Summary
이 방법을 처음으로 Pichia pastoris (Komagataella phaffii), 탄소 규제 소스 발기인 P 고용에 효율적인 유도할 수 있는 메탄올 무료 재조합 단백질 생산에 대 한 신뢰할 수 있는 실험 절차를 설명 합니다. DC및 PDF 재배 하면서 작은 규모의 실험에서 매개 변수를 모니터링할 수 있습니다 온라인, 그리고 지속적인 글리세롤 피드 적용 됩니다.
Abstract
메탄올은 기초가 튼튼한 탄소 소스와 마이크로-, 실험실 및 산업 규모 호스트로 Pichia pastoris (P. pastoris)를 채용 하는 효율적인 단백질 생산을 위한 유도. 그러나, 독성 및 가연성, P. pastoris의 높은 생산성을 유지 하면서 메탄올을 피하기 위해 욕망이 이다. 소규모 생물 경작 (0.5-5 L 작업 볼륨) 미 재배 깊은 잘 격판덮개에서 단단하게 통제 될 수 있다 또는 비싼 장비에 의존 이후 긴장 및 단백질 생산 특성을 평가 하는 통용. 또한, 재배와 P. pastoris 의 유도 대 한 전통적인 프로토콜 설치 되었다 제정 또는 메탄올이 식을 유도 하 고 지금까지, 아니 신뢰할 수 있는 프로토콜 화면 P. pastoris 식 설명 했다 (제어 및 모니터링) 병렬 경작 derepressible 발기인 변종. 특성화 고 새로운 단백질 생산 종자 비교 같은 초기 경작을 간소화 하기 위해 우리 메탄올 공급 일정 느린 글리세롤을 포함 한 생물 조건 시뮬레이션 표현의 자유에 대 한 간단한 동요 플라스 크 배양 시스템 설립 그리고 주로 적용된 소규모 배치 경작에 비해 bioreactors에서 실제 조건에 가까이 오고 온라인 모니터링, 그로 인하여. 재조합 형 단백질 표정 P. pastoris 에 탄소 소스를 PDC 및 PDF 적용 된 발기인을 억 눌렀다. 폴리머 디스크 포함 된 탄소 소스, 글리세롤, 발기인 바이오 매스 세대를 낮은 유지 하는 동안 활성 유지 하기 위한 필요한 에너지를 제공 하는 피드 속도 보장의 일정 금액을 공개 합니다.
Introduction
수율과 세균 이나 효 모 등 미생물에 의해 재조합 단백질 생산을 위한 대규모에 안정적인 재배 조건에 개선 주요 중 하나입니다 오늘날의 생명 공학1 과 산업의 상업적인 성공의 요구 응용 프로그램입니다. Dueto 간단한 재배 절차와 미디어, 높은 수율과 잘 특징이 도구2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii)은 재조합 단백질 생산을 위한 널리 이용 되 비 전통적인 효 모. 추가 혁신적인 도구는 끊임없이 새로운 식 벡터는 널리 사용 되는 PAOX1, 알콜 산화 효소 1 유전자3, 의 발기인 지구에 대 안으로 새로운 발기인을 포함 한 같은이 종족에 대 한 개발 4,5. 500 bp 긴 DNA 시퀀스 상류 CAT1 (CTA1) 유전자의 P. pastoris새로운 메탄올 자유롭고 다양 한 식 전략을 가능 하 게 발기인 지역으로 확인 되었습니다. CAT1 유전자 P. pastoris 의 유일한 catalase 유전자 이며 단백질은 peroxisomes에 위치 하 고 있습니다. catalase는 발생, 예를 들어반응성 산소 종 해독에 중요 한 역할., peroxisomal MUT 통로에 또는 지방산6,7의 베타 산화 동안 메탄올 산화에서. CAT1 유전자의 표현에 포도 당 또는 글리세롤 재배 매체에서의 prescence 억압 이며 이러한 탄소 소스8의 고갈에 따라 derepressed. 또한, 카 탈 라 제 유전자의 표현 메탄올과 올레산, 겉보기에 비슷한 식 수준으로 도달 하는 올레산으로 유도 될 수 있다 P. pastoris MUT 통로의 유일한 유전자 인와 또한 remarkebly와 유도 될 수 있다 메탄올 유도9.
즉 PDC (때때로 또한 약식된 PCAT1-500),이 P. pastoris CAT1 발기인의 500 bp 조각 이미 침 표현 하 고 분 비 단백질의 생산에 대 한 테스트 되었습니다 그리고 그것은 한 매력적인 대안 클래식 2 P. pastoris 발기인-강한 제정 P갭 과 메탄올 유도할 수 있는 PAOX1, 20 여 년 전에 개발 된. PDC 21% (CalB) 및 설탕 부유한 매체에서 P간격 에 비해 체적 활동의 35% (HRP)를 도달할 수 있었다. 메탄올 유도 시 PDC 만 PAOX1, 보다 빠르게 응답 하지 않았습니다 하지만 CalB9의 2.8 배 높은 최종 titer에 의해 또한 명확 하 게 그것을 능가할 수 있습니다.
PDC외 orthologous 발기인 (PDF) 했다 발견 되었습니다 비슷한 규칙 프로필 전시. 그러나, 그것은 상당히 강한 PDC 에서 derepressed로 메탄올 유도 아래 조건 (준비에서 원고)3.
강한 제정 P간격 순수 문제가 또는 세포 독성 단백질10,11때문에 실패 하는 경우에 PDC 와 PDF 는 이상적인 대안을 나타냅니다. 마이크로 규모 실험에서 이러한 발기인에 의해 구동 하는 식의 초기 탄소 소스 고갈 후 시작 (예., 포도 당 또는 글리세롤), 바이오 매스 생산을 용이 하 게 셀의 overexpression 부담 없이 처음부터 바로 재조합 단백질입니다. 이 발기인의 둘 다 여전히 메탄올으로 유도할 수 있는 동안, derepression에 의해 활성화 게 P를 채용 하는 식에 비해 preinduction 위상의 추가 사용AOX1. 또한, PDC 및 PDF 큰 산업 프로세스12에 대 한 바람직한 목표 이다 메탄올 무료 단백질 생산을 위해 사용할 수 있습니다.
해당 생산 긴장과 식 구조 개발, 개발의 여러 단계 확장에 대 한 선호 후보에 transformants의 많은 수에서 범위를 좁혀 하려면 전달 해야 합니다. 보통 검 진 다 잘 판에 높은 처리량에서 수행 (마이크로 규모: 0.5 mL 미만) 가능한 한 크게 클론의 범위를 캡처하기 위해. 이후 다시 검사 하 고 re-re-screening는 쉐이크 플라스 크 뒤 다음 단계 (작은 규모: 50-250 mL) (마이크로-) 생물 검사12. 그러나, 그것은 가장 잘 제어에 메탄올-무료 생산의 나중 스케일 업까지 동요 플라스 크에 몇 밀리 리터까지 깊은 잘 격판덮개에 microlitres의 수백에서 다른 비늘 사이 비슷한 방법을 바람직한 생물 반응 기입니다. 몇 가지 제한, 일정 한 먹이, 폭 기 및 온라인 모니터링13 성장 등 대규모 단백질 생산에 대 한 관련성이 높은 있다 쉐이크 플라스 크로 작은 bioreactors 이미 비슷한 볼륨을 제공할 수 있습니다, 그리고 산소 공급입니다. 쉐이크 플라스 크를 적응 광학 감시 고용 하 고 여전히 같은 주요 문화 매개 변수에 대 한 지속적인 온라인 정보를 제공 하는 동안 병렬 재배에 대 한 보다 정교한 장비에 대 한 비용 효율적인 대안을 제공 하는 진동 장치 바이오 매스 및 용 존된 산소 농도입니다. 폴리머 사업자에서 탄소 소스의 느린 방출 이전에 적용 된 간단한 전체 보다 bioreactors의 더 유사한 조건을 시뮬레이션 장치와 복잡 한 기술 솔루션에 의존 하지 않고 일정 및 제어 피드를 확보에 적용할 수 있습니다. 탄소 소스9,10, 고갈 지속적인 단백질 식 에너지 된다 제한 하 고 있다.
다음 방법에 설명 합니다 작은 중간 규모 메탄올-무료 제어 단백질 표정 P. pastoris 에서 시스템에 따라 새로운 발기인 PDC 및 PDf. Derepression에 의해 유도 두 단계를 포함 한다. 탄소 소스 명과 발기인 및 대상 단백질 생산의 두 번째 단계는 탄소 소스 작지만 일정 농도에서 제공 됩니다를 사용 하 여 관심사의 단백질의 생산 없이 바이오 매스 축적의 첫번째 짧은 단계 derepressed 발기인을 유지. 가장 중요 한 경작 매개 변수의 온라인 모니터링 전체 재배 기간 동안 적용 됩니다. 목표는 P. pastoris위한 메탄올 무료, 안정적이 고 확장 가능한 재배 시스템을 제공 했다.
Protocol
1. 미디어 준비
- 버퍼링 된 최소한의 미디어 (글리세롤과 BMG, 탄소 소스로 포도 당과 BMD) 준비 (1 L)
- 증류수 1 L 나사 뚜껑 유리병에 650 mL 압력솥. 후 냉각, YNB (아미노산 / 134 g/L 효 질소 기초), 칼륨 인산 염 버퍼 (1 M, pH 6) 200 mL, 10 %w / v 포도 당 또는 글리세롤 (에 따라 원하는 생성 된 바이오 매스 금액의 30-100 mL x 압력가 10 100 mL를 추가 하 여 매체 완료 일괄 처리), 동안 살 균 500 Biotin (10mg/mL) 솔루션 및 채우기와 멸 균 1 L x 2 mL 증류수.
참고: 모든 재료 별도 플라스 크에 압력가 마로 소독 될 필요가 있다. Biotin 압력가 때 파괴 되 고 따라서 0.2 µ m 멤브레인 필터와 살 균 필터를 수 있다.
- 증류수 1 L 나사 뚜껑 유리병에 650 mL 압력솥. 후 냉각, YNB (아미노산 / 134 g/L 효 질소 기초), 칼륨 인산 염 버퍼 (1 M, pH 6) 200 mL, 10 %w / v 포도 당 또는 글리세롤 (에 따라 원하는 생성 된 바이오 매스 금액의 30-100 mL x 압력가 10 100 mL를 추가 하 여 매체 완료 일괄 처리), 동안 살 균 500 Biotin (10mg/mL) 솔루션 및 채우기와 멸 균 1 L x 2 mL 증류수.
- 버퍼링 된 리치 미디어 (BYPG) (1 L)
- 오토 클레이 브와 1 %w / v 효 모 추출 물 및 2 %w / v 펩 1 L 마 개 병에 증류수의 700 mL. 냉각, 후 별도로 압력가 10 %w / v 글리세롤, 칼륨 인산 염 버퍼 (1 M, pH 6) 200 mL의 30 ~ 100 mL를 추가 하 고 멸 균 증류수 1 L를 채우십시오.
2. 동요 플라스 크 준비
- 당황 하 게 250 mL에 증류수 5 mL을 추가 플라스 크를 흔들어, 면 옷의 2 개의 층으로 커버와 고무 밴드와 함께 장소에 그것을 해결. 알루미늄 호 일의 조각 천으로 커버.
- 압력솥 완전 살 균에 대 일 분 동안 121 ° C에서 플라스 크.
- 각 플라스 크에 잔여 물 플라스 크 및 이전 준비 미디어의 aliquot 50 mL에서 제거 합니다.
3. 야간 문화 접종
- 뚜껑 약간 적당 한 통 기 통풍 수 있도록 열어두고 동안 50 mL 원심 분리기 튜브에서 YPD (1 %w / v 효 모 추출 물, 2 %w / v 펩, 포도 당 2 %w / v)의 5 mL에서 원하는 식 스트레인의 단일 신선한 식민지와 야간 문화 (ONC)를 시작 합니다.
- 28 ° C, 100-130 rpm (떨고 직경 2.5 c m) 통에 80% 습도에서 밤 동안 성장 하자.
4. 측정 설치 및 주요 문화 재배
- 온라인 모니터링 시스템을 설정 하기 위한 적절 한 교정 장치에 대 한 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 모니터링을 위한 적절 한 소프트웨어 측정 스테이션에 블루투스 연결에 대 한 범위에 설치 된 컴퓨터에 놓습니다. 블루투스를 통해 장치를 연결 하는 소프트웨어를 시작 합니다.
- 바이오 매스 측정 장치에 블루투스 연결 전면에 은색 버튼을 눌러 켭니다.
- 소프트웨어에서 장치 다음 찾을 장치를 클릭 합니다.
참고: 장치 윈도우 작업 줄 아래에 목록으로 나타납니다. 그들이 경우에, 그것은 배터리 충전 컴퓨터 블루투스 연결에 대 한 도달 시간입니다 있는지 확인 하는 것이 좋습니다. - 끌어서 화면 측정 용지함의 오른쪽에 사각형을 발견된 장치를 놓습니다.
- 연결을 클릭 합니다.
참고: 연결 된 컨트롤 화면이 나타납니다. - 블루투스 연결에 대 한 실행 하는 테스트를 시작 하려면 측정을 클릭 합니다.
- 실험을 설정 합니다.
- 시작 측정, 실험의 이름을 클릭 하 고 모니터링 하는 데 필요한 모든 매개 변수를 사용.
참고: 라이센스 가능한 측정된 매개 변수 각각의 대 한 필요 합니다. - -3 분 간격 을 설정 합니다.
참고: 간격 결정 얼마나 자주 측정 포인트 고 모든 측정 지점 이후에 값을 반환. 매 순간을 측정 하는 것은 매우 정확 하 게, 하지만 데이터를 많이 평가 하 더 힘 드는 게 생성 됩니다. - 11 평균 측정 포인트 를 설정 합니다.
참고:이 설정은 얼마나 많은 측정 포인트는 실제로 모든 3 분 촬영 결정 합니다. 따라서, 출력 11 측정 포인트 이상 11의 평균 값은 s. - 샘플에 대 한 이름을 입력 합니다.
- 각도 이미 (단계 4.1) 전에 보정으로 다음 화면을 건너뜁니다.
참고: 테스트 주요 문화를 접종 하기 전에 블루투스 연결에 대 한 실행 안정적인 연결 및 연결 된 컴퓨터의 적절 한 위치를 위해 조언 된다. 또한, 배터리 충전 될 필요가 있다.
- 시작 측정, 실험의 이름을 클릭 하 고 모니터링 하는 데 필요한 모든 매개 변수를 사용.
- 600 nm 파장에서 분 광 광도 계에 재배 미디어 (1:20)에 희석 ONC (3.1 단계)의 셀 밀도 측정 합니다. 매체의 50 mL를 접종 (권장 탄소 소스 농도 0.3-1%, 1 단계에에서 설명 된 대로 다른 미디어 가능.) 다음 계산을 사용 하 여 0.05의 OD600 ONC와.
- 감지기에는 플라스 크를 놓고 28 ° C, 130 rpm 및 80% 습도에 흔들.
참고: 플라스 크의 밑바닥에 집착 하 고 잘못 된 값을 응답 하지 셀을 피하기 위해 측정을 시작 하기 전에 문화 떨고 5 분에 게 매우 중요 하다. - 소프트웨어에서 측정 시작 을 클릭 합니다.
- 받아 0.2 mL 샘플 셀 밀도 측정 4 h는 접종 후 고 탄소 소스 면 고갈 (결정 단계 4.7에서에서 설명)에서 triplicates. 재배 미디어 (첫 번째 측정 1:5, 두 번째 측정 1시 20분)에 적절 하 게 샘플을 희석 하 고는 분 광 광도 계에서 600 nm 파장에서 흡수를 측정 한다. 플라스 크를 제거 하기 전에, 심지어는 셰이 커를 중지 하기 전에 항상 소프트웨어에서 측정을 일시 중지 합니다.
참고: 감지기 정의 떨고 조건 매개 변수를 기록에 대 한 보정 및 아직도 문화를 기록할 때 말도 측정을 떨어뜨립니다. 또한, 항상 떨고 다시 측정을 시작 하기 전에 5 분 대기 해야 합니다. 셀 밀도 측정 검출기는 바이오 매스와 진짜 셀 밀도 대 한 그냥 값을 제공 하기 때문에 필수적입니다. OD600 값 보정 기능 (x 값)과 온라인 측정 시스템 (y 값)에 의해 얻은 값 spectrophotometrically 여러 timepoints를 측정 하 여 달성 될 수 있다. 값은 선형이 아니라 다음 보정 기능에 따라 로그 관계에.
y: 분 광 광도 계에 의해 가져온 OD600 값
x: 온라인 측정 시스템에 의해 얻은 값
k: 슬로프
d: 축 절편
기울기와 축 절편 다음 해당 OD600 값으로 값을 변환에 사용할 수 있습니다. Excel에서 같은 timepoint에서 온라인 시스템에서 값에 대해 spectrophotometrically 취득된 세600 값을 플롯할 수 하나. 로그 추세선 및 해당 방정식의 추가 보정 기능 위에 표시 된 줄 것 이다. - 탄소 소스 거의 고갈된 (약 12-20 h) 될 때까지 육성. 그 목적에 대 한 산소 농도 0 접근을 셀 지 수 성장 단계에 있는 소프트웨어 다이어그램에서 볼 수 있습니다 때까지 성장 하는 문화를 보자.
참고: 이것은이 프로토콜에서 사용 하는 탄소 소스 농도 대 한 경우입니다. 같이 그것은 exemplarily 대표적인 결과 섹션에서 그림 1 때 산소 수준 0에 접근 하 고 셀 지 수 성장에는 탄소 소스 고갈의 timepoint 온라인 모니터링 시스템으로 결정 될 수 있다 단계입니다.
5. 단백질 식 드 억압
- Timepoint 단계 4.6에서 설명에 도달 하면 먹이 문화는 무 균 조건 하에서 플라스 크 당 4 개의 피드 디스크의 추가 의해 시작 합니다.
참고: 설명 된 조건에서 4 개의 글리세롤 피드 디스크 출시 2mg/h 글리세롤 제조 업체에 따라. - 샘플 선택의 분석 결과 의해 단백질 표정 모니터링을 24 시간 마다 복용 하는 동안 60-90 h에 대 한 재배를 계속 (예., Bradford 분석 결과15, SDS 페이지16 또는 활동 분석 실험) 및 밀도 측정 셀.
6. 문화 수확
- 후 재배의 60-90 h 50 mL 4000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확을 위한 원심 분리기 튜브에 문화를 작성.
참고: (분 비 단백질)에 대 한 상쾌한 또는 (세포내 단백질 식)에 대 한 셀 4000 x g, 10 분 동안 4 ° C에서 원심 분리에 의해 수확 수 있습니다 및 추가 분석을 수행할 수 있습니다. - 추가 분석을 위해 소프트웨어에서 스프레드시트 파일로 온라인 측정 데이터를 내보냅니다.
- 모든 플라스 크와 나머지 셀 비활성화를 압력솥에 증류수의 5-10 mL을 입력 합니다.
Representative Results
프로토콜 섹션에 설명 된 대로 소프트웨어 전체 재배에 중요 한 재배 매개 변수를 기록 합니다. 그림 1 에서는 바이오 매스 개발과 재배 0.5% (그림 1A) 또는 0.3% (그림 1B) 탄소 소스 디스크를 피드 하는 글리세롤의 추가 의해 다음 일괄 처리에서 시작 하는 동안 산소 농도의 시각화. 온라인 모니터링 시스템은 후 일괄 처리를 정확 하 게 결정 될 수 있다 탄소 소스 고갈의 timepoint로 드 억압 된 경작에 대 한 특히 유용 합니다. 그림 1에서 볼 수 있는, 매체에서 산소 농도 급격히 감소 하 고 0, 특히 0.5% 글리세롤 (그림 1A)는 바이오 매스를이 시점에서 기 하 급수적으로 증가 하는 동안 일괄 처리에 대 한 접근. 여기, 셀 지 수 성장 단계에 있고 문화 고정 단계에 도달 하기 전에 곧 탄소 소스 자료의 최적의 사용을 위해서는 피드 디스크 추가 해야 프로토콜에 설명된대로. 산소 농도가 0에 도달 하기 전에 피드 디스크의 추가 드 억압 된 단백질 식 산소 한계에서 세포를 방지 하기 위해 중요 하다. 그림 1B 에서 보일 수 있다 하 고 따라서 드 억압 된 단백질 표정에 대 한 것이 좋습니다 낮은 글리세롤 농도 단기 산소 제한의 효과 줄일.
에 다음과 같은 두 개의 다른 재배 실험-설명된 프로토콜 및 그림 1에 표시 된 모니터링 시스템 채용-설명의 결과. 첫 번째 실험, 인간 성장 호르몬을 생산 하는 P. pastoris 스트레인 PDC 의 두 번째에서 컨트롤에서 Aspergillus 니제르 (A. 니제르)에서 포도 당 산화 효소를 생산 하는 P. pastoris 스트레인에서 PDF 의 통제 표시 됩니다.
이 실험에서 PDC 의 통제 포도 당 산화 효소 생산 조사 했다. 따라서, 다른 재배 전략 비교 했다: 글리세롤 펄스, 피드 피드 디스크와 어떤 피드 또는 pulsing 없이 재배의 추가 의해 일정 글리세롤. 재배는 0.5% 포도 당 50ml 버퍼링 된 최소한의 미디어 250 mL 쉐이크 플라스 크 (표 1)에서 유일한 탄소 원으로 이루어졌다.
160 h 재배 시 농도가 높은 바이오 매스 획득 했다, 바이오 매스 생산 (38 h)와 글리세롤 펄스 (38 h 61 h, 86 h 재배 후 0.25 %w / v 글리세롤) 포도 당 일괄 처리를 사용 하 여 먹이 전략 때 고용 (0.21 g/L 총 분 비 단백질, 8.4 U/mL)입니다. 바이오 매스 농도 분 비 단백질의 총 금액의 2-fold 감소, 38 h 포도 당 배치 후 피드 디스크 추가 했을 때 확인, 체적 활동은 더 1 U/mL 높은 글리세롤 펄스를 사용 하 여 재배에 비해 . 이 상당한 양의 분 비 단백질은 상쾌한에 체적 활동에 기여 하지 않습니다 하 고 비활성 형태로 분 비 수 있습니다 나타냅니다. 따라서, 높은 글리세롤 농도 글리세롤 펄스에서 겉보기 대상 단백질 생산과 지속적인 낮은 글리세롤 릴리스 2 배 이상 높은 특정 생산성에 대신 바이오 매스의 형성을 부탁.
-억압 된 표현 기법을 사용 하는 또 다른 실험의 PDF통제 인간 성장 호르몬 (hGH)을 표현 하 여 이루어졌다. 구문이 안정적 P. pastoris 스트레인 BSYBG11의 게놈으로 통합 이었다. 여기, BYPG, 50 mL 버퍼링 풍부한 매체, 250 mL에 당황 하 고 쉐이크 플라스 크는 일괄 처리에서 탄소 소스로 0.3% (w/v) 글리세롤과 사용 되었다. 글리세롤 고갈 시 피드 일정 글리세롤과 단백질 표정 플라스 크 디스크 이송 및 아무 글리세롤 피드 (그림 2)에 비해 4의 추가 의해 보장 되었다.
그림 2 재배와 지속적인 글리세롤 피드 없이 같은 긴장의 바이오 매스 개발과 hGH 식의 비교를 보여준다. 분석 결과 샌드위치 ELISA는 HRP를 융합 하는 이차 항 체와 함께 사용 하 고 탐지 ′ 3, 3, 5, 5 '-tetramethylbenzidine (TMB) 기질으로와 함께 실시 되었다. 특히이 단백질에 대 한 그것은 경우는 어떤 먹이 없이 셀을 시작 후 약 30 h (밝은 파란색 사각형), 생산된 단백질을 저하 먹이 의해,이 저하 될 수 있는 반면 (어두운 파란색 삼각형) 막을 것 같았다 고 심지어는 바이오 매스 당 단백질 농도 아직 재배의 150 h 후 증가. 이미 Hansenula polymorpha14에 대 한 관찰,이 결과 like 그것 일반적으로 쉐이크 플라스 크 규모, 먹이-일괄 처리 모드로 사용 되는 일괄 처리에서 전환 P. pastoris 경작을 최적화할 수 있습니다 방법을 보여 줍니다.
그림 1: 온라인 시각화 기록 매개 변수는 일괄 처리에서 다른 글리세롤 농도가 두 경작 중. 0.5 %w / v (A)와 셀 플라스 크 당 4 피드 디스크를 적용 하 여 루 했다 드 억압 단계 다음 일괄 처리에서 0.3 %w / v (B) 글리세롤은 경작 시작 했다 (0.5 m g/h의 속도 출시/제조 업체에 따라 디스크). 파선 연속 라인 셀 밀도 (OD600) 반면, 매체에 산소 농도를 보여줍니다. 오차 막대는 6의 표준 편차 (2 생물학, 3 기술 각) 복제 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 일괄 처리 및 먹이 배치 모드에서 인간 성장 호르몬 (hGH) 식의 비교. hGH 콘텐츠 405에서 흡수 최대값으로 표시 2차 항 체는 HRP 퓨전와 TMB는 검색에 사용 되는 기판으로는 ELISA에 의해 nm. 두 개의 서로 다른 문화에 대 한 결과 표시: 라이트 블루 라인과 사각형 표시 셀 밀도 hGH 농도 글리세롤 디스크를 먹이 문화에 비해 일괄 처리 후 어떤 피드 문화의 셀 밀도 의해 정규화 (어두운 파란색 선과 삼각형) 적용. 오차 막대는 6의 표준 편차 (2 생물학, 3 기술 각) 복제 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| PDCGOX 160 h 재배 시 | OD600 | 제 활동 [U/mL] | 분 비 단백질 [mg/mL]의 총 금액 | 셀 밀도 당 체적 활동 | |||
| 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | SD | 평균 | |
| BMD1% 일괄 + 글리세롤 펄스 | 74.6 | 2 | 8.4 | 2.4 | 0.21 | 0.01 | 0.11 |
| BMD1% 일괄 + 상수 글리세롤 피드 | 32.5 | 0.3 | 9.4 | 0.7 | 0.09 | 0.01 | 0.29 |
| BMD1% 일괄 처리 | 18.8 | 0.6 | 3.7 | 0.7 | 0.01 | 0 | 0.2 |
표 1: 메탄올 독립적인 GOX 식 드 억압 된 발기인의 통제의 결과 PDC .
Discussion
이 방법은 효율적인 메탄올 독립적인 유도할 수 있는 식 P. pastoris 클래식 메탄올 유도 단백질 표정12 PAOX1의해 구동을 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다. PDC, PDF 또는 앞에서 설명한 돌연변이 PAOX1 변종17같은 드 repressible 발기인이 새로운 단백질 생산 개념에 대 한 분자 기초 구축. 표시 된 대표적인 결과 밑줄 유용 성과 여 드 억압 된 발기인 및 간단한 온라인 모니터링 소규모 상영 P. pastoris 에 재조합 형 단백질 표정의 실행할 수 있습니다. 한편으로, AOX1 발기인의 유도에 일반적으로 사용 되는 유해 하 고 독성 메탄올 재배에서 제거할 수 있습니다. 다른 한편으로, 성장과 단백질 생산 단계는 구성 단백질 식, 예를 들어달리 uncoupled9 ., 일반적으로 사용 되는 P간격. 이 때 특히 유용 세포 독성 또는 유해 단백질 그들에 대 한 부담을 표시 하는 표현 한다.
다른 탄소 소스 농도 경작을 시작을 시작 하는 하나의 단백질 생산 단계 전에 얻을 하 고 싶습니다 얼마나 많은 바이오 매스의 결정을 수 있습니다. 일괄 처리에서 낮은 탄소 소스 농도 선택할 때 다른 한편으로 더 높은 세포 밀도 높은 단백질 titers 발생할 수도 있습니다 동안 산소 전송 제한 때문에 너무 높은 세포 밀도 줄일 수 있습니다. 문화 개발 바이오 매스 생성 및 산소 농도 모니터링 하 여 먹이 배치 개시에 대 한 최적의 시간 포인트 확인할 수 있습니다 쉽게 그림 1에서 보듯이.
이러한 재배 매개 변수의 온라인 모니터링을 위한 적절 한 측정 시스템을 적용 한다. 측정 장치 (예를 들어, SFR Vario) 바이오 매스 간단 이며 문화 모니터링에 대 한 경제 온라인 측정 시스템 플라스 크를 흔들어. 광전자 리더 흩어져 빛 감지를 통해 플라스 크에 세포 성장을 결정 하 고 플라스 크에 통합 하는 산소 센서의 신호를 읽습니다. 바이오 매스 측정 광학 입자 (세포) 문화 국물에 의해 흩어져 커지고는 포토 다이오드로 빛 신호를 방출 하는 LED의 구성 됩니다. 광학 센서 형광으로 특정 파장의 빛을 방출 한다. 현재 실정이 분자의 양에 따라이 형광 신호 변경, 리더 광학에 의해 감지 고 농도 값으로 변환 합니다. 그러나, 셀 밀도 측정 교정 측정 시스템은 실제 세600 값을 측정 하지 이후 미리 설정할 수 있다. 산소 통풍 관 비율 리더 소프트웨어와 산소 곡선의 기울기 로부터 산출 될 수 있다 고 rpm 뿐만 아니라 온도 다른 매개 변수와 함께 지속적으로 기록 된다. 이 시스템으로 모니터링을 사용 하려면 쉐이크 플라스 크는 이전 원하는 매개 변수에 대 한 적절 한 센서 장착 해야 합니다.
4 느리게 출시 폴리머의 추가 의해 문화 국물에 글리세롤의 일정 금액을 제공 하는 디스크, 바이오 매스 축적 중지 거의 하 고 재조합 단백질 생산을 계속 했다. 피드 디스크 추가 시간 지점의 결정이이 실험에서 중요 한 단계 이지만 그 지 수 성장 단계 전에 조기 공급된 시작 수 수 억제 발기인 활성화 시 식을 시작으로 간주 한다 탄소 소스 고갈입니다. 또한, 폴리머 용량 제한으로 인해 시간을 먹이 총 셀 고정 단계에 도달 했습니다 후 피드 지연으로 이어질 수도 배 고 파 하 고 저하는 이미 단백질을 생산 하는 반면에, 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 피드 디스크의 금액은 발기인 드 바이오 매스 세대 낮은 (데이터 표시 되지 않음)을 누른 억압을 유지 하는 최적의 탄소 소스 릴리스에 대 한 실험적으로 결정 되었다. 이 방식으로 경작 수 개입 없이 쉽게 이상 160-180 h를 수행.
이 새로운 프로토콜의 주요 응용 프로그램 식 복제 검사, 효소 진화 및 발견, 특성화 및 잘 모니터링 상태에서 메탄올 무료 재배 프로토콜을 채용 하는 새로운 발기인의 공학에 될 것입니다. 원칙적으로, 동일한 프로토콜 메탄올 및 Panula Perälä 외에 의해와 같은 설명 하는 제한 일 탄소 소스 피드 피드 혼합 전략에 대 한 적용 해야 합니다. 201418.
Disclosures
제시 프로토콜은 일반적으로 재배 및 유도 derepressed 조건에 대 한 적용, 비록 bisy e. u.가이 연구에 사용 된 새로운 derepressed 발기인의 상용화에 관심을가지고 선언.
Acknowledgments
ROBOX는 작업 H2020 검색 바이오-2014-1 ROBOX (보조금 계약 n ° 635734) EU의 지평선 2020 프로그램 연구 및 혁신 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에서 자금을 받았다. 전망과 의견이 언급 된 저자의 들만 있으며 반드시 유럽 연합 연구 기관 들을 반영 하지 않습니다. 유럽 연합 수 있는 여기에 포함 된 정보의 사용에 대 한 책임을 지지 않습니다.
제이 피셔의 박사 학위 논문은 공동의 오스트리아 자금 FFG "Industrienahe 논문"에 대 한 교부 금에 의해 융자 된다.
우리는 유용한 토론 및 원고 초안에 대 한 귀중 한 입력에 대 한 Gernot 존 (PreSens GmbH) 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
| Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
| BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
| BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
| Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
| Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
| Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
| Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
| Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
| Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
| SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |
References
- Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).
- Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
- Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
- Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
- Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
- Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
- Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
- Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , Acta University Oulu C 480 (2014).
- Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
- Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
- Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).
