Summary

HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.

Abstract

La angiogénesis es un fenómeno que incluye diferentes procesos, como la proliferación de células endoteliales, la diferenciación y la migración, que conducen a la formación de nuevos vasos sanguíneos e implican varias vías de transducción de señales. Aquí mostramos que el ensayo de formación de tubos es un método in vitro simple para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis e investigar los mecanismos moleculares involucrados. En particular, en presencia del extracto de agua de Ruta graveolens (RGWE), las células endoteliales ya no son capaces de formar una red celular y que los efectos RGWE sobre la formación de tubos de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) son abolidos por la formación de tubos de células sociales humanas (HUVEC) activación constitutiva de MEK.

Introduction

La angiogénesis es un proceso fisiológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y se produce durante la embriogénesis y el crecimiento de órganos. En la edad adulta, la angiogénesis se activa sólo en el ovario de ciclismo, en la placenta durante el embarazo y durante la cicatrización y reparación de heridas. La angiogénesis depende de la capacidad de las células endotelialespara proliferar, diferenciar y migrar para formar una red vascular intacta 1. Sin embargo, en varios trastornos, como enfermedades inflamatorias, metabólicas y reumáticas, los procesos angiogénicos se alteran y la angiogénesis se vuelve excesiva. Además, los procesos angiogénicos no controlados también estimulan la progresión tumoral y la metástasis1. Por estas razones, en la última década, los estudios de investigación se centran en el desarrollo de nuevasestrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición de la angiogénesis excesiva en trastornos del cáncer, ocular, articular o cutáneo 2,3.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) representa elobjetivo principal de las terapias antiangiogénicas actuales 4, y se han desarrollado y sintetizado varios anticuerpos monoclonales anti-VEGF para prevenir la angiogénesis excesiva. Sin embargo, estas drogas sintéticas muestran efectos secundarios graves y tienen una relación costo-beneficio desfavorable5,6. Por lo tanto, es imperativo encontrar nuevas estrategias terapéuticas para limitar la angiogénesis excesiva con efectos secundarios mínimos para complementar y combinar con los fármacos utilizados actualmente. Estos nuevos fármacos se pueden encontrar entre los productos naturales que se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica.

En este artículo, proponemos un método sencillo para evaluar el impacto de la RGWE en la capacidad delos HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelificada in vitro 5. De hecho, RGWE es una mezcla de metabolitos secundarios como flavonoides y polifenoles entre los que la rutina es el componente principal5. Muchos de ellos ya han sido probados como agentes antiinflamatorios y vasoprotectores7,8,9,10,11. Además, recientemente hemos demostrado que RGWE, pero no la rutina, es capaz de inhibir la capacidad de HUVEC para formar túbulos en una matriz de sótano gelizada y que este fenómeno está mediado por la vía MEK-ERK, lo que indica RGWE como una herramienta terapéutica potencial capaz de evitar la formación excesiva de nuevos vasos sanguíneos5.

Protocol

1. Preparación de RGWE Recoger las hojas de R. graveolens de las plantas durante los meses de primavera/verano bajo la supervisión de un botánico.NOTA: En este caso, las hojas fueron recogidas en la Sección Experimental de Plantas Medicinales en el Jardín Botánico de Nápoles, Italia5. La planta es espontánea, perenne y está presente enlas regiones mediterráneas (Figura 1). Pesar 250 g de hojas y picarlas fina…

Representative Results

Para evaluar la influencia de RGWE en la angiogénesis, llevamos a cabo un ensayo de formación de tubos sobre una matriz de sótano gelificada. Cuando se cultivan en él, los HUVEC forman estructuras similares a tubos que se originan a partir de células que aparecen alargadas y que se conectan entre sí para formar una red de células celulares (Figura2). En la Figura3, mostramos que el número de sucursales en LOS HUVEC tratad…

Discussion

Los compuestos naturales se caracterizan por una alta diversidad química y especificidad bioquímica y representan una fuente de moléculas potencialmente terapéuticas. Aquí, mostramos cómo obtener extracto de agua de la planta R. graveolens y proponemos el ensayo de formación de tubos como un método fácil de realizar, confiable y cuantitativo útil para investigar los efectos de RGWE en la angiogénesis. Es importante hervir las hojas de R. graveolens durante 1 h para asegurarse de obtener el ex…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo ha sido financiado por Fondi di Ateneo a los fondos del Programa Luca Colucci-D’Amato y VALERE a Maria Teresa Gentile y al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.

Materials

HUVEC cells Clontech C2519A
FBS Invitrogen 10270106
EBM-2 basal medium Clontech cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors clontech cc4147
Matrigel Corning 354234
96-well plates Thermo Scientific 167008
15 mL conical tubes Sarstedt 62,554,502
10 mL disposable serological pipette Sarstedt 861,254,001
5 mL disposable serological pipette Sarstedt 861,253,001
1000 μL pipette Gilson Pipetman classic
100 μL pipette Gilson Pipetman classic
20 μL pipette Gilson Pipetman classic
p1000 pipette tips Sarstedt
p20-200 pipette tips Sarstedt 70,760,502
Burker chamber Fortuna
Trypan blu stain Gibco 15250-061
DPBS Gibco 14190-094
mill-ex 0.22 um filters Millipore SLGS033SS
Lyophilizer VirTis-SP Scientific
Incubator Thermo Scientific
CO2 AirCos
Pen-Strep Gibco 15070-063
100 mm dish Sarstedt 833,902
pcDNA3 Invitrogen v79020
Lipofectamine-2000 Invitrogen 11668027
Opti-MEM Gibco 31985070 Reduced serum medium
Rutin Sigma-Aldrich R5143-50G
Axiovert 25 microscope Zeiss
AmScope MD500 camera AmScope
Dispase Thermo Scientific D4818
Lab heater Falc
ParaFilm American National Can

References

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
  3. Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
  4. Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
  5. Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
  6. Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
  7. Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
  8. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  9. Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
  10. Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
  11. Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
  12. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
  13. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gentile, M. T., Pastorino, O., Bifulco, M., Colucci-D’Amato, L. HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis. J. Vis. Exp. (148), e58591, doi:10.3791/58591 (2019).

View Video