert sich auf Anweisungen zur Analyse von Actomyosin-Impulsen mit dem Surface Manager Plugin (Abbildung 3). Außerdem wird beschrieben, wie das individuelle Actomyosinverhalten auf der lokalen Mobilfunkskala manuell analysiert wird (Abbildung 4). Im zweiten Teil dieses Protokolls wird erläutert, wie eine dünne Schicht Epithelgewebe mit dem Ellipsoid-Oberflächenprojektions-Plugin extrahiert wird (Abbildung 5 und Abbildung 6). Erst dann ist es möglich, Actomyosin-Impulse auf der Gewebeskala mit dem Surface Manager Plugin zu analysieren (Abbildung 7). Repräsentative Ergebnisse und ein Vergleich des Actomyosin-Verhaltens bei rotierender Kontrolle und statischer Fett2-mutierter Drosophila-Eikammern auf der lokalen Zell- und Gewebeskala sind in Abbildung 8 und im entsprechenden Film 1dargestellt. Film 2, Film 3, Film 4, Film 5und Film 6 (Details siehe Abbildung 8).

Abbildung 1: Selektive Extraktion einer dünnen Schicht einer gekrümmten Gewebeoberfläche. (A) Um ausreichende Informationen über Actomyosin-Netzwerke in umlaufend gekrümmten Epithelien zu erhalten, ist es notwendig, einen tiefen Z-Stack (rosa) über den Großteil eines sichtbaren Gewebes zu erwerben, wie für das gekrümmte Follikelepithel (grau) dargestellt. von Drosophila-Eikammern. (A') Eine einfache Projektion eines solchen Z-Stacks führt jedoch zur Vermischung ganzer Actomyosin-Netzwerke in Follikelzellen. Myosin II visualisiert mit MRLC::GFP (grün) zeigt die stark exlomitende innere (apikale) Region der Follikelzellen in einer solchen Z-Projektion und fast keine Informationen von der basalen (äußeren) Seite, wo Myosin II einen starken planaren Zellpolaritätsphänotyp zeigt, Signalintensität ist niedrig¹². Um eine solche Vermischung zu vermeiden, wie in Panel A'gezeigt, haben wir ein benutzerfreundliches, Fidschi-basiertes Plugin namens Ellipsoid Surface Projection in BigDataViewer¹⁸ entwickelt, das (B) die selektive Extraktion einer definierten, dünnen Schicht (rosa) ermöglicht. ) von Actomyosin aus einem gekrümmten Epithel (B') wie für Myosin II (grün) in einer ausgewählten Extraktion der basalen (äußeren) Seite des Follikelepithels dargestellt. Vergleichen Sie den Signalunterschied von Myosin II (MRLC::GFP) in den Panels A' und B'. Beachten Sie das planare polarisierte Muster von Myosin II in Panel B'. Die Zellumrisse sind rot. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Planares polarisiertes Actomyosin-Netzwerk an der lokalen Zell- und Gewebewaage. Die Bildgebung von Actomyosin in verschiedenen Skalen ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Anzahl von Epithelzellen, nämlich (A) bis zu 15 Zellen im lokalen Zellmaßstab und (B) 50-100 Zellen auf der Gewebeskala im Follikelepithel kultiviert Drosophila Eikammern. Nonmuscle Myosin II wird mit MRLC visualisiert::GFP (grün) und der Genotyp der verwendeten transgenen Linie ist in der Tabelle der Materialienangegeben. Die Zellumrisse sind in Magenta. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Skalenbalken = 5 m (A); 50 m (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ein Beispiel für die Analyse von Myosin-II-Impulsen im Oberflächenmanager auf der lokalen Zellskala. (A) Ein Partikelstapel wird in den Oberflächen-Manager geladen. Beachten Sie, dass alle identifizierten Zellen im TLM im Fenster Oberflächen-Manager angezeigt werden. Es ist wichtig, alle unerwünschten oder unvollständigen Zellen in einem TLM zu löschen. (B) Statistiken, die auf Myosin II (MRLC::GFP) für ausgewählte Zellen ermittelt wurden, werden im Fenster "Durchschnitt grauer Wert Slice by Slice" im Oberflächenmanager angezeigt. MRLC::GFP wird grün dargestellt, während Zellmembranen rot sind. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ein Beispiel für die manuelle Analyse einzelner Myosin-II-Signale auf lokaler Mobilfunkskala. (A) Ein ausgewählter 30 s-langer Submovie wird neben (B) seine Zeitprojektion platziert. Beachten Sie, dass Myosin II (MRLC::GFP) bei der Zeitprojektion längere Bahnlinien (siehe Panel B) innerhalb einzelner Zellen anzeigt als in einem einzelnen Zeitrahmen (siehe Panel A). Einzelne Linien in Zellen sollten auf ihre Winkelrichtung relativ zur vorderen-hinteren Achse der Eikammern analysiert werden. (C) Beachten Sie, dass Fidschi nicht 0°–360° misst, sondern nur 0°–180° für Signale, die nach oben zeigen, und 0°–179° für nach unten zeigende Signale. Beachten Sie, dass 0° atypisch auf der rechten Seite eines analysierten Bildes platziert ist. (D) Auf der Grundlage dieser Informationen sollten Linien, die sich mit (oben in rosa) oder gegen (nach unten in Gelb) bewegen, die Richtung der Epithelrotation in einer bestimmten Eikammer gebunden werden, um festzustellen, ob symmetriemäßige Brüche analysierter Signale innerhalb eines und dann für mehrere Zellen im analysierten Gewebe. MRLC::GFP wird grün dargestellt, während Zellmembranen rot sind. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ein Beispiel für die Erzeugung einer ellipsoiden Passform auf der Gewebeskala. Um ein Ellipsoid mit dem Ellipsoid-Oberflächenprojektions-Plugin in BigDataViewer auf eineEikammer zu montieren, muss ein Begrenzungsrahmen definiert werden, der den Großteil des gescannten Gewebes enthält. Als Nächstes ist es wichtig (B) Signalpunkte zu identifizieren, die eine Voraussetzung für eine optimale ellipsoide Passform sind. (C) Wenn die Ellipsoidpassung nicht optimal ist und eine Eikammer nicht schön umgibt, führt dies zu einer (D) schlechten Gewebeschichtextraktion. Siehe die Extraktions- und späteren Projektionsergebnisse in Abbildung 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Vergleich einer falschen und optimalen Ellipsoidpassung und entsprechender Oberflächenprojektionen. (A) Wenn das Ellipsoid nicht richtig montiert ist (B) liefert die endgültige Oberflächenprojektion keine vollständigen Signaldaten in der dünnen Schicht des analysierten Gewebes. (C) Bei optimaler Einbau garantiert sie jedoch eine gleichmäßige Signalerkennung einer dünnen Schicht im Gewebe. (D) Beachten Sie, dass die optimale Oberflächenprojektion mehrere dünne Schichten als oberflächenprojizierten z-Stack im Laufe der Zeit enthält, die anschließend getrennt werden können, wie in Abbildung 8dargestellt. Myosin-II-Signale (MRLC::GFP, weiß) und Membransignale (weiß) werden zunächst vor der Projektion zusammengeführt (Panels A und C), aber bei der Oberflächenprojektion selbst sind diese Kanäle getrennt (siehe Projektionen von Myosin II in den Panels B und D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Ein Beispiel für die Analyse von Myosin-II-Impulsen im Oberflächenmanager auf der Gewebeskala. (A) Ein Partikelstapel wird in den Oberflächen-Manager geladen. Beachten Sie, dass alle identifizierten Zellen im TLM im Fenster Oberflächen-Manager angezeigt werden. Es ist wichtig, alle unerwünschten oder unvollständigen Zellen in einem TLM zu löschen. (B) Statistiken, die über Myosin II (MRLC::GFP)-Impulse (Mittelwert oder Median) für ausgewählte Zellen im Zeitverlauf ermittelt wurden, werden im Fenster "Durchschnitt grauer Wert Slice by Slice" im Oberflächenmanager angezeigt. Beachten Sie, dass stärkere Myosin-II-Punkte das letzte Maß der intrinsischen Myosin-II-Intensität beeinflussen können. Dies ergibt sich aus dem Problem, dass diese Myosin II-Punkte über die Zellumrisslinie hinaus zu migrieren scheinen, wenn eine falsche Zellumrissdefinition in der generierten Zellmaske vorhanden ist. MRLC::GFP wird grün dargestellt, während Zellmembranen rot sind. Die vordere Seite befindet sich auf der Oberseite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Repräsentative Ergebnisse eines Myosin-II-Netzwerks im Drosophila-Follikel-Epithel. Repräsentative Beispiele für dynamisches Myosin-II-Verhalten (MRLC::GFP) (A und B) auf der lokalen Zellskala und (C-F) auf der Gewebeskala zur Kontrolle und fett2 mutierten Drosophila-Eikammern. Ausführliche Informationen zu gebrauchten Genotypen finden Sie in der Tabelle der Materialien. Beachten Sie, dass sich MRLC::GFP-Signale (grün) senkrecht zur vorderen hinteren Achse (AP) der Kontrolleierkammern bewegen. Diese Polarität geht in fett2 mutierten Eikammern verloren und führt zu anisotropen Myosin II-Pulsen/Oszillationen¹². Bei manueller Analyse kleiner MRLC::GFP-Signale (ca. 300 m) und der Quantifizierung ihrer Winkelrichtbewegung, wie im Protokoll beschrieben, kann das Symmetriebrechen von MRLC::GFP-Signalen mit einer Präferenz gegen die Richtung des Epithel Rotation in einer analysierten Eikammer¹² (Abbildung 4). Entsprechende Filme sind: Panel A = Film 1, Panel B = Film 2, Panel C = Film 3, Panel D = Film 4, Panel E = Film 5und Panel F = Film 6. Zellumrisse werden in Magenta angezeigt. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Skalenbalken = 5 m (A und B) und 50 m (C-F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Empfohlene Parameter für die Kurzzeit-Hochgeschwindigkeits-Bildgebung auf lokaler Mobilfunkskala:
Ⅰ.	Gewebe von Interesse, das frei im Kultivierungsmedium platziert wird (d.h. keine Abdeckschlipse, flexible Decken usw.)
Ⅱ.	63x Wasserobjektiv mit numerischer Blende >= 1,3
Ⅲ.	Invertiertes konfokales Mikroskop
Iv.	Einzelebene
gegen.	6-12 s Zeitintervalle
Vi.	5-10 Min. TLMs
Vii.	Datenspeicherbedarf pro TLM bis zu 100 MB
Empfohlene Parameter für die Langzeit-Bildgebung mit niedriger Geschwindigkeit auf der Gewebeskala:
Ⅰ.	Gewebe von Interesse, das frei im Kultivierungsmedium platziert wird (d.h. keine Abdeckschlipse, flexible Decken usw.)
Ⅱ.	40x Wasserziele und numerische Blende >= 1,3
Ⅲ.	Invertiertes Spinnscheibenmikroskop
Iv.	z-Stacks, um ca. die Hälfte einer Eikammer zu erwerben
gegen.	60 s Zeitintervalle
Vi.	Mindestens 30 Min. TLMs
Vii.	Datenspeicherbedarf ca. 1 GB

Tabelle 1: Empfohlene Bildgebungsparameter.

Film 1: Repräsentatives dynamisches Verhalten von Myosin II (MRLC::GFP) im zellulären Maßstab in einer Kontrollierter Drosophila-Eikammer. Beachten Sie, dass MRLC::GFP (grün) es vorzieht, sich senkrecht zur AP-Achse der Eierkammern zu bewegen. Zellumrisse sind in Magenta. Basalansicht. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Skala Bar = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. Rechtsklick zum Download.

Film 2: Repräsentatives dynamisches Verhalten von Myosin II (MRLC::GFP) auf der zellulären Skala in einer fett2 mutierten Drosophila-Eikammer. Beachten Sie, dass MRLC::GFP-Impulse (grün) und nicht mehr planar senkrecht zur AP-Achse statischer Eikammern ausgerichtet ist. Zellumrisse sind in Magenta. Basalansicht. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Skala Bar = 5 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen. Rechtsklick zum Download.

Film 3: Repräsentatives dynamisches Verhalten von Basal Myosin II (MRLC::GFP) auf der Gewebeskala in einer Kontroll-Drosophila-Eikammer. Beachten Sie, dass aus fast der Hälfte des Follikelepithels einer Eikammer nur eine dünne Basalschicht (äußere) MRLC::GFP-Schicht extrahiert wird. MRLC::GFP ist grün und Zellumrisse sind in Magenta. Beachten Sie hier den Unterschied im Detailgrad des erhaltenen MRLC::GFP-Signalverhaltens (das die Gewebeskala darstellt) im Vergleich zu Film 1 (der die zelluläre Skala darstellt). Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Rechtsklick zum Download.

Film 4: Repräsentatives dynamisches Verhalten von Basal Myosin II (MRLC::GFP) auf der Gewebeskala in einer fett2 mutierten Drosophila-Eikammer. Beachten Sie, dass MRLC::GFP (grün) stark an der Basalseite von fast der Hälfte des Follikelepithels einer fat2 mutierten Eikammer pulsiert und nicht die synchronisierte Kraft erzeugt, die erforderlich ist, um die Epithelrotation zu fördern. Zellumrisse sind in Magenta. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Rechtsklick zum Download.

Film 5: Repräsentatives dynamisches Verhalten von apikalem Myosin II (MRLC::GFP) auf der Gewebeskala in einer Kontroll-Drosophila-Eikammer. Nur eine dünne MRLC::GFP-Schicht wird aus der apikalen (inneren) Seite von fast der Hälfte des Follikelepithels einer Eikammer extrahiert. Beachten Sie, dass MRLC::GFP (in grün) hier auf der apikalen Seite ein anderes dynamisches Verhalten zeigt als die Basalseite des Follikelepithels (wie in Film 3gezeigt). Zellumrisse sind in Magenta. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Rechtsklick zum Download.

Film 6: Repräsentatives dynamisches Verhalten von apikalem Myosin II (MRLC::GFP) auf der Gewebeskala in einer fett2 mutierten Drosophila-Eikammer. Verändertes dynamisches Verhalten von MRLC::GFP (grün) aus einer dünnen apikalen Region von fast der Hälfte des Follikelepithels einer statischen fett2 mutierten Eikammer extrahiert. Zellumrisse sind in Magenta. Die vordere Seite befindet sich auf der linken Seite. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. Rechtsklick zum Download.

Discussion

Kritische Schritte und Fehlerbehebung bei der Zerlegung und Kultivierung von Eierkammern

Wenn zu viele Fliegen in eine kleine Durchstechflasche gelegt werden, kann das Fliegenfutter nach 2–3 Tagen schlammig werden, da große Mengen an Fütterungslarven und erwachsenen Fliegen im Fliegenfutter gefangen werden. In einem solchen Fall, kippen Sie den Rest dieser Fliegen in eine neue Durchstechflasche mit frischem Essen und verkleinern ihre Anzahl. Insbesondere schließen Sie Frauen aus, die in der Nahrung stecken geblieben sind.

Der Schneider-Mix (SM) sollte im Voraus vorbereitet werden und kann bei 4 °C für 14 Tage gelagert werden. Beachten Sie, dass eine ältere Mischung Kristalle enthalten kann, die die Oberfläche von Eierkammern beschädigen können. Mischen Sie das SM immer mit frisch zugesetztem Insulin und lassen Sie es genügend Zeit, um Raumtemperatur zu erreichen. Dies schützt Eierkammern vor Kälteschock, die sich negativ auf das Wachstum von Mikrotubuli und die planare Ausrichtung des Zytoskeletts auswirken können (wie im sich entwickelnden Drosophila-Flügel ¹⁹gesehen).

Eierkammern und ausgewählte Eizellen sind sehr zerbrechlich und können aufgrund ihrer geringen Größe im SMI (SM mit Insulin) schwimmen. Es wird empfohlen, sie spontan im SMI versinken zu lassen. Sie halten sich auch oft an die Sezierzangen/Kaktuswerkzeug. Lassen Sie sich in einem solchen Fall von Seziervorrichtungen befreien, indem Sie sie sanft im SMI bewegen. Vermeiden Sie es, sie jederzeit direkt zu quetschen und zu berühren. Schließen Sie bei Bedarf diese Eikammern/Ovariolen aus dem weiteren Protokoll aus.

Da ein Semittestoskop für die Identifizierung beschädigter Eikammern/Ovariolen nicht zuverlässig ist, sollten Eierkammern/Ovariole mit einem CellMask- oder FM 4-64-Farbstoff unter einem konfokalen/spinnenden Scheibenmikroskop überprüft werden. Beschädigte Eikammern zeigen eine extreme Färbung im Vergleich zu einem unbeschädigten Eikammergewebe Hintergrund. Erwerben Sie niemals ein TLM mit starken Farbstoff-Patches.

Kritische Schritte und Fehlerbehebung für die In-vitro-Live-Bildgebung von Eikammern

Wenn sich frei platzierte Eierkammern im SMI noch bewegen, überprüfen Sie erneut unter dem konfokalen Mikroskop, ob noch restliche Reste von Muskelblechen und Ablagerungen im SMI schweben. Entfernen Sie sie, und versuchen Sie es erneut. Von den Eikammern sollten 90% bei der anschließenden Bildgebung stabil und unbeweglich sein.

Um sicherzustellen, dass eine ausgewählte Eikammer/Ovariole stabil ist, verwenden Sie Hochgeschwindigkeits-Bildgebung (6 s Intervalle) für 1 min. Instabile Eikammern würden sich um diesen Punkt bewegen. Es wird jedoch empfohlen, die gesamte Zeitrafferaufnahme zu beobachten, um eine mögliche unerwartete Bewegung der abgebildeten Eikammer sanft korrigieren zu können. Dies kann geschehen, indem die mikroskopische Bühne/Tabelle, die die Petrischale mit den kultivierten Eikammern/Ovariolen hält, in die ursprüngliche Position bewegt wird, so dass die Eikammer des Interesses wieder im abgebildeten, fokussierten Fenster ist.

Beenden Sie die Bildgebung, wenn eine plötzliche und unerwartete Bewegung der abgebildeten Eikammer auftritt. Überprüfen Sie die Dämpfung des Mikroskoptisches, und vermeiden Sie es, während der Erfassungszeit in der Nähe des Mikroskops herumzulaufen, da dies zu einer Unterbrechung der Bildaufnahme aufgrund der verursachten Vibrationen führen kann.

Wenn der Zellmembranfarbstoff nach 30 min nicht sichtbar ist und die verwendete Laserlinie korrekt ist, fügen Sie mehr vom Farbstoff hinzu und erhöhen Sie seine Konzentration für die nächste Erfassung.

Wenn die Actomyosin-Signale unscharf zu sein scheinen, überprüfen Sie die NA des verwendeten Objektivs. Eine NA unter 1,3 verringert die Bildqualität. Stellen Sie außerdem sicher, dass das verwendete Tauchöl korrekt auf das 63-fache Wasser-Objektiv aufgebracht wurde. Fügen Sie sie hinzu oder ersetzen Sie sie bei Bedarf.

Wenn die Eikammern schrumpfen und sich die beobachteten Zellmembranen verformen, prüfen Sie, ob der Deckel richtig geschlossen ist. Wenn der Deckel fehlt oder nicht richtig geschlossen ist, können die Eierkammern aufgrund der SMI-Verdunstung über die Anschaffungszeit austrocknen.

Wenn die Rotation der Eierkammern verlangsamt oder stoppt, verringern Sie die Laserleistung. Wenn ein Loch in der Eierkammer auftaucht, wurde es durch den Laser verbrannt. Verringern Sie die Laserleistung.

Wenn die Actomyosinsignale nach 2 min während der TLM-Erfassung bleichen, verringern Sie die Laserleistung und erhöhen Sie die Signalverstärkung in der Mikroskopsoftware.

Sobald ein TLM des Follikelepithels einer Eikammer erworben wurde, wird empfohlen, eine erneute Bildgebung im gleichen Gewebebereich dieser Eikammer zu vermeiden. Wenn sich jedoch Eikammern um ihre AP-Achse drehen, ist es möglich, die Erfassung eines TLM mit dieser unbeschädigten Eikammer nach ca. 30 min zu wiederholen. Während der Abbildung des Follikelepithels in einer Eikammer werden andere Eikammern nicht gebleicht/geschädigt, selbst wenn sie sich im selben Eiriole oder in einem anderen Eiriole im SMI befinden.

Wenn alle diese Anforderungen erfüllt sind, sollte der Prozentsatz der erfolgreich abgebildeten Eikammern für die Stufen 6–8 etwa 90 %–100 %, für die Stufen 3–5 etwa 50 %–60 % und für die Stufen 1–2 etwa 20 %-30 % betragen. Das Versagen ist hauptsächlich auf die Bewegung von Eierkammern oder deren Beschädigung während der Zerlegung/Manipulation zurückzuführen.

Kritische Schritte und Fehlerbehebung für die Datenverarbeitung

Während der Maskengenerierung mit dem bereitgestellten Skript in Fidschi kann es vorkommen, dass es viele generierte Zellumrisse gibt, die nicht die tatsächlichen Zellmembranen in einem TLM widerspiegeln. Dies wird oft durch hohe Hintergrundgeräusche verursacht, insbesondere wenn Farbstoffe verwendet werden, um Zellmembranen zu färben. Führen Sie in einem solchen Fall die Segmentierung erneut aus, um die mühsame Korrektur unerwünschter Zellumrisse in der generierten Maske zu vermeiden und die Parameter auf die beste Passform einzustellen. Dies kann durch Anpassen des Parameters Geschätzte Rauschtoleranz erfolgen.

Beim Laden einer der ParticleStack.tif-Dateien mit Zellumrissen in den Oberflächen-Manager wird die Ladezeit linear mit der Anzahl der Zellumrisse skaliert und kann mehrere Minuten dauern. Wenn die Beladung unterbrochen oder falsch ist, wiederholen Sie sie. Stellen Sie sicher, dass das Upload-Fenster im Fokus ist und kein anderes Programm verwendet wird.

Manchmal muss eine Zellumrissung in einigen Frames korrigiert werden. verwenden Sie in diesem Fall die Pinseltaste. Zeichnen Sie die richtige Zellumrisslinie in einem bestimmten Rahmen, indem Sie die Maus um die Zellmembran ziehen. Wechseln Sie zu einem anderen Frame des TLM, und kehren Sie dann mit der Korrektur zum Zeitrahmen zurück: Die falsche Zellumrisslinie sollte nun ersetzt werden. Gehen Sie dann erneut zum nächsten Frame, um diesen zu korrigieren. Das Pinselwerkzeug wechselt nun in den Entsasemodus. Korrigieren Sie bei Bedarf die Gliederungen in den nächsten Zeitrahmen, indem Sie die vorhandene Zellumrisslinie drücken und dann die Schaltfläche +Hinzufügen drücken, um eine neue Zellumrisslinie zu erstellen. Löschen Sie die alte S-Nummer aus dem Fenster Surface-Manager, und benennen Sie die neue Zellumrissumriss um, indem Sie bei Bedarf die Schaltfläche Umbenennen drücken.

Wenn eine ganze wichtige Zelle in einem TLM fehlt, erstellen Sie eine neue Maskenumrisslinie, indem Sie die Option Auswählen > Polygondrücken. Erstellen Sie eine neue Zellumrisslinie im ersten Frame des TLM, indem Sie auf die Zellmembran klicken. Wechseln Sie dann zum letzten Frame des TLM, und tun Sie dasselbe für die ausgewählte Zelle. Wenn der Film rechtzeitig ausgeführt wird, werden die Zellumrisse interpoliert. Korrigieren Sie ggf. mit dem Pinselwerkzeug. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie die +Add-Taste und benennen Sie die Zellumrissumriss um, indem Sie die Schaltfläche Umbenennen drücken. Je mehr Punkte/Klicks zum Erstellen einer neuen Zellumrisslinie angezeigt werden, desto besser funktioniert die Interpolation.

Neben der Epithelrotation werden TLMs manchmal durch unerwünschte Bewegungen beeinflusst. Daher wird empfohlen, für solche Gewebedrift in diesen TLMs zu korrigieren. Auf diese Weise werden TLMs auch für die epitheliale Rotation von Eikammern korrigiert, und Zellmembranen werden starr. Dies erleichtert die manuelle Analyse von Actomyosin-Signalen. Ein solcher Ansatz erlaubt es Wissenschaftlern jedoch nicht zu unterscheiden, ob sich die beobachteten Actomyosinsignale bewegen oder im Verhältnis zur Zellmembran statisch sind. Wenn eine Unterscheidung zwischen statischen und aktiven Bewegungen von Actomyosinsignalen das Ziel einer solchen Analyse ist, sollte keine Gewebedriftkorrektur angewendet werden. Wir fanden heraus, dass sich die Mehrheit der Actomyosin-Signale aktiv relativ zur Zellmembran bewegt und nur ein kleiner Teil von ihnen statisch erscheint.

Kritische Schritte und Fehlerbehebung bei der Analyse subzellulärer Actomyosinsignale

Wenn die generierten Statistiken Ausreißer enthalten, stellen Sie sicher, dass alle extrem niedrigen oder hohen Werte in Bezug auf den gesamten Datensatz wirklich das Verhalten in der Zelle widerspiegeln und keine Artefakte sind. Dies kann durch Die Identifizierung der Zelle, die die Ausreißer enthält, und die Überprüfung der Zellumrissqualität zum Zeitpunkt der Messung des niedrigen/hohen Wertes erfolgen. Häufig resultieren solche Extremwerte aus fehlerhaften Zellumrissen, die einen Teil einer anderen Zelle falsch messen. Dies kann besonders deutlich werden, wenn große Blobs die Zellumrisse einer benachbarten Zelle stören. In einem solchen Fall ist es entscheidend, die Zellumrisse zu korrigieren und die Messung zu wiederholen.

Um die Quantifizierung zu vereinfachen, analysieren Sie die Signale in einer bestimmten Zelloberfläche und fahren Sie nacheinander fort, bis alle Zellen in einem Unterfilm analysiert werden. Die Ergebnisse der manuellen Analyse von subzellulären Actomyosin-Signalen zeigen möglicherweise keinen Symmetriebruch in einer Zelle und einer bestimmten Eikammer. Wir haben erfahren, dass das Actomyosin die Symmetrie im Verhältnis zur Gewebebewegung in <10% der rotierenden Eikammern (Stufen 6–8) nicht eindeutig bricht. Dieser Prozentsatz wird um Stufe 4¹²erhöht. Wir fanden auch heraus, dass es keinen Unterschied gibt, ob 5 min oder 10 min in derIdentifizierung der bevorzugten Richtung der Actomyosin-Signalbewegung in einer Eikammer 12 analysiert werden.

Kritische Schritte und Fehlerbehebung für die selektive Extraktion von Actomyosin-Signalen aus gekrümmtem Gewebe

Die falsche Größe von Blobs (identifizierte Signale) führt zu keinen Blobs und das Programm wird im nächsten Schritt einfrieren. In diesem Fall, force-quit Fidschi und neu starten Sie das Plugin Ellipsoid Surface Projection. Tun Sie dasselbe, wenn das Programm nach dem Drücken von Computenicht reagiert. Dies ist oft ein Hinweis darauf, dass ungeeignete Parameter gewählt wurden.

Wenn es zu viele Blobs gibt und/wenn sie auf eine Seite der analysierten Eikammer konzentriert sind, kann dies auswirkungen auf das entworfene Ellipsoid und bieten nicht die richtige Passform für die Eikammer. Kehren Sie zur Blob-Identifikation zurück und versuchen Sie, ihre Größe in Kombination mit der x-, y- und z-Achsen-Auswahl der Eikammer anzuordnen. Ein Versäumnis, eine gute Ellipsoid-Passung zu erzeugen, tritt auch oft auf, wenn ungeeignete Cut-off-Entfernungseinstellungen verwendet werden.

Die erhaltenen Projektionen können manchmal falsch fokussiert aussehen, oder vielleicht bewegt sich die erhaltene z-Ebene tatsächlich zwischen Zellschichten in der Nähe der Oberfläche der Eikammer. Dies ist in der Regel ein Zeichen für ein schlecht passendes Ellipsoid, bei dem ein Bereich des Ellipsoids zu weit von der Eikammer entfernt ist. Versuchen Sie, das Ellipsoid so zu montieren, dass es den gleichen Abstand zum Zellraumumfang behält.

Einschränkungen der Methode und neuartige Ansätze

Diese freie Kultivierung von Eierkammern lässt die subtile Abflachung der Oberfläche einer Eierkammer aus. Zu diesem Zweck hat diese Methode ihre Vor- und Nachteile. Bei der Verwendung der konfokalen Mikroskopie bietet es Anwendern hochauflösende und hochschnelle Bildgebung, die das Actomyosinverhalten in Zellen am Umfang von Eikammern für kurze Zeit (5–10 min) zuverlässig freilegt. Dadurch wird jedoch die Größe einer einzelnen Ebene begrenzt, die im Laufe der Zeit mit konfokaler Mikroskopie abgebildet werden kann. Im Allgemeinen ist es möglich, bis zu 15 Zellen pro Eikammer in den Stadien 6-8 abzubilden, aber nur etwa zwei Zellen in Eikammern in den Stadien 1-5. Daher haben wir diese Methode hier als nur für die lokale Zellskala geeignet definiert.

Um diese Größenbeschränkungen zu überwinden, die durch die begrenzte Größe einer einzelnen konfokalen Ebene verursacht werden, haben wir einen alternativen Fidschi-basierten Ansatz namens Ellipsoid-Oberflächenprojektion entwickelt, der auf der Gewebeskala verwendet werden kann. Dies kombiniert die Spinnscheibenmikroskopie mit einer halbinteraktiven Oberflächenextraktion von Eikammern auf der Gewebeskala. Auf diese Weise können Actomyosinsignale gleichzeitig für mehr als 50–100 Zellen aus einer analysierten Eikammer erhalten werden. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Ansatz sehr große Datensätze der erfassten Daten erzeugt (-giga-Bytes), eine niedrigere Auflösung hat (es verwendet ein 40x im Vergleich zu einem 63x Objektiv), und bietet auch eine langsamere Bildgebungsgeschwindigkeit (es dauert 60 s, um die Hälfte des Gewebes einer Ei-Cham zu scannen [Stufen 6–8] und ist als solches 10x langsamer als die methode der begrenzten konfokalen Ebene).

Im Vergleich zu anderen vorhandenen Software zum Extrahieren von geschichteten Projektionen von parametrisierten Oberflächen konzentriert sich das für dieses Protokoll entwickelte Plugin auf Benutzerfreundlichkeit und interaktives visuelles Feedback bei jedem Schritt des Prozesses. Andere Werkzeuge, wie die MATLAB-basierte ImSaNE²⁰, die von Chen et al.²¹verwendet wird, konzentrieren sich auf die Handhabung einer Vielzahl von parametrisierten und nicht parametrisierten Oberflächenmodellen und verschiedenen Projektionsmethoden. ImSaNE erfordert beispielsweise, dass Daten auf eine bestimmte Weise vorverarbeitet und ausgerichtet werden und teilweise externe Tools in Zwischenschritten benötigt werden. Im Gegensatz dazu behandelt das hier vorgestellte Plugin jedes 3D/4D/5D-Bild (Sequenz), das in Fidschi ohne externe Vorverarbeitung geöffnet werden kann. Während ImSaNE durch die Bearbeitung von MATLAB-Skripten sehr konfigurierbar (programmierbar) ist, bieten wir einen minimalen Satz von Optionen in einem Workflow, der auf das hier diskutierte spezifische Problem zugeschnitten ist. Jeder Schritt des interaktiven Workflows liefert Ergebnisse, die bei Bedarf sofort visuell überprüft und angepasst werden können.

Die Entscheidung, welcher dieser bildgebenden Ansätze, die lokale Zell- oder Gewebeskala, für ein bestimmtes Experiment am besten ist, hängt rein von der zu beantwortenden wissenschaftlichen Frage ab (d. h. höhere vs. niedrigere Auflösung; kurze vs. lange Anerfassungszeit). Ein guter Kompromiss zwischen diesen beiden Skalen könnte darin bestehen, beide Ansätze zu kombinieren und so die Bildgebung von Actomyosinsignalen auf der Halbgewebeskala (d. h. 20–30 Zellen) zu gewinnen. Dies erfordert ein sich drehendes Scheibenmikroskop, eine 63-fache Wasserlinse mit NA 1,3 und etablierte Z-Stack-Einstellungen für 20 bis 30 Zellen einer Eikammer. Dieser viel flachere Z-Stack (im Gegensatz zum Z-Stack, der für die Erfassung einer halben Eikammer erforderlich ist) ermöglicht ein schnelleres Scannen von unter 60 s. Die hier gewonnene Zeit kann entweder für die wiederholte Z-Stack-Erfassung verwendet werden, um die Bildgebung zu beschleunigen, oder für eine Probenwiederherstellung (Zeitverflechtungen) zwischen einzelnen Z-Stacks. Mit letzterem kann eine längere Ankaufzeit (>30 min) von TLMs rotierender Eikammern erreicht werden. Dieser Semi-Gewebe-Ansatz garantiert eine ausreichende Auflösung für Actomyosin-Signale und die Gleichzeitige Abbildung von mehr Zellen über längere Zeiträume.

Zukünftige Anwendungen und Visionen

Beide beschriebenen Methoden (auf lokaler Zell- und Gewebeskala) bieten einen einfachen und kostengünstigen Ansatz (ohne Mikroskopgeräte) mit begrenzten Nebenwirkungen auf das Actomyosin-Netzwerk und können für andere sezierte Tiergewebe implementiert und leicht übernommen werden. Die einzige Voraussetzung hierfür ist ein bestehendes Kultivierungsprotokoll in einer Petrischale für ein gekrümmtes Gewebe von Interesse, verfügbare Transgene und Marker oder Etikettierungsmethoden.

In Kombination mit der Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie²²ist es auch möglich, Actomyosin-Maschinen in toto abzubilden (d.h. die gesamte äußere Umfangsfläche von Drosophila-Eikammern gleichzeitig und anschließend nachträglich abzubilden mit dem Plugin Ellipsoid Surface Extraction). Es gibt jedoch einige Einschränkungen, die in Bezug auf die Eignung für die Hochgeschwindigkeits-Bildgebung von Actomyosin-Signalen gelöst werden müssen, nämlich 1) die Einbettung von Eikammern in eine Low-Point-Schmelzagarose oder deren Festhalten an einer Kapillare während der Bildgebung; ii) eine niedrige numerische Öffnung der verwendeten Wasserlinsen, die keine ausreichende Actomyosin-Signalauflösung bieten; iii) die zusätzliche Zeit, die benötigt wird, um mehrere Winkel von Eierkammern zu erfassen, was eine Hochgeschwindigkeits-Bildgebung verhindert.

Zu diesem Zweck ist absehbar, dass die detaillierte Analyse von Actomyosin-Maschinen mit der Verfeinerung der Mikroskopparameter wie der Geschwindigkeit, die das Epithelgewebe durchscannlässt, und der Verbesserung der verwendeten mikroskopischen Linsen in Zukunft vielversprechende hochauflösende Ergebnisse, die über lange Zeiträume am Gewebe und in toto-Skala erzielt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.