Summary
Protokollet beskrivs här beskriver immunofluorescens analys, biocytin återhämtning och högkvalitativa rekonstruktioner av hippocampus CA2 interneuroner efter den intracellulära elektrofysiologiska recordings in vitro tillåter neuronala karakterisering och ytterst fina neuronala anatomi studeras.
Abstract
Hur kortikalt nätverksaktivitet bearbetar är information av betydelse för ett stort antal grundläggande och kliniska vetenskapliga frågor. Protokollet beskrivs här identifierar de grundläggande byggstenarna i denna kretsar. De fördjupade studierna av kortikala regioner kommer att i slutändan ge andra forskare med krets komponenter behövs för förståelsen av hur hjärnan förvärvar, processer och lagrar information och vad som går fel i sjukdom, medan den elektrofysiologiska och morfologiska data används allmänt av computational neuroforskare i byggandet av modellen nätverk som utforska informationsbehandling. Protokollet beskrivs här beskriver hur biocytin-fyllda celler registreras i regionen CA2 i hippocampus är återhämtade och sedan rekonstrueras i 3D. Protokollet beskrivs dessutom demonstrationen av kalcium bindande protein eller peptid innehåll i inspelade interneuroner.
Introduction
I hjärnbarken och hippocampus är strukturer av sådan komplexitet att klassificeringen av neuronala subtyper1,2,3,4, kartor över kopplingarna mellan dem.5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 och hur detta kretsar stödjer kognitiva funktioner12,13,14,15 är fortfarande under intensiva studier och fortsatta debatt. Till exempel att förstå detaljerna och komplexiteten i kretsarna att samordna data från många olika studier och, det är mycket hjälpsamt för att kunna definiera och beskriva komponenterna, men det är fortfarande en fråga för debatt hur många olika klasser av nervceller finns, eller ens om det är möjligt att definiera alla neuroner som tillhör en viss klass. Beräkningsverktyg som kan bygga och testa kretsar med varierande grad av komplexitet är att vara utvecklade16,17,18, men centralt för dessa strävanden är behovet av detaljerade studier av celltyper och egenskaper av sambanden mellan dem. En stor mängd information om de lokala kretsarna i hjärnbarken hos vuxna råttor har redan samlats in med protokollet beskrivs här10,19,20,21, 22. även om ”kopplingsschema” är långt ifrån komplett, vissa tydliga mönster eller regler har uppstått. Dessutom, även om vissa detaljer varierar, är dessa regler gemensamma till två däggdjursarter (råtta och katt) och över flera hjärnbarkens regioner, möjliggör utveckling av grundläggande byggstenar som sannolikt kommer att vara lika tillämpliga på mänskliga hjärnbarken. Den teknik som beskrivs här används för att utöka vår förståelse för funktionella karta över kortikala kretsar genom att identifiera de presynaptiska och postsynaptiska neuronerna som inblandade i anslutningar i de regioner som inte har studerats i detalj innan, ett protokoll som gör utmärkta vävnad bevarande och anmärkningsvärd färgning återhämtning i vuxen hjärnvävnad. Uppgifter om de lokala kretsarna i CA2 och neuronala boenden i detta delfält har samlats med denna metod genom att kombinera intracellulära elektrofysiologiska inspelningar (Parade inspelningar med skarpa mikroelektroder) med biocytin fyllning, immunofluorescens, histologiska förfaranden och mycket detaljerade neuronala rekonstruktioner, möjliggör direkt jämförelse med närliggande CA regioner23,24,25.
Tekniken som beskrivs i denna artikel har utvecklats under åren för att få detaljerad neuronala anatomi tillåter korrekt klassificering av celler och hög kvalitet och korrekta rekonstruktioner av båda deras dendritiska och axonal arbors, data som kan vara korrelerade med elektrofysiologiska insamlade från Parade inspelningar med skarpa elektroder. Histologiska protokollet har optimerats för att bevara ultrastruktur av nervceller och få utmärkt återvinning av både (inklusive Dendritutskotten) och axonal arbors. Till exempel ger principen om dubbel fixering tekniken genom att för det första nedsänkning i en fixativ lösning och för det andra efter fastställande i osmium vanligtvis en bra kontrast för ljusmikroskopi26. En liten mängd glutaraldehyd och pikrinsyra lösning tillsätts fixativ lösningen att förbättra antikropp penetration och bevara cellernas ultrastruktur som föreslås i en tidigare studie27. Permeabiliseringen i hjärnan skivor med metoden frysning-tining kombinerat med kryo-skydd med sackaros, snarare än ett traditionellt rengöringsmedel, ger också optimalt bevarande av vävnader för detaljerad Morfologisk analys av inspelade cellerna. Dessutom bättre visualisering särskilt av mycket fina strukturer genom att minska bakgrundsfärgning, med inkubationer med väteperoxid (H2O2) och natriumborhydrid (NaBH4). Att lägga till nickel klorid (NiCl2) till pepparrotsperoxidas (HRP) ökar reaktion att få en svart pigment reaktionsprodukt också kontrasten.
Följande protokoll beskriver de förfaranden som används för att fastställa utmärkt vävnad bevarande och mycket detaljerade neuronala 3D rekonstruktioner efter intracellulära inspelningar i vitro. Beskrivning av slice preparatet, intracellulära Parade inspelningar med skarpa elektroder och efterföljande histologiska förfaranden som används i vårt laboratorium har varit tidigare rapporterade28. Även om protokollet gäller för cellerna intracellulärt fylld biocytin i 450 – 500 μm tjocka skivor, får samma protokoll användas efter hela-cell inspelningar. Men kommer att användningen av tunnare skivor resultera i mindre fullständig rekonstruktioner av cellerna.
Protocol
Alla förfaranden som används i hela denna studie genomfördes enligt de brittiska Home Office förordningarna när det gäller djur vetenskapliga förfaranden Act 1986.
1. bestämning av kalcium bindande Protein eller proteininnehållet i interneuronen och Biocytin visualisering efter elektrofysiologiska inspelningar och Biocytin fyllning
Obs: I slutet av elektrofysiologiska inspelningarna, skivor som innehåller biocytin-fyllda celler är fasta över natten före histologiska förfaranden. Fixativ lösningen kommer att ersättas med en enda förändring 0,1 M fosfatbuffert nästa morgon, om resten av proceduren utförs på en annan dag, för att förhindra vävnadsskada. Fixering lösningen (4% paraformaldehyd, 0,2% mättade pikrinsyra lösning, 0,025% glutaraldehyd lösning i 0,1 M fosfatbuffert (PB)) måste göras färsk på dagen av inspelningarna för bästa resultat.
- I slutet av elektrofysiologiska inspelningen, försiktigt plocka upp segmentet som innehåller inspelade cellerna med en pensel och placera den i en kruka som innehåller konstgjorda cerebral ryggmärgsvätskan (ACSF).
Obs: Detaljer för det protokoll som används för slice förberedelser och intracellulära inspelningar med skarpa elektroder har tidigare beskrivits28. - I ett dragskåp, försiktigt plocka upp på hjärnan segmentet med en pensel och rulla den på en liten fin kvalitet filter papper. Placera en annan bit fuktad filtrerpapper på segmentet och placera två bitar av våta filterpapper i en liten plastkruka som innehåller 5-10 mL fixativ lösning och förvara i kylen över natten vid 4 ° C.
- Bered en lösning av gelatin i destillerat vatten. Häll 20 mL destillerat vatten i en bägare på en värmeplatta och Värm till 60 ° C. Tillsätt successivt 2,4 g gelatin till vatten, vänta tills upplöst och låt det svalna till 35 – 40 ° C före användning för att förhindra vävnadsskada.
- Ersätta fixativ lösningen med 2 mL 0,1 M PB. Placera segmentet i en petriskål och skär bort någon överflödig vävnad med skalpell blad. Placera den trimmade vävnaden i en petriskål (9 cm i diameter, höjd 1,4 cm), säkerställa att det ligger platt utan veck eller veck och ta bort överflödig bufferten med en torr pensel.
- Täcka vävnaden med varma gelatin lösningen och placera petriskål på ett fryst block svalna snabbt lösningen.
- Använda en vinkel-poise lampa för att ge kontrast, Titta igenom sidan av skålen och hålla segmentet platta med lätt tryck från en fin pensel tills gelatinet börjar.
Obs: Gelatin kan vara åter smält om vävnaden inte ligger platt. Eventuella ojämnheter på ytan av gelatin förorsakade av avlägsnande av pensel eftersom det stelnar kan avlägsnas genom smältning ytskiktet försiktigt genom att flytta glödlampan av lampan nära ytan i några sekunder. - Flytta skålen av inställningen gelatin till kylskåpet och lämna vid 4 ° C i 30-60 min.
- I ett dragskåp, klipp ut ett litet block (~ 1 x 1 cm) som innehåller gelatin-embedded vävnaden i skålen med hjälp av en skalpell blad, lyfta blocket med hjälp av en liten spatel och försiktigt placera den i samma men fräsch fixativ lösningen används fixar skivor under minst 30 minuter vid 4 ° C .
- Tvätta gelatin blocket i 5 mL 0,1 M PB tre gånger, torka den med en bit papper vävnad och stick den blockera sidan uppåt (dvs.med vävnaden längst upp) på en vibratome chuck med superlim.
- Ta bort överflödigt lim med en bit av filterpapper och använda en skalpell blad avskurna hörn av blocket, lämnar en diamantform.
- Avsnitt slice på 50 µm tjocklek med hjälp av en vibratome och placera varje avsnitt noggrant i en injektionsflaska av glas innehållande 10% sackaros.
- Försiktigt plocka upp ett avsnitt från injektionsflaskan, placera den platta i en petriskål locket. Använda dissekera Mikroskop och ett färskt skalpell blad, ta bort gelatin från runt avsnittet och återgå avsnittet till en flaska innehållande 2 mL färsk 10% sackaros
Obs: Det är viktigt att ta bort så mycket gelatin som möjligt i detta skede att minska vävnad krympning under uttorkning steget (steg 1,37). - Cryo-skydda avsnitten i 0.1 M PB-baserade sackaros-glycerol lösning vid rumstemperatur genom inkubering i 10 min i 10% sackaroslösning, 20 min i 20% sackaros - 6% glycerol lösningen två gånger och slutligen 30 min i 30% sackaros - 12% glycerol lösningen två gånger under ständig agitation.
- Placera i avsnitt platt på en liten rektangel av tin omkullkastar genom att använda en pensel. Ta bort överflödig vätska från avsnitten och noggrant vik i aluminiumfolie i ett skifte.
- Håll skiften nära ytan av flytande kväve utan att vidröra ytan för 30 s och sedan låta avsnitten Tina helt för cirka 30 s. Upprepa den frysning-tining en annan två gånger.
- Ta bort alla avsnitt med en pensel och placera dem i en injektionsflaska av glas innehållande 2 mL 0,1 M PB under ständig omskakning att tvätta bort överflödig sackaros.
- Ta bort PB med en Pasteur-pipett och inkubera avsnitten i 2 mL 1% vattenlösning H2O2 för 30 min. Tvätta avsnitten i 2 mL av 0,1 M PB 3 x 5 min.
- Ta bort 0,1 M PB med en Pasteur-pipett och tillsätt 1% natriumborhydrid (NaBH4) i 0,1 M PB.
Obs: Inte cap injektionsflaskan, som NaBH4 lösning avger vätgas. - Ta bort natriumborhydrid med en Pasteur-pipett och tvätta avsnitten grundligt i 2 mL 0,1 M PB 5 x 5 min.
- Ersätta 0,1 M PB med 10% normalt get serum (NGS) i 0,1 M PB i 30 min.
- Ta bort bocken serumet och inkubera avsnitten övernattning på 4 ° C i en blandning av mus monoklonal och kanin polyklonala antikroppar består i ABC lösning.
Anmärkning: En lista över primära antikroppar används i tidigare studier visas i tabell 1 i Botcher et al. (2014) 29. - Inkubera i avsnitt 2 h i mörker i en blandning av fluorescently-märkta sekundära antikroppar (Tabell för material).
- Montera avsnitten på bilder i monteringsmedium och täck med ett täckglas.
- Ta bilder av fluorescens märkning på 40 X förstoring (figur 1Bb).
- Efter fluorescensen imaging, placera bilden i en glas petriskål som innehåller PBS och ta försiktigt bort täckglaset. Tvätta sedan avsnitten utanför bilden använder lätta ljuspulser PBS från en Pasteur-pipett. Placera avsnitten i en ren glasflaska innehållande PBS.
- Utföra avidinen-HRP reaktionen genom att för det första ruvning avsnitten i ABC för minst 2 h att förstärka HRP reaktionsprodukten.
- Bered den 3,5 Diaminobenzidin (DAB) genom att lägga till en tablett 5 mL destillerat vatten.
- Tvätta avsnitten med PBS tre gånger i 10 min och sedan med Tris buffert två gånger för 10 min. ta bort Tris buffert efter den sista tvättningen.
- Snabbt lägga till en droppe av 8% NiCl2 lösning till DAB lösningen, Pipettera lösningen in och ut för att blanda och tillsätt 1 mL av denna lösning snabbt över delar. Inkubera i avsnitt i DAB/NiCl2 lösningen för 15 min.
- Tillsätt 10 µL av 1% H2O2 till DAB lösningen. Låt reaktionen att gå vidare i mörkret under konstant omrörning i ca 1 till 2 min och övervaka märkning av fyllda cellerna med dissekera Mikroskop.
- Stoppa reaktionen genom att ta bort DAB/NiCl2h2O2 lösningen och tvätta avsnitten med Tris buffert två gånger för 5 min.
- I ett dragskåp, placera en liten krets av filterpapper i en petriskål och fukta det med 0,1 M PB. Lyft i avsnitt en i taget från glaset flaskan med hjälp av en pensel och placera dem försiktigt platta på papperet.
- Täcka avsnitten med en annan fuktade cirkel filtrerpapper och ta bort överflödig buffert genom att försiktigt trycka mjukpapper till ytan.
- Gäller 8 – 9 droppar 1% osmium vanligtvis i 0,1 M PB och den översta papperet, täck skålen och behålla i dragskåp för minst 30 min, men inte mer än 1 h.
- Öppna petriskål och lyft det övre filterpappret. Lyft i avsnitt försiktigt en i taget med en pensel, placera dem i en injektionsflaska av glas och skölj dem i destillerat vatten två gånger.
- Avyttra osmium vanligtvis avfallet på lämpligt sätt. Skölj all disponibel utrustning och placera dem på lämpliga lagerplatser.
- Placera varje avsnitt platt på ett objektglas och täckglas avsnitten. Överför bilden i en petriskål, placera en tom glasflaska över täckglaset att behålla den på plats och täck med 50% alkohol. Efter 15 min, ta bort bilden från lösningen och ta bort avsnitten från bilden. Plats i avsnitt tillbaka på bilden och sedan placera bilden i 70% alkohol för 15 min. Upprepa samma process med 95% och slutligen 100% alkohollösning.
- Efter uttorkning steget, överföra avsnitten till en injektionsflaska av glas innehållande 100% alkohol på en shaker i ett dragskåp. Ersätta alkohol lösningen med propylenoxid (C3H6O) och tvätta tre gånger för 5 min. Efter den sista tvättningen, hålla ~ 2 mL propylenoxid i injektionsflaskan och lägga till harts (1:1 ratio). Säkerställa att kådan löses och hålla avsnitten under konstant omrörning i 30 min.
- Placera varje avsnitt i en aluminium planchette som innehåller epoxiharts med en träpinne och inkubera över natten.
Obs: Lämna inte avsnitten i kådan längre än 24 h för att undvika risken för skador på avsnitten. - Plats planchette över en värmeplatta för cirka 10 min. plocka upp varje avsnitt med en träpinne och placera dem på en ren bild. Hålla orienteringen för varje avsnitt konsekvent med dissekera Mikroskop. Placera ett täckglas över avsnitten. Placera bilden i ugnen i 48 h vid 56 ° C för att bota.
2. 3D neuronala rekonstruktioner
Obs: Neurolucida programvara används. Instruktionerna nedan gäller endast för ett specifikt neurone återuppbyggnad system (Tabell för material). Avsnitten från styckningen matchas innan de rekonstruktioner med Mikroskop.
- Placera en bild på scenen och säkra med scen klipp och öppna programvaran neuron återuppbyggnad. Klicka på Skaffa fliken och välj Live-avbilden.
- Mät tjockleken på varje avsnitt med hjälp av 100 X olja objektiv. Anteckna värdet på z-mätaren på toppen och botten av varje avsnitt och beräkna snittjockleken som skillnaden mellan de två värdena.
- Använd en låg förstoring mål för att fokusera på de hem innehåller avsnittet cellkroppen. Sedan använda ett 100 x mål, fokusera på cellkroppen och klicka i mitten att markera referenspunkten.
- Fliken spår , Välj Seriell avsnitt Manager. Välj sedan Skapa nytt avsnitt (+ ikon) i fönstret Serial sektionschef . Ange antalet sektioner. Namnge varje avsnitt i rätt ordning för Z och ange skär tjocklek mäts i steg 2.2.
- För att spåra soma i 3D med 100 X mål, Välj kontur från fliken spår och välj Cell kroppen konturen. Joysticken flytta fokus till toppen av cellkroppen. Placera punkter genom att klicka runt omkretsen av den del som för närvarande är i fokus. Högerklicka och välj Stäng kontur till slut det första utkastet. Upprepa denna process på olika z positioner tills botten av cellkroppen uppnås (figur 2).
Obs: Välj 3D visualisera i Trace -fliken att visualisera cellkroppen i 3D. - För att spåra cell kroppen i 2D med 100 X målsättningen, Välj cellkroppen menyn Neuron i fliken spårning fokus på mitten av cellkroppen. Placera punkter genom att klicka runt omkretsen av cellkroppen. För att slutföra cellkroppen, högerklicka och välj Avsluta cellkroppen.
- För att spåra dendritiska bersån, Välj Dendrite eller Apikala Dendrite i menyn Neuron . Först spåra ett kort, initiala segment för varje dendrite använda musens rullhjul för att justera markören för att matcha dendrite diameter diameter. Spåra längs varje dendriter som med hjälp av joysticken flytta över avsnittet och musens rullningshjul att justera diametern på spårning.
- Kontrollera uppriktningen av kalkeringen med levande Mikroskopbilden och justera vid behov, särskilt efter att ha flyttat med hjälp av joysticken. Spår på fliken Välj Justera spårning, klicka på spårning och klicka sedan på rätt plats.
- När en nod i trädet nås, högerklicka och välj Bifurcating noden eller Trifurcating från droppa-ned menyn.
- När slutet av en gren har nåtts, Välj en ändelse från den nedrullningsbara menyn i menyn Neuron . Välj rätt slutar typ, dvs., hög slut, normala slut eller low slutar att underlätta matchande över avsnitt.
- Minska förstoringen på mikroskopet när alla dendriter i det aktuella avsnittet har spårats, Välj fliken Glädje fria och flytta till ett avsnitt som matchar omedelbart ovanför eller nedanför avsnittet avslutade.
- För att identifiera matchande punkter mellan dendriter i ett avsnitt som matchar avslutade avsnittet, klicka på den Flytta fliken och välj Match points. Välj antalet poäng som behövs för att matchas (tre eller fler punkter är att föredra) och tryck sedan på OK. Klicka på slutet av en avslutad gren och klicka sedan på grenen. Upprepa detta för varje matchboll. Upprepa denna process på 100 X förstoring för exakt matchande.
- Lägga till matchande grenar i föregående avsnitt direkt genom att högerklicka på ändelsen. Välj Lägg till slut när grenen linjer med den ifyllda spårade gren och spår enligt beskrivningen ovan.
- När alla dendriter av varje avsnitt har spårats, spåra axon använder samma process genom att välja Axon från menyn Neuron .
- Gå till avsnittet hem , åter justera återuppbyggnaden med levande Mikroskopbilden och välj konturer från fliken spåra Välj en fördefinierad contour/skikt gränsregionen/kantlinje och klicka på spåra längs en kontur. Välj slutet öppet kontur. Spåra alla önskat lager och regionen konturer.
- Använd 3D visualisera i Trace -fliken för att visualisera rekonstruktionerna i 3D.
- Att spela in video i 3D rekonstruktioner (Video 1), öppna den 3D rekonstruktionen och skapa filmer. Ange en Fildestination och önskade rotationshastighet. Det är rekommenderat att ange roteringen till 270°. Välj Starta inspelning, rekord för några sekunder, klicka på Auto-rotera. Välj stoppa inspelningen när det behövs. Redigera video med ett videoredigeringsprogram (Tabell för material).
- För att exportera filer till Tiff- eller JPEG-filer, Välj filen | Exportera | Exportera spårning som bild. Välj en µm/pixel-förhållande och välj Fit. Välj en bakgrundsfärg och välj fil. Namnge filen och välj Tiff eller JPEG tryck Spara. För att exportera filer till vektor filer, Välj filen | Exportera | Exportera spårning som vektor filer.
- Använd en neuron återuppbyggnad analys programvara för att utföra morfometriska analyser.
- Att analysera dendritiska träd och få ett dendrogram, öppna filen i Neurolucida Explorer. Välj analysera | Struktur och välj Dendrogram från droppa-ned menyn (figur 3).
- För att utföra en omfattande morfometriska analys av de 3D rekonstruktionerna (gren komplexitet, volymer av filialer och somas, yta), öppna filen i programvaran. I fliken Visa klickar du på Markera alla. Välj fliken analysera . Välj sedan struktur och Gren strukturanalys.
3. felsökning
- Ändra kamerainställningarna. För bästa resultat, Ställ in exponeringstiden till mindre än 100 ms och vinna och kompensera så nära 0 som möjligt.
- Om neuron återuppbyggnad programvaran inte visas automatiskt spåras konturer som 3D cell organ i 3D visualisera i Trace -fliken, Välj Markera objekt i Trace flik, håll ner Ctrl -tangenten på tangentbordet och Klicka på alla ritade konturer, högerklicka och välj sedan Ange cell kroppen på den nedrullningsbara menyn.
- Justera z-parametrarna för en individuell gren, Välj trädet (Markera objekt i Trace -fliken) och ställa in nedrullningsbara z-justering av alla punkter via högerklicksmenyn. Välj ändra z position, Välj SKIFT z värdet och ange önskat värde.
- Justera de rekonstruktioner som använder 'Gå till' på fliken ' Flytta' när det är nödvändigt att flytta ett stort avstånd över spårning.
- Lägga till fler noder när som helst under återuppbyggnadsprocessen. Välj den gren där noden är att placeras in i (Välj objekt i Trace -fliken och klicka på grenen), högerklicka och välj Infoga nod till utvalda träd. Klicka sedan på rätt plats på grenen.
- När rekonstruera en komplex neurone, spåra matchande grenar individuellt och senare skarva dem för enklare identifiering av grenar. Spåra grenarna i avsnittet nya individuellt och sedan bifoga dessa grenar till de matchande grenarna på föregående avsnitt genom att hovra över slutet på grenen skarvas, högerklicka och välja skarva, sedan svävar över ändelsen som grenen är att skarvas till och klicka på.
- Om en filial är spåras under fel träd typ, Välj trädet, högerklicka på väljer du Ändra träd typoch välj rätt träd.
- Om en punkt är felaktigt placerad, utföra Ctrl + Zeller klicka på Ångra -knappen i menyn spår att ta bort den sista punkten. Detta förfarande fungerar dock inte om styrspaken används för att flytta hela avsnittet innan du försöker ta bort en punkt. I det här fallet kan punkten tas bort när grenen är avslutad. Välj grenen (tryck på Välj objekt och klicka på grenen), håll muspekaren över punkten tas bort, högerklicka och välja ta bort punkt.
- Om du är osäker om två grenar matchas, antingen (1) Använd 3D visualisera i Trace -fliken för att kontrollera avsnitt huruvida grenarna matcha i z-planet, eller (2) använda Visa flankerande funktionen i seriell avsnitt Manager för att Visa omedelbart över och under det aktuella avsnittet i grått.
- Om ett avsnitt är vänt, gå till verktyg på fliken spåra Välj Justera XY skalning och ändra x-axeln till -1. Markera rätt Z-krympning och ändra z-axeln till -1. Sedan spåra grenar som vanligt. Kom ihåg att ångra dessa ändringar när du flyttar till ett avsnitt som hade den ursprungliga orienteringen. Förändras de x - och z - axeln kommer inte ändra gren slutar etiketter, så var försiktig när skarvning att korrekta ändelser används.
- Rätt Z-krympning kan korrigeras, om det finns en betydande skillnad mellan avsnittet skär tjocklek och monterade tjockleken mätt. I fliken spår , Välj verktygoch sedan rätta till Z-krympningoch ange den krympning faktorn för z-axeln som en decimal representation av skurna tjocklek dividerat med tjockleken monterade.
Representative Results
Nervceller i hippocampus CA2 fylldes med biocytin efter elektrofysiologiska recordings (siffror 1Ac, Ad och 1Bc, Bd). Skivor var fasta över natten efter inspelningarna och de neurokemi och morfologisk karakterisering av nervceller avslöjades efter det protokoll som beskrivs här.
Den kalcium bindande protein eller proteinhalt i fyllda interneuroner bestämdes genom ruvning skivor först med primära antikroppar och sedan med fluorescently märkta sekundära antikroppar. Bränning egenskaperna hos interneuroner under inspelningarna kommer att diktera valet av primära antikroppar används. Avidinen-AMCA användes för att visualisera den biocytin-fyllda interneuron och antimus fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och get anti-kanin Texas Red (TR) har använts för att karakterisera interneuronal neurokemi (figur 1Bb).
Efter fluorescens visualisering användes ett HRP protokoll att avslöja biocytin (figur 1Ab). Fina detaljerade anatomi CA2 interneuroner drogs sedan i 3D med en neuron återuppbyggnad programvara (figur 2 och figur 3a). En video av en 3D rekonstruktion av en korg cell registreras och fyllt i CA2 visas i Video. Neuronala rekonstruktioner ansågs vara komplett om båda de dendritiska och axonal arbors begränsades inom djupet av 450-500 μm segmentet. Stackars axonal arbor färgning bedömdes av närvaron av avklippta grenar med öppen ändelser på toppen eller botten av slice eller genom en färgning som var begränsad till axon inledande segmentet och mycket proximala grenar. Figur 4 representerar en bra och en dålig HRP färgning följande biocytin visualisering exempel.
Morfometriska analys av 3D rekonstruktioner (figur 3) kan utföras för att påvisa gren komplexitet, soma yta och yta och volym av de dendritiska och axonal arbors.
Figur 1 : Neuronala rekonstruktioner av två typer av korg celler registreras och fyllt i regionen Hippocampus CA2 och korrelerade elektrofysiologiska data som erhållits efter intracellulära recordings in vitro. Denna siffra har ändrats från tidigare studier23,24. SÅ Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Moleculare. (A) Aa: återuppbyggnad av en CA2 korg cell med begränsad dendritiska och axonal berså med en ritning tube (1000 X). Dendriter är i svart, och axon är i rött. AB: Bilden av biocytin-fylld korg cellen efter det metoden-HRP-protokollet som beskrivs här. AC: Representativa spår av spänning Svaren till hyperpolarizing och depolariserande nuvarande injektion av en CA2 korg cell med begränsad dendritiska och axonal arbor. Annons: Exempel på en CA2 pyramid till smala arbor korg cell anslutningar inspelade med skarpa elektroder. Sammansatta excitatoriska efter synaptiska potentialen (EPSP) medelvärden visar kort tåg depression uppenbara under Svaren till tåg av tre spikar. (B), Ba: 2D återuppbyggnaden av en CA2 korg cell med bred dendritiska och axonal arbors använder en ritning tube (1000 X). Dendritiska trädet av denna korg cell (i svart) extended radiellt genom alla lager av CA2 regionen och horisontellt i SO och SP av CA2 och CA3 regioner. En horisontell dendrite nådde också regionen CA1. Axonet (i rött) utvidgas till regionerna CA3 och CA1. BB: Biocytin-fyllda (AMCA färgningen) korg cellen var PV-immunopositive (FITC färgning) och CB-immunonegative (Texas-röd färgning). BC: Representativa spår av spänning Svaren till hyperpolarizing och depolariserande nuvarande injektion av en CA2 korg cell med bred dendritiska och axonal arbor. BD: Sammansatta EPSP medelvärden visar kort tåg underlättande uppenbara under Svaren till tåg av tre spikar. Exempel på andra typer av interneuroner registreras i CA2 kan hittas i tidigare studier25,30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : 3D cellkroppen återuppbyggnad. (A) 3D spårning av cellkroppen. Visa olika konturer spåras vid olika z positioner samtidigt fokusera genom cellkroppen. (B) 3D-vy av olika konturer. (C) 3D-vy av cell kroppen i en annan vinkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Morfometri analyser av 3D neuronala rekonstruktioner. (A) 3D rekonstruktion av en CA2 smala arbor korg cell. Varje dendritiska filial representeras av en färg (grön, blå, röd och rosa) och axon är i ljusblått. (B) Dendrogram korg cellens representerar antalet dendritiska grenar och längden på varje segment inom sfärer koncentriska med soma och 100 μm intervall från soma. Färgerna på dendrogram motsvarar till de av dendriter i A. (C) exempel på morfometriska analys utförs på CA2 pyramidala celler (anpassad från en tidigare studie23). Antalet dendritiska grenar var plottas mot avståndet från soma av CA2 pyramidala celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Exempel på bra (A) och dålig b HRP färgning. (A) Biocytin återhämtning visade en mycket väl fyllda interneuron i CA2. Cellkroppen (CB) är mörkt missfärgade och har tydliga konturer. Dendriter är pärlstav och visas vissa spines (företrädd av röda stjärnor). Axonal bersån (A) är tät och presenterar små knappar. (B) exempel på en dålig dendritiska och axonal färgning av 2 pyramidala celler i CA2. Färgningen av CB är svag med någon tydlig disposition. Stackars färgning förknippas ofta med kortare elektrofysiologiska inspelningar vilket resulterar i närvaro av mycket få biocytin-fyllda grenar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: 3D neuronala rekonstruktion av en CA2 korg cell med begränsad dendritiska arbor (också kallad CA2 smala arbor korg cell) med dess soma i stratum pyramidale, dendriter som spänner över alla lager och axon i CA2 stratum pyramidale och intilliggande stratum oriens och radiatum. Mycket få grenar nådde proximala CA3 stratum oriens och CA3 stratum pyramidale. Denna cell fylldes med biocytin efter elektrofysiologiska inspelningar och sektioner behandlades med avidinen-HRP efter protokollet beskrivs här. På grund av skivning återfanns endast axon inom segmentet djup, även dendriter är intakt. Dendriter är mörkrosa och axon i vitt. Lager och regionen gränser har lagts till i början av videon. 3D rekonstruktion av Georgia Economides-3D video av Svenja Falk. Videon spelades in med en neuron återuppbyggnad programvara som anges i steg 2.17 och redigeras med ett videoredigeringsprogram. Länk till video:30. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
| Lösningar används | Sammansättning med instruktioner. |
| Fixering lösning | 4% paraformaldehyd, 0,2% mättade pikrinsyra lösning, 0.025% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB) |
| 0,1 M fosfatbuffert pH 7,6 | Tillsätt 100 mL lager 1 M fosfat buffert till 900 mL destillerat vatten |
| Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) pH 7,4/7.5 | Tillsätt 10 mL 0,1 M fosfatbuffert, 0,2 g KCl och 8.76 g NaCl till 990 mL destillerat vatten |
| TRIS buffert pH 7,5 | Lös 5,72 g Tris hydroklorid och 1,66 g Tris Base i 50 mL destillerat vatten. Gör sedan upp till 1 L med destillerat vatten. |
| Glutaraldehyd och paraformaldehyd fixativ buffertlösning | 4% paraformaldehyd, 0,2% mättade pikrinsyra lösning, 0.025% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert. |
| ABC lösning | Lösningen skall göras minst 30 min innan användning från ABC kit. Tillsätt 1 droppe av lösning A och 1 droppe av lösning B till 2,5 mL PBS. |
| Durcupan epoxiharts: | Att göra 20 krukor: 20 g komponent A, 20 g komponent B, 0,6 g av komponent C och 0,4 g komponent D - |
| Skydda balansen från spill genom att täcka plattan med en cirkel filtrerpapper. Noga väga reagenser till en tripour bägare i de proportioner som anges ovan. Blanda omsorgsfullt genom omrörning kraftfullt med två träpinnar för minst 5 min. Blandningen bör bli en enhetlig täthet mörk brun färg. Placera bägaren i ugn på ~ 50 ° C i högst 10 min att ta bort så många luftbubblor som möjligt. Obs: Kådan börjar bota om du lämnar bägaren i ugnen längre än 10 min. Dekantera kådan ut i plastkrukor eller 5 mL sprutor, datum dem och förvaras i-20 ° C frysen redo för användning. |
Tabell 1: Tabell över lösningar.
Discussion
Elektrofysiologiska inspelningar i vitro (figur 1 Ac,d och f.Kr., d) kombinerat med histochemical och immunhistokemisk förfaranden gör det möjligt för de detaljerade morfologi, kalcium bindande proteininnehåll och identiteten hos vuxna kortikala interneuroner registreras för att avslöjas. I regionen CA2, denna teknik får studien av de lokala kretsarna för första gången och avslöjade underklasser till interneuroner som inte hade tidigare beskrivits i CA1 eller CA3: bred dendritiska och axonal arbor korg celler (figur 1B), bistratified celler och SP-SR interneuroner.
Protokollet beskrivs här har optimerats för att bevara ultrastruktur av nervceller och få utmärkt återvinning av både (inklusive Dendritutskotten) och axonal arbors. Kritiska steg inkluderar användning av dubbel fixering teknik för att förbättra kontrast för ljusmikroskopi26 och tillägg av glutaraldehyd och pikrinsyra lösning till fixativ lösning för att förbättra antikropp penetration och bevara den neuronala ultrastruktur27. Mild frysning-tining vilket ger bättre bevarande av fin struktur, medan osmication och harts inbäddning minska z-planet krympning28. Visualisering av mycket fina strukturer (fina axoner med små knappar till exempel) är dessutom förbättras genom ruvning avsnitten med H2O2 och NaBH4 att minska bakgrundsfärgning. Kontrast kan också ökas med tillägg av NiCl2 till HRP reaktion.
Histologiska förfarandet beskrivs här erbjuder utmärkta resultat när det gäller reproducerbarhet och tillförlitlighet. Varaktigheten av elektrofysiologiska inspelningarna kommer dock avgöra kvaliteten på biocytin/fluorescensen färgning, med kortare inspelningar vanligtvis förknippas med dålig axonal färgning. Valet av inspelning protokoll (intracellulära inspelningar med skarpa elektroder vs. hela-cell patch fastspänning) kan också påverka biocytin bevarande och bevarande av fina anatomi.
Medan svårigheterna som möter i bevara fin struktur under histologisk bearbetning beskrivs här och den tid det tar att rekonstruera på 100 X förstoring (1-4veckor beroende på komplexiteten i axonen) uppskattas, denna metod ger en korrekt representation av dendritiska och axonal diametrar. Användning av mindre krävande protokoll att avslöja biocytin-märkning är förståeligt, men dessa utgör hinder ofta tydlig visualisering av fina axonal grenar. Rengöringsmedel, för att främja införandet av metoden-HRP att avslöja biocytin och antikroppar, är ofta nödvändiga i tjocka sektioner, men kan störa fin struktur. Neuroforskare Sök ständigt för halvautomatiska metoder för återuppbyggnad, men, för förblir nu och för axoner särskilt, biocytin-HRP med manuell återuppbyggnad den gyllene standard31.
Mycket detaljerade neuronala rekonstruktioner, särskilt noggranna ritningar av axonal knappar och noder, närvaro eller frånvaro av myelin och mer allmänt ritningen av komplett axonal arbor, med representation av korrekt axon-diameter förändras längs dess längd, tillhandahålla ytterligare information för korrekt identifiering av en distinkt typ av interneurone. Även om många interneuroner inte kan passar exakt i en viss klass, ger den teknik som beskrivs ovan korrelerade data på neuronal elektrofysiologiska egenskaper, kortsiktiga plasticitet är associerad med en viss typ av anslutning och detaljerade neuronala rekonstruktioner, så att kopplingsschemat, i regionen CA2, exempelvis kan studeras i detalj.
Fin, detaljerad struktur är ofta förenklat i beräkningsmodeller. Medan förståeligt, resulterar detta i förlust av information som kan vara avgörande i framtiden. Analys av detaljerade 3D rekonstruktioner med parallella synaptic data kommer att tillåta tillägg av ytterligare kriterier för interneuronal klassificering. Data kan deponeras i offentliga databaser och används av modellbyggare för att utforska resultatet av sporadiska ändringar i axon diameter och myelinisering på aktionspotentialens spridning computationally.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har fått finansiering från Novartis Pharma (Basel) och medicinska forskningsrådet tilldelas Prof Alex Thomson, bioteknik och biologiska Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), fysiologiska samhället, EUs Ramprogrammet Horisont 2020 för forskning och Innovation under de särskilda avtal nr 720270 (Human Brain Project SGA1) och under den särskilda avtal nr 785907 (mänskliga hjärnan projektet SGA2). Vi är ytterst tacksamma för Prof Alex Thomson för att ställa in protokollet i andra kortikala regioner, säkra finansiering och för hennes fortsatta stöd för detta projekt. Bidrag från lab-medlemmar som hjälpte till att optimera återhämtning protokollet och rekonstruerade CA2 neuron är erkänt tacksamt: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
