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Bioengineering

मेथनॉल स्वतंत्र अभिव्यक्ति द्वारा पिच्या Pastoris रोजगार De-दमन प्रौद्योगिकियों

doi: 10.3791/58589 Published: January 23, 2019

Summary

पहली बार के लिए इस विधि कुशल inducible मेथनॉल के लिए विश्वसनीय प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन-मुक्त रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन में पिच्या pastoris (Komagataella phaffii), कार्बन स्रोत विनियमित प्रवर्तकों रोजगार P छोटे पैमाने पर प्रयोग में डीसी और पीDF जबकि खेती मापदंडों ऑनलाइन निगरानी की जा सकती है, और एक निरंतर ग्लिसरॉल फ़ीड लागू किया जाता है ।

Abstract

मेथनॉल एक अच्छी तरह से स्थापित कार्बन स्रोत और कुशल प्रोटीन उत्पादन के लिए उत्प्रेरण पिच्या pastoris (पी pastoris) माइक्रो पर एक मेजबान के रूप में, प्रयोगशाला और औद्योगिक पैमाने पर है । तथापि, इसकी विषाक्तता और वायुम के कारण, वहाँ पी pastorisकी उच्च उत्पादकता को बनाए रखते हुए मेथनॉल से बचने की इच्छा है. छोटे पैमाने पर प्रतिक्रिया की खेती (0.5-5 एल कार्य मात्रा) आमतौर पर गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में अतिसूक्ष्म खेती के बाद से एक तनाव और उसके प्रोटीन उत्पादन विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है शायद ही नियंत्रित किया जा सकता है या महंगे उपकरणों पर निर्भर करता है । इसके अलावा, खेती और पी pastoris की प्रेरण के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल गठन अभिव्यक्ति या मेथनॉल प्रेरण और अब तक के लिए स्थापित किया गया था, कोई विश्वसनीय प्रोटोकॉल के लिए स्क्रीन P. pastoris अभिव्यक्ति वर्णित किया गया में derepressible प्रवर्तकों के साथ उपभेदों (नियंत्रित और निगरानी) समानांतर खेती । इस तरह के प्रारंभिक खेती को सरल करने के लिए और विशेषताएं नए प्रोटीन उत्पादन उपभेदों की तुलना, हम मेथनॉल मुक्त अभिव्यक्ति के लिए एक सरल शेक कुप्पी खेती प्रणाली की स्थापना की है कि एक निरंतर धीमी ग्लिसरॉल फ़ीड सहित प्रतिप्रतिक्रियात्मक शर्तों simulates और ऑनलाइन निगरानी, जिससे ज्यादातर लागू छोटे पैमाने पर बैच खेती की तुलना में प्रतिक्रिया करने वालों में वास्तविक परिस्थितियों के करीब आ रहा है । p. pastoris में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए, कार्बन स्रोत दमित प्रवर्तकों pDC और pDF लागू किए गए थे । एंबेडेड कार्बन स्रोत के साथ बहुलक डिस्क, ग्लिसरॉल की एक निरंतर राशि जारी, एक फ़ीड की दर कम बायोमास पीढ़ी रखते हुए सक्रिय प्रवर्तकों को बनाए रखने के लिए आवश्यक ऊर्जा पहुंचाने का आश्वासन दिया ।

Introduction

ऐसे बैक्टीरिया या खमीर के रूप में सूक्ष्मजीवों द्वारा रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन के लिए बड़े पैमाने पर उपज और विश्वसनीय खेती की स्थिति में सुधार आज के जैव प्रौद्योगिकी1 और औद्योगिक की व्यावसायिक सफलता की प्रमुख जरूरतों में से एक है अनुप्रयोगों. Dueto सरल खेती प्रक्रियाओं और मीडिया, उच्च पैदावार और अच्छी तरह से विशेषता उपकरण2 पिच्या pastoris (Komagataella phaffii) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गैर रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन के लिए पारंपरिक खमीर है । अतिरिक्त अभिनव उपकरण लगातार इस प्रजाति के लिए विकसित कर रहे हैं, नए प्रमोटरों के रूप में व्यापक रूप से इस्तेमाल पीAOX1, शराब oxidase 1 जीन3के प्रवर्तक क्षेत्र के लिए विकल्प के रूप में नए प्रमोटर सहित अभिव्यक्ति वैक्टर, 4,5. CAT1 (CTA1) जीन के एक ५०० बीपी लंबे डीएनए अनुक्रम नदी के ऊपर प्रवर्तक क्षेत्र है, जो पी pastorisमें एक नया मेथनॉल मुक्त और बहुमुखी अभिव्यक्ति रणनीति सक्षम बनाता है के रूप में पहचान की थी । CAT1 जीन पी. pastoris का एकमात्र catalase जीन है और प्रोटीन peroxisomes में स्थित है. catalase मेथनॉल ऑक्सीकरण से peroxisomal MUT मार्ग में या फैटी एसिड6,7के बीटा ऑक्सीकरण के दौरान उत्पंन कर रहे हैं, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, के detoxification में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । CAT1 जीन की अभिव्यक्ति की खेती मध्यम में ग्लूकोज या ग्लिसरॉल के prescence में दबी हुई है और इन कार्बन स्त्रोतों के घट जाने पर derepressed. इसके अलावा, catalase जीन की अभिव्यक्ति मेथनॉल और remarkebly के साथ भी ओलिक एसिड के साथ प्रेरित किया जा सकता है, प्रतीत होता है कि pastoris एसिड के साथ प्रेरित किया जा सकता है की ही जीन जा रहा है भी साथ के रूप में समान अभिव्यक्ति के स्तर तक पहुंचने मेथनॉल प्रेरणे.

इस p. pastoris CAT1 प्रवर्तक, जो पीडीसी कहा जाता है की ५०० बीपी टुकड़ा (कई बार भी पीCAT1-500), पहले से ही व्यक्त की intracellularly के उत्पादन के लिए परीक्षण किया गया है और स्रावित प्रोटीन और यह साबित हो गया एक दो शास्त्रीय पी pastoris प्रवर्तकों के लिए आकर्षक विकल्प-मजबूत गठन पीगैप और मेथनॉल inducible पीAOX1, जो 20 से अधिक साल पहले विकसित किए गए थे । पीडी सी ने शुगर रिच मीडियम में पीगैप की तुलना में volumetric एक्टिविटीज के 21% (CalB) और ३५% (एचआरपी) तक पहुंचने में सफल रहे । मेथनॉल प्रेरण पर, पीडीसी ने पीAOX1से न केवल तेजी से जवाब दिया था, लेकिन यह भी स्पष्ट रूप से यह एक २.८ CalB9के उच्च अंतिम titer गुना द्वारा मात सकता है ।

पीडीसीके अलावा, एक orthologous प्रमोटर (पीDF) एक समान विनियमन प्रोफ़ाइल प्रदर्शन की पहचान की गई थी । हालांकि, यह काफी मजबूत है derepressed के तहत पीडीसी के रूप में अच्छी तरह के रूप में मेथनॉल प्रेरित शर्तों के तहत (तैयारी में पांडुलिपि)3

मामलों में जहां मजबूत गठन पीगैप शारीरिक समस्याग्रस्त या साइटोटोक्सिक प्रोटीन10,11, पीडीसी और पीDF के कारण विफल एक आदर्श विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं । सूक्ष्म पैमाने पर प्रयोगों में, इन प्रमोटरों द्वारा संचालित अभिव्यक्ति प्रारंभिक कार्बन स्रोत (जैसे, ग्लूकोज या ग्लिसरॉल) की कमी के बाद शुरू होता है, जो कोशिकाओं के साथ बोझ के बिना बायोमास उत्पादन की सुविधा रिकॉमबिनेंट प्रोटीन सही शुरुआत से । हालांकि इन दोनों प्रमोटरों के अभी भी मेथनॉल द्वारा inducible हैं, derepression द्वारा सक्रियण preinduction चरण का अतिरिक्त उपयोग करता है पी AOX1 रोजगार भाव की तुलना में इसके अलावा, पीडीसी और पीDF मेथनॉल-मुक्त प्रोटीन उत्पादन, जो बड़े औद्योगिक प्रक्रियाओं12के लिए एक वांछनीय लक्ष्य है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

लागू उत्पादन उपभेदों और अभिव्यक्ति का निर्माण के विकास के लिए, विकास में कई कदम transformants की बड़ी संख्या से नीचे स्केल के लिए पसंदीदा उंमीदवार के लिए संकीर्ण करने के लिए पारित किया जाना है । स्क्रीनिंग आमतौर पर बहु में उच्च प्रवाह में प्रदर्शन कर रहे है अच्छी तरह से प्लेटें (माइक्रो स्केल: से कम ०.५ एमएल) के रूप में संभव के रूप में बड़े क्लोन की एक सीमा पर कब्जा करने के लिए । इसके बाद फिर से स्क्रीनिंग और फिर से फिर से स्क्रीनिंग अगले कदम है, हिला कुप्पी (छोटे पैमाने: 50-250 मिलीलीटर) या (माइक्रो) के बाद से प्रतिक्रिया12। हालांकि, यह एक विधि है, जो सबसे गहरे में microlitres के सैकड़ों से अलग तराजू के बीच समान है इच्छा है अच्छी तरह से हिला कुप्पी में कई मिलीलीटर को ऊपर बाद में स्केल अप करने के लिए मेथनॉल-मुक्त उत्पादन में अच्छी तरह से नियंत्रित बायोरिएक्टर. हालांकि शेक कुप्पी पहले से ही छोटे उपयंत्रों के रूप में समान मात्रा प्रदान कर सकते हैं, कई सीमाएं हैं, जो बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए अत्यधिक प्रासंगिक हैं जैसे लगातार खिला, वातन और ऑनलाइन-निगरानी विकास की13 और ऑक्सीजन की आपूर्ति । ऑप्टिकल निगरानी के लिए अनुकूलित हिला कुप्पी और मिलाते हुए उपकरणों के समानांतर खेती के लिए और अधिक परिष्कृत उपकरणों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करते हुए अभी भी इस तरह के रूप में प्रमुख संस्कृति मानकों के बारे में निरंतर ऑनलाइन जानकारी प्रदान बायोमास और भंग ऑक्सीजन एकाग्रता । कार्बन स्रोत के बहुलक वाहकों से धीमी गति से जारी जटिल तकनीकी समाधान और उपकरणों पर निर्भर बिना एक स्थिर और नियंत्रित फ़ीड सुरक्षित लागू किया जा सकता है, पहले से लागू सरल पूर्ण तुलना में अधिक से अधिक इसी तरह की शर्तों का अनुकरण कार्बन9स्रोत,10, जहां चल रहे प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए ऊर्जा सीमित हो जाता है की कमी ।

निम्न विधि का वर्णन करता है एक छोटे से मध्यम पैमाने पर मेथनॉल-नि: शुल्क नियंत्रणीय प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के आधार पर पी pastoris में नए प्रवर्तकों पीडीसी और पीडीएफ. derepression द्वारा प्रेरण दो चरणों में शामिल है । ब्याज की प्रोटीन के उत्पादन के बिना बायोमास संचय की एक पहली छोटी चरण, एक कार्बन स्रोत है कि प्रवर्तकों और लक्ष्य प्रोटीन उत्पादन, जहां एक कार्बन स्रोत छोटे लेकिन निरंतर सांद्रता में आपूर्ति की है एक दूसरे चरण का दमन का उपयोग प्रवर्तक derepressed को बनाए रखना. सबसे महत्वपूर्ण खेती मापदंडों की ऑनलाइन निगरानी पूरी खेती की अवधि के दौरान लागू किया जाता है । लक्ष्य के लिए एक मेथनॉल मुफ्त, pastorisके लिए विश्वसनीय और स्केलेबल खेती प्रणाली प्रदान किया गया ।

Protocol

1. मीडिया की तैयारी

  1. बफ़र्ड मिनिमल मीडिया (ग्लिसरॉल के साथ बीएमजी, कार्बन स्रोत के रूप में डेक्सट्रोज के साथ बीएमडी) तैयारी (1 एल)
    1. आटोक्लेव ६५० एक 1 एल पेंच टोपी कांच की बोतल में आसुत पानी की मिलीलीटर । नीचे ठंडा करने के बाद, autoclaved 10x YNB (१३४ g/L खमीर नाइट्रोजन बेस w/o अमीनो एसिड) की १०० मिलीलीटर जोड़कर माध्यम पूरा करें, पोटेशियम फॉस्फेट बफर की २०० मिलीलीटर (1 एम, पीएच 6), 30-100 मिलीलीटर की 10% w/v ग्लूकोज या ग्लिसरॉल (वांछित उत्पन्न बायोमास राशि पर निर्भर करता है बैच के दौरान), बाँझ 500x बायोटिन की 2 मिलीलीटर (10 मिलीग्राम/एमएल) समाधान और बाँझ आसुत पानी के साथ 1 L तक भरें ।
      नोट: सभी अवयवों को अलग कुप्पी में autoclaved किया जाना है । बायोटिन autoclaved जब नष्ट हो जाता है, और इसलिए ०.२ µm झिल्ली फिल्टर के साथ निष्फल फिल्टर किया जाना है ।
  2. बफ़र्ड रिच मीडिया (BYPG) (1 L)
    1. 1% w/v खमीर निकालने और 2% w/v peptone के साथ आसुत जल के आटोक्लेव ७०० एमएल एक 1 एल पेंच कैप बोतल में । नीचे ठंडा करने के बाद, अलग autoclaved 10% डब्ल्यू के 30-100 मिलीलीटर जोड़ें/v ग्लिसरॉल, २०० मिलीग्राम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (1 एम, पीएच 6) और बाँझ आसुत पानी के साथ 1 एल करने के लिए भरें ।

2. शेक कुप्पी तैयारी

  1. २५० मिलीलीटर में आसुत पानी की 5 मिलीलीटर जोड़ें हिला हुआ कुप्पी, यह सूती कपड़े की दो परतों के साथ कवर और रबर बैंड के साथ जगह में इसे ठीक । एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा के साथ कपड़े को कवर ।
  2. पूर्ण नसबंदी के लिए 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी आटोक्लेव ।
  3. एक कुप्पी के लिए पहले से तैयार मीडिया की कुप्पी और aliquot ५० मिलीलीटर से अवशिष्ट पानी निकालें ।

3. रातोंरात संस्कृति टीका

  1. YPD के 5 मिलीलीटर में वांछित अभिव्यक्ति तनाव के एक एकल ताजा कॉलोनी के साथ एक रात संस्कृति (ONC) शुरू (1% डब्ल्यू/2% w/v peptone, 2% w/v ग्लूकोज) एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में जबकि ढक्कन थोड़ा खुला छोड़ने के लिए उचित वातन अनुमति देते हैं ।
  2. यह 28 ° c, ८०% आर्द्रता, 100-130 rpm पर एक शेखर में पर रात में वृद्धि (२.५ सेमी व्यास मिलाते हुए) ।

4. माप सेटअप और मुख्य संस्कृति की खेती

  1. ऑनलाइन मॉनिटरिंग सिस्टम को सेट करने के लिए, डिवाइस के उपयुक्त अंशांकन के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
  2. एक कंप्यूटर, जहां निगरानी के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर श्रेणी में माप स्टेशनों के लिए एक ब्लूटूथ कनेक्शन के लिए स्थापित है प्लेस । ब्लूटूथ के माध्यम से उपकरणों से कनेक्ट करने के लिए सॉफ्टवेयर शुरू.
    1. फ्रंट पर सिल्वर बटन दबाकर बायोमास मापने वाले डिवाइस पर ब्लूटूथ कनेक्शन चालू करें ।
    2. सॉफ़्टवेयर में, डिवाइस तब डिवाइस ढूंढेंक्लिक करें ।
      नोट: डिवाइस कार्य पंक्ति के नीचे विंडो में एक सूची के रूप में प्रकट होना चाहिए । यदि वे नहीं करते हैं, यह जांच करने के लिए सलाह दी जाती है अगर बैटरी चार्ज कर रहे है और कंप्यूटर एक ब्लूटूथ कनेक्शन के लिए पहुंच के भीतर है ।
    3. प्राप्त उपकरणों को स्क्रीन मापन ट्रेके दाईं ओर स्थित चौकोरों पर खींचें और छोड़ें ।
    4. कनेक्टकरेंक्लिक करें ।
      नोट: जब कनेक्शन सफल रहा, तो एक नियंत्रण स्क्रीन प्रकट होता है ।
    5. ब्लूटूथ कनेक्शन के लिए कोई परीक्षण रन प्रारंभ करने के लिए, मापनपर क्लिक करें.
    6. प्रयोग को सेट करें ।
      1. क्लिक करें प्रारंभ मापन, प्रयोग नाम और सभी पैरामीटर्स को सक्षम करने के लिए आवश्यक निगरानी ।
        नोट: लाइसेंस संभव मापा मापदंडों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक हैं ।
      2. 3 मिनट के लिए अंतराल सेट करें ।
        नोट: अंतराल निर्धारित करता है कि माप बिंदुओं को कितनी बार लिया जाता है और प्रत्येक माप बिंदु बाद में किसी मान में परिणाम होता है । हर मिनट मापने बहुत सटीक है, लेकिन डेटा के बहुत से उत्पंन कर रहे है जो इसे और अधिक श्रमसाध्य मूल्यांकन करने के लिए बनाता है ।
      3. सेट औसत माप अंक 11 के लिए ।
        नोट: यह सेटिंग निर्धारित करता है कि कितने माप बिंदु वास्तव में हर 3 मिनट लिया जाता है । इसलिए, 11 s से अधिक 11 माप बिंदुओं का माध्य मान है ।
      4. नमूनों के लिए नाम दर्ज करें ।
      5. अगले स्क्रीन को छोड़ें, क्योंकि कोण पहले से ही तुले हुए थे (चरण ४.१) ।
        नोट: inoculating से पहले ब्लूटूथ कनेक्शन के लिए एक परीक्षण चलाने के लिए मुख्य संस्कृतियों स्थिर कनेक्शन और कनेक्टेड कंप्यूटर के उपयुक्त स्थान सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती है । साथ ही बैटरी चार्ज भी करना होगा ।
  3. ONC के सेल घनत्व को मापने (चरण ३.१) खेती मीडिया में पतला (1:20) ६०० एनएम तरंग दैर्ध्य में एक spectrophotometer में । Inoculate ५० एमएल के मध्यम (अनुशंसित कार्बन स्रोत एकाग्रता 0.3-1%, अलग मीडिया संभव के रूप में चरण 1 में वर्णित है.) के साथ ONC के लिए एक आयुध डिपो६०० का उपयोग करके निंन परिकलन का प्रयोग करके ।
    Equation 1
  4. डिटेक्टरों में बोतल प्लेस और 28 डिग्री सेल्सियस, १३० rpm और ८०% आर्द्रता पर हिला ।
    नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए माप शुरू करने से पहले मिलाते के 5 मिनट की कुप्पी के नीचे से चिपके कोशिकाओं से बचने के लिए और गलत मूल्यों उपज ।
  5. सॉफ़्टवेयर में माप प्रारंभ करेंक्लिक करें ।
  6. टीका के बाद सेल घनत्व माप 4 एच के लिए ०.२ मिलीलीटर नमूने ले और जब कार्बन स्रोत समाप्त हो जाता है (दृढ़ संकल्प ४.७ चरण में वर्णित) triplicates में । नमूनों को उचित रूप से खेती मीडिया में पतला करें (पहला माप 1:5, दूसरा माप 1:20) और एक spectrophotometer में ६०० एनएम तरंग दैर्ध्य में अवशोषण को मापने । कुप्पी को हटाने से पहले और भी शेखर को रोकने से पहले, हमेशा सॉफ्टवेयर में माप को थामने ।
    नोट: डिटेक्टरों निर्धारित मिलाते हुए शर्तों के तहत मापदंडों रिकॉर्डिंग के लिए तुले हुए हैं और अभी भी संस्कृतियों जब रिकॉर्डिंग बकवास माप करने के लिए निकलेगा. इसके अलावा, हमेशा माप फिर से शुरू करने से पहले मिलाते हुए के 5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें । सेल घनत्व माप आवश्यक है क्योंकि डिटेक्टर सिर्फ बायोमास और नहीं वास्तविक कोशिका घनत्व के लिए मूल्यों को वितरित कर रहा है । आयुध डिपो६०० मूल्यों (x मान) और ऑनलाइन माप प्रणाली (y मान) द्वारा प्राप्त मूल्यों के बीच एक अंशांकन समारोह कई timepoints spectrophotometrically को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । मान एक रैखिक लेकिन निम्नलिखित अंशांकन समारोह के अनुसार एक लघुगणकीय संबंध में नहीं हैं:
    Equation 2
    y: आयुध डिपो६०० spectrophotometer द्वारा प्राप्त मूल्यों
    x: ऑनलाइन माप प्रणाली द्वारा प्राप्त मान
    कश्मीर: ढलान
    d: अक्ष अवरोधन
    ढलान और अक्ष अवरोधन तो इसी आयुध डिपो६०० मूल्य में किसी भी मूल्य में परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक्सेल में एक एक ही timepoint से ऑनलाइन प्रणाली से मूल्यों के खिलाफ spectrophotometrically प्राप्त आयुध डिपो६०० मूल्यों साजिश कर सकते हैं । एक लघुगणकीय ट्रेंडलाइन और इसी समीकरण के अलावा अंशांकन ऊपर दिखाए गए समारोह दे देंगे ।
  7. जब तक कार्बन स्रोत लगभग समाप्त हो गया है खेती (app. 12-20 ज) । उस प्रयोजन के लिए, संस्कृतियों बढ़ने जब तक यह सॉफ्टवेयर चित्र में देखा जा सकता है कि ऑक्सीजन एकाग्रता शूंय आ रहा है और कोशिकाओं को घातीय विकास के चरण में हैं ।
    नोट: यह इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कार्बन स्रोत सांद्रता के लिए मामला है । कार्बन स्रोत घट की timepoint ऑनलाइन निगरानी प्रणाली के साथ निर्धारित किया जा सकता है क्योंकि यह प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चित्रा 1 में exemplarily दिखाया गया है, जब ऑक्सीजन स्तर शूंय के दृष्टिकोण और कोशिकाओं को घातीय वृद्धि में है चरण.

5. De-दमन द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. जब चरण ४.६ में वर्णित timepoint तक पहुंच गया है, के अलावा चार कुप्पी शर्तों के तहत बोतल प्रति फ़ीड डिस्क के अतिरिक्त द्वारा संस्कृतियों खिला शुरू करते हैं ।
    नोट: वर्णित शर्तों के तहत, चार ग्लिसरॉल फ़ीड डिस्क रिलीज़ 2 mg/h ग्लिसरॉल निर्माता के अनुसार ।
  2. 60-90 एच के लिए खेती जारी रखते हुए हर 24 घंटे के नमूने लेने के लिए पसंद की परख (जैसे, ब्रैडफोर्ड परख15, एसडीएस पृष्ठ16 या गतिविधि परख) और कोशिका घनत्व माप द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति की निगरानी ।

6. संस्कृति संचयन

  1. खेती के 60-90 ज के बाद, ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में ४,००० x जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से कटाई के लिए में संस्कृतियों भरें ।
    नोट: supernatant (स्रावित प्रोटीन के लिए) या कोशिकाओं (intracellular प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए) ४,००० x gपर केंद्रापसारक द्वारा काटा जा सकता है, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और आगे विश्लेषण किया जा सकता है ।
  2. आगे विश्लेषण के लिए सॉफ़्टवेयर से एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में ऑनलाइन माप डेटा निर्यात करें ।
  3. शेष कोशिकाओं को निष्क्रिय करने के लिए सभी कुप्पी और आटोक्लेव को आसुत जल के 5-10 मिलीलीटर भरें ।

Representative Results

के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है, सॉफ्टवेयर पूरी खेती पर महत्वपूर्ण खेती मापदंडों रिकॉर्ड । चित्रा 1 एक खेती के दौरान बायोमास विकास और ऑक्सीजन एकाग्रता के दृश्य से पता चलता है या तो ०.५% (आंकड़ा 1a) या ०.३% (आंकड़ा 1b) ग्लिसरॉल फ़ीड डिस्क के अलावा बैच में कार्बन स्रोत के साथ शुरू कर दिया । ऑनलाइन निगरानी प्रणाली के लिए विशेष रूप से उपयोगी है de-दमित खेती के timepoint के रूप में कार्बन स्रोत की कमी के बाद बैच बिल्कुल निर्धारित किया जा सकता है । के रूप में यह चित्र 1में देखा जा सकता है, मध्यम में ऑक्सीजन एकाग्रता तेजी से घटते जा रहा है और शूंय आ, विशेष रूप से ०.५% ग्लिसरॉल के लिए बैच में (आंकड़ा 1a) जबकि बायोमास तेजी से इस बिंदु पर बढ़ रही है । यहां, कोशिकाओं को घातीय विकास के चरण में है और आदेश में कार्बन स्रोत रिलीज के इष्टतम उपयोग करने के लिए, शीघ्र ही संस्कृति स्थिर चरण में पहुंच से पहले, फ़ीड डिस्क के रूप में यह प्रोटोकॉल में वर्णित है जोड़ा जाना चाहिए । ऑक्सीजन एकाग्रता से पहले फ़ीड डिस्क के अलावा शूंय तक पहुंचता de-दमित प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है ऑक्सीजन सीमा से कोशिकाओं को रोकने के लिए । कम ग्लिसरॉल सांद्रता अल्पकालिक ऑक्सीजन सीमाओं के प्रभाव को कम करने के रूप में यह आंकड़ा 1b में देखा जा सकता है और इसलिए de-दमित प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।

निंनलिखित में, दो अलग खेती के प्रयोगों के परिणाम-वर्णित प्रोटोकॉल और निगरानी प्रणाली 1 चित्रा में दिखाया रोजगार-वर्णित हैं । पहले प्रयोग में पीडीसी के नियंत्रण के तहत Aspergillus नाइजर (ए. नाइजर) से ग्लूकोज oxidase का उत्पादन करने वाले एक pastoris तनाव में और दूसरा ए पी pastoris मानव विकास हार्मोन का निर्माण करने वाले तनाव में PDF के नियंत्रण के अंतर्गत दिखाया गया है ।

इस प्रयोग में पीडीसी के नियंत्रण में ग्लूकोज oxidase उत्पादन की जांच की गई । इसलिए, विभिंन खेती रणनीतियों की तुलना में थे: ग्लिसरॉल स्पंदन, फ़ीड डिस्क और किसी भी फ़ीड या स्पंदन के बिना खेती के अलावा द्वारा लगातार ग्लिसरॉल फ़ीड । खेती ५० मिलीलीटर में किया गया था ०.५% ग्लूकोज के साथ ंयूनतम मीडिया २५० मिलीलीटर शेक कुप्पी (तालिका 1) में एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में ।

१६० ज खेती पर, उच्चतम बायोमास सांद्रता प्राप्त की गई, जब एक खिला रणनीति बायोमास उत्पादन के लिए एक ग्लूकोज बैच का उपयोग कर (३८ ज) और ग्लिसरॉल स्पंदन (०.२५% डब्ल्यू/वी ग्लिसरॉल के बाद ३८ एच, ६१ एच और ८६ एच खेती) कार्यरत था (०.२१ g/L कुल स्रावी प्रोटीन, ८.४ U/एमएल) । हालांकि एक 2-बायोमास एकाग्रता की कमी और गुप्त प्रोटीन की कुल राशि प्राप्त किया गया, जब फ़ीड डिस्क ३८ एच ग्लूकोज बैच के बाद जोड़ा गया, volumetric गतिविधि भी 1 U/एमएल उच्च ग्लिसरॉल स्पंदन का उपयोग कर खेती की तुलना में था . यह इंगित करता है कि गुप्त प्रोटीन की एक पर्याप्त राशि supernatant में volumetric गतिविधि के लिए योगदान नहीं करता है और एक निष्क्रिय रूप में स्रावित किया जा सकता है । इसलिए, ग्लिसरॉल दालों से उच्च ग्लिसरॉल सांद्रता प्रतीत होता है कि अधिक से अधिक दो गुना उच्च विशिष्ट उत्पादकता के नेतृत्व में लक्ष्य प्रोटीन उत्पादन और लगातार कम ग्लिसरॉल रिहाई के बजाय बायोमास के गठन एहसान ।

एक अंय प्रयोग de-दमित अभिव्यक्ति विधि रोजगार पीDFके नियंत्रण में मानव विकास हार्मोन (hGH) व्यक्त द्वारा किया गया था । निर्माण छुरा pastoris तनाव BSYBG11 के जीनोम में एकीकृत किया गया था । यहां, BYPG के ५० मिलीलीटर, बफर रिच मध्यम, २५० मिलीलीटर चकित हिला कुप्पी में बैच में कार्बन स्रोत के रूप में ०.३% (डब्ल्यू/वी) ग्लिसरॉल के साथ प्रयोग किया गया । ग्लिसरॉल कमी पर, लगातार ग्लिसरॉल फ़ीड के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति की कुप्पी प्रति 4 फ़ीड डिस्क के अलावा द्वारा सुनिश्चित किया गया था और कोई ग्लिसरॉल फ़ीड (चित्रा 2) की तुलना में ।

चित्रा 2 hGH अभिव्यक्ति और एक ही तनाव के साथ और लगातार ग्लिसरॉल फ़ीड के बिना खेती की बायोमास विकास के बीच तुलना से पता चलता है. के रूप में परख सैंडविच एलिसा माध्यमिक एंटीबॉडी एचआरपी से जुड़े और पता लगाने के साथ इस्तेमाल किया गया था 3, 3', 5, 5 ' के साथ-tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट के रूप में ले जाया गया था । इस प्रोटीन के लिए विशेष रूप से, यह मामला है कि किसी भी खिला के बिना लग रहा था, कोशिकाओं को लगभग 30 घंटे के बाद उत्पादित प्रोटीन नीचा करने के लिए शुरू (हल्के नीले चौकों), जबकि खिलाने के द्वारा, इस गिरावट रोका जा सकता है (डार्क ब्लू त्रिभुज) और यहां तक कि बायोमास प्रति प्रोटीन एकाग्रता अभी भी खेती के १५० ज के बाद वृद्धि हुई है । के रूप में पहले से ही Hansenula polymorpha14के लिए मनाया, इस परिणाम से पता चलता है कैसे बैच से स्विचन, जैसे कि यह आमतौर पर शेक कुप्पी पैमाने में प्रयोग किया जाता है, फेड-बैच मोड पी pastoris खेती का अनुकूलन कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: बैच में अलग ग्लिसरॉल सांद्रता के साथ दो खेती के दौरान ऑनलाइन दर्ज मापदंडों के दृश्य । खेती को ०.५% w/v (A) और ०.३% w/v (B) ग्लिसरॉल के साथ प्रारंभ किया गया था जिसके बाद बैच में डि-प्रेस चरण जहां कोशिकाओं कुप्पी प्रति 4 फ़ीड डिस्क लागू करने से खिलाया गया था (के रिलीज दर ०.५ मिलीग्राम/एच/ डैश्ड रेखाएं मध्यम में ऑक्सीजन एकाग्रता दिखाती हैं, जबकि निरंतर लाइनें कोशिका घनत्व (OD६००) दिखाती हैं । त्रुटि पट्टियां छह प्रतिकृति (2 जैविक, तीन तकनीकी प्रत्येक) के मानक विचलन दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: बैच और फेड-बैच मोड में मानव विकास हार्मोन (hGH) अभिव्यक्ति की तुलना. hGH सामग्री एक एलिसा द्वारा ४०५ एनएम पर अवशोषण मूल्यों द्वारा संकेत दिया है, जहां 2एन डी एंटीबॉडी एक एचआरपी संलयन और TMB का पता लगाने के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था. दिखाया दो अलग संस्कृतियों के लिए परिणाम हैं: लाइट ब्लू लाइन और चौकों सेल घनत्व और hGH के बैच के बाद किसी भी फ़ीड के बिना एक संस्कृति के सेल घनत्व द्वारा सामान्यीकृत एकाग्रता प्रदर्शन, एक संस्कृति की तुलना में, जहां ग्लिसरॉल फ़ीड डिस्क थे लागू (डार्क ब्लू लाइंस और त्रिकोण) । त्रुटि पट्टियां छह प्रतिकृति (2 जैविक, तीन तकनीकी प्रत्येक) के मानक विचलन दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

PDC-GOX पर १६० h खेती समय ओडी६०० vol. गतिविधि [यू/एमएल] गुप्त प्रोटीन की कुल राशि [mg/ सेल घनत्व प्रति volumetric गतिविधि
मतलब एसडी मतलब एसडी मतलब एसडी मतलब
BMD1% बैच + ग्लिसरॉल स्पंदने ७४.६ 2 ८.४ २.४ ०.२१ ०.०१ ०.११
BMD1% बैच + लगातार ग्लिसरॉल फीड ३२.५ ०.३ ९.४ ०.७ ०.०९ ०.०१ ०.२९
BMD1% बैच १८.८ ०.६ ३.७ ०.७ ०.०१ 0 ०.२

तालिका 1: de-दमित प्रवर्तक के नियंत्रण में मेथनॉल स्वतंत्र GOX अभिव्यक्ति के परिणाम पीडीसी .

Discussion

इस विधि के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है कुशल मेथनॉल स्वतंत्र inducible अभिव्यक्ति p. pastoris द्वारा शास्त्रीय मेथनॉल प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति पीAOX112से प्रेरित करने के लिए एक विकल्प के रूप में । De-repressible प्रवर्तकों, pDC, pDF या पहले वर्णित की तरह रूपांतरित pAOX1 वेरिएंट17, इस नए प्रोटीन उत्पादन अवधारणा के लिए आणविक आधार का निर्माण । दिखाया प्रतिनिधि परिणाम उपयोगिता और de-दमित प्रवर्तकों और सरल ऑनलाइन निगरानी के साथ छोटे पैमाने पर स्क्रीनिंग के द्वारा पी pastoris में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की साध्यता रेखांकित । एक तरफ तो आम तौर पर AOX1 प्रवर्तक की प्रेरण के लिए प्रयोग की जाने वाली हानिकारक एवं विषैली मेथनॉल को खेती से समाप्त किया जा सकता है । दूसरी ओर, वृद्धि और प्रोटीन उत्पादन चरण में गठित प्रोटीन अभिव्यक्ति के विपरीत9 युगल हैं, जैसे, आमतौर पर इस्तेमाल किया पीगैपके साथ । यह विशेष रूप से लाभप्रद है जब कोशिकाओं को विषाक्त या हानिकारक प्रोटीन है कि उनके लिए एक बोझ प्रदर्शित व्यक्त करना चाहिए ।

संभावना विभिंन कार्बन स्रोत सांद्रता के साथ खेती शुरू करने के लिए कितना बायोमास एक प्रोटीन उत्पादन चरण शुरू होने से पहले हासिल करना चाहते है के निर्णय में सक्षम बनाता है । जब बैच में एक कम कार्बन स्रोत एकाग्रता का चयन, ऑक्सीजन स्थानांतरण सीमाओं के कारण भी उच्च कोशिका घनत्व कम किया जा सकता है, जबकि दूसरी ओर उच्च कोशिका घनत्व भी उच्च प्रोटीन titers में परिणाम कर सकते हैं । बायोमास उत्पादन और ऑक्सीजन सांद्रता के संदर्भ में संस्कृति विकास की निगरानी करके, फेड-बैच दीक्षा के लिए इष्टतम समय-बिंदु आसानी से निर्धारित किया जा सकता है के रूप में यह चित्र 1में दिखाया गया है ।

इन खेती मापदंडों की ऑनलाइन निगरानी के लिए एक उपयुक्त माप प्रणाली लागू की जानी चाहिए । बायोमास मापक यंत्र (उदा., SFR Vario) संस्कृति की निगरानी के लिए शेक कुप्पी में एक सरल और आर्थिक ऑनलाइन मापन प्रणाली है । optoelectronic पाठक बिखरे हुए प्रकाश का पता लगाने के माध्यम से कुप्पी में सेल विकास निर्धारित करता है और बाहर ऑक्सीजन कुप्पी में एकीकृत संवेदक के सिग्नल पढ़ता है. बायोमास माप के लिए प्रकाशिकी एक एलईडी से मिलकर बनता है कि एक प्रकाश संकेत है, जो कणों (कोशिकाओं) द्वारा संस्कृति शोरबा में बिखरा हुआ है और एक photodiode के साथ पता चलता है उत्सर्जित करता है । ऑप्टिकल सेंसर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन जब एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ उत्साहित । analyte वर्तमान अणुओं की मात्रा पर निर्भर करता है, इस प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तन, जो पाठक प्रकाशिकी द्वारा पता चला है और एकाग्रता मूल्यों में अनुवाद किया है । माप प्रणाली वास्तविक आयुध डिपो६०० मूल्यों को मापने नहीं है, क्योंकि हालांकि, एक सेल घनत्व माप अंशांकन पहले से स्थापित किया जाना है । ऑक्सीजन की गति दर पाठक सॉफ्टवेयर के साथ ऑक्सीजन वक्र की ढलान से गणना की जा सकती है, और तापमान के साथ ही rpm को लगातार अंय मापदंडों के साथ दर्ज कर रहे हैं । इस प्रणाली के साथ निगरानी को सक्षम करने के लिए, शेक कुप्पी पहले वांछित मापदंडों के लिए उपयुक्त सेंसर के साथ सुसज्जित किया जाना है ।

चार धीमी गति से रिलीज बहुलक डिस्क के अलावा द्वारा संस्कृति शोरबा करने के लिए ग्लिसरॉल की एक निरंतर राशि उपलब्ध कराने, बायोमास संचय लगभग बंद कर दिया है, और रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन जारी रखा है । फ़ीड डिस्क इसके अलावा समय बिंदु का निर्धारण इस प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम नहीं है, लेकिन यह विचार किया जाना चाहिए कि घातीय वृद्धि के दौर से पहले एक समयपूर्व फ़ीड शुरू हो सकता है प्रमोटर सक्रियण बाधा के रूप में अभिव्यक्ति पर शुरू होता है कार्बन स्रोत घट रहा है । इसके अतिरिक्त, कुल खिला समय बहुलक क्षमता सीमाओं के कारण कम किया जा सकता है, जबकि फ़ीड देरी के बाद कोशिकाओं स्थिर चरण तक पहुंच चुके है भूखे और पहले से ही उत्पादित प्रोटीन के क्षरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । फ़ीड इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया डिस्क की राशि के लिए इष्टतम कार्बन स्रोत रिहाई के लिए प्रयोग के लिए निर्धारित किया गया था प्रमोटर de-दमित रखने जबकि बायोमास पीढ़ी कम (दिखाया डेटा नहीं) । इस तरीके में, खेती किसी भी हस्तक्षेप के बिना 160-180 ज पर आसानी से प्रदर्शन किया जा सकता है ।

इस नए प्रोटोकॉल के मुख्य अनुप्रयोगों अभिव्यक्ति क्लोन स्क्रीनिंग, एंजाइम विकास और खोज, लक्षण वर्णन और नए प्रमोटरों में एक मेथनॉल-मुक्त खेती प्रोटोकॉल रोजगार के अच्छी तरह से निगरानी की स्थिति में इंजीनियरिंग होगा । सिद्धांत रूप में, एक ही प्रोटोकॉल मिश्रित फ़ीड रणनीतियों मेथनॉल और सीमित fermentative कार्बन स्रोत को रोजगार के लिए लागू किया जाना चाहिए ऐसे पैन्यूला द्वारा वर्णित के रूप में-Perälä एट अलफ़ीड । में २०१४18.

Disclosures

हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल derepressed शर्तों के तहत खेती और प्रेरण के लिए आम तौर पर लागू होता है, bisy e.U. इस अध्ययन में प्रयुक्त नए derepressed प्रवर्तकों के व्यावसायीकरण में रुचि लेने की घोषणा करता है ।

Acknowledgments

ROBOX यूरोपीय संघ (ईयू) परियोजना ROBOX (अनुदान समझौते n ° ६३५७३४) के तहत ईयू के क्षितिज २०२० कार्यक्रम अनुसंधान और नवाचार क्रियाओं H2020-LEIT जैव 2014-1 से धन प्राप्त हुआ है । विचार और राय इस के साथ साथ व्यक्त की केवल लेखक (ओं) के उन हैं, और जरूरी यूरोपीय संघ अनुसंधान एजेंसी के उन प्रतिबिंबित नहीं है । यूरोपीय संघ किसी भी उपयोग के लिए उत्तरदाई नहीं है जो यहां निहित जानकारी से बनाया जा सकता है ।

जे फिशर की पीएचडी थीसिस सह है ऑस्ट्रिया के वित्तपोषण एजेंसी FFG के "Industrienahe शोध प्रबंध" के लिए एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित ।

हम उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि मसौदे के लिए बहुमूल्य इनपुट के लिए Gernot जॉन (संवेदना GmbH) धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689

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References

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मेथनॉल स्वतंत्र अभिव्यक्ति द्वारा <em>पिच्या Pastoris</em> रोजगार De-दमन प्रौद्योगिकियों
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Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).More

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).

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