Summary
שיטה זו בפעם הראשונה מתאר אמין הליכים ניסיוני לייצור חלבון רקומביננטי ללא מתנול inducible יעיל Pichia pastoris (Komagataella phaffii), העסקת היזמים מקור מוסדר פחמן P DCו- PDF בניסויים בקנה מידה קטן תוך טיפוח פרמטרים ניתן לנטר באופן מקוון, והיא מיושמת הזנה מתמדת גליצרול.
Abstract
מתנול הוא מקור פחמן ומבוססת משרן לייצור חלבון יעיל העסקת Pichia pastoris (pastoris פ) כמחשב מארח בקנה מידה מיקרו - מעבדה, תעשייה. עם זאת, בשל שלה רעילות דליקות, יש רצון להימנע מתנול תוך שמירה על הפרודוקטיביות הגבוהה של pastoris פ. Cultivations ביוריאקטור בקנה מידה קטן (0.5-5 L עבודה נפח) משמשים בדרך כלל כדי להעריך את זן ומאפייניה ייצור חלבון מאז microscale בטיפוח צלחות עמוק טוב יכול להיות נשלט בקושי או מסתמך על ציוד יקר. יתר על כן, פרוטוקולים מסורתי אינדוקציה של pastoris פ וטיפוח הוקמו עבור אינדוקציה ביטוי או מתנול מכוננת, עד כה, שאין פרוטוקולים אמינים תוארו כביטוי המסך pastoris פ זנים עם היזמים derepressible ב cultivations מקבילים (מבוקרת, בפיקוח). כדי לפשט כזה cultivations הראשונית לאפיין ולהשוות בין זנים חדשים של ייצור חלבון, הקמנו מערכת טיפוח פשוט לנער את הבקבוק מתנול חופש הביטוי המדמה את התנאים ביוריאקטור כולל של גליצרול איטי מתמיד להאכיל ניטור מקוון, ובכך להגיע קרוב יותר אל תנאי אמיתי ריאקטורים בהשוואה לרוב בקנה מידה קטן יישומית אצווה cultivations לנהוג חלבון רקומביננטי ביטוי pastoris פ, מקור פחמן מודחקים היזמים PDC ו- PDF הוחלו. פולימר דיסקים עם מקור פחמן מוטבע, משחרר כמות קבועה של גליצרול, הבטיח תעריף הזנה אספקת האנרגיה הנחוצים לשמירה על היזמים פעיל תוך שמירה על הדור ביומסה נמוכה.
Introduction
שיפור התשואה ותנאי טיפוח אמינים בקנה מידה גדול לייצור חלבון רקומביננטי על-ידי מיקרואורגניזמים כגון חיידקים או שמרים הוא אחד המרכזיים הצרכים של ביוטכנולוגיה של היום1 , ההצלחה המסחרית של התעשייה יישומים. רבותי טיפוח פשוטה הליכים ומדיה, תפוקה גבוהה וכלים טוב מאופיין2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) הוא בשימוש נרחב שמרים לא קונבנציונלי לייצור חלבון רקומביננטי. כלים חדשניים נוספים כל הזמן מפותחים עבור המין הזה, כמו וקטורים ביטוי חדש כולל היזמים החדשים כמו חלופות שימוש נרחב PAOX1, האזור המקדם של אלכוהול אוקסידאז 1 ג'ין3, 4,5. 500 bp DNA רצף ארוך במעלה הזרם של הגן CAT1 (CTA1) זוהה כאזור יזם, אשר מאפשרת ביטוי ללא מתנול ופסיביות אסטרטגיה חדשה ב pastoris פ. הגן CAT1 הגן קטלאז היחיד של pastoris פ והוא החלבון ממוקם ב peroxisomes. קטלאז ממלא תפקיד חשוב דטוקסיפיקציה של מינים חמצן תגובתי, אשר חופרים, למשל., מפני התחמצנות מתנול מסלול MUT peroxisomal או במהלך חמצון בטא של חומצות שומן6,7. הביטוי של הגן CAT1 מודחקים ב prescence של גלוקוז או גליצרול במדיום טיפוח, derepressed על דלדול של אלה מקורות פחמן8. יתר על כן, הביטוי של הגן קטלאז יכולה להיגרם עם מתנול, remarkebly גם עם חומצה אולאית, לכאורה להיות הגן היחיד של מסלול pastoris פ MUT זה יכול להיגרם בחומצה אולאית אפילו לכת רמות ביטוי דומה כמו עם מתנול אינדוקציה9.
הרסיס bp 500 של מקדם פ pastoris CAT1 הזה, אשר נקרא PDC (לפעמים גם מקוצר PCAT1-500), כבר נבדקו לייצור של חלבונים intracellularly ביטוי, המופרש, הוא הוכיח חלופה אטרקטיבית אל השניים קלאסית pastoris פ היזמים – P מכוננתהפער חזקה, מתנול inducible PAOX1, אשר פותחה לפני יותר מ 20 שנה. ה-PDC היה מסוגל להגיע 21% (CalB) ו-35% (HRP) נפחי פעילות לעומת Pהפער סוכר עשיר בינוני. עם מתנול אינדוקציה, PDC רק הגיבו מהר יותר PAOX1, אבל אפשר גם ללא ספק להתעלות זה על-ידי קיפול 2.8 גבוה כייל הסופי של CalB9.
מלבד ה P-DC, יזם orthologous (PDF) זוהה מפגין פרופיל תקנה דומה. עם זאת, משמעותית יותר חזקה. ממה PDC מתחת derepressed, כמו גם תחת מתנול-induced תנאים (כתב יד בהכנה)3.
במקרים בו חזק את מכוננת Pהפער נכשל עקב חלבונים בעייתי מבחינה פיזיולוגית או ציטוטוקסיות10,11, PDC ו- P שלDF מייצגות חלופה אידיאלית. בניסויים סולם מיקרו, הביטוי מונע על ידי היזמים אלה מתחיל לאחר דלדול של מקור פחמן (למשל., גלוקוז או גליצרול), אשר מקלה לייצור ביומסה מבלי להעמיס רגשי התאים עם ביטוי של חלבון רקומביננטי כבר מן ההתחלה. בעוד שני היזמים אלה הם עדיין inducible מאת מתנול, ההפעלה על-ידי derepression עושה שימוש נוסף של שלב preinduction בהשוואה הביטויים העסקת PAOX1. יתר על כן, פיDC ו- PDF יכול לשמש לייצור חלבון ללא מתנול, המהווה מטרה רצויה עבור תהליכים תעשייתיים גדולים12.
פיתוח ייצור ישים זנים וקבועים ביטוי, מספר שלבים בהתפתחות יש שמדלגים במטרה לצמצם ממספרים גדולים של transformants למועמד המועדף על הסולם. הקרנות בדרך כלל מבוצעות בתפוקה גבוהה בפלטות טוב מרובה (סולם מיקרו: פחות מ- 0.5 מ"ל) כדי ללכוד את מגוון של שיבוטים גדול ככל האפשר. הקרנת מחדש העוקבים, re-re-screening הוא השלב הבא, ואחריו לנער את הבקבוק (בקנה מידה קטן: 50-250 מ ל) או (מיקרו) ביוריאקטור הקרנות-12. עם זאת, זה אלההם יש שיטה, הדומה ביותר בין המשקל שונה ממאות microlitres ב באר לוחות עד כמה מיליליטר ב- shake מבחנות עד מאוחר יותר הסולם למעלה לייצור ללא מתנול ב ומבוקרות היטב אינקובטורים-מטלטל סיבובי. למרות מבחנות טלטול יכול לספק אמצעי אחסון דומה כבר כמו ריאקטורים קטן, יש מספר מגבלות, שהן רלוונטיות גבוהה לייצור חלבונים בקנה מידה גדול, כגון האכלה קבועה, לערבב, ניטור מקוון13 של צמיחה, אספקת החמצן. העסקת ניטור אופטי הותאם טלטול מבחנות, התקנים חזק לספק חלופה חסכונית לציוד מתוחכם יותר לטיפוח במקביל תוך מתן קבוע מידע מקוון אודות התרבות הגדולות פרמטרים כגון ביומסה, ריכוז חמצן מומס. שחרור איטי של מקור פחמן פולימר נושאות יכול להיות מיושם כדי לאבטח הזנה קבועה ומבוקרת מבלי להסתמך על פתרונות טכניים מורכבים והתקנים, הדמיה דומה יותר בתנאים של ריאקטורים מאשר מלוא פשוטה שהוחלו בעבר דלדול של פחמן מקור9,10, שבו האנרגיה עבור ביטוי חלבון מתמשך הופך הגבלת.
השיטה הבאה מתארת קטן לביטוי בקנה מידה בינוני חלבון ללא מתנול לשליטה במערכת pastoris פ בהתבסס על היזמים החדשים PDC DPפ אינדוקציה מאת derepression כרוכה בשני שלבים. תקופה קצרה הראשון של הצטברות ביומסה ללא הייצור של החלבון של עניין, באמצעות פחמן מקור represses היזמים וגם שלב השני לייצור חלבון המטרה, היכן מקור פחמן מסופק בריכוזים קטנים אך קבוע שמירה על ייצוג המקדם derepressed. ניטור מקוון של פרמטרים קריטיים ביותר טיפוח מוחל במהלך תקופת כל הטיפוח-תרגול. המטרה הייתה לספק של מתנול חינם, שיטת הטיפוח מדרגי ואמין עבור pastoris פ.
Protocol
1. הכנה מדיה
- במאגר מדיה מינימלי (BMG עם גליצרול, BMD עם דקסטרוז כמקור פחמן) הכנה (1 ליטר)
- 650 מ ל מים מזוקקים בבקבוק זכוכית 1 ליטר בורג מכסה אוטוקלב. לאחר קירור, להשלים את המדיום על-ידי הוספת 100 מ של בלוק 10 x YNB (134 גרם/ליטר שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו), 200 מ של אשלגן פוספט מאגר (1 מ', ה-pH 6), 30-100 מ ל 10% w/v גלוקוז או גליצרול (בהתאם לכמות הרצויה ביומסה שנוצר במהלך הקבוצה), 2 מ של 500 סטרילי x ביוטין (10 mg/mL) פתרון ומילוי עד 1 L עם סטרילי מים מזוקקים.
הערה: כל החומרים חייב להיות בלוק מבחנות נפרד. ביוטין נהרס כאשר בלוק, ולכן חייב להיות מסנן לעקר 0.2 µm ממברנה מסננים.
- 650 מ ל מים מזוקקים בבקבוק זכוכית 1 ליטר בורג מכסה אוטוקלב. לאחר קירור, להשלים את המדיום על-ידי הוספת 100 מ של בלוק 10 x YNB (134 גרם/ליטר שמרים חנקן בסיס ללא חומצות אמינו), 200 מ של אשלגן פוספט מאגר (1 מ', ה-pH 6), 30-100 מ ל 10% w/v גלוקוז או גליצרול (בהתאם לכמות הרצויה ביומסה שנוצר במהלך הקבוצה), 2 מ של 500 סטרילי x ביוטין (10 mg/mL) פתרון ומילוי עד 1 L עם סטרילי מים מזוקקים.
- במאגר מדיה עשירים (BYPG) (1 ליטר)
- אוטוקלב 700 מ"ל של מים מזוקקים עם 1% w/v שמרים תמצית ו- 2% w/v peptone בבקבוק פקקי בורג 1 ליטר. לאחר קירור, להוסיף 30-100 מ של גליצרול 10% w/v בנפרד בלוק, 200 מ"ל אשלגן פוספט מאגר (1 מ', ה-pH 6) ולמלא עד 1 ליטר מים מזוקקים סטריליים.
2. לנער להכנת מבחנות
- הוסף 5 מ ל מים מזוקקים 250 מ ל במבוכה לנער מבחנות, לכסות את זה עם שתי שכבות של בד כותנה, לתקן אותו במקום עם גומיות. מכסים את הבד עם חתיכה של נייר אלומיניום.
- אוטוקלב המבחנות ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עבור עיקור מלא.
- להסיר שאריות מים מן הבקבוק aliquot 50 מ של התקשורת מוכנה קודם לכן את כל הבקבוק.
3. לילה תרבות חיסון
- נתחיל תרבות לילה (שוב) מושבה טריים יחיד של המתח הביטוי הרצוי ב- 5 מ של YPD (תמצית שמרים 1% w/v, peptone 2% w/v, w/v 2% גלוקוז) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל תוך השארת את המכסה פתוח מעט כדי לאפשר אוורור נאות.
- נתתי לו לגדול במשך הלילה ב 28 ° C, 80% לחות, ב שייקר ב- 100-130 סל ד (2.5 ס מ קוטר חזק)
4. מדידת ההתקנה וטיפוח תרבות הראשי
- להגדרת מערכת ניטור מקוון, בצע את הוראות היצרן כיול המתאים של המכשירים.
- מקום במחשב, שבה מותקנת התוכנה המתאימה עבור ניטור בטווח עבור חיבור Bluetooth אל תחנות מדידה. הפעל את התוכנה כדי לחבר את ההתקנים באמצעות Bluetooth.
- הפעל חיבור Bluetooth במכשיר מדידה ביומסה על-ידי לחיצה על לחצן כסוף בחזית.
- התוכנה, לחץ על התקני ואז למצוא מכשירים.
הערה: ההתקנים אמורה להופיע ברשימה שבחלון מתחת לקו הפעילות. אם הם לא, רצוי לבדוק אם הסוללות מחויב שהמחשב נמצא בהישג יד של חיבור Bluetooth. - גרור ושחרר את ההתקנים שנמצאו על הריבועים בצד ימין של המסך מגש מדידה.
- לחץ על התחבר.
הערה: כאשר החיבור היה מוצלח, שליטה מופיע מסך. - כדי להפעיל את מבצע בדיקה עבור חיבור Bluetooth, לחץ על מדידה.
- להגדיר את הניסוי.
- לחץ על התחל מדידה, שם הניסוי ולאפשר את כל הפרמטרים הדרושים כדי לפקח.
הערה: רישיונות נדרשים עבור כל אחד מהפרמטרים נמדד אפשרי. - הגדר מרווח זמן 3 דקות.
הערה: מרווח הזמן קביעת התדירות נקודות מדידה נלקחים ותוצאות כל נקודת המדידה ערך אחר כך. מדידת כל דקה מאוד מדויק, אבל הרבה נתונים מופקים מה שהופך אותו יותר מפרך להעריך. - להגדיר נקודות מדידה ממוצע ל- 11.
הערה: הגדרה זו קובעת כמה נקודות מדידה למעשה נלקחים כל 3 דקות. לכן, הפלט הוא הערך הממוצע של 11 נקודות מדידה מעל 11 s. - הזן את השמות על הדגימות.
- דלג על המסך הבא, כמו הזווית היה מכויל כבר בעבר (שלב 4.1).
הערה: מבצע בדיקה עבור חיבור Bluetooth לפני מזריקים את התרבויות הראשי מומלץ להבטיח חיבורים יציב ואת המיקום המתאים של המחשב מחובר. הסוללות יש גם, להיות טעונה.
- לחץ על התחל מדידה, שם הניסוי ולאפשר את כל הפרמטרים הדרושים כדי לפקח.
- למדוד צפיפות תאי סרטן שעומדים (שלב 3.1) מדולל בתקשורת טיפוח (1:20) בספקטרופוטומטר-600 גל nm. לחסן 50 מ של המדיום (מומלץ ריכוז מקור פחמן 0.3-1%, האפשר מדיה שונים כפי שמתואר בשלב 1.) עם. סרטן שעומדים יתר600 של 0.05 באמצעות את החישוב שלהלן.
- למקם את המבחנות גלאי ומנערים -28 ° C, 130 סל ד ו- 80% לחות.
הערה: חשוב מאוד לתת את התרבות 5 דקות של טלטול לפני מתחילים את המדידה כדי להימנע תאים נדבקת לתחתית הבקבוק, מניב ערכים מוטעים. - לחץ על התחל מדידה בתוכנה.
- לקחת דגימות 0.2 מ"ל עבור תא צפיפות מדידה 4 שעות לאחר חיסון ועל מקור פחמן נעשית דלה (נחישות שמתואר בשלב 4.7) ב- triplicates. לדלל את הדגימות. שמסמכי בתקשורת טיפוח (הראשון מדידה 1:5, המדידה השנייה 1:20) ולמדוד את הספיגה-גל nm 600 בספקטרופוטומטר. לפני הסרת המבחנות, אפילו לפני העצירה ניעור, תמיד להשהות את המדידה בתוכנה.
הערה: גלאי מכוילים להקלטת הפרמטרים בתנאים מוגדרים חזק, תניב שטויות למדידות בעת הקלטת תרבויות עדיין. כמו כן, הקפד תמיד לחכות 5 דקות של לרעוד לפני תחילת המדידה שוב. המדידות צפיפות תא חיוניים כי הגלאי מעביר ערכים רק עבור ביומסה וצפיפות התאים לא אמיתי. פונקציה כיול בין הערכים600 OD (x ערכים) ואת הערכים שהתקבלו על ידי מערכת מדידה באינטרנט (ערכי y) יכולה להיות מושגת על ידי מדידת מספר timepoints spectrophotometrically. הערכים הם לא פונקציה קווית אלא יחס לוגריתמי לפי הפונקציה כיול הבאה:
יום: OD600 ערכים מתקבל על ידי ספקטרופוטומטרים
x: ערכי מתקבל על ידי שיטת מדידה באינטרנט
k: שיפוע
d: חיתוך ציר
השיפוע וחיתוך ציר ואז ניתן להמיר הערך המתאים של600 OD ערך כלשהו. ב- Excel באפשרותך להתוות את הערכים600 OD spectrophotometrically שהושג נגד ערכי המערכת מ timepoint אותו. התוספת של קו מגמה לוגריתמי, המשוואה המתאימה ייתן את הפונקציה כיול המוצג לעיל. - לטפח עד מקור הפחמן הוא כמעט מדולדל (app. h 12-20). למטרה זו, תן את התרבויות לגדול עד ניתן לראות את הדיאגרמות התוכנה ריכוז החמצן מתקרבת לאפס וזה התאים נמצאים בשלב צמיחה אקספוננציאלית.
הערה: זהו המקרה עבור ריכוזים מקור פחמן בשימוש בפרוטוקול זה. ניתן לקבוע את timepoint של דלדול המקור פחמן עם ניטור המערכת כפי שהיא מוצגת exemplarily איור 1 במקטע נציג תוצאות, כאשר רמת החמצן מתקרבת לאפס, התאים נמצאים הגידול האקספוננציאלי שלב.
5. חלבון הביטוי על-ידי דה-דיכוי
- כאשר timepoint המתוארים שלב 4.6, להתחיל להאכיל את התרבויות על ידי התוספת של ארבעה דיסקים הזנה לכל הבקבוק בתנאים סטריליים.
הערה: בתנאים המתוארים, ארבעה דיסקים הזנה גליצרול שחרור גליצרול 2 מ ג/h על פי היצרן. - להמשיך את הטיפוח-תרגול של 60-90 h תוך נטילת דגימות בכל 24 שעות ביממה כדי לפקח בביטוי חלבונים על ידי וזמינותו של בחירה (למשל., ברדפורד assay15, מבחני16 או פעילות למען חברה דמוקרטית דף) ותא מדידות צפיפות.
6. תרבות קציר
- לאחר ה 60-90 הטיפוח למלא את התרבויות צינורות צנטריפוגה 50 מ ל לשימוש על ידי צנטריפוגה ב 4000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הערה: את תגובת שיקוע (עבור המופרש חלבונים) או את התאים (עבור ביטוי חלבונים תאיים) ניתן לקצור על ידי צנטריפוגה ב 4000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, עוד אפשר לעשות ניתוחים. - לייצא את נתוני המדידה באינטרנט בתור קובץ גיליון אלקטרוני מתוך התוכנה לצורך ניתוח נוסף.
- מלא 5-10 מ ל מים מזוקקים לכל המבחנות, החיטוי כדי להשבית את התאים הנותרים.
Representative Results
כמתואר בסעיף פרוטוקול, התוכנה מתעד את הפרמטרים הטיפוח חשוב מעל כל הטיפוח. איור 1 מציג את החזיית ביומסה פיתוח וריכוז החמצן במהלך הטיפוח התחיל עם 0.5% (איור 1 א') או 0.3% (איור 1B) מקור פחמן באצוות ואחריו התוספת של גליצרול להאכיל דיסקים. מערכת ניטור מקוונת שימושית במיוחד cultivations דה מודחקים כמו timepoint של דלדול המקור פחמן לאחר האצווה ניתן לקבוע בדיוק. כפי שניתן לראות באיור1, ריכוז החמצן במדיום יורדת במהירות, מתקרב אפס, במיוחד עבור 0.5% גליצרול באצווה (איור 1 א') בעוד ביומסה גדל באופן אקספוננציאלי בשלב זה. כאן, התאים בשלב צמיחה אקספוננציאלית, על מנת להפוך שימוש אופטימלי של המהדורה מקור פחמן, זמן קצר לפני התרבות מגיע השלב נייח, הדיסקים הזנה אמור להתווסף כמפורט בפרוטוקול. התוספת של הזנה הדיסקים לפני ריכוז החמצן מגיע לאפס חשוב חלבון מודחקים מבטל את הביטוי למנוע תאים מן הגבלה חמצן. ריכוז גליצרול נמוך יותר להפחית את האפקט של מגבלות חמצן לטווח קצר כמו שניתן לראות ב איור 1B לכן מומלץ לקבל ביטוי חלבון בטל מודחקים.
בחלק זה, התוצאות של טיפוח שונים שני ניסויים – העסקת את הפרוטוקול המתואר ואת המערכת המוצגת איור 1 – מתוארים. בניסוי הראשון, זן pastoris פ בייצור גלוקוז אוקסידאז של אספרגילוס ניז'ר (ניז'ר א) תחת השליטה של ה-PDC ועל השני זן pastoris פ לייצור הורמון גדילה אנושי תחת השליטה PDF מוצג.
בניסוי זה, נחקר גלוקוז אוקסידאז ייצור תחת השליטה של PDC . לכן, הושוו אסטרטגיות הטיפוח-תרגול: הפועמים גליצרול, גליצרול קבוע להאכיל על ידי תוספת של דיסקים הזנות וטיפוח ללא כל הזנה או הפועמת. הטיפוח נעשה תקשורתי מזערי במאגר 50 מ עם 0.5% גלוקוז כמקור פחמן הבלעדית מבחנות טלטול 250 מ ל (טבלה 1).
על טיפוח 160 h, הריכוזים הגבוהים ביותר של ביומסה התקבלו, כאשר אסטרטגיה האכלה באמצעות אצווה גלוקוז עבור ביומסה הייצור (38 h) גליצרול הפועמים (0.25% w/v גליצרול אחרי 38 h, 61 h ו 86 h טיפוח) הועסק (0.21 g/L סה כ הפרשה חלבון, 8.4 U/mL). למרות ירידה 2-fold של ביומסה הריכוז ואת הסכום הכולל של חלבון המופרש התקבלו, כאשר הדיסקים הזנה נוספו לאחר 38 h גלוקוז אצווה, נפחי הפעילות היתה אפילו 1 U/mL גבוה יותר בהשוואה טיפוח באמצעות גליצרול הפועמים . אפשרות זו מציינת כי כמות משמעותית של חלבון המופרש ואינה תורמת הפעילות הנפחי תגובת שיקוע, עשוי להיות מופרש בצורה לא פעילה. לכן, ריכוז גליצרול גבוה מן פולסים גליצרול לכאורה טובה היווצרות של ביומסה במקום ייצור החלבון היעד ואת שחרור גליצרול נמוך מתמדת הובילו כפולה יותר תפוקה גבוהה יותר ספציפי.
ניסוי אחר כשנוקטים בשיטה מודחקים מבטל את הביטוי נעשה על ידי הבעת את הורמון גדילה אנושי (hGH) תחת שליטה של PDF. Stably שולבה הבונה הגנום של זן pastoris פ BSYBG11. . כאן, 50 מ של BYPG, באגירה עשיר בינוני, ב- 250 מ ל שימש לנער במבוכה מבחנות עם 0.3% (w/v) גליצרול כמקור פחמן האצווה. על התרוקנות גליצרול, הביטוי חלבון מתמדת גליצרול להאכיל הייתה מובטחת באמצעות התוספת של 4 דיסקים לכל הבקבוק ומאכיל בהשוואה גליצרול אין להאכיל (איור 2).
איור 2 מציג את ההשוואה בין hGH ביטוי ופיתוח ביומסה של המתח באותו מעובדים עם ובלי גליצרול קבוע להאכיל. כמו assay כריך אליסה שימשה עם הנוגדן משני דבוקה HRP, זיהוי בוצע עם 3,3′, 5, יונקות-tetramethylbenzidine (שוייץ) כמו המצע. במיוחד עבור חלבון זה, נדמה היה להיות המקרה ללא כל האכלה, התאים להתחיל להשפיל את החלבון המיוצר לאחר כ 30 h (ריבועים כחול בהיר), ואילו על ידי האכלה, את ההשפלה הזו יכולה להיות מונעת (משולשים כחול כהה) ואפילו את ריכוז חלבון לכל ביומסה עדיין גדל לאחר 150 h של טיפוח-תרגול. בדיוק מבין Hansenula מצויה14תוצאה זו מראה כיצד מתמיכת אצווה, כאילו הוא משמש בדרך כלל לנער את הבקבוק קנה מידה, למצב האכיל-אצווה באפשרותך למטב pastoris פ cultivations.
איור 1: ויזואליזציה של online שנרשם פרמטרים במהלך שני cultivations עם ריכוזים שונים גליצרול באצוות. Cultivations החלה עם 0.5% w/v (A) ו- 0.3% w/v (B) גליצרול באצוות ואחריו שלב דה-דיכוי שבו התאים מוזנים על ידי החלת 4 דיסקים הזנה לכל בקבוק (לשחרר את שיעור של 0.5 מ ג/h/דיסק לדברי היצרן). קווים מקווקווים הצג את ריכוז החמצן המדיום, ואילו הקווים רציפה להראות את צפיפות התאים (OD600). קווי שגיאה מראים שסטיית התקן של שש משכפל (ביולוגית 2, הטכנית 3 בכל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השוואה של הורמון גדילה אנושי (hGH) ביטוי במצב אצווה והאכלת-אצווה. תוכן hGH הוא הצביע על ידי ספיגת ערכים-405 ננומטר מאת אליסה הנוגדן 2nd היה פיוז'ן HRP ואיפה שוייץ שימש מצע לצורך זיהוי. מוצגות התוצאות עבור שתי תרבויות שונות: אור כחול תצוגת שורות וריבועים צפיפות התאים, hGH ריכוז מנורמל על ידי תא הצפיפויות של תרבות ללא כל הזנה לאחר האצווה, לעומת תרבות, איפה גליצרול להאכיל דיסקים היו חלה (קווים כחולים כהים, משולשים). קווי שגיאה מראים שסטיית התקן של שש משכפל (ביולוגית 2, הטכנית 3 בכל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| PDC- GOX בזמן הטיפוח-תרגול 160 h | OD600 | פעילות כרך [U/mL] | הסכום הכולל של חלבון המופרש [מ"ג/מ"ל] | נפחי פעילות לפי צפיפות תא | |||
| זאת אומרת | SD | זאת אומרת | SD | זאת אומרת | SD | זאת אומרת | |
| BMD1% האצווה + גליצרול הפועמים | 74.6 | 2 | 8.4 | 2.4 | 0.21 | 0.01 | 0.11 |
| BMD1% האצווה + גליצרול קבוע להאכיל | 32.5 | 0.3 | 9.4 | 0.7 | 0.09 | 0.01 | 0.29 |
| BMD1% אצווה | 18.8 | 0.6 | 3.7 | 0.7 | 0.01 | 0 | 0.2 |
טבלה 1: תוצאות לביטוי GOX עצמאית מתנול, תחת השליטה של האמרגן מודחקים בטל PDC .
Discussion
שיטה זו מציג פרוטוקול אמין יעיל מתנול עצמאית inducible ביטוי מאת pastoris פ כחלופה מתנול קלאסית המושרה ביטוי חלבון מונע על ידי PAOX112. היזמים דה repressible, כמו ה-PDC, PDF או שתואר לעיל מוטציה PAOX1 גרסאות17, לבנות את הבסיס המולקולרי בקונספט חדש זה ייצור החלבון. התוצאות המוצגות נציג להדגיש את השימושיות ואת practicability של ביטוי חלבון רקומביננטי פ pastoris על-ידי היזמים מודחקים לבטל את ההקרנה בקנה מידה קטן עם ניטור מקוון פשוטה. מצד אחד, ניתן לסלק את מתנול מזיקים ולא רעיל המשמש בדרך כלל אינדוקציה של האמרגן AOX1 של הטיפוח. מצד שני, הגידול שלב הייצור חלבון הם חשיפות9 לעומת חלבון מכוננת הביטוי, למשל., עם נפוץ Pהפער. דבר זה מועיל במיוחד כאשר התאים צריך לבטא חלבונים רעילים או מזיקים המציגים נטל עבורם.
האפשרות להתחיל את cultivations עם ריכוזים מקור פחמן שונות מאפשר ההחלטה של כמה ביומסה אחד רוצה להרוויח לפני השלב ייצור חלבון מתחיל. בעת בחירת ריכוז נמוך יותר של מקור פחמן באצוות, יכול להיות מופחת חמצן מגבלות העברה בשל צפיפות גבוהה מדי תא בזמן צפיפות גבוהה יותר לעומת תא יכול גם לגרום titers חלבון גבוה יותר. על ידי מעקב אחר התפתחות תרבות מבחינת ביומסה הדור, ריכוז חמצן, נקודת הזמן אופטימלי של חניכה האכיל-אצווה ניתן לקבוע בקלות כפי שהיא מוצגת באיור1.
ניטור מקוון של פרמטרים אלה טיפוח, מערכת מדידה מתאים צריך להיות מיושם. ביומסה מומס (למשל, SFR Vario) הוא פשוט ומנערים שיטת מדידה באינטרנט כלכלי לניטור תרבות בתוך המבחנות. הקורא מעגל קובע גידול תאים של הבקבוק דרך גילוי אור מפוזר וקורא את האות של חיישן חמצן משולב את הבקבוקון. האופטיקה למדידה ביומסה מורכב LED הפולטת אות אור, אשר מפוזרים על ידי חלקיקים (תאים) במרק תרבות, מזוהה עם פוטודיודה. חיישנים אופטיים פולטים קרינה פלואורסצנטית כשהוא מתרגש עם אור גל מסוים. בהתאם לכמות של מולקולות analyte הנוכחי, את האות פלורסצנטיות משתנה, אשר הוא שזיהה את אופטיקה קורא והוא תורגם ריכוז ערכים. אולם, כיול מדידה צפיפות של תאים יש שתוקם מראש, מאחר בשיטת המדידה היא לא מודדים ערכים בפועל של600 OD. קצב ספיגת החמצן ניתן לחשב את השיפוע של העקומה חמצן עם התוכנה הקורא, הטמפרטורה, כמו גם סל ד נרשמים באופן רציף עם הפרמטרים האחרים. כדי לאפשר בקרה באמצעות מערכת זו, המבחנות טלטול צריך להיות מצויד בעבר החיישנים המתאים עבור הפרמטרים הרצויים.
על ידי התוספת של פולימר שחרור איטי ארבעה דיסקים מתן כמות קבועה של גליצרול כדי שהמרק תרבות, ביומסה הצטברות כמעט ואין ייצור חלבון רקומביננטי הוא המשיך. קביעת נקודת זמן תוספת הזנה דיסק אינה צעד קריטי בניסוי זה, אך זה יש לקחת בחשבון כי התחלה הזנה מוקדמת לפני השלב הגידול האקספוננציאלי יכול להיות מגביל את הפעלת המקדם כפי הביטוי מתחיל על דלדול המקור פחמן. בנוסף, ייתכן תיפגם סה כ זמן בשל מגבלות קיבולת פולימר האכלה, ואילו לעכב את ההזנה לאחר התאים הגיעו לשלב נייח עלול להוביל ברעב ו השפלה של כבר מיוצר חלבון. הסכום של דיסקים הזנה בשימוש פרוטוקול זה נקבע השפעול לשחרור מקור פחמן האופטימלי לשמור את המקדם בטל מודחקים תוך החזקת ביומסה דור נמוך (נתונים לא מוצג). באופן זה, ניתן cultivations לבצע בקלות מעל 160-180 ש ללא כל התערבות.
יישומים עיקריים של פרוטוקול חדש זה יהיה שיבוט ביטוי ההקרנה, אנזים האבולוציה הגילוי, אפיון ואת הנדסה של היזמים החדשים העסקת פרוטוקול הטיפוח ללא מתנול בתנאים המבוקרים היטב. בעקרון, באותו הפרוטוקול צריך להיות ישימים עבור אסטרטגיות מעורבות-feed העסקת מתנול והזנות מקור פחמן fermentative מוגבל כמו שתואר על ידי Perälä פאנולה ואח. ב-18.
Disclosures
פרוטוקול הציג אמנם חלים באופן כללי על טיפוח ועל אינדוקציה בתנאים derepressed, bisy האירופי מצהיר שיש אינטרס מסחור של היזמים derepressed החדש נעשה שימוש במחקר זה.
Acknowledgments
ROBOX קיבלה מימון הפרויקט האיחוד האירופי (EU) ROBOX (גרנט הסכם n ° 635734) תחת אופק 2020 תכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי פעולות H2020-LEIT ביו-2014-1. הדעות בזאת הביע הן רק לאלה של והמלצה, ואינם משקפים בהכרח אלה של הסוכנות למחקר של האיחוד האירופי. האיחוד האירופי אינה אחראית לכל שימוש עשויים של המידע הכלול במסמך זה.
נושא עבודת הדוקטורט של ג'יי פישר ממומנת במשותף על ידי מענק עבור "עבודת Industrienahe" של סוכנות מימון האוסטרי FFG.
אנו מודים ג'ון Gernot (PreSens GmbH) על דיונים מועילים והזנת בעלי ערך לגייוס כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Yeast Extract | BD Biosciences | 212720 | |
| Baffled Flask 250 mL | DWK Life Science | 212833655 | |
| BBL Phytone Peptone | BD Biosciences | 298147 | |
| BioPhotometer | Eppendorf AG | 5500-200-10 | |
| Certoclav-EL | CertoClav GmbH | 9.842 014 | |
| Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids | BD Biosciences | 291920 | |
| Feed discs glycerol | Adolf Kuhner AG | 315060 | |
| Glucose-monohydrate | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6887 | |
| Glycerol ≥98 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3783 | |
| K2HPO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6875 | |
| KH2PO4 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904 | |
| Multitron Standard | Infors AG | 444-4226 | |
| SFR Vario v2 | PreSens GmbH | 200001689 |
References
- Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).
- Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
- Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
- Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
- Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
- Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
- Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
- Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
- Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
- Ukkonen, K. Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , Acta University Oulu C 480 (2014).
- Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
- Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
- Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).
