Summary
Denne metode for første gang beskrives pålidelige eksperimentelle procedurer for effektiv inducerbar methanol-fri rekombinante protein produktion i Pichia pastoris (Komagataella phaffii), beskæftiger carbon kilde reguleret initiativtagere P DCog PDF i lille skala eksperimenter mens dyrkning parametre kan overvåges online, og en konstant glycerol foder anvendes.
Abstract
Methanol er en veletableret carbon kilde og inducer for effektiv protein produktion beskæftiger Pichia pastoris (P. pastoris) som vært på mikro-, lab og industriel skala. Men på grund af dens toksicitet og antændelighed, der er et ønske om at undgå methanol samtidig opretholde den høje produktivitet af P. pastoris. Lille skala bioreaktor udlæg til planteavl (0,5-5 L arbejder bind) er almindeligt anvendt til at evaluere en stamme og protein produktion karakteristika da individuel dyrkning i dyb brønd plader kan næppe kontrolleret eller afhængig af dyrt udstyr. Derudover blev traditionelle protokoller for dyrkning og induktion i P. pastoris etableret for konstituerende udtryk eller methanol induktion og indtil videre ingen pålidelig protokoller blev beskrevet til skærmen P. pastoris udtryk stammer med derepressible initiativtagerne i (kontrollerede og overvågede) parallelle udlæg til planteavl. For at forenkle disse indledende udlæg til planteavl til at karakterisere og sammenligne nye protein produktionsstammer, etableret vi en simpel ryste kolben dyrkning system for methanol ytringsfriheden, der simulerer bioreaktor betingelser herunder en konstant langsom glycerol feed og online overvågning, dermed kommer tættere på de reelle forhold i bioreaktorer i forhold til det meste anvendte små batch udlæg til planteavl. Undertrykt initiativtagere PDC og PDF blev anvendt til at drive rekombinante protein udtryk i P. pastoris, carbon kilde. Polymer-diske med integrerede carbon kilde, frigive en konstant mængde af glycerol, forsikrede et tilførselshastigheden levere den nødvendige energi til at opretholde initiativtagerne aktive samtidig med at den biomasse generation lav.
Introduction
Forbedring af udbyttet og pålidelige dyrkning betingelser på stor skala for rekombinante protein produktion af mikroorganismer såsom bakterier eller gær er en af største dagens bioteknologi1 og de kommercielle succes af industrielle behov applikationer. Dueto enkel dyrkning procedurer og medier, højt udbytte og godt karakteriseret værktøjer2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) er en meget anvendt ikke-konventionelle gær for rekombinante protein produktion. Yderligere innovative værktøjer udvikles konstant for denne art, ligesom nye udtryk vektorer herunder nye projektledere som alternativer til den udbredte PAOX1, regionen promotor af alkohol oxidase 1 gen3, 4,5. En 500 bp lange DNA-sekvens opstrøms af CAT1 (CTA1) genet blev identificeret som promotor-regionen, som giver mulighed for en ny methanol-frie og alsidige udtryk strategi i P. pastoris. CAT1 gen er den eneste katalase gen af P. pastoris og protein er beliggende i peroxisomerne. Katalase spiller en vigtig rolle i afgiftning af reaktive ilt arter, som opstår, fx., fra methanol oxidation i peroxisomal MUT pathway eller under beta oxidation af fedtsyrer6,7. Udtryk af CAT1 -genet er undertrykt i nærvær af glucose eller glycerol på mellemlang og dyrkning og derepressed ved nedbrydningen af disse carbon kilder8. Desuden kan udtryk for katalase gen induceres med methanol og remarkebly også med oliesyre, tilsyneladende er den eneste gene i P. pastoris MUT reaktionsvej, som kan være fremkaldt med oliesyre selv at nå lignende udtryk niveauer som med methanol induktion9.
500 bp fragmentet af denne P. pastoris CAT1 promotor, som kaldes PDC (undertiden også forkortede PCAT1-500), er allerede blevet testet for produktionen af intracellulært udtrykt og udskilles proteiner og det viste sig for at være en attraktivt alternativ til de klassiske to P. pastoris initiativtagere – stærk konstitutiv Pedersenhul og methanol inducerbar PAOX1, som blev udviklet for mere end 20 år siden. PDC var i stand til at nå 21% (CalB) og 35% (HRP) af de volumetriske aktiviteter i forhold til Pedersenhul i sukker rig medium. Methanol induktion, PDC kun reagerer ikke hurtigere end PAOX1, men kunne også tydeligt udkonkurrerer det med en 2,8 fold højere endelige titer af CalB9.
Udover PDC, var blevet identificeret en orthologous promoter (PDF) udviser en lignende forordning profil. Det er imidlertid væsentligt stærkere end PDC under derepressed som under methanol-induceret betingelser (håndskriftet under forberedelse)3.
I tilfælde hvor stærk konstitutiv Pedersenhul mislykkedes på grund af fysiologisk problematisk eller cytotoksiske proteiner10,11, repræsenterer PDC og PDF et ideelt alternativ. I micro skala eksperimenter, udtrykket drevet af disse initiativtagere starter efter nedbrydningen af den oprindelige carbon kilde (fx., glucose eller glycerol), som letter biomasseproduktionen uden at belaste celler med overekspression af det rekombinante protein lige fra begyndelsen. Mens begge af disse initiativtagere er stadig inducerbar af methanol, aktivering af derepression gør ekstra brugen af den preinduction fase i forhold til udtryk beskæftiger PAOX1. Desuden, PDC og PDF kan bruges til methanol-fri protein produktion, som er et ønskværdigt mål for store industrielle processer12.
For udviklingen af gældende produktionsstammer og udtryk konstruktioner skal flere trin i udviklingen være bestået for at indsnævre fra et stort antal transformants til den foretrukne kandidat for opskalering. Screeninger normalt udføres i høj overførselshastighed i multi godt plader (mikro skala: mindre end 0,5 mL) for at indfange en række kloner så stor som mulig. Efterfølgende re screening og re-re-screening er det næste skridt, efterfulgt af ryste kolben (lille skala: 50-250 mL) eller (mikro-) bioreaktor screeninger12. Det er imidlertid ønskeligt at have en metode, der er mest ens mellem de forskellige skalaer fra hundredvis af μl i dyb-godt plader op til flere milliliter i ryste kolber op til senere opskalering af methanol-fri produktion i velkontrollerede bioreaktorer. Selvom ryste kolber kan give allerede lignende mængder som små bioreaktorer, findes der flere begrænsninger, som er yderst relevante for storstilet protein produktion som konstant fodring, beluftning og online-overvågning13 af vækst og iltforsyning. Optisk kontrol beskæftiger tilpasset ryste kolber og ryster enheder giver en omkostningseffektiv alternativ til mere avanceret udstyr til parallel dyrkning mens det stadig giver konstant online oplysninger om større kultur parametre såsom biomasse og koncentration af opløst ilt. Langsom frigivelse af CO2 kilde fra polymer luftfartsselskaber kan anvendes for at sikre en konstant og kontrolleret feed uden at påberåbe komplekse tekniske løsninger og udstyr, simulerer flere lignende forhold af bioreaktorer end de tidligere anvendte simpel fuld nedbrydning af kulstof kilde9,10, begrænsende hvor energi for igangværende protein udtryk bliver.
Følgende metode beskriver en lille til mellemstor skala methanol-fri styrbar protein udtryk system i P. pastoris baseret på de nye promotorer PDC og PDF. Induktion af derepression omfatter to faser. En første korte fase af biomasse ophobning uden produktion af protein af interesse, ved hjælp af en carbon kilde, der undertrykker initiativtagerne og en anden fase af target protein produktion, hvor en carbon kilde leveres i lille men konstant koncentrationer opretholdelse af selskabet derepressed. Online overvågning af mest kritiske dyrkning parametre anvendes hele dyrkning i perioden. Målet var at give en methanol gratis, pålidelige og skalerbare dyrkning system for P. pastoris.
Protocol
1. medier forberedelse
- Bufferet minimal medier (BMG med glycerol, BMD med dextrose som carbon kilde) forberedelse (1 L)
- Autoklave 650 mL destilleret vand i et 1 L skruelåg glasflaske. Efter afkøling, komplet medium ved tilsætning af 100 mL af autoklaveres 10 x YNB (134 g/L gær nitrogen base aminosyrer), 200 mL af kalium fosfat buffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glucose eller glycerol (afhængigt af den ønskede genererede biomasse beløb under batch), 2 mL sterilt 500 x Biotin (10 mg/mL) løsning og fylde op til 1 L med sterilt destilleret vand.
Bemærk: Alle ingredienser skal være autoklaveres i separate kolber. Biotin er ødelagt når autoklaveres, og derfor skal filteret steriliseret med 0,2 µm membranfiltre.
- Autoklave 650 mL destilleret vand i et 1 L skruelåg glasflaske. Efter afkøling, komplet medium ved tilsætning af 100 mL af autoklaveres 10 x YNB (134 g/L gær nitrogen base aminosyrer), 200 mL af kalium fosfat buffer (1 M, pH 6), 30-100 mL 10% w/v glucose eller glycerol (afhængigt af den ønskede genererede biomasse beløb under batch), 2 mL sterilt 500 x Biotin (10 mg/mL) løsning og fylde op til 1 L med sterilt destilleret vand.
- Bufferet rig medier (BYPG) (1 L)
- Autoklave 700 mL destilleret vand med 1% w/v gær ekstrakt og 2% w/v pepton i et 1 L skruelåg flaske. Efter afkøling, tilsættes separat autoklaveres 10% w/v glycerol, 200 mL af kalium fosfat buffer (1 M, pH 6) 30-100 mL og fylde op til 1 L med sterilt destilleret vand.
2. Ryst kolber forberedelse
- Der tilsættes 5 mL destilleret vand i 250 mL forbløffet ryste kolber, dække det med to lag af bomuldsklud og ordne det på plads med elastikker. Dække med et stykke aluminiumsfolie klud.
- Autoklave kolberne ved 121 ° C i 20 min. for fuld sterilisation.
- Fjerne resterende vand fra kolben og alikvot 50 mL af den tidligere forberedt medier til hver kolbe.
3. natten kultur podning
- Starte en overnight kultur (ONC) med en enkelt frisk koloni af den ønskede udtryk stamme i 5 mL YPD (1% w/v gærekstrakt, 2% w/v pepton, 2% w/v glukose) i et 50 mL centrifugeglas mens låget lidt åben, så ordentlig udluftning.
- Lad det vokse i løbet af natten ved 28 ° C, luftfugtighed 80% i en shaker på 100-130 rpm (2,5 cm ryster diameter).
4. måling Setup og vigtigste kultur dyrkning
- For at oprette det online overvågningssystem, Følg fabrikantens instruktioner for passende kalibrering af enhederne.
- Placer en computer, hvor den relevante software til overvågning er installeret i intervallet for en Bluetooth-forbindelse til målestationer. Starte software til at tilslutte enheder via Bluetooth.
- Tænd Bluetooth-forbindelsen på anordningen til måling af biomasse ved at trykke på knappen sølv på forsiden.
- I softwaren, skal du klikke på enheder og derefter Finde enheder.
Bemærk: Enhederne, der skal vises som en liste i vinduet under linjen opgave. Hvis de ikke gør det, er det tilrådeligt at kontrollere, om batterierne er opladet, og computeren er inden for rækkevidde for en Bluetooth-forbindelse. - Træk og slip de fundne enheder til firkanter på højre side af skærmbilledet Måling bakke.
- Klik på Tilslut.
Bemærk: Når forbindelsen var vellykket, en kontrolskærm vises. - Start en testkørsel for Bluetooth-forbindelsen, klikke på måling.
- Opsætning af eksperimentet.
- Klik på Start måling, navn eksperimentet og aktiverer alle parametre for at overvåge.
Bemærk: Licenser er nødvendig for hver af de mulige målte parametre. - Angiv Interval til 3 min.
Bemærk: Intervallet bestemmer, hvor ofte målepunkter er taget og hvert målepunkt resulterer i en værdi bagefter. Måling af hvert minut er meget præcis, men masser af data, der genereres som gør det mere besværligt at evaluere. - Angiv Gennemsnittet målepunkter til 11.
Bemærk: Denne indstilling bestemmer, hvor mange målepunkter er faktisk taget hver 3 min. Derfor, arbejdsydelse er gennemsnitsværdien af 11 målepunkter over 11 s. - Indtast navnene på prøverne.
- Springe det næste skærmbillede, som vinklen var allerede kalibreret før (trin 4.1).
Bemærk: En testkørsel for Bluetooth-forbindelsen, før vaccination de vigtigste kulturer er rådes til at sikre stabile forbindelser og passende placering på den tilsluttede computer. Også, batterierne skal oplades.
- Klik på Start måling, navn eksperimentet og aktiverer alle parametre for at overvåge.
- Måle celle tætheden af ONC (trin 3.1) fortyndet i dyrkning media (1:20) i et spektrofotometer ved 600 nm bølgelængde. Podes 50 mL af substratet (anbefalet carbon kilde koncentration 0,3-1%, forskellige medier muligt som beskrevet i trin 1.) med ONC til en OD600 på 0,05 ved hjælp af følgende beregning.
- Placer kolberne i detektorerne og ryste ved 28 ° C, 130 rpm og 80% luftfugtighed.
Bemærk: Det er meget vigtigt at give kulturen 5 min af ryster før start måling at undgå celler holder sig til bunden af kolben og giver forkerte værdier. - Klik på Start måling i softwaren.
- Tage 0,2 mL prøver for celle densitetsmåling 4 h efter podning, og når CO2-kilden bliver forarmet (bestemmelse beskrevet taktfast 4.7) i tre. Fortynd prøver passende i dyrkning medier (første måling 1:5, anden måling 1:20) og måle absorption på 600 nm bølgelængde i et spektrofotometer. Før du fjerner kolberne og endda før du stopper shaker altid pause måling i softwaren.
Bemærk: Detektorerne er kalibreret til optagelse parametre under definerede ryster betingelser og vil vige for nonsens målinger, når du optager stadig kulturer. Også, Sørg for at altid vente 5 min af ryste før du begynder målingen igen. Celle tæthed målinger er afgørende, fordi detektoren leverer bare værdier for biomasse og ikke reelle celle tæthed. En kalibreringsfunktionen mellem OD600 værdier (x-værdier) og de værdier, der er fremstillet ved online målesystemet (y-værdier) kan opnås ved at måle adskillige timepoints spektrofotometrisk. Værdierne er ikke i en lineær, men i en logaritmisk forhold efter følgende kalibreringsfunktionen:
y: OD600 værdier opnået ved Spektrofotometer
x: værdier opnået ved online målesystem
k: hældning
d: akse skæring
Hældningskoefficienten og skæringspunktet akse kan derefter bruges til at konvertere en værdi til den tilsvarende OD600 værdi. I Excel kan en plot spektrofotometrisk opnåede OD600 værdier mod værdier fra online-system fra samme tidspunkt. Tilføjelse af en logaritmisk tendenslinje og den tilsvarende ligning vil give kalibreringsfunktionen vist ovenfor. - Dyrke indtil carbon kilde er næsten forarmet (ca. 12-20 h). Med henblik herpå, lad kulturer vokse indtil det kan ses i diagrammerne, software, at koncentrationen af ilt er nærmer sig nul og cellerne i den eksponentielle vækstfase.
Bemærk: Dette er tilfældet for CO2 kilde koncentrationerne anvendes i denne protokol. Tidspunkt af kulstof kilde udtynding kan bestemmes med den online overvågningssystem, som det er vist eksemplarisk i figur 1 i afsnittet repræsentant resultater når iltindholdet nærmer sig nul, og cellerne i den eksponentielle vækst fase.
5. protein udtryk af nedtrapning undertrykkelse
- Når det tidspunkt, der er beskrevet i trin 4.6 er nået, begynde at fodre kulturer ved tilsætning af fire feed diske pr. flaske under sterile forhold.
Bemærk: Under de beskrevne betingelser, fire glycerol feed diske frigive 2 mg/h glycerol ifølge producenten. - Fortsat dyrkning i 60-90 timer mens du tager prøver hver 24 h at overvåge protein udtryk ved en analyse af valg (fx., Bradford assay15, SDS side16 eller aktivitet assays) og celle tæthed målinger.
6. kultur høst
- Efter 60-90 h dyrkning, fylde kulturer i 50 mL centrifugeglas for høst ved centrifugering på 4.000 x g, 4 ° C i 10 min.
Bemærk: Supernatanten (for udskilles proteiner) eller celler (for intracellulær protein udtryk) kan høstes ved centrifugering på 4.000 x g, 4 ° C i 10 min og yderligere analyser kan gøres. - Eksportere online måledata som en regnearksfil fra software for yderligere analyse.
- Fylde 5-10 mL destilleret vand til alle de kolber og autoklave til at inaktivere de resterende celler.
Representative Results
Som beskrevet i afsnittet protokol, registrerer softwaren vigtige dyrkning parametre over hele dyrkning. Figur 1 viser visualisering af biomasse udvikling og iltkoncentrationen under en dyrkning begyndte med enten 0,5% (figur 1A) eller 0,3% (figur 1B) carbon kilde i partiet efterfulgt af tilsætning af glycerol feed diske. Online overvågningssystemet er navnlig nyttig nemlig de de undertrykte udlæg til planteavl som tidspunkt af kulstof kilde udtynding efter partiet kan bestemmes nøjagtigt. Som det kan ses i figur 1, koncentrationen af ilt i medium faldende hurtigt og nærmer sig nul, især for 0,5% glycerol i batch (figur 1A) mens biomassen stiger eksponentielt på dette punkt. Her, at cellerne er i den eksponentielle vækstfase og for at gøre optimal brug af kulstof source frigivelse, kort tid før kulturen når den stationære fase, feed-diske skal tilføjes som det er beskrevet i protokollen. Tilføjelsen af feed-diske før iltkoncentrationen når nul er vigtigt for de undertrykte protein udtryk at forhindre celler fra ilt begrænsning. Lavere glycerol koncentrationer reducere effekten af kortsigtede ilt begrænsninger, som det kan ses i figur 1B og derfor anbefales til de undertrykte protein udtryk.
I følgende, resultaterne af to forskellige dyrkning eksperimenter – ansættelse af de beskrevne protokol og det overvågningssystem, der er vist i figur 1 – er beskrevet. I det første eksperiment, en P. pastoris stamme producerer glucose stavbakterier fra Aspergillus niger (A. niger) under kontrol af PDC og i andet en P. pastoris stamme producerer det menneskelige væksthormon under kontrol af PDF er vist.
I dette eksperiment, blev glucose stavbakterier produktionen under kontrol af PDC undersøgt. Derfor forskellige dyrkning strategier blev sammenlignet: glycerol pulserende, konstant glycerol feed ved tilsætning af feed diske og dyrkning uden nogen feed eller pulserende. Dyrkningen blev gjort i 50 mL "buffered" minimal medier med 0,5% glukose som eneste carbon kilde i 250 mL ryste kolber (tabel 1).
160 h dyrkning, de højeste biomasse koncentrationer blev indhentet, da en fodring strategi ved hjælp af et glukose parti for produktion af biomasse (38 h) og glycerol pulserende (0,25% w/v glycerol efter 38 h, 61 h og 86 h dyrkning) var ansat (0.21 g/L total sekretoriske protein, 8.4 U/mL). Selv om en 2-fold reduktion af biomasse koncentrationen og den samlede mængde udskilles protein blev opnået, når de feed diske blev tilføjet efter 38 h glukose batch, var volumetriske aktiviteten endnu 1 U/mL højere i forhold til dyrkning ved hjælp af glycerol pulserende . Dette angiver, at en betydelig mængde af udskilles protein ikke bidrager til den volumetriske aktivitet i supernatanten og kan udskilles i inaktiv form. Derfor, højere glycerol koncentrationer fra glycerol pulser tilsyneladende favorisere dannelsen af biomasse i stedet for målet protein produktion og konstant lav glycerol frigivelse førte til mere end to gange højere specifik produktivitet.
Et andet eksperiment beskæftiger metoden de undertrykte udtryk blev gjort ved at udtrykke den menneskelige væksthormon (hGH) under kontrol af PDF. Konstruktionen var stabilt integreret i genomet i P. pastoris stamme BSYBG11. Her, 50 mL af BYPG, buffered rig medium, i 250 mL forbløffet ryste kolber blev brugt med 0,3% (w/v) glycerol som carbon kilde i partiet. På glycerol udtynding, blev protein udtryk med konstant glycerol feed sikret ved tilsætning af 4 feed diske pr. flaske og i forhold til ingen glycerol feed (figur 2).
Figur 2 viser en sammenligning mellem hGH udtryk og biomasse udvikling af samme stamme dyrket med og uden konstant glycerol feed. Som analysen sandwich ELISA blev brugt med den sekundære antistof smeltet til HRP og detektion blev udført med 3,3′, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) som substrat. Især for dette protein, det syntes at være tilfældet, uden nogen fodring, cellerne begynde at forringe den producerede protein efter ca 30 h (lys blå firkanter), ved at fodre, denne nedbrydning kan faa forhindret (mørk blå trekanter) og selv den proteinkoncentration pr. biomasse stadig steg efter 150 h dyrkning. Som allerede bemærket for Hansenula polymorpha14viser dette resultat, hvordan skifter fra parti, ligesom det er normalt bruges i ryste kolben skala, fed-batch-mode kan optimere P. pastoris udlæg til planteavl.
Figur 1: visualisering af online indspillet parametre under to udlæg til planteavl med forskellige glycerol koncentrationer i batchen. Udlæg til planteavl blev startet med 0,5% w/v (A) og 0,3% w/v (B) glycerol i partiet efterfulgt af nedtrapning undertrykkelse fase hvor cellerne blev fodret ved at anvende 4 feed diske pr. kolbe (frigivelse sats på 0,5 mg/h/disc ifølge producenten). De stiplede linjer Vis iltkoncentrationen i medium, hvorimod de løbende linjer viser cellen densitet (OD600). Fejllinjer Vis standardafvigelsen af seks replikater (2 biologiske, tre tekniske hver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sammenligning af humant væksthormon (hGH) udtryk i batch og fed-batch mode. hGH indhold er indiceret ved absorption værdier ved 405 nm ved en ELISA hvor 2nd antistof var en HRP fusion og TMB blev brugt som substrat for registrering. Vist er resultaterne for to forskellige kulturer: lys blå linje og firkanter display celle tæthed og hGH koncentration normaliseret af celle tætheder af en kultur uden enhver feed efter parti, i forhold til en kultur, hvor glycerol feed diske var anvendt (mørk blå linjer og trekanter). Fejllinjer Vis standardafvigelsen af seks replikater (2 biologiske, tre tekniske hver). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| PDC- GOX på 160 h dyrkning tid | OD600 | Vol. aktivitet [U/mL] | samlede mængde udskilles protein [mg/mL] | volumetriske aktivitet pr. celle tæthed | |||
| Middelværdi | SD | Middelværdi | SD | Middelværdi | SD | Middelværdi | |
| BMD1% batch + glycerol pulserende | 74,6 | 2 | 8.4 | 2.4 | 0,21 | 0,01 | 0,11 |
| BMD1% batch + konstant glycerol feed | 32,5 | 0,3 | 9.4 | 0,7 | 0,09 | 0,01 | 0,29 |
| BMD1% batch | 18,8 | 0,6 | 3.7 | 0,7 | 0,01 | 0 | 0,2 |
Tabel 1: resultater af methanol uafhængige GOX udtryk under for de undertrykte kontrol PDC .
Discussion
Denne metode giver en pålidelig protokol for effektiv methanol uafhængige inducerbar udtryk af P. pastoris som et alternativ til klassiske methanol induceret protein udtryk drevet af PAOX112. De repressible initiativtagere, som PDC, PDF eller tidligere beskrevet muterede PAOX1 varianter17, bygge det molekylære grundlag for denne nye protein produktionskoncept. Vist repræsentative resultaterne understreger nytten og gennemførligheden af rekombinante protein udtryk i P. pastoris af de undertrykte initiativtagere og små screening med enkle online overvågning. På den ene side kan de skadelige og giftige methanol, der normalt anvendes til induktion AOX1 -promotoren fjernes fra dyrkning. På den anden side vækst og protein produktionsfase er frakoblet9 i modsætning til konstituerende protein udtryk, fx., med den almindeligt anvendte Phul. Dette er især gavnligt, når cellerne bør udtrykke toksiske eller skadelige proteiner, der viser en byrde for dem.
Mulighed for at starte udlæg til planteavl med forskellige kulstof kilde koncentrationer giver mulighed for afgørelse af, hvor meget biomasse, man gerne vil vinde før protein produktionsfasen starter. Når du vælger en lavere kulstof kilde koncentration i partiet, kan ilt overførsel begrænsninger på grund af for høj celle tætheder reduceres, mens til gengæld højere celle tætheder kan også resultere i højere protein titers. Ved at overvåge kultur udvikling i form af biomasse generation og ilt koncentrationer, kan det optimale tidspunkt for fed-batch indledningen bestemmes let som det er vist i figur 1.
Online overvågning af disse parametre, dyrkning, bør en passende målesystem anvendes. Biomassen måleapparat (fxSFR Vario) er en simpel og økonomisk online målesystem til overvågning af kultur ryste kolber. Optoelektroniske læser bestemmer cellevækst i kolben via spredte lys påvisning og læser signal af lambda-sonden integreret i kolben. Optikken for biomasse måling består af en LED, der udsender et lyssignal, som er spredt af partikler (celler) i kultur bouillon og registreret med en fotodiode. De optiske sensorer udsender fluorescens når ophidset med lys af en bestemt bølgelængde. Afhængigt af mængden af analysand molekyler nuværende ændres fluorescens signalet, som er opdaget af læseren optik og oversat til koncentrationsværdier. Imidlertid har en celle tæthed måling kalibrering skal fastsættes på forhånd, da målesystemet ikke er måle faktiske OD600 værdier. Ilt optagelse sats kan beregnes ud fra hældningen af ilt kurve med skærmlæser-software, og temperatur samt rpm registreres løbende sammen med de andre parametre. Hvis du vil aktivere overvågning med dette system, har ryste kolberne tidligere udstyret med passende sensorer for de ønskede parametre.
Ved tilsætning af fire langsom frigivelse polymer diske at levere en konstant mængde af glycerol til kultur bouillon, biomasse ophobning er næsten stoppet og rekombinante protein produktion er fortsat. Bestemmelse af foder disc tilføjelse tidspunkt er ikke et kritisk skridt i dette eksperiment, men det bør overvejes, at en tidlig feed start før den eksponentielle vækstfase kunne hæmme aktiveringen af initiativtageren, som udtrykket starter ved Carbon kilde udtynding. Derudover kan alt fodringstid på grund af polymer kapacitetsbegrænsninger reduceres, mens at udsætte feed efter cellerne har nået den stationære fase kan føre til sultende og forringelse af allerede produceret protein. Mængden af foder-diske bruges i denne protokol var bestemmes eksperimentelt for optimal carbon source frigivelse til at holde selskabet de undertrykt mens du holder biomasse generation lav (data ikke vist). På denne måde, at udlæg til planteavl kan udføres nemt over 160-180 h uden indgriben.
Vigtigste ansøgninger af denne nye protokol bliver udtryk klon screening, enzym evolution og opdagelsen, karakterisering og engineering af nye promotorer beskæftiger en methanol-fri dyrkning protokol i godt overvåget betingelser. I princippet bør samme protokol gælde for blandet foder strategier ansættelse af methanol og begrænset Fermentativ carbon kilde feeds som beskrevet af Panula-Perälä mfl. i 201418.
Disclosures
Selvom præsenteres protokollen er generelt gældende for dyrkning og induktion derepressed betingelser, erklærer bisy e.U. for at have interesse i kommercialisering af nye derepressed initiativtagerne anvendes i denne undersøgelse.
Acknowledgments
ROBOX har modtaget støtte fra den Europæiske Union (EU) projekt ROBOX (grant aftale n ° 635734) under EUs Horisont 2020-programmet forskning og Innovation handlinger H2020-LEIT BIO-2014-1. De synspunkter og udtalelser heri er kun dem, for hvem der har udarbejdet, og nødvendigvis afspejler ikke de af EU 's forskningsagentur. Den Europæiske Union er ikke ansvarlig for enhver anvendelse, der kan være lavet af oplysningerne heri.
Ph.d.-afhandling af J. Fischer er samfinansieret af et tilskud til "Industrienahe afhandling" af det østrigske finansiering agenturet FFG.
Vi takker Gernot John (PreSens GmbH) for nyttige diskussioner og værdifulde input til udkastet til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
| Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
| BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
| BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
| Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
| Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
| Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
| Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
| Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
| Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
| SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |
References
- Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).
- Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
- Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
- Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
- Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
- Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
- Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
- Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , Acta University Oulu C 480 (2014).
- Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
- Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
- Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).
