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Bioengineering

Metanolo espressione indipendente di Pichia Pastoris che impiegano tecnologie di-repressione

doi: 10.3791/58589 Published: January 23, 2019

Summary

Questo metodo per la prima volta descrive procedure sperimentali affidabili per la produzione di proteina ricombinante privo di metanolo viscoelastica efficiente in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), che impiegano i promotori di fonte regolata di carbonio P DCe PDF negli esperimenti su piccola scala durante la coltivazione, i parametri possono essere monitorati online e un feed di glicerolo costante viene applicato.

Abstract

Il metanolo è una fonte di carbonio ben consolidata e induttore per la produzione di proteina efficiente impiegando Pichia pastoris (p. pastoris) come un host su scala micro-, laboratorio e industriale. Tuttavia, a causa della sua tossicità e infiammabilità, c'è un desiderio di evitare metanolo pur mantenendo l'elevata produttività di p. pastoris. Coltivazioni di bioreattore a piccola scala (0,5-5 volume di lavoro L) sono comunemente utilizzati per valutare un ceppo e le sue caratteristiche di produzione di proteine poiché Microscala coltivazione nel pozzi profondo piastre sono difficilmente controllabili o si basa su attrezzature costose. Inoltre, tradizionali protocolli per la coltivazione e l'induzione di p. pastoris sono stati stabiliti per induzione costitutiva di espressione o metanolo e finora, che nessun protocolli affidabili sono stati descritti all'espressione di p. pastoris schermo ceppi con derepressible promotori in colture parallele (controllati e monitorati). Per semplificare tali coltivazioni iniziale per caratterizzare e confrontare nuovi ceppi di produzione di proteina, abbiamo istituito un sistema di coltivazione di boccetta semplice shake per la libera espressione di metanolo che simula condizioni di bioreattore compreso un glicerolo lento costante feed e monitoraggio on-line, quindi si avvicina alle condizioni reali in bioreattori rispetto alle coltivazioni di batch principalmente applicata su piccola scala. Per guidare l'espressione della proteina ricombinante in p. pastoris, fonte di carbonio represso promotori PDC e PDF sono stati applicati. Polimero dischi con fonte di carbonio incorporato, rilasciando una quantità costante di glicerolo, ha assicurato una velocità di avanzamento fornire l'energia necessaria per mantenere attivi i promotori, mantenendo bassa la produzione di biomassa.

Introduction

Miglioramento della resa e condizioni affidabile coltivazione su larga scala per la produzione di proteine ricombinanti da microrganismi come batteri o lieviti è una delle principali esigenze di biotecnologie1 odierno e il successo commerciale di industriale applicazioni. Dueto coltivazione semplice procedure e supporti, alti rendimenti e strumenti ben caratterizzati2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) è un lievito non convenzionale ampiamente usato per la produzione di proteine ricombinanti. Ulteriori strumenti innovativi sono costantemente sviluppati per questa specie, come nuovi vettori di espressione, tra cui nuovi promotori come alternative all'ampiamente usato PAOX1, regione del promotore del alcol ossidasi 1 gene3, 4,5. Una 500 bp lunga sequenza di DNA a Monte del gene CAT1 (CTA1) è stata identificata come la regione del promotore, che consente una nuova strategia di espressione versatile e privo di metanolo in p. pastoris. Il gene CAT1 è l'unico gene della catalasi di p. pastoris e la proteina si trova nei perossisomi. La catalasi svolge un ruolo importante nella disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno, che sono derivanti, ad es., dall'ossidazione del metanolo nella via del MUT peroxisomal o durante la beta ossidazione di acidi grassi6,7. L'espressione del gene CAT1 è represso nel prescence di glucosio o glicerolo nel medium di coltivazione e derepresso dopo l'esaurimento di queste fonti di carbonio8. Inoltre, l'espressione del gene di catalasi può essere indotta con metanolo e remarkebly anche con acido oleico, essendo apparentemente l'unico gene del pathway di p. pastoris MUT che può essere indotta con acido oleico anche di raggiungere simili livelli di espressione come con metanolo induzione9.

Il frammento di bp 500 del promotore p. pastoris CAT1 , che si chiama PDC (a volte anche abbreviato PCAT1-500), è già stato testato per la produzione delle proteine intracellulare espresse e secrete e si è rivelato per essere un interessante alternativa ai due classici p. pastoris promotori – il forte costitutiva PGAP e il metanolo viscoelastica PAOX1, che sono stati sviluppati più di 20 anni fa. La PDC fu in grado di raggiungere il 21% (CalB) e 35% (HRP) delle attività volumetrico rispetto al PGAP nel terreno ricco di zucchero. All'induzione di metanolo, il PDC non solo ha risposto più velocemente della PAOX1, ma anche chiaramente potrebbe sovraperformare esso da un 2,8 volte più alto titolo finale di CalB9.

Oltre la PDC, era stato identificato un promotore orthologous (PDF) esibendo un simile profilo di regolamento. Tuttavia, è significativamente più forte di quanto il PDC sotto derepresso nonché in metanolo-indotto condizioni (manoscritto in preparazione)3.

In casi dove il forte costitutiva PGAP non riuscita a causa di proteine fisiologicamente problematico o citotossici10,11, la PDC e il PDF rappresentano l'alternativa ideale. In esperimenti su scala micro, l'espressione guidato da questi promotori inizia dopo l'esaurimento della fonte di carbonio iniziale (ad es., glucosio o glicerolo), che facilita la produzione di biomassa senza gravare le cellule con iperespressione di la proteina ricombinante fin dall'inizio. Mentre entrambi di questi promotori sono ancora inducibili da metanolo, l'attivazione di derepressione fa un uso ulteriore della fase preinduction rispetto alle espressioni che impiegano PAOX1. Inoltre, il PDC e PDF può essere utilizzato per la produzione di proteina privo di metanolo, che è un obiettivo desiderabile per processi industriali grandi12.

Per lo sviluppo di ceppi di produzione applicabile e costrutti di espressione, diversi passaggi nello sviluppo devono essere passati al fine di limitare giù da un gran numero dei transformants per il candidato preferito per scale-up. Proiezioni di solito vengono eseguite in elevato throughput in piastre multi-pozzetto (scala micro: meno di 0,5 mL) al fine di acquisire una gamma dei cloni più grande possibile. Successiva ri-screening e re-re-screening è il passo successivo, seguito da agitare boccetta (su piccola scala: 50-250 mL) o (micro-) bioreattore proiezioni12. Tuttavia, è desiderabile avere un metodo, che è più simile tra le diverse scale da centinaia di microlitri in pozzetti profondi fino a diversi millilitri in boccette di agitare fino a successive scale-up di produzione privo di metanolo in ben controllato Bioreattori. Anche se shake boccette in grado di fornire volumi già simili come bioreattori piccoli, ci sono diverse limitazioni, che sono molto importanti per la produzione di proteine su larga scala come alimentazione costante, aerazione e il monitoraggio on line13 di crescita e rifornimento di ossigeno. Che impiegano monitoraggio ottico adattato boccette di scossa e tremante dispositivi forniscono un'alternativa conveniente all'attrezzatura più sofisticata per coltivazione parallela pur fornendo costante informazioni online sui parametri principali cultura come biomassa e concentrazione di ossigeno disciolto. Lento rilascio di fonte di carbonio dagli elementi portanti di polimero possa essere applicato per garantire un'alimentazione costante e controllata senza fare affidamento su soluzioni tecniche complesse e dispositivi, simulando condizioni più simili di bioreattori rispetto l'intero semplice applicato in precedenza lo svuotamento di carbonio fonte9,10, dove l'energia per l'espressione della proteina in corso diventa limitante.

Il metodo riportato di seguito viene descritto un piccolo per l'espressione della proteina senza metanolo controllabile di medie dimensioni sistema in p. pastoris basato sui nuovi promotori PDC e PDF. Induzione di derepressione prevede due fasi. Una prima breve fase di accumulo di biomassa senza la produzione della proteina di interesse, utilizzando una fonte di carbonio che reprime i promotori e una seconda fase di produzione della proteina bersaglio, dove una fonte di carbonio è fornita in concentrazioni piccole ma costante mantenere il promotore derepresso. Monitoraggio online dei parametri più critici di coltivazione viene applicato durante il periodo di coltivazione tutta. L'obiettivo era quello di fornire un sistema di coltivazione affidabile e scalabile, metanolo gratuito per p. pastoris.

Protocol

1. Media preparazione

  1. Preparazione di media minimi tamponata (BMG con glicerolo, BMD con destrosio come fonte di carbonio) (1 L)
    1. Autoclave 650 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro tappo a vite 1 L. Dopo il raffreddamento, completare il mezzo aggiungendo 100 mL di autoclavato 10 x YNB (134 g/L lievito azoto base w/o amminoacidi), 200 mL di tampone fosfato di potassio (1 M, pH 6), 30-100 mL di glucosio di 10% w/v o glicerolo (a seconda della quantità di biomassa generata desiderata durante il batch), 2 mL di 500X sterili di soluzione di biotina (10 mg/mL) e riempire fino a 1 L con sterile di acqua distillata.
      Nota: Tutti gli ingredienti devono essere autoclavati in flaconi separati. Biotina è distrutto quando in autoclave e pertanto deve essere filtro sterilizzato con filtri a membrana 0,2 µm.
  2. Tamponata contenuti multimediali (BYPG) (1 L)
    1. Autoclave 700 mL di acqua distillata con 1% w/v lievito estratto e 2% p/v di peptone in una bottiglia da 1 litro tappo a vite. Dopo il raffreddamento, aggiungere 30-100 mL di glicerolo 10% w/v separatamente in autoclave, 200 mL di tampone fosfato di potassio (1 M, pH 6) e riempire fino a 1 L con acqua distillata sterile.

2. Agitare preparazione cilindri

  1. Aggiungere 5 mL di acqua distillata nel 250 mL sconcertato agitare boccette, coprirlo con due strati di panno di cotone e fissarla con gli elastici. Coprire il panno con un pezzo di carta stagnola.
  2. Autoclave le beute a 121 ° C per 20 min per la sterilizzazione completa.
  3. Rimuovere l'acqua residua dalla boccetta e aliquota 50ml del supporto precedentemente preparato in ciascuno dei palloni.

3. durante la notte cultura inoculazione

  1. Avviare una coltura durante la notte (ONC) con una singola Colonia fresca del ceppo espressione desiderata in 5 mL di YPD (Estratto di lievito 1% w/v, peptone 2% w/v, glucosio 2% w/v) in una provetta da centrifuga 50ml, lasciando il coperchio leggermente aperta per permettere l'aerazione adeguata.
  2. Far crescere tutta la notte a 28 ° C, umidità 80%, in uno shaker a 100-130 rpm (2,5 cm di diametro d'agitazione).

4. misura installazione e cultura principale coltivazione

  1. Per impostare il sistema di monitoraggio online, seguire le istruzioni del produttore per la calibrazione dei dispositivi.
  2. Collocare un computer dove è installato il software appropriato per il monitoraggio in gamma per una connessione Bluetooth per le stazioni di misura. Avviare il software per collegare i dispositivi tramite Bluetooth.
    1. Attivare la connessione Bluetooth sul dispositivo di misurazione di biomassa premendo il pulsante d'argento sulla parte anteriore.
    2. Nel software, fare clic su dispositivi quindi Trovare dispositivi.
      Nota: I dispositivi dovrebbero essere visualizzato come un elenco nella finestra sotto la linea di attività. Se non lo fanno, è opportuno controllare se le batterie sono cariche e il computer è a portata di mano per una connessione Bluetooth.
    3. Trascinare e rilasciare i dispositivi rilevati alle piazze sul lato destro della schermata Misurazione vassoio.
    4. Fare clic su Connetti.
      Nota: Quando la connessione è riuscita, viene visualizzata una schermata di controllo.
    5. Per avviare un test per la connessione Bluetooth, fare clic su misura.
    6. Impostare l'esperimento.
      1. Fare clic su Avvia misurazione, nome dell'esperimento e attivare tutti i parametri necessari per il monitoraggio.
        Nota: Le licenze sono necessarie per ciascuno dei possibili parametri misurati.
      2. Impostare intervallo per 3 min.
        Nota: L'intervallo determina quanto spesso punti di misurazione sono presi e ogni punto di misura si traduce in un valore in seguito. Ogni minuto di misurazione è molto preciso, ma un sacco di dati vengono generato che lo rende più laborioso per valutare.
      3. Impostare Punti di misurazione media a 11.
        Nota: Questa impostazione determina quanti punti di misurazione sono effettivamente prese ogni 3 min. Di conseguenza, l'output è il valore medio di 11 punti di misurazione oltre 11 s.
      4. Immettere i nomi per i campioni.
      5. Saltare la schermata successiva, in quanto l'angolo è stato già calibrato prima (punto 4.1).
        Nota: Un test per la connessione Bluetooth prima di inoculare le principali culture è consigliato per garantire connessioni stabili e posizione appropriata del computer collegato. Inoltre, le batterie sono a carico.
  3. Misurare la densità delle cellule delle ONC (punto 3.1) diluita in mezzi di coltura (01:20) con uno spettrofotometro a 600 Nm. 50 mL di terreno di inoculare (consigliato la concentrazione di carbonio fonte 0,3-1%, possibili diversi media come descritto nel passaggio 1.) con l'ONC a un OD600 di 0.05 utilizzando il seguente calcolo.
    Equation 1
  4. Posizionare le beute nei rivelatori e agitare a 28 ° C, 130 giri/min e 80% di umidità.
    Nota: È molto importante dare la cultura 5min di agitazione prima di iniziare la misurazione per evitare le celle attaccarsi al fondo del matraccio e producendo valori errati.
  5. Fare clic su Avvia misura nel software.
  6. Prelevare campioni di 0,2 mL per la misura di densità cellulare 4 h dopo l'inoculazione e quando la fonte di carbonio diventa impoverito (determinazione descritto al punto 4.7) in triplici copie. Diluire i campioni in modo appropriato nei mezzi di coltura (prima misurazione 1:5, seconda misura 01:20) e misurare l'assorbimento a 600 nm in uno spettrofotometro. Prima di rimuovere le beute e persino prima di arrestare lo shaker, sempre di mettere in pausa la misurazione nel software.
    Nota: I rivelatori sono calibrati per registrare i parametri in condizioni definite di agitazione e produrranno per misurazioni di sciocchezze, quando si registra ancora culture. Inoltre, assicurarsi di attendere sempre 5 minuti di agitazione prima di iniziare la misurazione. Le misurazioni della densità cellulare sono essenziali perché il rivelatore sta consegnando i valori soli per la biomassa e la densità delle cellule non reale. Una funzione di calibrazione tra i valori di600 OD (x valori) e i valori ottenuti con il sistema di misura on-line (valori di y) possono essere realizzati misurando spettrofotometricamente punti temporali diversi. I valori sono non in modo lineare, ma in un rapporto logaritmico secondo la seguente funzione di calibrazione:
    Equation 2
    y: valori di600 OD ottenuti mediante lo spettrofotometro
    x: i valori ottenuti dal sistema di misura on-line
    k: pendenza
    d: intercetta asse
    Convertire qualsiasi valore nel corrispondente valore di600 OD utilizzabile quindi la pendenza e l'intercetta di asse. In Excel una possibile tracciare i valori di600 OD spettrofotometricamente ottenuti contro i valori dal sistema online da timepoint stesso. L'aggiunta di una linea di tendenza logaritmica e l'equazione corrispondente darà la funzione di calibrazione sopra indicata.
  7. Coltivare fino a quando la fonte di carbonio è quasi impoverito (ca. 12-20 ore). A tale scopo, lasciare che le culture crescere fino a quando può essere visto nei diagrammi software che la concentrazione di ossigeno è prossimi allo zero e le cellule sono in fase di crescita esponenziale.
    Nota: Questo è il caso per le concentrazioni di fonte di carbonio utilizzata nel presente protocollo. Timepoint di svuotamento fonte di carbonio può essere determinato con il sistema di monitoraggio online, come è dimostrato esemplarmente in Figura 1 nella sezione risultati rappresentante, quando il livello di ossigeno si avvicina a zero e le cellule sono in crescita esponenziale fase.

5. proteina espressione dalla de-repressione

  1. Quando viene raggiunto il timepoint descritto in passaggio 4.6, avviare l'alimentazione le culture mediante l'aggiunta di quattro dischi mangimi per fiaschetta in condizioni sterili.
    Nota: Le condizioni descritte, quattro dischi di mangimi di glicerolo rilasciare glicerolo 2 mg/h secondo il produttore.
  2. Continuare la coltivazione per 60-90 h durante l'assunzione di campioni ogni 24 h per monitorare l'espressione della proteina mediante saggio di scelta (ad es., Bradford saggio15, analisi di16 o attività di SDS PAGE) e misure di densità di cella.

6. cultura raccolta

  1. Dopo le h 60-90 di coltivazione, riempire le culture in provette centrifuga da 50 mL per la raccolta mediante centrifugazione a 4.000 x g, 4 ° C per 10 min.
    Nota: Il surnatante (per proteine secernute) o le cellule (per l'espressione della proteina intracellulare) possono essere raccolte mediante centrifugazione a 4.000 x g, 4 ° C per 10 min e ulteriori analisi possono essere fatte.
  2. Esportare i dati di misura on-line come un file di foglio di calcolo dal software per ulteriori analisi.
  3. Riempire il 5-10 mL di acqua distillata per tutte le boccette e autoclave per inattivare le cellule rimanenti.

Representative Results

Come descritto nella sezione protocollo, il software registra i parametri importanti di coltura sopra la coltura intera. La figura 1 Mostra la visualizzazione di sviluppo di biomassa e la concentrazione di ossigeno durante una coltivazione iniziata con 0,5% (Figura 1A) o 0,3% (Figura 1B) fonte di carbonio nel batch seguito dall'aggiunta di glicerolo feed dischi. Il sistema di monitoraggio online è particolarmente utile per le coltivazioni de-represse come timepoint di svuotamento fonte di carbonio dopo il batch può essere determinato esattamente. Come si può vedere nella Figura 1, la concentrazione di ossigeno nel terreno diminuisce rapidamente e prossimi allo zero, soprattutto per 0,5% glicerolo nel batch (Figura 1A) mentre la biomassa sta aumentando in modo esponenziale a questo punto. Qui, le cellule sono in fase di crescita esponenziale, e al fine di fare un uso ottimale del rilascio fonte di carbonio, poco prima che la cultura raggiunge la fase stazionaria, i dischi di alimentazione devono essere aggiunto come descritto nel protocollo. L'aggiunta dei dischi dell'alimentazione prima che la concentrazione di ossigeno raggiunge lo zero è importante per l'espressione della proteina de-repressa impedire le cellule da limitazione di ossigeno. Le concentrazioni più basse di glicerolo riducono l'effetto delle limitazioni di ossigeno a breve termine come può essere visto in Figura 1B e sono pertanto consigliato per l'espressione della proteina de-represso.

In seguito, i risultati dei due esperimenti – impiegando il protocollo descritto e illustrato nella Figura 1 il sistema di monitoraggio – sono descritte differenti di coltura. Nel primo esperimento, un ceppo di p. pastoris producendo l'ossidasi di glucosio da Aspergillus niger (a. niger) sotto il controllo della PDC e nel secondo un ceppo di p. pastoris produzione di ormone della crescita umano sotto controllo del PDF è indicato.

In questo esperimento, la produzione del glucosio ossidasi sotto il controllo di PDC è stata studiata. Di conseguenza, sono state confrontate le strategie differenti di coltura: glicerolo pulsare, glicerolo costante feed tramite l'aggiunta di mangimi dischi e coltivazione senza ogni feed o pulsante. La coltivazione è stato fatto in media minimi tamponata 50ml con 0,5% glucosio come fonte di carbonio suola in palloni shake da 250 mL (tabella 1).

Su coltivazione 160 h, sono state ottenute le più alte concentrazioni di biomassa, quando una strategia di alimentazione utilizzando un batch di glucosio per la produzione di biomassa (38 h) e glicerolo pulsare (0,25% glicerolo w/v dopo h 38, 61 h e coltivazione h 86) è stato impiegato (totale 0,21 g/L secretiva proteina, 8.4 U/mL). Anche se sono stati ottenuti una riduzione di 2 volte la concentrazione di biomassa e la quantità totale di proteina secreta, quando i dischi di alimentazione sono stati aggiunti dopo batch glucosio h 38, l'attività volumetrica era anche 1 U/mL superiore rispetto alla coltivazione utilizzando glicerolo pulsare . Questo indica che una notevole quantità di proteina secernuta non contribuisce all'attività volumetrica nel surnatante e può essere secreto in forma inattiva. Di conseguenza, le più alte concentrazioni di glicerolo da impulsi di glicerolo apparentemente favoriscono la formazione di biomassa invece la produzione di proteine bersaglio e rilascio di glicerolo basso costante ha portato a più di due volte maggiore produttività specifica.

Un altro esperimento che impiegano il metodo di espressione de-repressa è stato fatto con l'ormone della crescita umano (hGH), sotto il controllo di PDFdi esprimere. Il costrutto è stato stabilmente integrato nel genoma di p. pastoris ceppo BSYBG11. Qui, 50 mL di BYPG, tamponata ricco medio, in 250 mL agitare sconcertato boccette è stato utilizzato con 0,3% (p/v) glicerolo come fonte di carbonio nel batch. Dopo lo svuotamento del glicerolo, l'espressione della proteina con glicerolo costante feed è stata assicurata mediante l'aggiunta di 4 dischi di alimentazione per fiaschetta e rispetto a nessun glicerolo avanzamento (Figura 2).

La figura 2 Mostra il confronto tra hGH espressione e lo sviluppo di biomassa dello stesso ceppo coltivato con e senza glicerolo costante feed. Come panino di dosaggio ELISA è stata utilizzata con l'anticorpo secondario fusa a HRP e rilevamento è stato effettuato con 3,3′, 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) come substrato. Soprattutto per questa proteina, sembrava di essere il caso che senza qualsiasi alimentazione, le cellule iniziano a degradare la proteina prodotta dopo circa 30 h (quadratini blu chiaro), considerando che dall'alimentazione, questa riduzione potrebbe essere impedito (triangoli blu scuri) e anche il concentrazione di proteina per biomassa è aumentato ancora dopo 150 h di coltivazione. Come già osservato per Hansenula polymorpha14, questo risultato dimostra come la commutazione da batch, come è usato solitamente in scala di boccetta di agitare, per modalità fed-batch può ottimizzare p. pastoris coltivazioni.

Figure 1
Figura 1: visualizzazione di online registrati parametri durante due colture con concentrazioni differenti di glicerolo nel batch. Le coltivazioni sono state avviate con 0,5% p/v (A) e 0,3% glicerolo di p/v (B) nel batch seguito dalla fase de-repressione dove le cellule sono state alimentate mediante l'applicazione di alimentazione 4 dischi per fiaschetta (rilascio di 0,5 mg/h/disco secondo il produttore). Le linee tratteggiate mostrano la concentrazione di ossigeno nel terreno, mentre le linee continue indicano la densità delle cellule (OD600). Barre di errore indicano che la deviazione standard di sei replica (biologico 2, tre tecnici di ogni). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: confronto dell'espressione di ormone della crescita umano (hGH) in modalità batch e fed-batch. contenuto di hGH è indicato dai valori di assorbimento a 405 nm di ELISA dove l'anticorpo 2nd era una fusione di HRP e TMB è stato utilizzato come substrato per il rilevamento. Vengono mostrati i risultati per le due diverse culture: luce blu visualizzazione linea e piazze, la densità delle cellule e la concentrazione di hGH normalizzata per la densità delle cellule di una cultura senza qualsiasi feed dopo il batch, rispetto ad una cultura, dove il glicerolo nutrire dischi erano applicato (linee blu scuri e triangoli). Barre di errore indicano che la deviazione standard di sei replica (biologico 2, tre tecnici di ogni). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

P.DC- GOX fase di coltivazione 160 h OD600 attività Vol [U/mL] quantità totale di proteina secernuta [mg/mL] attività volumetrico per densità cellulare
Significa SD Significa SD Significa SD Significa
BMD1% batch + glicerolo pulsare 74,6 2 8.4 2.4 0.21 0,01 0,11
BMD1% batch + glicerolo costante feed 32.5 0.3 9.4 0,7 0,09 0,01 0,29
BMD1% batch 18,8 0.6 3.7 0,7 0,01 0 0.2

Tabella 1: risultati di metanolo indipendente GOX espressione sotto il controllo del promotore de-represso PDC .

Discussion

Questo metodo presenta un protocollo affidabile per espressione inducibile metanolo efficiente indipendente da p. pastoris come alternativa alla classica metanolo ha indotto l'espressione della proteina guidato da PAOX112. De-reprensibile promotori, come il PDC, la PDF o varianti precedentemente descritte di PAOX1 mutato17, costruire la base molecolare per questo nuovo concetto di produzione di proteine. I risultati rappresentativi mostrati sottolineano l'utilità e la praticabilità dell'espressione della proteina ricombinante in p. pastoris di promotori de-repressi e screening in piccola scala con semplice monitoraggio on-line. Da un lato, il metanolo tossico e dannoso che viene solitamente utilizzato per l'induzione del promotore AOX1 può essere eliminato dalla coltivazione. D'altra parte, la crescita e la fase di produzione della proteina sono disaccoppiate9 in contrasto con l'espressione costitutiva della proteina, ad es., con il comunemente usato PGAP. Questo è particolarmente utile quando le cellule dovrebbero esprimere proteine tossiche o nocive che visualizzano un peso per loro.

La possibilità di iniziare le coltivazioni con concentrazioni di origine differente del carbonio permette la decisione di quanta biomassa uno vorrebbe guadagnare prima della fase di produzione di proteina inizia. Quando si sceglie una minore concentrazione di carbonio in origine nel batch, limitazioni di trasferimento di ossigeno a causa della densità delle cellule troppo alto possono essere ridotto mentre invece maggiore densità delle cellule può anche tradursi in più alti titoli di proteina. Monitorando lo sviluppo della cultura in termini di produzione di biomassa e concentrazioni di ossigeno, il tempo-punto ottimo per l'iniziazione di fed-batch può essere determinato facilmente come è mostrato nella Figura 1.

Monitoraggio online di questi parametri di coltivazione, deve essere applicato un sistema di misurazione adeguati. La biomassa (ad es., SFR Vario) dispositivo di misurazione è un semplice e sistema di misura economica online per cultura monitoraggio shake boccette. Il lettore optoelettronico determina la crescita delle cellule nel pallone tramite rilevazione luce sparsi e legge il segnale del sensore dell'ossigeno integrato nel pallone. L'ottica per la misura di biomassa è costituito da un LED che emette un segnale luminoso, che viene diffusa dalle particelle (cellule) il brodo di cultura e rilevato con un fotodiodo. I sensori ottici emettono fluorescenza quando eccitato con la luce di una certa lunghezza d'onda. A seconda della quantità di molecole di analita presente, questo segnale di fluorescenza cambia, che viene rilevato dall'ottica lettore e tradotta in valori di concentrazione. Tuttavia, una calibrazione della misura di densità cella deve essere stabilito in anticipo, poiché il sistema di misurazione non sta misurando i valori effettivi di600 OD. Il tasso di assorbimento di ossigeno può essere calcolato dalla pendenza della curva dell'ossigeno con il software di lettura, e la temperatura così come i giri vengono registrati continuamente insieme agli altri parametri. Per attivare il monitoraggio con questo sistema, le beute di agitare dovranno essere precedentemente dotati di sensori appropriati per i parametri desiderati.

Con l'aggiunta di quattro lento rilascio polimero dischi fornendo una quantità costante di glicerolo nel brodo di cultura, accumulo di biomassa è quasi fermato e produzione di proteine ricombinanti è continuata. La determinazione del punto di tempo di alimentazione disco aggiunta non è un passaggio fondamentale in questo esperimento, ma dovrebbe essere considerato che un inizio precoce dell'alimentazione prima della fase di crescita esponenziale potrebbe essere inibendo l'attivazione del promotore come l'espressione comincia al momento svuotamento di fonte di carbonio. Inoltre, il totale di tempo a causa delle limitazioni di capacità del polimero di alimentazione può essere ridotta, considerando che ritardare il feed dopo che le cellule hanno raggiunto la fase stazionaria potrebbe portare a morire di fame e degrado del prodotto già proteina. La quantità di alimentazione dischi usati in questo protocollo è stata determinata sperimentalmente per il rilascio di fonte di carbonio ottimale mantenere il promotore de-represso tenendo basso di produzione di biomassa (dati non mostrati). In questo modo, le coltivazioni possono essere realizzate facilmente oltre 160-180 h senza alcun intervento.

Applicazioni principali di questo nuovo protocollo sarà in clone di espressione di screening, evoluzione di enzima, la scoperta, la caratterizzazione e ingegnerizzazione di nuovi promotori che impiegano un protocollo privo di metanolo coltivazione in condizioni ben monitorati. In linea di principio, lo stesso protocollo dovrebbe essere applicabile per mangimi misti strategie che impiegano metanolo e limitato fermentativo carbonio fonte feed come descritto da Panula-Perälä et al. nel 2014,18.

Disclosures

Sebbene il protocollo presentato è generalmente applicabile per la coltivazione e l'induzione in condizioni derepresso, Marco e.U. dichiara di avere un interesse nella commercializzazione dei nuovi promotori derepresso utilizzato in questo studio.

Acknowledgments

ROBOX ha ricevuto finanziamenti dal progetto dell'Unione europea (UE) ROBOX (accordo di finanziamento n ° 635734) nell'ambito dell'UE Orizzonte 2020 programma ricerca e innovazione azioni H2020-LEIT BIO-2014-1. Le viste e le opinioni qui espresse sono solo quelle degli autori e non riflettono necessariamente quelle dell'agenzia di ricerca dell'Unione europea. L'Unione europea non è responsabile dell'uso che potrà essere fatto delle informazioni in esso contenute.

La tesi di dottorato di J. Fischer è co-finanziata da una sovvenzione per la "Tesi di Industrienahe" dell'Agenzia austriaca di finanziamento FFG.

Ringraziamo Gernot John (PreSens GmbH) per le utili discussioni e prezioso contributo per la stesura del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
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Metanolo espressione indipendente di <em>Pichia Pastoris</em> che impiegano tecnologie di-repressione
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Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).More

Fischer, J. E., Hatzl, A. M., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).

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