Summary
Протокол, изложенные здесь описывает помощью иммунофлуоресцентного анализа, biocytin восстановления и реконструкции высокого качества гиппокампа CA2 интернейронов после внутриклеточных электрофизиологических записи в пробирке, позволяя нейронов Характеристика и в конечном итоге штраф нейрональных анатомии для изучения.
Abstract
Как корковых сетевой активности процессов информация имеет важное значение для большого числа фундаментальных и клинических научных вопросов. Протокол, описанные здесь определяет основные строительные блоки этой схемы. Углубленные исследования корковых регионов будет в конечном итоге обеспечить другие ученые с компонентами цепи необходимы для понимания как мозг получает, обрабатывает и хранит информацию и что идет не так в заболевании, а электрофизиологических и морфологические данные широко используются вычислительные неврологи в строительство сетей модели, которые исследуют обработки информации. Протокол, изложенные здесь описывается как biocytin заполнены клетки, записанная в регионе CA2 гиппокампа оправился и затем реконструирован в 3D. Кроме того протокол описывает проявление кальция связывания белка или пептида контента в записанных интернейронов.
Introduction
Коры головного мозга и гиппокампе являются структуры такой сложности, что классификация нейронов подтипы1,2,3,4, карты связей между ними5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 и как эта цепь поддерживает когнитивные функции12,13,,1415 находятся в стадии интенсивного исследования и предметом продолжающихся дебатов. Например, чтобы понимать детали и сложности схемы и координации данных, полученные из многих различных исследований, это очень полезно иметь возможность определить и описать компоненты, но она остается предметом обсуждения как много различных существуют классы нейронов, или даже является ли это можно определить все нейроны как принадлежащие к определенного класса. Вычислительные средства, которые можно построить и проверить схемы с разной степени сложности в настоящее время развитые16,17,18, но центральное место в этих усилиях является необходимость для детального изучения типов клеток и свойства соединений между ними. Уже собрано большое количество информации о местных схем коры головного мозга взрослых крыс с помощью протокола описаны здесь10,19,20,21, 22. Хотя «схема» является далеко не полным, некоторые ясные шаблоны или появились правила. Кроме того хотя некоторые детали различаются, эти правила являются общими для двух видов млекопитающих (крысы и кошка) и в нескольких регионах кортикальное, позволяя развития основные строительные блоки, которые могут быть в равной степени применимы к человека Неокортекс. Метод, описанный здесь используется для расширения нашего понимания функциональной карте корковых схемы путем выявления Пресинаптический и постсинаптических нейронов, участвующих в связи в регионах, которые не были изучены в деталях прежде, используя протокол что позволяет сохранение отличные ткани и замечательные окрашивание восстановления в ткани взрослого мозга. Путем объединения внутриклеточных электрофизиологических записи (парные записей с острыми микроэлектродов) с biocytin начинкой, с помощью этого метода были собраны данные о местных схем в CA2 и нейрональных свойства в этом вложенном иммунофлюоресценции, гистологические процедуры и высоко детализированные нейрональных реконструкций, позволяя прямое сравнение с соседними CA регионов23,24,25.
Метод, описанный в этой статье был разработан с годами для получения подробных нейрональных анатомии, позволяя правильной классификации клеток и высокое качество и точные реконструкций как их дендритных и аксональной беседок, данные, которые могут быть коррелирует с электрофизиологических данных, собранных из парных записей, используя острые электродов. Гистологические протокол оптимизирован для сохранения ультраструктуру нейронов и получить отличные восстановления дендритных (включая шипиков) и аксональной беседки. Например принцип двойной фиксации техники, во-первых окунет в фиксирующие решения и во-вторых, после фиксации в осмия тетраоксид дает хороший контраст для световой микроскопии26. Небольшое количество раствора пикриновой кислоты и глутаровый добавляются фиксирующие решение для улучшения проникновения антитела и сохранения ультраструктуру клетки как это было предложено в предыдущем исследовании27. Permeabilization срезы мозга с помощью метода замораживания оттаивания, в сочетании с крио защита с сахарозой, а не традиционные моющие средства, также обеспечивает оптимальное сохранение тканей для детального морфологического анализа записанных клеток. Кроме того визуализация особенно очень тонких структур повышается за счет уменьшения фон окраски, с инкубаций с перекисью водорода (H2O2) и натрия боргидрид (4NaBH). Добавление пероксидазы (ПХ) Хлорид никеля (NiCl2) реакция получить продукт реакции черный пигмент также увеличивает контрастность.
Следующий протокол описывает процедуры, используемые для выяснения отличные ткани сохранения и высоко детализированные нейрональных 3D реконструкций, после внутриклеточных записей в пробирке. Описание подготовки фрагмента, внутриклеточный парных записи с помощью острый электродов и последующего гистологического процедуры, используемые в нашей лаборатории были ранее сообщалось28. Хотя Протокол применяется к ячейкам внутриклеточно заполнены с biocytin в 450 — 500 мкм толстые ломтики, тот же протокол может использоваться после поклеточного записей. Однако использование более тонкие ломтики приведет к менее полной реконструкции клеток.
Protocol
Все процедуры, используемые в настоящем исследовании были проведены согласно правилам внутренних дел Великобритании в отношении животных научных процедур Закона 1986.
1. определение привязки белка или содержание белка интернейронов и Biocytin визуализации после электрофизиологических записей и заполнения Biocytin кальция
Примечание: В конце электрофизиологических записей, фрагменты, которые содержат biocytin заполненные ячейки фиксируются на ночь до гистологические процедур. Фиксаторные решения будут заменены одной смены 0,1 М фосфатного буфера следующим утром, если остальная часть процедуры проводится на другой день, чтобы предотвратить повреждение тканей. Решение фиксации (параформальдегида 4%, 0,2% насыщенных пикриновой кислоты раствор, глютаральдегид 0,025% раствора в 0,1 М фосфатного буфера (PB)) следует свежий день записи для достижения наилучших результатов.
- В конце электрофизиологических записи тщательно подобрать фрагмент, содержащий записанные ячейки с кистью и поместите его в кастрюлю содержащие искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО).
Примечание: Детали протокола, используемого для подготовки фрагмента и внутриклеточных записей, используя острые электроды были описаны ранее28. - В Зонта тщательно подобрать срез мозга с кистью и раскатайте его на небольшой кусок фильтровальной бумаги высокого качества. Место другой кусок смоченной фильтр-бумаги на срез и поместите две части мокрый фильтр-бумаги в небольшой пластиковый горшок, содержащий 5-10 мл раствора фиксирующие и хранить в холодильнике на ночь при 4 ° C.
- Приготовляют раствор желатина в дистиллированной воде. 20 мл дистиллированной воды в стакан на горячей плите и нагреть до 60 ° C. Добавить в воду постепенно 2,4 г желатина, подождите пока растворится и дайте ему остыть до 35 – 40 ° C перед использованием для предотвращения повреждения тканей.
- Фиксаторные решение замените 2 мл 0,1 М PB. Место среза в чашку Петри и отрезать любые излишки ткани с лезвием скальпеля. Обрезанной ткани в чашке Петри (диаметр 9 см, высота 1,4 см), обеспечение того, что он лежит плоские без складок и заломов и удалите избыток буфер с помощью сухой кистью.
- Покрытие ткани раствором теплой желатина и место Петри на замороженных блоков для быстрого охлаждения решение.
- С помощью лампы угол равновесие обеспечивают контраст, посмотрите на стороне блюдо и держать ломтик плоская, с помощью светового давления от тонкой кистью до тех пор, пока желатин начинает набор.
Примечание: Желатин может быть повторно топленое, если ткань не лежать. Неровности на поверхности желатина, вызванные удаления кисть, как он твердеет могут быть удалены путем плавления поверхностного слоя осторожно передвигая колба лампы близко к поверхности в течение нескольких секунд. - Переместить блюдо параметр желатин в холодильнике и оставить на 4 ° C на 30-60 мин.
- В Зонта, вырезать небольшой блок (~ 1 x 1 см) содержащие желатин встроенный ткани блюдо с помощью лезвие скальпеля, поднимите блок, с помощью небольшой лопаткой и осторожно поместите его в то же, но свежий фиксирующие решение используется для фиксации фрагментов для по крайней мере 30 мин при температуре 4 ° C .
- Мойте блок желатина в 5 мл 0,1 М PB три раза, высушить его с помощью кусок бумаги и палку, блок стороной вверх (то есть, с ткани в верхней) на vibratome патрон с помощью суперклея.
- Удалите излишки клея с кусок фильтровальной бумаги и использовать лезвие скальпеля срезать углы блока, оставляя ромб.
- Раздел ломтик на 50 микрон толщины с помощью vibratome и поместите каждую секцию тщательно в стеклянный флакон с 10%-ая сахароза.
- Тщательно подберите раздел из флакона, поместить его квартиру в Петри блюдо крышкой. С использованием рассечения микроскоп и свежие скальпель лезвие, удалите желатин из вокруг раздела и вернуть флакон с 2 мл свежего 10% сахарозы секции
Примечание: Важно удалить как можно больше желатина на данном этапе сокращения усадка ткани при дегидратации шаг (шаг 1.37). - Крио защитить разделы в 0,1 на основе PB М сахарозы глицерола раствор при комнатной температуре, инкубации их за 10 мин в 10% растворе сахарозы, 20 минут в растворе глицерина 20% сахарозы - 6% и, наконец, дважды 30 мин в растворе глицерина 30% сахарозы - 12% дважды под Постоянное агитации.
- Место разделы на небольшой прямоугольник фольги олова, используя кисть. Удалите любой избыток жидкости из разделов и аккуратно сложить фольги олова в посылку.
- Держите посылку близко к поверхности жидкого азота не касаясь поверхности для 30 s, а затем позволить разделы таять полностью около 30 с. повторить еще два раза замораживания оттаивания.
- Удалите все разделы с кистью и поместите их в стеклянный флакон с 2 мл 0,1 М PB под постоянным агитации смыть излишки сахарозы.
- Удаление PB с пипетка Пастера и инкубировать в подразделах 2 мл 1% водного раствора H2O2 за 30 минут промыть в подразделах 2 мл 0,1 М PB 3 x 5 мин.
- Удаление 0,1 М PB с пипетка Пастера и добавить 1% натрия боргидрид (4NaBH) в 0,1 М PB.
Примечание: Не Крышка флакона, как NaBH,4 решение испускает газообразный водород. - Удаление боргидрид натрия с пипетка Пастера и вымойте тщательно в разделах 2 мл 0,1 М PB 5 x 5 мин.
- Замените 0,1 М PB 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) в 0,1 М PB 30 мин.
- Удаление козьего сыворотки и инкубировать разделы на ночь при 4 ° C в смеси моноклональные мыши и кролика polyclonal антитела в решение ABC.
Примечание: Список первичных антител, используемые в предыдущих исследованиях отображается в таблице 1 в Botcher и др. (2014) 29. - Инкубируйте в разделах 2 h в темноте в смесь дневно помечены вторичных антител (Таблица материалов).
- Смонтируйте разделы на слайды монтажа средних и крышка с coverslip.
- Принимать образы флуоресценции маркировки на 40 кратном (bрис. 1B).
- После флуоресценции изображений слайд в чашке Петри стекла, содержащие PBS и тщательно удалить coverslip. Затем промойте разделы слайда с помощью нежные импульсов PBS из пипетки Пастера. Место разделы во флакон чистого стекла с PBS.
- Выполните авидин ПХ реакции, во-первых инкубации разделы в ABC для по крайней мере 2 h усилить HRP продукт реакции.
- Приготовляют раствор 3,5 Диаминобензидин (DAB), добавив одну таблетку в 5 мл дистиллированной воды.
- Мыть секции с PBS три раза за 10 мин и затем с буфера Tris дважды за 10 мин удалить буфер Tris после последнего мыть.
- Быстро добавить одну каплю раствора2 NiCl 8% решение DAB, Пипетка решение и смешать и быстро добавить 1 мл этого раствора над разделами. Инкубируйте разделы в решении2 DAB/NiCl за 15 мин.
- Добавьте 10 мкл 1% H2O2 решение DAB. Разрешить реакции для продолжения работы в темноте под постоянным агитации за около 1-2 мин и контролировать маркировки заполненных клеток с микроскопом рассечения.
- Остановить реакции, удалив DAB/NiCl2/h2O2 решения и мыть секции с буфера Tris дважды за 5 мин.
- В Зонта небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и ослабить его с 0,1 М PB. Поднимите разделы один момент из стекла флаконе с помощью кисти и место их тщательно плоский на бумаге.
- Охватывают разделы с другой смоченной круг фильтровальной бумаги и удалите избыток буфера нежно прикасаясь оберточной бумаги на поверхности.
- Применить 8 – 9 капель 1% осмия тетраоксид в 0,1 М PB для верхней бумаги, Обложка блюдо и удерживать в вытяжной шкаф для по крайней мере 30 минут, но не более чем 1 час.
- Откройте Петри и поднимите верхний фильтровальной бумаги. Осторожно поднимите секции одновременно с кисть, поместите их в стеклянный флакон и промойте их в дистиллированной воде дважды.
- Утилизация отходов осмия тетраоксид надлежащим образом. Промойте все одноразовые оборудования и поместите их в соответствующие контейнеры.
- Место каждой секции на стеклянное скольжение и coverslip разделы. Перевести слайд в чашку Петри, поместите пустой стакан флакона coverslip сохранить ее на месте и крышка с 50% спирта. После 15 минут удалить слайд из решения и удалите разделы из слайда. Место разделы обратно на слайде, а затем поместить слайд в 70% спирта для 15 минут повторите тот же процесс с 95% и, наконец, 100% спиртовой раствор.
- После обезвоживания шаг передать разделы стеклянный флакон с 100% алкоголя на шейкер в зонта. Замените спиртовой раствор окиси пропилена (C3H6O) и мыть три раза за 5 мин. После последнего мыть Держите ~ 2 мл окиси пропилена в пробирку и добавить смолы (соотношение 1:1). Убедитесь, что смола растворяется и сохранить разделы под постоянным агитации за 30 мин.
- Каждый раздел в алюминиевой планшет, содержащей эпоксидную смолу с помощью деревянной палочкой и инкубировать на ночь.
Примечание: Не оставляйте разделы в смоле, дольше, чем 24 часа, чтобы избежать риска повреждения разделов. - Место, планшет над горячей плитой для примерно 10 мин забрать каждый раздел с деревянной палочкой и разместить их на чистой слайд. Держите согласуется с использованием рассечения Микроскоп ориентации каждого раздела. Место coverslip на разделы. Поместите слайд в духовке в течение 48 ч в 56 ° C для лечения.
2. 3D реконструкций нейронов
Примечание: Neurolucida программное обеспечение используется. Приведенным ниже применяются только к конкретным Неврон реконструкции системы (Таблица материалов). Разделы, полученные из резания совпадают до реконструкции с помощью микроскопа.
- Поместите слайд на сцене и зафиксировать хомутиком стадии и откройте программу реконструкции нейрон. Нажмите на вкладку приобретать и выберите Live-образа.
- Измерьте толщину каждого раздела с помощью 100 X Нефть объектива. Запишите значение на z метр в верхней и нижней части каждого раздела и расчета толщины среза как разница между двумя значениями.
- Используйте низкий увеличение цель сосредоточиться на дома раздел, содержащий клетки тела. Затем использовать объектив 100 x, сосредоточиться на клетки тела и нажмите кнопку в центре для обозначения точки отсчета.
- Из вкладки трассировки выберите Раздел Менеджер серийный. Выберите Создать новый раздел (значок +) в окне Диспетчера раздела серийный . Введите количество секций. Имя каждого раздела в правильном порядке Z и введите отрезока толщина измеряется в шаге 2.2.
- Чтобы проследить сома в 3D с использованием 100 X цели, выберите контур из вкладки трассировки и контур тела клетки . Используйте джойстик для перемещения фокуса на самом верху клетки тела. Поместите очки, нажав вокруг периметра часть, которая в настоящее время находится в фокусе. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите пункт Закрыть контур закончить этот первый набросок. Повторите этот процесс на разных z позиции до тех пор, пока в нижней части клетки тела достигается (рис. 2).
Примечание: 3D визуализации трассировки закладке выберите визуализировать клетки тела в 3D. - Проследить клетки тела в 2D, с помощью 100 X цели, выберите клетки тела из меню нейрон в закладке трассировки фокус на середине клетки тела. Поместите очки, нажав вокруг периметра клетки тела. Для завершения тела клетки, щелкните правой кнопкой мыши и выберите закончить клетки тела.
- Чтобы проследить дендритных Арбор, выберите Dendrite или Апикальных дендритов в нейрон меню. Первый след короткий, первоначальных сегмента для каждого дендритов, с помощью колеса прокрутки мыши для регулировки диаметра курсор, чтобы соответствовать диаметр дендритов. След вдоль каждой дендритов, используя джойстик для перемещения через секцию и колесо прокрутки мыши для регулировки диаметра трассировки.
- Проверьте выравнивание трассировки с изображением живой микроскопа и корректировать по мере необходимости, особенно после перемещения с помощью джойстика. На вкладке Трассировка выберите Выровнять трассировки, нажмите на отслеживание и затем нажмите на нужное место.
- Когда достигается в дереве узел, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Количество Trifurcating узел или из раскрывающегося меню.
- Когда достигнут конец ветвь, выберите окончание из раскрывающегося меню в меню « нейрон ». Выберите правильный конечный тип, т.е., высокий конец, нормальное окончание или лВЛ окончание для облегчения сопоставления между разделами.
- Уменьшите масштаб на микроскопе после того, как все дендритов в текущем разделе был проложен, выберите вкладку Радость свободного и перейти к разделу, который соответствует сразу выше или ниже разделе завершенные.
- Для определения точек сопоставления между дендритов в раздел, соответствующий секции завершено, нажмите на вкладку переместить и выберите очка матча. Выберите количество баллов, необходимых для сопоставления (три или более точек является предпочтительным) и затем нажмите кнопку ОК. Нажмите на окончание завершенных ветвь и нажмите на ветке. Повторите это для каждой точки матча. Повторите этот процесс на 100 крат для обеспечения точного соответствия.
- Добавьте соответствующие ветви в предыдущем разделе напрямую, щелкнув правой кнопкой мыши на окончание. Выберите Добавить в конец , когда филиал линии с завершенных прослеживается отделение и трассировки, как описано выше.
- После того, как все дендритов каждой секции был проложен, проследить аксона, используя такой же процесс, выбрав Axon нейрон меню.
- Перейдите в секцию дома , повторно выровнять реконструкция с живой Микроскоп изображение и выберите контуры из трассировки tab. Выберите границы предопределенные контур/слой границы или региона проследить по контуру. Выберите конец открытого контура. Отслеживать все желаемого слои и региона контуры.
- Используйте 3D визуализации в закладке трассировки для визуализации реконструкций в 3D.
- Для записи видео 3D реконструкций (1 видео) Откройте 3D-реконструкции и создания фильмов. Установите файл назначения и требуемой скорости вращения. Рекомендуется для установки угла поворота 270 °. Выберите начать запись, запись на несколько секунд, затем нажмите кнопку автоматического поворота. Выберите остановить запись при необходимости. Редактировать видео с видео редактирования программного обеспечения (Таблица материалов).
- Чтобы экспортировать файлы в формате Tiff или JPEG файлы, выберите файл | Экспорт | Отслеживание экспорта как изображение. Выберите мкм/пиксель соотношение и подходят. Выберите цвет фона и выберите файл. Имя файла, выберите JPEG или Tiff и нажмите сохранить. Чтобы экспортировать файлы в векторные файлы, выберите файл | Экспорт | Отслеживание, экспорт как векторные файлы.
- Используйте программное обеспечение анализа реконструкции нейрон для выполнения морфометрического анализа.
- Чтобы проанализировать дендритных деревья и получить дендрограмма, откройте файл в обозревателе Neurolucida. Выберите анализировать | Структура и дендрограмма выберите из раскрывающегося меню (рис. 3).
- Чтобы выполнить всеобъемлющий морфометрический анализ 3D реконструкций (филиал сложности, объемы филиалов и СОСМ, площадь поверхности), откройте файл в программном обеспечении. На вкладке вид нажмите кнопку выбрать все. Выберите вкладку анализ . Затем выберите Структура и Анализ структуры отрасли.
3. Устранение неисправностей
- Изменить настройки камеры. Для достижения наилучших результатов установите время экспозиции до менее чем 100 мс и получить и компенсировать как можно ближе к 0, как можно скорее.
- Если нейрон реконструкции программное обеспечение не показывать автоматически прослеживаются контуры как 3D тела клетки в 3D визуализации в трассировки на вкладке, выберите выбрать объекты в закладке трассировки , удерживайте нажатой клавишу Ctrl на клавиатуре и Нажмите на все нарисованные контуры, щелкните правой кнопкой мыши и в раскрывающемся меню выберите команду набор клеток тела .
- Z-параметры отдельных ветвь, выберите дерево (Выбор объектов на вкладке Трассировка ) и задать z регулировка всех точек через контекстное меню падение вниз. Выберите изменить позиции z, а затем выберите значение z сдвиг и введите требуемое значение.
- Выравнивание с помощью «Перейти» на вкладке « переместить», когда это необходимо для перемещения на большое расстояние по отслеживанию реконструкций.
- Добавление дополнительных узлов в любой момент во время процесса восстановления. Выберите филиал, где узел должен быть помещен в (Выбор объекта в закладке трассировки и нажмите на ветке), щелкните правой кнопкой мыши и выберите Вставить узел в выбранные дерево. Затем нажмите на нужном месте на ветке.
- При реконструкции сложных Неврон, отслеживать соответствующие ветви индивидуально и позже Химера их проще идентификации филиалов. След филиалов в новом разделе индивидуально и затем присоединить эти ветви в соответствующие отделения в предыдущем разделе, парящей над окончание ветви быть сращивания, щелкните правой кнопкой мыши и выберите пункт соединения, а затем парящей над окончание, филиал является сращивания на и нажмите кнопку.
- Если филиал прослеживается под дерево неправильный тип, выберите дерево, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Изменить тип дереваи выберите тип правильные дерево.
- Если точка помещается неправильно, выполните Ctrl + Z, или нажмите кнопку отменить в меню трассировки , чтобы удалить последнюю точку. Однако эта процедура не будет работать, если используется джойстик для перемещения через раздел, прежде чем пытаться удалить точку. В этом случае точки могут быть удалены, когда ветвь завершается. Выберите филиал (пресс Выберите объект и нажмите на ветке), наведите на точку следует удалить, щелкните правой кнопкой мыши и выберите Удалить точку.
- Если вы не уверены ли соответствуют две ветви, либо 1) использовать 3D визуализация в закладке трассировки для проверки ли ветви матч в плоскости z, или 2) использовать Показать фланговые функцию в разделе Менеджер серийный для отображения разделов немедленно выше и ниже текущего раздела в серый цвет.
- Если раздел переворачивается, перейдите в инструменты на вкладке Трассировка выберите Настроить XY масштабирования и изменить оси x-1. Затем выберите правильный Z-усадка и изменить ось z-1. Затем как обычно след ветви. Не забудьте отменить эти изменения при переходе к разделу, который имел исходную ориентацию. Изменение осей x и z - не изменится филиал, заканчивающийся этикетки, так что будьте внимательны, когда сплайсинга, что используются правильные окончаний.
- Правильное Z-усадка может быть исправлена, если существует значительная разница между секцией, сократить толщину и навесные толщиной измеренная. На вкладке трассировки выберите инструменты, затем исправить Z-усадкаи введите коэффициент усадки для оси z как десятичное представление отрезока толщины, разделенных толщину навесные.
Representative Results
Нейроны гиппокампа CA2 были заполнены с biocytin после электрофизиологических записи (цифры 1Ac, Ad и 1Bc, Bd). Ломтики были зафиксированы на ночь после записи и нейрохимии и морфологическая характеристика нейронов были выявлены после протокол, описанных здесь.
Белок, связывающий кальций или содержание белка заполненные интернейронов определяется инкубации ломтики сначала с первичных антител и затем дневно помечены вторичные антитела. Обжиг характеристики интернейронов во время записи будет диктовать выбор основного антитела, которые используются. Авидин-AMCA была использована для визуализации заполнены biocytin межнейронного и анти мыши флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) и коз анти кролик Техас красный (TR) были использованы для характеризовать interneuronal нейрохимия (Рисунок 1Bb).
После визуализации флуоресценции ПХ протокол был использован раскрыть biocytin (Рисунок 1Ab). Тонкой подробное анатомии CA2 интернейронов было обращено в 3D, с помощью программ реконструкции нейрон (рис. 2 и рис. 3a). Видео 3D реконструкции Корзинчатый нейрон записан и заполнить CA2 отображается в видео. Нейрональных реконструкций были рассмотрены как полный если дендритных и аксональной беседки были ограничены в глубину среза 450-500 мкм. Бедные аксональное Арбор пятнать оценивали присутствие усеченного филиалов с открытым окончаний в верхней или нижней части фрагмента или путем пятнать что была ограничена аксон первоначального этапа и очень проксимальной филиалов. Рисунок 4 представляет примеры хорошей и плохой HRP окрашивание следующие biocytin визуализации.
Чтобы продемонстрировать филиал сложности, Сома площадь и площадь поверхности и объем дендритных и аксональной беседки может осуществляться морфометрический анализ 3D реконструкций (рис. 3).
Рисунок 1 : Нейрональных реконструкции двух типов клеток корзина записан и заполнены в регионе гиппокампа CA2 и коррелирует электрофизиологических данных получены следующие внутриклеточных записи в пробирке. Эта цифра была изменена с предыдущих исследований23,24. ТАК Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, ОДС слое Stratum Lacunosum Moleculare. (A) АА: реконструкция CA2 корзину ячейки с ограниченным дендритных и аксональной Арбор, с использованием рисования трубки (1000 X). Дендритов в черном, и аксон в красный. AB: Изображение biocytin заполнены корзину ячейки после авидин ПХ протокол, описанных здесь. AC: Представитель след напряжения ответы на гиперполяризирующий и расшатывания текущего инъекции CA2 корзину ячейки с ограниченным дендритных и аксональной Арбор. Объявление: Пример CA2 пирамиды сузить Арбор корзину ячейки соединения записаны с помощью резкое электродов. Композитный возбуждающим пост синаптический потенциал (ВПСП) средние Показать краткое поезд депрессии очевидной во время ответы на поезда три пики. (B) Ba: 2D реконструкция CA2 корзину ячейки с широким дендритных и аксональной беседки с помощью рисования трубки (1000 X). Дереве дендритных клеток этой корзины (в черном) продлил радиально через все слои CA2 региона и горизонтально в так и SP CA2 и CA3 регионов. Одна Горизонтальная дендритов также достигли регионе CA1. Аксона (в красном) распространена на CA3 и CA1 регионов. BB: Biocytin заполнены (AMCA окрашивание) Корзинчатый нейрон был PV-immunopositive (FITC окрашивание) и CB-immunonegative (Техас-красное окрашивание). До н.э.: Представитель след напряжения ответы на гиперполяризирующий и расшатывания текущего инъекции CA2 корзину ячейки с широким дендритных и аксональной Арбор. BD: Композитный EPSP средние Показать краткое поезд упрощению очевидной во время ответы на поезда три пики. Примеры других типов интернейронов, записанная в CA2 можно найти в предыдущих исследованиях25,30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Реконструкция 3D тела клетки. (A) 3D трассировки клеток тела. Представление разных контуров, трассируется в позициях различных z, хотя упором через тело клетки. (B) 3D вид разных контуров. (C) 3D вид тела клетки под другим углом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Анализ морфометрия 3D реконструкций нейронов. (A) 3D реконструкция CA2 узкие Арбор Корзинчатый нейрон. Каждая ветвь дендритных представлена цвета (зеленый, синий, красный и розовый) и аксон в светло-голубой. (B) дендрограмма Корзинчатый нейрон, представляющие количество дендритных филиалов и длина каждого сегмента, содержащихся в сферах концентрических с сома и интервалы 100 мкм из сома. Цвета на дендрограмма соответствуют дендритов в A. пример (C) Анализ морфометрических CA2 пирамидных клеток (взято из предыдущего исследования23). Количество филиалов дендритных был заговор против расстояние от Сома CA2 пирамидных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Примеры хороших (A) и бедными (B) HRP пятнать. (A) Biocytin восстановления показали очень хорошо заполнены межнейронного в CA2. Тело клетки (CB) мрачно окрашенных и имеет четкие очертания. Дендритов бисером и отображаются некоторые шипами (представленное красной звезды). Аксональное Арбор (A) плотной и представляет небольшой boutons. (B) пример плохой дендритных и аксональной пятнать 2 пирамидных клеток в CA2. Пятнать CB слабый с без четкого контура. Бедные пятнать зачастую ассоциируется с короче электрофизиологических записи результате присутствии очень немногие заполнены biocytin ветви. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: 3D нейрональных реконструкция CA2 корзину ячейки с ограниченным дендритных Арбор (также называется CA2 узкие Арбор Корзинчатый нейрон) с его сома в слой pyramidale, дендриты, охватывающих все слои и аксон CA2 слой pyramidale и прилегающей пласт oriens и radiatum. Очень мало ветвей достиг проксимальной oriens пласт CA3 и CA3 пласт pyramidale. Эта ячейка была заполнена с biocytin после электрофизиологических записи и разделы были обработаны с авидин ПХ после протокол, описанных здесь. Из-за нарезки, была восстановлена только аксон в глубину среза, хотя дендритов нетронутыми. Дендриты находятся в темно-розовый и аксон в белом. Границы слоя и региона были добавлены в начале видео. 3D реконструкция Грузии Экономидес 3D видео, Свенья Falk. Видео был записан с программным обеспечением реконструкции нейрон, как указано в шаге 2.17 и отредактирован с программное обеспечение для редактирования видео. Ссылка на видео:30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
| Решения, используемые | Композиция/инструкции |
| Фиксация решение | параформальдегида 4%, 0,2% насыщенных пикриновой кислоты раствор, раствор глютаральдегид 0,025% в 0,1 М фосфатного буфера (PB) |
| 0,1 М фосфатного буфера рН 7,6 | Добавить 100 мл бульона, 1 M фосфатного буфера в 900 мл дистиллированной воды |
| Фосфат буфер солевой (PBS) рН 7,4/7,5 | Добавить 10 мл 0,1 М фосфатного буфера, 0,2 г KCl и 8.76 г NaCl до 990 мл дистиллированной воды |
| Трис-буфер рН 7,5 | Растворите 5,72 g Tris гидрохлорид и 1,66 г Tris база в 50 мл дистиллированной воды. Затем сделайте до 1 Л дистиллированной водой. |
| Глутаровый и параформальдегида фиксирующие раствор | параформальдегида 4%, 0,2% насыщенных пикриновой кислоты раствор, раствор глютаральдегид 0,025% в 0,1 М фосфатного буфера. |
| Решение ABC | Решение, чтобы быть сделаны по крайней мере 30 минут перед использованием из комплекта ABC. Добавьте 1 каплю раствора A и 1 капля раствора B 2,5 мл ФСБ. |
| Durcupan эпоксидной смолы: | Чтобы сделать 20 горшки: 20 g компонент a, 20 g компонента B, 0,6 г компонента C и 0,4 г компонента D - |
| Защитите баланс от разливов, пластина с кружок фильтровальной бумаги. Тщательно взвесьте реагентов в стакан tripour в пропорциях, говорилось выше. Тщательно перемешать, энергично помешивая, используя две деревянные палочки для по крайней мере 5 минут. Смесь должна стать единой плотности темно-коричневого цвета. Поместите стакан в духовку на ~ 50 ° C для максимум 10 мин для удаления как много пузырьков как можно скорее. Примечание: Смола начнут лечить, если вы оставите стакан в духовке длиннее 10 минут Decant смолы в пластиковые горшки или 5 мл-шприцы, дата их и хранить в морозильной камере-20 ° C, готовый к использованию. |
Таблица 1: Таблица решений.
Discussion
Электрофизиологические записей в пробирке (Рисунок 1 Ac,d и . до н.э., d) в сочетании с гистохимические и иммуногистохимическое процедуры включить подробную морфологии, содержание белка связывания кальция и личность взрослого корковых интернейронов записал чтобы быть выявлены. В регионе CA2, этот метод позволил изучение местных схем в первый раз и показал подклассы интернейронов, которые не были описаны ранее в СА1 или CA3: широкий дендритных и аксональной Арбор корзина клеток (рис. 1B), клетки bistratified и SP-SR интернейронов.
Протокол, описанные здесь была оптимизирована для сохранения ультраструктуру нейронов и получить отличные восстановления дендритных (включая шипиков) и аксональной беседки. Важнейшие шаги включает в себя использование метода двойной фиксации для повышения контраста для световой микроскопии26 и добавлением глютаральдегид и пикриновой кислоты решения фиксирующие решение для улучшения проникновения антитела и сохранения нейронов Ультраструктура27. Permeabilization нежный замораживания оттаивания дает лучшее сохранение тонкой структуры, osmication и смолы встраивание уменьшить z плоскости усадка28. Кроме того визуализация очень тонких структур (например, штраф аксоны с небольшой boutons) улучшается инкубации в разделах с H2O2 и4 NaBH для уменьшения фона пятнать. Можно также увеличить контраст с добавлением2 NiCl реакцией ПХ.
Гистологические процедура подробно здесь предлагает отличные результаты с точки зрения надежности и повторяемость. Однако продолжительность электрофизиологических записей будет определять качество biocytin/флуоресценции, окрашивание, короче записи обычно ассоциируется с плохой аксональное пятнать. Выбор записи протоколов (внутриклеточный записи с помощью резкое электроды против поклеточного патч зажима) могут также влиять biocytin удержание и сохранение тонкой анатомии.
Хотя трудности в сохранении тонкой структуры во время получения воссоздать на 100 крат (1-4weeks в зависимости от сложности аксон) и гистологической обработки, описанные здесь ценятся, этот метод дает точное представление дендритных и аксональной диаметров. Использование менее требовательных протоколов раскрыть маркировки biocytin понятно, однако, они часто препятствует четкой визуализации тонкой аксональное ветвей. Моющие средства, чтобы содействовать вступлению авидин-ПХ раскрыть biocytin и антител, часто необходимы в толстые секции, но может нарушить тонкой структуры. Неврологи Поиск постоянно для полуавтоматического методы восстановления, но для теперь и аксоны особенно, biocytin-HRP с ручного восстановления остается золотой стандарт31.
Очень подробные нейрональных реконструкции, особенно в точные чертежи аксональное boutons и узлы, наличия или отсутствия миелина и в целом рисунок полной аксональное Арбор, с представлением точной аксон диаметр изменяется вдоль его Длина, предоставить дополнительную информацию для точной идентификации отдельный тип interneurone. Хотя многие интернейронов может не поместиться точно в определенный класс, метод, описанный выше обеспечивает коррелированных данных нейрональных электрофизиологических свойств, краткосрочные пластичности связанные с определенным типом подключения и подробные нейрональных реконструкций, позволяя схема, в регионе CA2, например, необходимо изучить в деталях.
Штраф, подробная структура часто упрощена в вычислительных моделей. Хотя понятно, это приводит к потере информации, которая в будущем может оказаться критической. Анализ подробные 3D реконструкций с параллельной синаптических данных позволит добавление дополнительных критериев для классификации interneuronal. Данные можно на хранение в государственных хранилищах и используемые для моделистов вычислительно изучить итоги спорадические изменения в диаметре аксона и миелинизации на потенциал действия распространения.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование получил финансирование от Novartis Pharma (Базель) и Совет по медицинским исследованиям, присуждена проф Алекс Томсон, биотехнологии и биологических наук исследовательского совета (СИББН-BB/G008639/1), физиологического общества, Европейский союз Horizon 2020 Рамочная программа исследований и инноваций под конкретные Грант соглашение № 720270 (человеческий мозг проекта SGA1) и под конкретные Грант соглашение № 785907 (человеческий мозг проекта SGA2). Мы чрезвычайно признательны проф Алекс Thomson для настройки протокола в других регионах кортикального слоя, обеспечение финансирования и за ее постоянную поддержку для этого проекта. Взносы, сделанные членами лаборатории, которые помогли оптимизации восстановления протокол и реконструированы CA2 нейронов с благодарностью: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. Хьюз, A. P. Баннистер, K. Истлейке, H. Тригг, н. а. Botcher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
| Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
| 3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
| Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
| Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
| Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
| Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
| Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
| Gelatin | Sigma | 48723 | |
| Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
| Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
| Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
| Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
| Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
| Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
| Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
| Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
| Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
| Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
| Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
| Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
| Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
| Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
| Equipment used | |||
| Vibratome | Agar Scientific | ||
| C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
| Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
| X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
| Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
| 0.18 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
| 0.25 mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
| Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
| CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
| Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
| Glass vials 14 mL | Fisher scientific |
References
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
- Bezaire, M. J., Soltesz, I. Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity. Hippocampus. 23, 751-785 (2013).
- Katona, L., et al. Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus. Hippocampus. 27, 359-377 (2017).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus. Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).
- Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
- Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat. Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).
- Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus. European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).
- Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus. Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).
- Thomson, A. M., Lamy, C. Functional maps of neocortical local circuitry. Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Wilent, W. B., Nitz, D. A. Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons. Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).
- Hirsch, J. A., Martinez, L. M. Laminar processing in the visual cortical column. Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).
- Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep. Nature. 531, 185-190 (2016).
- Yu, J. Y., et al. Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility. eLife. 6, e27621 (2017).
- Markram, H., et al. Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry. Cell. 163, 456-492 (2015).
- Van Geit, W., et al. BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience. Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17 (2016).
- Gal, E., et al. Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry. Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).
- Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro. Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).
- Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex. Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).
- West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs. Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).
- Bannister, A. P., Thomson, A. M. Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex. Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).
- Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).
- Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).
- Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus. Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).
- Somogyi, P., Takagi, H. A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry. Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).
- Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).
- Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104 (2014).
- Mercer, A., Thomson, A. M. Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers? Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83 (2017).
- Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65 (2014).
